Αφηρημένο

Η απενεργοποίηση του γονιδίου p53 ογκοκατασταλτικό παρατηρείται συνήθως στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη και σχετίζεται με θεραπευτικές αντίσταση. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι το πράσινο τσάι πολυφαινόλες (GTP) διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις παρατηρήσεις παραμένουν ασαφείς. Εδώ ερευνήσαμε τους μηχανισμούς του GTP-επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη LNCaP σταθερώς επιμολυσμένα με μικρή φουρκέτα-RNA κατά p53 (LNCaPshp53) και φορέα ελέγχου (LNCaPshV). θεραπεία GTP επαγόμενη σταθεροποίηση ρ53 και ενεργοποίηση των κατάντη στόχοι p21 /WAF1 και Bax με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο ειδικώς σε κύτταρα LNCaPshV. Ωστόσο, GTP-επαγόμενη αυξητική ρύθμιση FAS μέσω της ενεργοποίησης του c-Jun-Ν-τερματικής κινάσης αποτέλεσμα φωσφορυλίωση FADD, κασπάση-8 ενεργοποίηση και η αποκοπή του BID, οδηγώντας σε απόπτωση και στα δύο κύτταρα LNCaPshV και LNCaPshp53. Παράλληλα, η θεραπεία των κυττάρων με GTP είχε σαν αποτέλεσμα την αναστολή της οδού επιβίωσης, διαμεσολαβείται από Akt απενεργοποίηση και απώλεια BAD φωσφορυλίωσης εντονότερα σε κύτταρα LNCaPshp53. Αυτές οι διακριτές οδούς κυτταρικού θανάτου συγκλίνει σε ένα κοινό μονοπάτι, που οδηγεί σε απώλεια του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού, απελευθέρωση κυτοχρώματος c και ενεργοποίηση του τερματικού κασπασών, με αποτέλεσμα PARP-διάσπαση. GTP-επαγόμενη απόπτωση εξασθενημένος με αναστολέα JNK, SP600125 στις δύο κυτταρικές σειρές? λαμβάνοντας υπόψη ότι η PI3K-Akt αναστολέα, LY294002 οδήγησε σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε περίοπτη θέση στα κύτταρα LNCaPshp53, για την ίδρυση του ρόλου των δύο διακριτών οδών της GTP-απόπτωση. Επιπλέον, η έκθεση GTP είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της κατηγορίας Ι HDAC πρωτεΐνης, η συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών-H3 σε ολικό κυτταρικό χρωματίνη, με αποτέλεσμα την αύξηση της προσβασιμότητας των παραγόντων μεταγραφής να δεσμεύονται με τις αλληλουχίες υποκινητή του p21 /WAF1 και Bax, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 του κύτταρα, αντίστοιχες με τις επιδράσεις που προκαλούνται από ένα αναστολέα HDAC, τριχοστατίνη Α Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι GTP επάγει καρκίνο του προστάτη κυτταρικό θάνατο από δύο διακριτούς μηχανισμούς ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53, με προσδιορισμό ειδικών καλά καθορισμένη μοριακών μηχανισμών που μπορούν να στοχεύονται από χημειοπροληπτική και /ή θεραπευτικές στρατηγικές

Παράθεση:. Gupta K, Thakur VS, Bhaskaran Ν, Nawab Α, Babcook MA, Jackson MW, et al. Πολυφαινόλες (2012) Πράσινο Τσάι Προκαλέστε p53-εξαρτώμενη και p53-ανεξάρτητη απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών. PLoS ONE 7 (12): e52572. doi: 10.1371 /journal.pone.0052572

