Abstract

Ιστορικό

Ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς εμφανίζουν μια υψηλή τάση για την ανάπτυξη σκελετικών μετάσταση, με αποτέλεσμα την υπερβολική δραστηριότητα οστεολυτική. Το /RANK σύστημα RANKL /OPG, η οποία παίζει καθοριστικό ρόλο στην οστική αναδιαμόρφωση ρυθμίζοντας τον σχηματισμό οστεοκλαστών και τη δραστηριότητα, είναι πιθανό να ενδιαφέρει σε αυτό το πλαίσιο.

Υλικά και Μέθοδοι

αλυσίδας πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης αντίδραση, κηλίδωση Western, και ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η έκφραση του RANKL, RANK, και OPG σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC με διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό, όπως επίσης και σε 52 βασικά δείγματα NSCLC και 75 NSCLC δείγματα μετάσταση στα οστά. Σε NSCLC ασθενείς πρωτογενούς, η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών συσχετίστηκε με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη RANKL και επιμολυσμένα RANKL cDNA προστέθηκαν στο PAA κυτταρική γραμμή για την αξιολόγηση της δράσης προαγωγού του RANKL κατά τη διαδικασία της μετάστασης

in vitro

και

in vivo

.

αποτελέσματα

Up-ρυθμίζονται RANKL, RANK, και την έκφραση OPG και αυξημένη RANKL: λόγος OPG ανιχνεύθηκαν σε κυτταρικές σειρές NSCLC και σε ιστούς όγκων με μετάσταση στα οστά, και συσχετίσθηκαν με υψηλότερο μεταστατικό δυναμικό. Το μεταστατικό δυναμικό των NSCLC

in vitro

και

in vivo

, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης και την ικανότητα εισβολής, ήταν σημαντικά αυξημένη με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη RANKL και την επιμόλυνση του RANKL cDNA, και ήταν μειωμένη μετά προστέθηκε OPG . Η αυξημένη έκφραση του RANKL και OPG συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου, τη λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, και μακρινή μετάσταση.

Συμπεράσματα

Η διαφορική έκφραση του RANKL, RANK και OPG συνδέεται με το μεταστατικό δυναμικό του ανθρώπινου NSCLC στο σκελετό, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι το /RANK σύστημα RANKL /OPG θα μπορούσε να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του NSCLC ασθενείς με μεταστατικό

Παράθεση:. Peng X, Guo W, Ρεν Τ, Lou Z, X Lu , Zhang S, et al. (2013) διαφορική έκφραση του RANKL /RANK /συστήματος OPG σχετίζεται με μετάσταση στα οστά στο ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (3): e58361. doi: 10.1371 /journal.pone.0058361

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιουλ 2012? Αποδεκτές: 6 Φεβ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Peng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 30973020 και 81001193). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια και η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στην Ασία και δυτικούς πληθυσμούς, με πάνω από 150.000 άνθρωποι αναμένεται να πεθαίνουν κάθε χρόνο από την ασθένεια αυτή [1] . Ο σκελετός αποτελεί την πιο κοινή ιστοσελίδα της μετάστασης του όγκου. Περίπου 9% έως 30% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα αναπτύσσουν οστικές μεταστάσεις, οι οποίες οδηγούν σε σημαντική νοσηρότητα από συμπίεση του νωτιαίου μυελού, παθολογικά κατάγματα, και ανίατο πόνο [2], [3]. Παρά το υψηλό ποσοστό της μετάστασης, οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα να πολλαπλασιάζονται και να εισβάλλουν παραμένουν ελάχιστα κατανοητή, και επιτυχής τρόπους θεραπείας παραμένουν ασαφείς.

Για να αναπτυχθούν αποτελεσματικές θεραπείες για μετάσταση στα οστά, είναι αναγκαίο να διευκρινιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν όγκου που προκαλείται από τις αλλαγές στο μικροπεριβάλλον των οστών. Κανονικά, υπάρχει μια στενά συντονισμένη ισορροπία στην οποία οστεοκλαστών οστικής επαναρρόφησης και σχηματισμού οστού οστεοβλαστών μεσολάβηση εξουδετερώσει και να συμβάλει στη συνεχή αναδιαμόρφωση της δομής των οστών [4]. Όταν ο καρκίνος του πνεύμονα κάνει μετάσταση στα οστά, η διατάραξη αυτής της ισορροπίας μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη οστική απορρόφηση, με αποτέλεσμα την υπερβολική δραστηριότητα οστεολυτικές και την επακόλουθη σκελετικής νόσου [5].