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29, Αυγ του 2012? Αποδεκτές: 19 Νοέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Gupta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα έργο υποστηρίζεται από Ηνωμένες Πολιτείες Δημόσιας Υγείας Υπηρεσία Χορηγιών RO1 CA115491, RO1 CA108512, RO1 AT002709, και R21 CA109424 και τα ταμεία Endowment να SG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες στον Dr Mark W Jackson, ο οποίος εκτίει συνεργασία συγγραφέα σε αυτό το χειρόγραφο και είναι ένα ακαδημαϊκό πρόγραμμα επεξεργασίας του PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Με περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές διαθέσιμες για τον καρκίνο του προστάτη, οι ασθενείς με υποτροπιάζουσα νόσο έλαβαν θεραπεία με αντι -androgens. Ωστόσο, η αρχική κλινική απόκριση συχνά ακολουθείται από την εμφάνιση ορμονικά ανθεκτικών και τελικά τη χημειοθεραπεία του καρκίνου ανθεκτική [1]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν χημειοαντίσταση μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών, οι περισσότεροι από αυτούς συνεπάγεται ένα αλλαγμένο αποπτωτικό πρόγραμμα [2]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η κατάσταση ρ53 θα μπορούσε να είναι ένας κρίσιμος προσδιοριστής για χημειο-ευαισθησία σε ανθρώπινους όγκους [3], [4]. Περισσότερο από το 50% των ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, παρουσιάζουν απώλεια της φυσιολογικής λειτουργιών ρ53 ή /και ελαττώματα στο μονοπάτι σηματοδότησης ρ53 όπως επίσης και μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος ή διαγραφές? αυτές οι μοριακές αλλαγές σχετίζονται με την αντίσταση σε κυτταρικό θάνατο [4], [5]. Η σχετική αναποτελεσματικότητα των σημερινών χημειοθεραπευτικών σχημάτων δικαιολογεί μια συνεχή έρευνα για ασφαλείς και αποτελεσματικούς παράγοντες που θα μπορούσαν να βελτιώσουν τη θεραπεία ή /και αναστέλλουν την ανάπτυξη αντίστασης στη χημειοθεραπεία.

Η πρωτεΐνη ρ53, ένας καταστολέας όγκων, λειτουργεί στη μεταγραφή γονίδια αναστολή ανάπτυξης που εμπλέκονται στην απόπτωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την επιδιόρθωση του DNA [4] – [6]. Η λειτουργία καταστολής όγκου του p53 οφείλεται κυρίως στο ρόλο της σε μία από τις δύο μηχανισμούς: είτε προωθώντας την επισκευή και την επιβίωση των κατεστραμμένων κυττάρων, ή την προώθηση της μόνιμη απομάκρυνση των ανεπανόρθωτα κυττάρων μέσω της απόπτωσης [6], [7]. Για παράδειγμα, το ρ53 προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά κύριο λόγο με την ενεργοποίηση της μεταγραφής ενός αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη, p21 /WAF1, και επάγει την απόπτωση μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης των προ-αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας Bcl2, Bax, PUMA και Noxa [7]. Μια εναλλακτική και συμπληρωματική οδού σηματοδότησης που οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο περιλαμβάνει την εξωγενή οδό του υποδοχέα θανάτου. Η εξωγενής οδός ενεργοποιείται μετά την πρόσδεση του υποδοχέα του FAS /CD95 συνδέτη που προκαλείται από ένα μόριο προσαρμογέας FAS-σχετίζεται περιοχή θανάτου (FADD), η οποία γεφυρώνει τον υποδοχέα με το κατάντη τελεστή, κασπάσης 8, με αποτέλεσμα τη συναρμολόγηση του θανάτου που επάγει σηματοδότηση σύμπλοκο [ ,,,0],7], [8]. Τα εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια της απόπτωσης που συνδέονται με το κασπάσης-8 μεσολαβούμενη διάσπαση της προ-αποπτωτικών Bcl-2 μέλος της οικογένειας Bid. Περικομμένο Bid (tBid) μετατοπίζεται προς τα μιτοχόνδρια, όπου προκαλεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C, ακολουθούμενη από επαγωγή απόπτωσης [9].

Ως απορρύθμιση της οδού ρ53 σε καρκινικό κύτταρο είναι ένα κοινό συμβάν και μπορεί να συμβάλει με ανθεκτικότητα στα φάρμακα, χρειάζονται χημειοθεραπευτικό στρατηγικές που στοχεύουν σε αυτό το ελαττωματικό μηχανισμό. Για παράδειγμα, μια νέα θεραπευτική προσέγγιση, με τη συμμετοχή φαρμακολογική αναστολή αποακετυλασών ιστόνης (HDACs), επιτρέπει στις τοπικές αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και δυναμικές αλλαγές στην νουκλεοσωμικών συσκευασία, μέσω ακετυλίωσης /de-ακετυλίωση της πρωτεΐνης πυρήνα ιστόνης, και ως εκ τούτου παίζει ένα κεντρικό ρόλο στην ρύθμιση της πρόσβασης σε χρωμοσωμικό DNA, και με τον τρόπο αυτό, στη ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής [10]. Μεταξύ των πιο σημαντικών ρυθμιστών των φαινομένων αυτών είναι ειδικά ένζυμα που ρυθμίζουν Ν-τελική ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης σε Η3 και Η4 ιστονών, οι ακετυλτρανσφεράσες ιστόνης (καπέλα) και HDACs [10], [11]. Αυτά τα ένζυμα μπορούν να προσληφθούν για την τροποποίηση συγκεκριμένων γονιδίων σε συγκροτήματα από παράγοντες μεταγραφής ειδική αλληλουχία. Η αναστολή της δραστικότητας HDAC προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, κυρίως μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης της ρ53 με τη μεσολάβηση προ-αποπτωτική απόκριση και επαγωγή κυτταρικού κύκλου αναστολέα κινάσης ρ21 /WAF1 και Bax, καθώς και μέσω μεταγραφικά ανεξάρτητη άμεση σύνδεση της ρ53 να Βαχ, Bcl2 και Bcl-

xL [12], [13].

Δίπλα σε αδρανοποίηση των αποπτωτικών στοιχεία σηματοδότησης όγκοι αναπτύσσουν επίσης αντίσταση χημειοθεραπεία με ενεργοποίηση της σηματοδότησης επιβίωσης, όπως η phosphatidylinositide 3-κινάσης ( ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι [14]. Η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ από κινάσες τυροσίνης υποδοχέα οδηγεί στην πρόσληψη της πρωτεΐνης κινάσης Β (ΡΚΒ /Akt) προς την μεμβράνη του πλάσματος, όπου στη συνέχεια ενεργοποιείται κατά τη φωσφορυλίωση στα κατάλοιπα Thr308 και Ser473, οι οποίες με τη σειρά τους φωσφορυλιώνεται από φωσφοϊνοσιτιδίου-εξαρτώμενες κινάσες. Η ενεργοποιημένη Akt ενισχύει την επιβίωση των κυττάρων τόσο από την αναστολή της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών

δηλαδή

. BAD ή κασπάσης-9 και με την ενεργοποίηση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών προωθώντας έτσι την κυτταρική επιβίωση [14], [15].

Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, ένας αριθμός φυσικών πολυφαινολικών ενώσεων έχουν αξιολογηθεί για την πιθανή χρήση τους στην πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου [16]. Πράσινο πολυφαινόλες τσαγιού, το κύριο συστατικό του οποίου είναι epigallocatechic-3-gallate (EGCG), έχουν δειχθεί να επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [17]. Το εργαστήριο μας έχει διεξάγει εκτεταμένες έρευνες των μηχανισμών που διέπουν τις αντι-καρκινογόνες επιδράσεις του πράσινου τσαγιού πολυφαινολών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη [12], [13]. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι το πράσινο τσάι πολυφαινόλες προκαλούν απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, ανεξαρτήτως του συνεταιρίζεσθαι των ανδρογόνων και την κατάσταση p53 [13]. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι GTP και μεταγραφική δραστικότητα αύξησης ρ53 EGCG και ακετυλίωση καταστέλλοντας τάξης Ι αποακετυλασών ιστόνης [12]. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το πράσινο τσάι πολυφαινόλες επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη με την ενεργοποίηση του υποδοχέα θανάτου FAS /κασπάσης-8 οδού και αναστολή της ρ-ρ-Akt μονοπάτι BAD /κυτταρικής επιβίωσης. συσσωρευμένη ευρήματά μας έχουν σημαντικές συνέπειες για την κατανόηση του μοριακού μηχανισμού του χημειοαντίσταση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, και ειδικότερα, ο ρόλος των ρ53 και Akt σε αυτή τη διαδικασία. Δεδομένου χημειοαντίσταση είναι ένας περιοριστικός παράγοντας στις προσπάθειες να παρέχει επιτυχή θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη, είναι κρίσιμο να κατανοήσουμε πώς GTP υπερνικά διαφορικά θεραπευτική αντίσταση και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με διάφορους τύπους ανωμαλιών ρ53.