Πρόσφατα δημοσιεύματα έφεραν στο φως ένα νέο σύστημα υποδοχέα-συνδετήρα που ανήκουν για τον παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) υπεροικογένεια: τον ενεργοποιητή του υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα (NF) -Kb (RANK), συνδετήρα αυτού (RANKL), και η πρωτεΐνη οστεοπροτεγερίνη (OPG) [6], [7]. RANKL, μία πρωτεΐνη δεσμευμένη σε μεμβράνη που εκφράζεται κυρίως στην επιφάνεια των οστεοβλαστών και στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών, δεσμεύεται για την κατάταξη στην επιφάνεια των προδρόμων οστεοκλαστών, διεγείροντας τη διαφοροποίηση τους σε ώριμα οστεοκλάστες [8] – [10]. OPG, ένα δόλωμα υποδοχέας ΚΑΝΚΕ που επίσης παράγεται από κύτταρα οστεοβλαστών /στρωματικών, μπορεί να αποτρέψει την καταστροφή των οστών από το κλείδωμα τη σύνδεση μεταξύ RANKL και RANK, αναστέλλοντας έτσι τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και της ενεργοποίησης [6], [11]. Δυσλειτουργία του RANK συστήματος OPG RANKL //έχει ανιχνευθεί σε διάφορα όγκους, όπως ο καρκίνος του μαστού [12], [13], του καρκίνου του προστάτη [14], κακοήθεις όγκοι των οστών (π.χ., πολλαπλό μυέλωμα, γιγαντοκυττάρων όγκους των οστών, και χονδροβλάστωμα) [15] – [17], καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [18], και η νόσος του Hodgkin [19]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι RANKL είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του οστεολυτικές βλάβες στα οστά [20]. Επιπλέον, αναστέλλοντας την αλληλεπίδραση RANKL-RANK, οστεολυτικές βλάβες έχουν ανασταλεί με επιτυχία σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλού μυελώματος και του καρκίνου του προστάτη [21] – [23].

καρκίνος του πνεύμονα, ο RANKL /σύστημα RANK /OPG έχει εντοπιστεί τόσο παρουσία όσο και απουσία των μεταστάσεων των οστών. Αυξημένα επίπεδα του διαλυτού RANKL και OPG στον ορό έχουν αναφερθεί σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με μεταστάσεις οστών [24]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι RANKL ενεργοποιεί επίσης τη μετανάστευση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν RANK [25]. Επιπλέον, RANK-Fc, μία χιμαιρική πρωτεΐνη η οποία αναστέλλει την αλληλεπίδραση RANK-RANKL, έχει αποδειχθεί να αντισταθεί οστεοκλαστογένεση [26]. Συνεπώς, υποθέτουμε ότι η έκφραση του RANKL /RANK /OPG μπορεί να συσχετίζεται με την πρόοδο NSCLC. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση του RANKL, RANK, και OPG εξετάστηκαν σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών με διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη RANKL και επιμολυσμένα RANKL cDNA προστέθηκαν σε κυτταρική γραμμή NSCLC να αξιολογηθεί η δράση υποκινητή του RANKL κατά τη διαδικασία της μετάστασης. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση του RANKL, RANK, και OPG σε πρωτογενείς όγκους NSCLC, καθώς και στην οστική μεταστατική ιστούς του NSCLC. Έκφραση των πρωτεϊνών αυτών συσχετίστηκε με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων της πρωτοβάθμιας NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς

Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η χειρουργική δείγματα βιοψίας από 127 ασθενείς με ΜΜΚΠ, συμπεριλαμβανομένων των 52 περιπτώσεις των νεοδιαγνωσθέντων NSCLC και 75 περιπτώσεις οστικής μετάστασης του NSCLC. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε νοσοκομείο του Πανεπιστημίου του Πεκίνου Λαϊκή και δεν έλαβαν θεραπεία κατά τη στιγμή της συλλογής δειγμάτων. Λεπτομερή κλινικά δεδομένα σχετικά με τους ασθενείς αυτούς παρέχεται στον Πίνακα 1. ασθενείς Η NSCLC οργανώθηκαν σύμφωνα με την κατάταξη Αμερικανικής Θωρακικής Εταιρείας TNM, και βαθμολογήθηκαν ιστολογικά είτε ως καλά, μέτρια, ή κακώς διαφοροποιημένο. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Institutional Review Boards του Νοσοκομείου Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Λαϊκή. Οι επιτροπές δεοντολογίας ενέκριναν τη διαδικασία αυτή. Ενημερωμένη συγκατάθεση για την πειραματική χρήση των χειρουργικών δείγματα ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς σε γραπτή μορφή σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας του νοσοκομείου.

Η

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα PG- BE1, PG-LH7, και PAA αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Παθολογίας, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Επιστημονικό Κέντρο Υγείας (Πεκίνο, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη RANKL πρωτεΐνης και OPG αγοράστηκαν από Prospec Biotechnology Inc. (Prospec, Ness Ziona-Ισραήλ, Cat Νο: CYT-334 και CYT-633). Αντισώματα που δημιουργούνται κατά RANK, RANKL και OPG αγοράστηκαν από Abcam Inc. (Abcam, MA, USA, Cat No: ab12008, ab9957 και ab73400). β-ακτίνης αντίσωμα αποκτήθηκε από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA, Cat No: SC-130065).

Ζώα

Έξι εβδομάδων αρσενικό σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ( SCID) ποντικούς που ζυγίζουν 20-25 g χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Η μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από τις Institutional Review Boards του Νοσοκομείου Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Λαϊκή. Τα ζώα λήφθηκαν από το Κέντρο Ερευνών Μοντέλο Ζώων του Πανεπιστημίου του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, στεγάζονται υπό συνθήκες άνευ παθογόνων σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΝΙΗ χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και χρήση στο κολλέγιο.

RT-PCR και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA εξήχθη από PG-BE1, PG-LH7, και τα κύτταρα ΡΑΑ με μια μέθοδο ενός σταδίου χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, La Jolla, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και το RNA στη συνέχεια μεταγράφηκε αντίστροφα σε συμπληρωματικό DNA. Οι ειδικοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του DNA συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Το ενισχυμένο προϊόν PCR κλασματώθηκε μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης 1,5%, φωτογραφήθηκε κάτω από υπεριώδες φως, και αναλύθηκαν με πυκνομετρία. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ Prism7300 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Beverly, ΜΑ, USA) χρησιμοποιώντας ένα κιτ A6001 GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA). Το θερμικό προφίλ ήταν 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 58 ° C για 30 s. Η έκφραση του mRNA του RANKL /RANK /OPG αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το 2

– (ΔΔCt) μέθοδος (κυτταρική σειρά ΡΑΑ ως βαθμονομητής) με βάση τιμές Ct για τις δύο γονίδια-στόχους και αναφοράς. Η ποσότητα κάθε μεταγράφημα κανονικοποιήθηκε έναντι γνωστή ποσότητα αφυδρογονάσης γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH) και β-ακτίνης. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα του πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση δίνονται ως μέση ± το σταθερό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Θερμική οικόπεδα διάστασης εξετάστηκαν για τις καμπύλες διφασική τήξης, ενδεικτικό του πόσο αστάρι-διμερή ή άλλα μη ειδικά προϊόντα θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην ενίσχυση του σήματος.

Η

ανάλυση Western ανάλυση κηλίδος

Western blot ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν επί μετουσιωτικής γέλης πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF. Μεμονωμένα ανοσοστυπώματα εκτελέσθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εγείρονται έναντι RANK (1:500), RANKL (1:1000), OPG (1:500), και β-ακτίνη (1:1000). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε ΤΒδ-Τ που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα, και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύον αντίσωμα. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (Santa Cruz, CA, USA) για 1 ώρα. αντιδραστήριο ECL (GE Healthcare, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρωτεΐνης. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης αντέδρασαν με αντι-RANKL πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού (1:500 αραίωση), αντισώματα αντι-RANK πολυκλωνικό ποντικού (1:200 αραίωση) ή αντισωμάτων αντι-OPG κουνελιού (1:100 αραίωση), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Τμήματα χρωματίστηκαν με μη-άνοσο κουνέλι ή ορού ποντικού (1:200 αραίωση) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) αντί του πρωτογενούς αντισώματος χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Για την αξιολόγηση RANKL, RANK, και χρώση OPG, τα καρκινικά κύτταρα που εμφανίζουν θετική χρώση στις κυτταρικές μεμβράνες και σε κυτταρόπλασμα μετρήθηκαν σε τουλάχιστον 10 αντιπροσωπευτικά πεδία (400 × μεγέθυνση) και το μέσο ποσοστό των θετικών καρκινικών κυττάρων υπολογίστηκε. Περιπτώσεις στις οποίες η αναλογία των θετικών καρκινικών κυττάρων ήταν ≥50% ορίστηκαν ως θετικά, και εκείνα που περιέχουν & lt? 50% θετικά καρκινικά κύτταρα ορίστηκαν ως αρνητικός. Ανοσοχρώση εκτιμήθηκε από δύο ανεξάρτητους παθολόγους τύφλωσε με κλινικά χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα.

ανάλυση εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή των ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοχρώση όλων των αντισωμάτων αναλύθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας με τη βοήθεια υπολογιστή . Εν συντομία, οι εικόνες του χρωματισμένο τμήματα συνελήφθησαν με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Leica και επεξεργασία με χρήση Image Pro Plus λογισμικό ανάλυσης (έκδοση 6.0? Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Το όριο ορίστηκε με προσδιορισμό της θετική χρώση των τμημάτων ελέγχου και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση αυτόματα όλες τις καταγεγραμμένες εικόνες από όλα τα δείγματα που χρωματίστηκαν στην ίδια περίοδο υπό τις ίδιες συνθήκες. Η περιοχή του ανοσοχρώση περιφερειών υπολογίζεται αυτόματα από το λογισμικό σε κάθε μικροσκοπικό πεδίο. μετρήσεις Pixel του προϊόντος ανοσοαντιδράσεως υπολογίστηκαν αυτομάτως και δόθηκαν ως συνολική πυκνότητα του ολοκληρωμένου ανοσοχρώσης σε μια δεδομένη περιοχή των τμημάτων. Αυτό αντανακλά τη σχετική ποσότητα των πρωτεϊνών που ανιχνεύονται από τα αντισώματα στα τμήματα του όγκου. Η αναλογία του RANKL /OPG ήταν υπολογίζονται από την ολοκληρωμένη πυκνότητες ανοσοχρώση του RANKL και OPG σε κάθε ομάδα

RANKL cDNA επιμόλυνση

Ολόσωμη RANKL cDNA ανθρώπινη.: Εισήχθη (REFSEQ NM_033012.2) στον ευκαρυωτικό φορέα pCMV6-XL5 (αγοράστηκε από ΟηΟεηε Technologies, Inc. Cat Νο: SC305532). κύτταρα ΡΑΑ διαμολύνθηκαν με τον ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ή φορέας μόνο (mock επιμολύνσεις) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή, και καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 500 μg /ml G418 (Amresco, ΟΗ, USA). RANKL σταθερές επιμολύνσεις (ονομάζεται PAA-RANKL) και πλαστή επιμολύνσεις (ονομάζεται PAA-παρωδία) καθιερώθηκαν και διατηρήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 250 μg /ml G418.