Υλικά Και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και Αντιδραστήρια

LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα δημιουργήθηκαν με μόλυνση ανθρώπινων κυττάρων LNCaP καρκίνου του προστάτη που λαμβάνεται από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) με shp53 φακοϊό παρασκευάζεται στο εργαστήριο με επιμόλυνση 293Τ κύτταρα με φορείς λεντοϊού pLVTHSiGFP ή pLVTHMshp53RNA και συσκευασίας κατασκευάσματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], [19]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Hyclone, Thermo Fischer, Logan, UT) συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου μόσχου (Foundation, West Sacramento, CA) σε 50-70% συρροή. Τα κύτταρα έλαβαν τις ακόλουθες θεραπείες: 20 ng /ml τριχοστατίνη Α (Sigma, St Louis, ΜΟ), διαλύθηκε σε DMSO? 20-80 μg /ml Polyphenon E® (Mitsui Norin, Ιαπωνία) εφεξής ως πράσινο τσάι πολυφαινόλες (GTP) για υποδεικνύεται φορές. Συγκεντρώσεις 10μg /ml Polyphenon Ε αντιστοιχεί σε 14 μΜ EGCG όπως προσδιορίζεται με ανάλυση HPLC. Τα συστατικά που υπάρχουν στο Polyphenon E® περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Αντισώματα για αντι-ρ53 (SC-126), αντι-p21 /WAF1 (SC-397), αντι-Akt (SC-8312), αντι-Βαχ (SC-493), αντι-BID (SC-6538), αντι -HDAC1 (SC-7872), αντι-HDAC2 (SC-6296), αντι-HDAC3 (SC-11417), αντι-HDAC8 (SC-11405), αντι-FAS (SC-715), αντι-FADD (SC- 5559), αντι-ρ-FADD Ser194 (SC-12439), αντι-κασπάση-8 (SC-7890) και αντι-β-ακτίνης (SC-47778) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα για αντι-ιστόνης Η3 (05-928), αντι-ιστόνης Η3 ακετυλο Lys9 /18 (07-593) από την Upstate (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ), και BID (44 έως 4334) αγοράστηκαν από την Invitrogen Corporation (Camarillo , CA). Αντισώματα για αντι-κασπάση-9 (# 9502), αντι-κασπάση-3 (# 9662), διασπασμένη PARP (# 9544), αντι-c-IAP (# 3130), αντι-Χ-ΙΑΡ (# 2045), αντι -SAPK /JNK (# 9258), αντι-ρ-ΙΝΚ Thr183 /Tyr185 (# 9251), αντι-ρ-Akt Ser473 (# 4051), αντι-BAD (# 9292), αντι-ρ-BAD Ser136 (# 9295 ) και αντι-VDAC (# 4866) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ).