In vitro

μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

δοκιμασίες μετανάστευση και εισβολή διεξήχθησαν με σπορά 3 × 10

5 κύτταρα σε 200 μΐ RPMI1640 πάνω από ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας Transwell που περιέχει μία μεμβράνη από τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο προ-επικαλυμμένα με Matrigel ή έλλειψη ( ένθετα 24-καλά, 8,0 μm μέγεθος πόρων? Coster, Corning Inc., Corning, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Η κάτω θάλαμος πληρώθηκε με 0,8 ml RPMI1640, με ή χωρίς την προσθήκη ανθρώπινου ανασυνδυασμένου RANKL και με ή χωρίς ανθρώπινη ανασυνδυασμένη OPG. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα αποξέστηκαν και οι μεμβράνες στερεώθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης Diff-Quik (Sysmex Co., Hyogo, Japan). Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των μεμβρανών ποσοτικοποιήθηκαν με προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων σε τρία τυχαία επιλεγμένα οπτικά πεδία σε 200 × μεγέθυνση.

Κνημιαίο εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα

Ένα intratibial μοντέλο ποντικού ένεση του μετάσταση στα οστά χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία οστεολυτικές βλάβες σε αυτή τη μελέτη [28] – [30]. Τα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (5 × 10

5 κύτταρα) αιωρήθηκαν σε 10 μΐ 1% PBS και αναμίχθηκε με 10 μΙ Matrigel (Biosciences BD , San Jose, CA) για κάθε κνημιαίο ένεση. 20 μΐ του μίγματος κυττάρων και matrigel εγχύθηκε στο εγγύς κνήμη του ηλικίας 6 εβδομάδων ποντικούς SCID, όπως δημοσιεύεται προηγουμένως [29], [31]. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο (1,5-2%) και οξυγόνου. Η υπερκείμενη δέρμα προετοιμάστηκε με στείρο τρόπο με 70% αιθανόλη και betadine. Μία διαμήκης τομή 3-mm έγινε κατά τη διάρκεια της επιγονατιδικού συνδέσμου με μία λεπίδα νυστεριού αριθμό 12, και στη συνέχεια μια διαμήκης τομή 2-mm έγινε κατά μήκος της διάμεσης συνόρων του επιγονατιδικού συνδέσμου στο κνημιαίο πλάτωμα. Μια βελόνα 26 gauge 1/2 εισήχθη μέσω του εγγύς κνημιαίο πλατώ και 20 μΐ κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και μίγμα matrigel εγχύθηκε εντός του μυελικού κοιλότητα. Η πληγή έκλεισε με ένα μόνο 5-0 Vicryl ράμμα (Ethicon Inc.).

ομάδες μελέτης των ζώων

Σε αυτή τη μελέτη, πενήντα αρσενικά ποντίκια SCID υποβλήθηκαν κνημιαίου εμφύτευση με καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα και ήταν εξίσου χωρίζονται σε πέντε ομάδες μελέτης. Ομάδα Ι (ΠΑΑ) ζώα έλαβαν intratibial έγχυση των κυττάρων του ΠΑΑ και μόνο. Ομάδα II (ΡΑΑ-Mock) κνημών έλαβαν PC-3 κύτταρα που μορφομετατράπηκαν με έναν κενό φορέα για τον έλεγχο για επιμόλυνση. Ομάδα III (ΡΑΑ-RANKL) ζώα έλαβαν κύτταρα ΡΑΑ που επιμολύνθηκαν με ένα φορέα που εκφράζει πάνω RANKL cDNA. Τα κνημιαία στην ομάδα IV (ΡΑΑ-RANKL + OPG) εμφυτεύθηκαν με ΡΑΑ-RANKL κύτταρα και τα ζώα στη συνέχεια έλαβαν θεραπεία με OPG. OPG χρησιμοποιήθηκε σε δόση των 10 mg /kg διαλύθηκε σε ένα 100 μΐ φωσφορικού ρυθμιστικού αλατούχου διαλύματος (PBS) και εγχύθηκε υποδόρια τρεις φορές την εβδομάδα ξεκινώντας την ημέρα της εμφύτευσης κνημιαίου των καρκινικών κυττάρων και συνεχίστηκε για συνολικά 8 εβδομάδων. Ομάδα V (ΡΑΑ-RANKL + PBS) κνημιαία οστά εμφυτεύθηκαν με ΡΑΑ-RANKL κύτταρα και τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μΐ PBS, η οποία επίσης εγχύθηκαν υποδορίως τρεις φορές την εβδομάδα για 8 εβδομάδες.

παρασκεύασμα ραδιοϊχνηθετών

το φθόριο ιόντων που παράγονται με τη χρήση O-18 νερού και πρωτονίων βομβαρδισμό χρησιμοποιώντας ένα κυκλοτρόνιο RDS (CTI). ιόντων

18F-φθόριο παρήχθη σε συγκεκριμένες δραστηριότητες περίπου 1000 Ci /mmol και

18F-FDG συντέθηκε σε συγκεκριμένες δραστηριότητες περίπου 5000 mCi /mmol όπως δημοσιεύθηκε στο παρελθόν [30].

Micro PET /CT πρωτόκολλο απεικόνισης

Ζώα σε υποομάδες απεικόνισης υποβλήθηκαν σε τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET) και πολύ μικρές αξονικές τομογραφίες σε 8 εβδομάδες σε ίδρυμα του συγγραφέα, σύμφωνα με ένα προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο [30]. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο (1,5-2%) και οξυγόνου σε θαλάμους επαγωγή. Τα ποντίκια στη συνέχεια απευθείας ένεση με περίπου 250 μθί

18F-FDG μέσω ουραίας φλέβας χρησιμοποιώντας βελόνα διαμετρήματος 27 με σπείρωμα σε έναν καθετήρα πολυαιθυλενίου. Τα ζώα χορηγήθηκαν τη διατήρηση της αναισθησίας με 2% ισοφλουράνιο στο σύστημα κρεβάτι απομόνωση κατά τη διάρκεια της ραδιο-ιχνηθέτη πρόσληψης. Κύστες εκφράστηκαν με το χέρι 5-λεπτά πριν την απεικόνιση και τα ζώα τοποθετήθηκαν σε ένα φορητό σύστημα πολυτροπικότητα κρεβάτι που αποτελείται από ένα λουσίτη θαλάμου με θύρες αναισθησία και υπερυψωμένη πλατφόρμα. σαρώνει ολόκληρο το σώμα πραγματοποιήθηκαν με χρόνο κτήσης 10 λεπτά με τη χρήση ενός συστήματος MicroPET® FOCUS 220 (CTI Concorde Microsystems LLC). Αμέσως μετά, μια μη-αντίθεσης βελτιωμένη μελέτη μικρο CT χρησιμοποιώντας microCAT® II (ImTek Inc.) σύστημα απεικόνισης χρησιμοποιήθηκε για να σαρώσει τα ζώα με το χρόνο απόκτησης 10 λεπτών με τα πόδια. PET εικόνες σάρωσης ανοικοδομήθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρο οπίσθιας προβολής. MicroPET και microCAT® εικόνες ήταν στη συνέχεια συγχωνεύθηκαν για ανάλυση για χρήση με το λογισμικό AMIDE®.

Η ποσοτική ανάλυση των μικρο PET /CT δεδομένων

PET και CT δεδομένα σάρωσης αναλύθηκε και ποσοτικά με AMIDE® ( Μια ιατρική Image Data Examiner) έκδοση 0.7.154, όπως δημοσιεύεται στο παρελθόν [30].

πρόσληψη 18F-FDG συσχετίζεται με το μεταβολισμό της γλυκόζης και την κυτταρική χρησιμοποιήθηκε σε μικρο απεικόνιση ΡΕΤ για την ανίχνευση και την παρακολούθηση των διαμήκη φορτίου όγκου. Εν συντομία, περιοχές ενδιαφέροντος (ROI που) καταρτίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εργαλείο ROI έναντι των διμερών οροπέδια της κνήμης που ήταν τρισδιάστατα ανακατασκευάστηκε για να περιορίσει όλα τα διακριτά προσλήψεις σήμα. Χρησιμοποιώντας κουτιά ROI του ίδιου μεγέθους, τα εργαλεία ανάλυσης δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί το μέγιστο και μέση ένταση σήματος και στις δύο κνημών όγκου εμφυτεύονται και τα αντίπλευρα uninjected κνημών. Το ετερόπλευρο κνήμη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για κάθε ζώο. Για να ποσοτικοποιηθεί το μέγεθος του όγκου, 3D isocontour ROI συντάχθηκε στην κνήμη όγκου χρησιμοποιώντας τη μέγιστη ένταση του σήματος FDG στο ετερόπλευρο κνήμη ως όριο, και τον όγκο σήμα FDG (mm

3) Στη συνέχεια, υπολογίστηκε στα όγκου εμφυτεύονται κνημών. Micro CT εικόνες χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό οστεολυτικές βλάβες.

Οι μετρήσεις του όγκου επιβάρυνση

Τα ζώα θυσιάστηκαν μετά από μικρο-PET /CT σάρωση στις 8 εβδομάδες, και οι όγκοι τους στο οπίσθιο άκρο συλλέχθηκαν για μαλακά -tissue μέτρησης. Το βάρος μαλακών όγκου ιστού υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο όπως δημοσιεύεται στο παρελθόν [29], [32].

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα από την ανάλυση της εικόνας των τμημάτων εκφράζονται ως μέση τιμή ± το τυπικό σφάλμα η μέση (SEM) της κάθε ομάδας. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

t-test

και ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), με το

ρ-τιμές

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. τεστ chi-τετράγωνο του Pearson χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ RANKL /RANK έκφραση /OPG και κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).