Δημιουργία LNCaPshV και LNCaPshp53 Cells

κύτταρα συσκευασίας 293Τ καλλιεργήθηκαν σε πλάκες των 100 mm, η ημέρα πριν από την επιμόλυνση σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS χωρίς πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 6 μα shp53 ή shGFP (έλεγχος) RNA μαζί με κατασκευάσματα συσκευασίας δεύτερης γενιάς (pCMV-dR8.74 και pMD2G) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη Plus αντιδραστηρίου (Invitrogen Corp.) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον πωλητή. Για δύο επόμενες ημέρες, μέσο συλλέχθηκε και επιστρώθηκε πάνω στα κύτταρα LNCaP μετά την προσθήκη 10 μΐ από 4 mg /ml polybrene ανά 10 ml και την αποστείρωση μέσω διήθησης.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Η επίδραση του GTP στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε με ΜΤΤ [3- (4, 5-διμεθυλο-θειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ tetrazoliumbromide] δοκιμασίας και η αναστολή της ανάπτυξης εκτιμήθηκε ως το ποσοστό βιωσιμότητας όπου τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα ελήφθησαν ως 100 % βιώσιμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

μεθυλενίου κυανή χρώση και ποσοτικοποίηση

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις καμπτοθεκίνης (50-200 ng /ml) για 24 h. Media στη συνέχεια απομακρύνθηκε και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα κυανού του μεθυλενίου μετά την κατεργασία και οι πλάκες διατηρήθηκαν επί αναδευτήρα επί 1 ώρα. Οι πλάκες πλύθηκαν ήπια με διπλά αποσταγμένο νερό για να απομακρυνθεί η περίσσεια του χρώματος, ξηραίνεται και σαρώνεται.

Light Microscopy

LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή και επεξεργάστηκε με 20-40 μg /ml συγκέντρωση του GTP για 24 ώρες. Οι φωτογραφίες τραβήχτηκαν με x40 μεγέθυνση χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός.

DNA κατακερματισμός Δοκιμασία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 70% συμβολή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 40 μg /ml συγκέντρωση του GTP για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την απομόνωση του DNA και ανιχνεύσεως κατακερματισμό. Οι ζώνες έγιναν ορατές κάτω από μια συσκευή υπεριώδους, ακολουθούμενο από την ψηφιακή φωτογραφία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

κυτταρικού θανάτου Δοκιμασία

απόπτωση των κυττάρων μετρήθηκε με

in vitro

προσδιορισμό της κυτταροπλασματική ιστόνης σχετιζόμενη-DNA-θραύσματα (μονο και oligonucleosomes) μετά την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου από φωτομετρική ανοσοδοκιμασία ενζύμου χρησιμοποιώντας κιτ κυττάρου Death Detection ELISA από την Roche (Cat # 11774425001) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του πωλητή. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ LY294002 ή 20 μΜ SP600125 για 8 ώρες και 40 μg /ml GTP για 16 ώρες ή σε συνδυασμό για 24 ώρες και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα κυττάρων μεταφέρθηκαν πάνω στα επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη πλάκες μικροφρεατίων με περιέχουν ανοσο-αντιδραστήριο αντι- ιστόνης-βιοτίνη, αντι-DNA-POD. Μετά την επώαση, η ενζυματική αντίδραση διεξήχθη και το χρώμα μετρήθηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας μήκος κύματος αναφοράς ως 490 nm. Οι τιμές υποβάθρου (ρυθμιστικό διάλυμα επώασης μόνο) αφαιρέθηκαν, και οι τιμές OD που αντιπροσωπεύουν νουκλεοσώματος θραύσματα του DNA σε δείγματα που κατεργάζονται συγκρίθηκαν με αυτές τις τιμές που λαμβάνονται από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, και εκφράζονται ως φορές αύξηση.

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα λύθηκαν σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό (που περιέχει 1% ΝΡ40, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS σε PBS, και προσφάτως προστέθηκε πλήρης κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Sciences, Indianapolis, ΙΝ). συγκέντρωση πρωτεΐνης στο κυτταρολύματος καθορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτείνης συμβατό με το απορρυπαντικό από την Bio-Rad (Hercules, CA). Τα δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα για την ολονύκτια μπλοκαριστεί σε 5% άπαχο γάλα σε PBS. Επόμενη μεμβράνη ημέρες απομακρύνθηκε από πρωτογενές αντίσωμα, πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης και στη συνέχεια επωάστηκαν με τις κατάλληλες υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη στη συνέχεια αναπτύχθηκε με αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (GE Healthcare, Piscataway, NJ) και εκτίθεται σε φιλμ Hyblot CL αυτοραδιογραφία (Denville Scientific, Metuchen, NJ). ψηφιοποίηση εικόνας και ποσοτικοποίηση διεξήχθησαν με σύστημα απεικόνισης Kodak 2000.