Αποτελέσματα

Η έκφραση του RANKL, RANK και OPG σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Κατ ‘αρχάς, προσδιορίζεται το μεταστατικό δυναμικό του PG-BE1, PG-LH7, και τα κύτταρα ΠΣ. κύτταρα PG-BE1 διεισδύσει πιο έντονα το φίλτρο από τις άλλες κυτταρικές σειρές, και ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν ΡΑΑ ήταν ελάχιστη (

ρ

& lt? 0,05? Σχήμα 1Α, Β). Επιπλέον, το επίπεδο της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (ΜΜΡ9) mRNA παρατηρήθηκε μέσω της ανάλυσης RT-PCR ήταν παρόμοιο με το επίπεδο που παρατηρήθηκε με Transwell ένθετα (

ρ

& lt? 0,05? Σχήμα 1Γ). Όλα παραπάνω έδειξαν ότι αυτές οι τρεις κυτταρικές σειρές είχαν διαφορετικά μεταστατικό δυναμικό. Στη συνέχεια, η έκφραση του RANKL, RANK και OPG αξιολογήθηκε και στις τρεις κυτταρικές σειρές σε μεταγραφικό και πρωτεΐνη επίπεδα χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και κηλίδωση Western. Και οι τρεις NSCLC κυτταρικές σειρές παρουσίασαν διαφορετικά επίπεδα RANKL, RANK, και την έκφραση OPG. Από τις τρεις κυτταρικές σειρές, κύτταρα PG-BE1 (το οποίο είχε την υψηλότερη μεταστατικού δυναμικού) κατέδειξε την ισχυρότερη έκφραση του RANKL, RANK, και OPG (

ρ

& lt? 0,05 έναντι άλλων κυτταρικών σειρών? Σχήματα 2 και 3 ). κύτταρα ΠΑΑ, η οποία ήταν η λιγότερο επεμβατική, εμφάνισαν μόνο ελάχιστη RANKL, RANK, και χρώση OPG. Ανοσοκυτταροχημεία επιβεβαίωσε την έκφραση RANKL, RANK και OPG παρατηρείται με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση western. Επιπλέον, ένα σημαντικά υψηλότερο RANKL: λόγος πυκνότητας OPG παρατηρήθηκε στα κύτταρα με υψηλότερα μεταστατικό δυναμικό (

ρ

& lt? 0,05? Σχήματα 2D και 3D)

Το μεταστατικό δυναμικό των τριών NSCLC. κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκε πρώτα χρησιμοποιώντας μία vitro δοκιμασία μετανάστευσης στο (Α, Β). Η διαφορική έκφραση ΜΜΡ9 σε τρεις κυτταρικές γραμμές NSCLC αναλύθηκε περαιτέρω με RT-PCR (C). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) από τρία ξεχωριστά πειράματα. **

σ

& lt? 0,05 για PG-BE1 έναντι PG-LH7. *

σ

& lt?. 0.05 για PG-LH7 έναντι PAA

Η

RT-PCR για την ανίχνευση RANKL, RANK, και τα επίπεδα OPG mRNA σε PG-BE1, PG-LH7 , και τα κύτταρα ΡΑΑ (Α). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου αποκάλυψε την σχετική έκφραση του RANKL, RANK και OPG mRNA σε τρεις NSCLC κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το 2

– μέθοδος (ΔΔCt) (κυτταρική σειρά ΠΑΑ ως βαθμονόμησης). GAPDH και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερική αναφορά (Β, C). Στη συνέχεια, η αναλογία του ΚΑΝΚΕ: έκφραση OPG mRNA σε τρεις κυτταρικές γραμμές NSCLC υπολογίστηκε με βάση τις τιμές Ct για τις δύο γονιδίου στόχου και αναφοράς (D). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) τριών διαφορετικών πειραμάτων. **

σ

& lt? 0,05 για PG-BE1 έναντι PG-LH7. *

σ

& lt?. 0.05 για PG-LH7 έναντι PAA

Η

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη για την ανίχνευση RANKL, RANK, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης OPG σε PG-BE1, PG-LH7 , και τα κύτταρα ΠΣ. εντάσεις Band ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη (A-C). Στη συνέχεια, η αναλογία του ΚΑΝΚΕ: έκφραση OPG πρωτεΐνης υπολογίστηκε σε τρία NSCLC κυτταρικές γραμμές (D). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) τριών διαφορετικών πειραμάτων. **

σ

& lt? 0,05 για PG-BE1 έναντι PG-LH7. *

σ

& lt? 0,05 για PG-LH7 έναντι PAA

Η

Η ανασυνδυασμένη RANKL τονωθεί η μετανάστευση ΠΑΑ και την εισβολή

In vitro

Η

Με το. χαμηλότερο μεταστατικό δυναμικό και το λιγότερο RANKL έκφραση, ο χαμηλός αριθμός των κυττάρων μετανάστευσαν ΡΑΑ αυξήθηκε κατά τρεις φορές υπό την παρουσία ανασυνδυασμένου ανθρώπινου RANKL (

ρ

& lt? 0,05). Αυτό το αποτέλεσμα μπλοκάρεται από την προσθήκη της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης OPG με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β). Διεγερμένα εισβολή αυξήθηκε επίσης κατά δύο φορές όταν ανασυνδυασμένο RANKL προστέθηκε σε κύτταρα ΡΑΑ. Ομοίως, OPG παρήγαγε μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην εισβολή των κυττάρων ΡΑΑ. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σύστημα ΚΑΝΚΕ /ΚΑΝΚ /OPG ήταν λειτουργικό σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε

υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης RANKL σε ΡΑΑ-RANKL κυττάρων σε σύγκριση με ΡΑΑ και ΡΑΑ-Mock κύτταρα (Α). Η ανασυνδυασμένη RANKL διεγείρεται κυτταρική μετανάστευση ΡΑΑ, και η επίδραση της χορήγησης RANKL αποκλείστηκε με προσθήκη OPG στο μέσο καλλιέργειας σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. *

ρ

& lt? 0,05 για 300 ng /ml ανασυνδυασμένης RANKL έναντι του ελέγχου και 200 ​​ng /ml δείγματα OPG-αγωγή (Β). Αυξημένη μετανάστευση κυττάρων ΡΑΑ-RANKL in vitro επιδείχθηκε, και θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από την προσθήκη OPG στο μέσο καλλιέργειας. *

σ

& lt? 0,05 για PAA-RANKL έναντι PAA, PAA-Mock και 200 ​​ng /ml δείγματα OPG-αγωγή (C). Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) των προσδιορισμών εις τριπλούν.

Η

RANKL cDNA διαμόλυνση διεγερμένα μετανάστευση ΡΑΑ και εισβολή

in vitro

και

vivo

η

για την περαιτέρω διαλεύκανση των βιολογικών λειτουργιών του συστήματος RANKL /RANK /OPG σε NSCLC, χρησιμοποιήσαμε την τεχνική επιμόλυνσης να ρυθμίζει ειδικά την έκφραση του γονιδίου RANKL σε κύτταρα PAA. κύτταρα ΡΑΑ επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο DNA που κωδικοποιεί το γονίδιο RANKL πλήρους μήκους. Μετά το κοσκίνισμα G418 για αρκετές εβδομάδες, η σταθερή κυτταρική γραμμή μορφομετατροπέας ΡΑΑ-RANKL καθιερώθηκε. έκφραση RANKL ήταν σημαντικά up-ρυθμίζονται σε αυτή την κυτταρική σειρά σε σχέση με την αρχική γραμμή ΠΑΑ και του ψευδοεπιμολυντικό με φορέα pCMV6-XL5 (PAA-Mock) (

σ

& lt? 0,05? Εικόνα 4Α).

στη συνέχεια, διερευνήσαμε την επίδραση της προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης RANKL στην μεταστατική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων με Transwell δοκιμασίας. Ο αριθμός των κυττάρων ήταν μετανάστευσαν πάνω από δύο φορές υψηλότερη σε ΡΑΑ-RANKL κύτταρα σε σχέση με ΡΑΑ και ΡΑΑ-Mock κύτταρα? ο αριθμός των κυττάρων ήταν εισέβαλαν επίσης δύο φορές υψηλότερη. Και οι δύο αυτές επιδράσεις αποκλείστηκαν με προσθήκη OPG στο μέσο καλλιέργειας σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4C).

Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της RANKL σε NSCLC in vivo, ιδρύσαμε ποντικούς ξενομοσχεύματος μοντέλο με intratibial ένεση ΡΑΑ κυττάρων ή ΡΑΑ-RANKL κυττάρων στα ποντίκια SCID. Μετά από 8 εβδομάδες, παρατηρήσαμε ότι ο όγκος του όγκου που προέρχονται από κύτταρα ΡΑΑ-RANKL ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη που προέρχεται από κύτταρα ΡΑΑ (Πίνακας 3). ανάλυση Micro ΡΕΤ αποκάλυψε επίσης σημαντική διαφορά του μεγέθους των οστών αλλοίωσης μεταξύ Group (ΡΑΑ) και Ομάδα (ΡΑΑ-RANKL) (Πίνακας 3? Σχήμα 5). Επιπλέον, με OPG υποδορίως με ένεση τρεις φορές την εβδομάδα, και οι δύο τον όγκο του όγκου και

18F-FDG μέγεθος οστική αλλοίωση της ομάδας (ΡΑΑ-RANKL + OPG) ήταν σημαντικά μικρότερες από Group (ΡΑΑ-RANKL) και της ομάδας (ΡΑΑ-RANKL + PBS) (Πίνακας 3?. Σχήμα 5)

Α-Απλό ακτινογραφία? B-micro CT (εγκάρσια)? C-micro PET /CT επικάλυψης (εγκάρσια). Απλό ακτινογραφία και μικρο PET /CT έδειξε αυξημένη καταστροφή των οστών (λευκά βέλη) και

18F-FDG πρόσληψη στην ομάδα (ΡΑΑ-RANKL) και ομάδα (ΡΑΑ-RANKL + PBS) σε 8-εβδομάδες μετά intratibial ένεση των κυττάρων του όγκου, ενώ η αύξηση ανεστάλη στην ομάδα (PAA-RANKL + OPG).

η

στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα παραπάνω αποδεικνύεται ότι το σύστημα RANKL /RANK /OPG διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στις μεταστάσεις των οστών NSCLC in vivo. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τις in vitro μελέτες και κλινικοπαθολογική δεδομένων.