Εκχύλιση και Έκφραση ακετυλιωμένων ιστονών Πρωτεΐνες

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20-80 μg /ml GTP για 24 h και συλλέχθηκαν μετά πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) συμπληρωμένο με 5 mM βουτυρικό νάτριο. Μετά πλύση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης Triton [PBS που περιέχει 0.5% Triton Χ-100 (όγκος /όγκος), 2 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 0,02% (βάρος /όγκο) NaN3] και λύθηκαν επί πάγου για 10 λεπτά με ήπια ανάδευση, φυγοκεντρείται σε 2000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Pellet πλύθηκε σε ρυθμιστικό εκχύλισης Triton και μετά επαναιωρήθηκαν σε 0,2 Ν HCI. Οι ιστόνες εκχυλίστηκαν οξύ όλη τη νύκτα στους 4 ° C και φυγοκεντρήθηκε στις 2000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την ανάλυση των ιστονών χρησιμοποιώντας ανοσοκηλίδωση.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20-80 μg δόσεις /ml του GTP διαλυμένο σε PBS ή μόνο με PBS (έλεγχος) για 3 ημέρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ορό που περιείχε 1% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για εγκάρσια σύνδεση. Η αντίδραση στη συνέχεια τερματίστηκε με τη χρήση 0,125 Μ τελική συγκέντρωση γλυκίνης. Η χρωματίνη υπέστη πέψη με νουκλεάση monococcal ένζυμο και επωάστηκαν με αντι-ακετυλιωμένη Η3 ιστόνης (Cat # 07-593? Upstate Biotechnology) αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Cross-linking αντιστράφηκε με επώαση των δειγμάτων επί μία νύκτα στους 65 ° C. DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας διάλυμα φαινόλης-χλωροφορμίου-ισοαμυλικής με εκχύλιση που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης. DNA ακολούθως επαναιωρήθηκε σε ύδατος άνευ νουκλεάσης. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για τη γονιδιακή p21 /WAF1 υποκινητή ήταν ως ακολούθως: εμπρόσθια εναύσματα 5′-GTGGCTCTGATTGG CTTTCTG-3 ‘, αντίστροφοι εκκινητές 5′-GTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3′ και για γονιδιακή υποκινητή Βαχ, εμπρόσθια εναύσματα 5’-TAATCCCAGCGCTTTGGAA-3 ‘και αντίστροφους εκκινητές 5’-TGCA GAGACCTGGATCTAGCAA-3 ‘, αντίστοιχα. Ανοσοκαταβυθισμένες DNAs, χάντρες ή ελέγχους εισροών υποβλήθηκαν σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για 30 κύκλους από τις ακόλουθες συνθήκες ποδηλασίας: Στάδιο-1-95 ° C για 2 λεπτά (1 κύκλος), Στάδιο-2-95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, 72 ° C για 1 λεπτό (30 κύκλοι), Στάδιο-3-72 ° C για 3 λεπτά (1 κύκλος). Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας 2% πηκτή αγαρόζης.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση και απόπτωση Ανίχνευση

Η επίδραση του GTP επί του κυτταρικού κύκλου και subG1 μετρήθηκε εκτελώντας δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής. LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GTP και συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση μετά την αγωγή (τόσο συνημμένο και επιπλέοντα κύτταρα από τα μέσα ενημέρωσης μετά τη θεραπεία) συλλέχθηκαν. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Περίπου, 1 × 10

6 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 90% ψυχρή μεθανόλη και αφέθηκε επί πάγου για τουλάχιστον 30 λεπτά και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C έως επεξεργασία για τον κυτταρικό κύκλο. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε 0,04 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου και 100 μg /ml RNase σε PBS. Τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και διεξήχθη κυτομετρία ροής επί EPICS XL-MCL κυτταρομετρητή ροής και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ΜΟϋΡΙΤ Κυττάρων Quest ανάλυση για να προσδιοριστεί ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές εις διπλούν. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± SD. Οι εικόνες ψηφιοποιήθηκαν και ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα λογισμικού με σύστημα απεικόνισης Kodak 2000. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με ANOVA ακολουθούμενο από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης ενός Dunnett.