Η έκφραση της πρωτεΐνης του RANKL, RANK και OPG στην πρωτοβάθμια βλάβες NSCLC και μεταστάσεις

Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιηθούν για ανοσοχρώση να εξετάσει RANKL, RANK , και τα επίπεδα πρωτεΐνης OPG σε δείγματα ανθρώπινου ιστού NSCLC. 75 NSCLC μεταστάσεις στα οστά που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη, 60 περιπτώσεις (80%) και 54 περιπτώσεις (72%) εμφάνισαν έκφραση του RANKL και RANK, αντίστοιχα, ενώ 62 περιπτώσεις (82,7%) παρουσίασαν OPG έκφραση (Πίνακας 4). RANKL και χρώση RANK παρατηρήθηκαν κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη και κυτόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. Μη νεοπλασματικές ιστούς των οστών έδειξαν ασθενή και εστιακή RANKL, RANK, και χρώση OPG, και την ένταση χρώσης και των τριών πρωτεϊνών ήταν ισχυρότερη στις διεπαφές καρκινικών κυττάρων /οστού σε σχέση με το κέντρο των καρκινικών κυττάρων φωλιές (Σχήμα 6Α). Συγκριτικά, σε 52 πρωτογενείς καρκίνους μόνο το 53,8% και το 59,6% των περιπτώσεων παρουσίασαν RANKL και RANK έκφραση, αντίστοιχα, και το 63,5% των περιπτώσεων αποδεικνύεται OPG έκφρασης (

σ

& lt? 0,05? Πίνακας 4). Σημαντικά ισχυρότερη ανοσοχρώση για όλες τις τρεις πρωτεΐνες παρατηρήθηκε σε οστικές μεταστάσεις από ό, τι σε κύτταρα όγκου στην πρωτογενή θέση. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώθηκε με ποσοτική ανάλυση της πυκνότητας ανοσοχρώση των πρωτεϊνών σε κάθε ομάδα.

Η ανοσοκυτταροχημεία για RANKL, RANK και OPG πραγματοποιήθηκε σε τομές ιστού από πρωτογενή αλλοιώσεις NSCLC και οστικές μεταστάσεις που προέρχονται από NSCLC, και ο εντάσεις χρώσης αξιολογήθηκαν (Α). Στη συνέχεια, η αναλογία του ΚΑΝΚΕ: OPG πυκνότητα ανοσοχρώση υπολογίστηκε σε πρωτογενείς βλάβες NSCLC και οστικές μεταστάσεις που προέρχονται από NSCLC (Β). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) από τρία ξεχωριστά πειράματα. *

σ

& lt? 0,05

Η

Στη συνέχεια, για να εκτιμηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια τα αποτελέσματα ανοσοχρώση, υπολογίσαμε RANKL:. OPG αναλογίες με τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των ιστών από την πρωτογενή NSCLC και NSCLC οστικές μεταστάσεις. Η ανάλυση αποκάλυψε σημαντικά υψηλότερο RANKL:. OPG αναλογίες σε οστικές μεταστάσεις σε σύγκριση με τους ιστούς πρωτογενούς NSCLC (Εικόνα 6Β)

Συσχέτιση του RANKL, RANK, και η έκφραση OPG με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων του καρκίνου του πνεύμονα

Διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά του NSCLC ασθενείς με πρωτοπαθή συγκρίθηκαν με βάση τα επίπεδα έκφρασης του RANKL, RANK και OPG. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, RANKL, έκφραση RANK και OPG είχαν δεν συνδέονται με την ηλικία, το βιολογικό φύλο, το ιστορικό καπνίσματος, ή histotype. Ωστόσο, σαφείς συσχετίσεις μεταξύ RANKL και OPG έκφρασης και το στάδιο του όγκου, τη λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, και μακρινή μετάσταση. Ως εκ τούτου, οι υψηλότερες RANKL (78,6%, 71,4%, και 88,9%) και η έκφραση OPG (64,3%, 76,2%, και 77,8%) παρατηρήθηκαν σε πιο προχωρημένο μεταστατικούς όγκους (

ρ

& lt? 0,05? Πίνακας 1 ). Περίπου τα τρία τέταρτα (71,4%) του σταδίου Τ3 /4 δείγματα όγκων χρωματίστηκαν θετικά για RANK, σε σύγκριση με το 39,5% των δειγμάτων Τ1 /2 του όγκου στάδιο (

ρ

& lt? 0,05? Πίνακας 1). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης RANK και μετάσταση στους λεμφαδένες ή μακρινές μεταστάσεις. Τέλος, οι ασθενείς με ελάχιστα διαφοροποιημένο ιστολογικό βαθμό παρουσίασαν πολύ υψηλότερη έκφραση RANKL από αυτούς με καλά διαφοροποιημένο ιστολογικές Βαθμός (90,9% έναντι 43,9%,

σ

& lt? 0,05)? δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση όσον αφορά RANK ή OPG.

Συζήτηση

Οι οστικές μεταστάσεις που προέρχονται από καρκίνο του πνεύμονα και άλλες κακοήθειες που σχετίζονται με σοβαρές σκελετικές επιπλοκές, και ο καρκίνος του πνεύμονα μετάσταση στα οστά παραμένει μια σημαντική πηγή νοσηρότητας, με λίγες επιτυχημένες θεραπευτικές επιλογές. Οι περισσότερες μεταστάσεις στα οστά NSCLC συνήθως χαρακτηρίζονται ως οστεολυτικές σύμφωνα με ραδιογραφική εμφάνιση [20], [33], [34]. Στο φυσιολογικό οστό, υπάρχει μια δυναμική ισορροπία μεταξύ των οστεοκλαστών ρυθμιζόμενων επαναρρόφηση οστού και σχηματισμός οστού οστεοβλάστες ρυθμίζεται [4].