P

αξιών & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Αν και η αποτελεσματικότητα του GTP στην επαγωγή της απόπτωσης σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών τύπων έχει τεκμηριωθεί καλά [22] – [24], η επίδραση του GTP σε απουσία ανωμαλιών ρ53 δεν έχει διερευνηθεί λεπτομερώς. Προγενέστερες μελέτες έχουν δείξει ότι η αδρανοποίηση του p53 με siRNA σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη LNCaP αυξημένη αντίσταση σε EGCG απόπτωση που διαμεσολαβείται [25]. Για τη δημιουργία απερίφραστα τον ρόλο των p53 και να διερευνήσουν οδούς υπεύθυνοι για την αυξημένη κυτταρική αντίσταση, δημιουργήσαμε ισογονιδιακές κύτταρα με φακοϊό φόντο διάνυσμα με μόνιμα νοκ ντάουν p53 σε LNCaP κύτταρα να παράγουν LNCaPshp53 και επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου για να παράγουν κύτταρα LNCaPshV. Για να καθοριστεί εάν τα επίπεδα της ρ53 επηρεάζουν απόκριση κυτταρικού θανάτου, τα ισογενετικών κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με camptothechin, ένα DNA επιζήμια αντικαρκινικό παράγοντα που προκαλεί απόπτωση σε διάφορα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [26]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, η θεραπεία με 50 και 100 ng /ml camptothechin για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση των κυττάρων LNCaPshV στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Σε σύγκριση με δείγμα αναφοράς άνευ αγωγής, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 αυξήθηκε από 67,36% σε 79,62% και 86,22% μετά από θεραπεία με 50 και 100 ng /συγκεντρώσεις καμπτοθεκίνης ml. Ομοίως, τα κύτταρα LNCaPshp53 παρουσίασαν G1 σύλληψη φάση μετά την αγωγή καμπτοθεκίνης με 74,43% και 71,42% μετά από θεραπεία με 50 και 100 ng /ml καμπτοθεκίνη, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα με 62,51% στην φάση G1. Εκτός από τη σύλληψη φάση G1, καμπτοθεκίνη προκάλεσε επίσης σημαντική συσσώρευση των κυττάρων στη φάση subG1, ενδεικτική της απόπτωσης. Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (3,37%), η κατεργασία των κυττάρων με LNCaPshV καμπτοθεκίνη αυξήθηκε από 34,91% σε 50 ng /ml και 51,97% στα 100 ng /ml στη φάση υπο-G1. Ωστόσο, τα κύτταρα LNCaPshp53 ήταν πιο ανθεκτικά στην camptothechin απόπτωση που διαμεσολαβείται με 23,87% και 29,59% στα 50 ng /ml και 100 ng /ml δόσεις στη φάση subG1, σε σύγκριση με 1,71% στα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κλωνογονική δοκιμασία όπου knockdown του ρ53 είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη αντίσταση σε camptothechin μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 1Β).

ισογονικών κυττάρων με φόντο φορέα Lenti-ιού που παράγεται από μόνιμους knockdown του ρ53 σε LNCaP κυττάρων [LNCaPshp53] και επιμολύνονται με φορέα μάρτυρα, κύτταρα LNCaPshV. [Α] των κυττάρων σε επεξεργασία με 50 και 100 ng /ml καμπτοθεκίνης για συλλέχθηκαν 24 ώρες, χρωματίστηκαν με ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση της υπο-G1 και G1 πληθυσμού. [Β] Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50, 100 και 200 ​​ng /ml της καμπτοθεκίνης για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με κυανό του μεθυλενίου. Η ένταση του κυανού του μεθυλενίου παραλαμβάνεται από τα ζωντανά κύτταρα μετρήθηκε spectrophotometerically μετά έκλουση της χρωστικής σε 0.1 Ν HCl και σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. [C] εξόντωση ρ53 ρυθμίζεται αυξητικά Akt /BAD σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα λύθηκαν και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για p53, Akt, π-Akt (Ser473), BAD, π-BAD πρωτεΐνες (Ser136). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. [D] σχετικές εντάσεις των ρ-Akt και π-Bad πρωτεΐνης σε LNCaPshV και LNCaPshp53RNA κύτταρα όπου συγκροτήματα κανονικοποιήθηκαν προς ακτίνη και να εκφράζονται σε σχετικές τιμές σε σύγκριση με την φυσική πρωτεΐνη. Οι λεπτομέρειες περιγράφονται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι.

Η

εξόντωση ρ53 Αυξάνει Akt Επιβίωση μονοπάτι σηματοδότησης

Από μελέτες έχουν δείξει ότι τα ενεργοποιημένα Akt μπορεί να οδηγήσει σε ρύθμιση προς τα κάτω των επιπέδων ρ53 [27 ], είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η επίδραση της p53 νοκ ντάουν στα επίπεδα Akt και κατάντη των στόχων της. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Γ, knockdown του ρ53 προκάλεσε σημαντική αύξηση στο ρ-Akt (Ser473) και ρ-BAD (Ser136) έκφραση σε κύτταρα LNCaPshp53, σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaPshV. Ένα 2,0 φορές αύξηση σε π-Akt επίπεδα και 3.78 φορές αύξηση στην ρ-BAD επίπεδα παρατηρήθηκαν μετά ρ53 knockdown σε κύτταρα LNCaPshp53, σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaPshV (Σχήμα 1 D).

πράσινο τσάι Πολυφαινόλες επάγουν απόπτωση σε αμφότερες LNCaPshV και LNCaPshp53 κύτταρα ανεξάρτητα από την κατάσταση p53

για να χαρακτηρίσουμε την κατάσταση p53 σχετικά με την επίδραση της θεραπείας με GTP, μεταγενέστερες μελέτες διεξήχθησαν σε κύτταρα LNCaPshV και LNCaPshp53. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, ΜΤΤ δοκιμασία εκτελέστηκε μετά από 24 ώρες θεραπείας με 20-80 μg /ml συγκέντρωση του GTP εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενη αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων από 100% έως 33,98% σε LNCaPshV και 100% σε 66% σε κύτταρα LNCaPshp53. Σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaPshp53, κύτταρα LNCaPshV ήταν πιο ευαίσθητα σε GTP έκθεση στις αρχικές 24 ώρες της θεραπείας. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της περισσότερο παρατεταμένης έκθεσης σε GTP, εξαρτώμενες από το χρόνο μελέτες πραγματοποιήθηκαν με 40 μg /δόση κ.εκ. GTP. Η επεξεργασία των κυττάρων με GTP προκάλεσε αξιοσημείωτη συσσώρευση κυττάρων σε Ο0 /G1 φάση? 71,02% έως 84,57% σε κύτταρα LNCaPshV, σε σύγκριση με 78,39% έως 81,19% σε κύτταρα LNCaPshp53 μεταξύ 48-96 h, αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Ο αριθμός των κυττάρων σε subG1 επίσης αυξήθηκε σημαντικά κατά 96 h θεραπεία μετα-GTP και στις δύο γραμμές κυττάρων? 0,53% έως 66,97% σε κύτταρα LNCaPshV και 0,31% έως 83,94% σε κύτταρα LNCaPshp53, ανεξάρτητα από την κατάστασή τους ρ53 (Σχήμα 2C). θεραπεία GTP είχε επίσης ως αποτέλεσμα την απόπτωση των κυττάρων δύο LNCaPshV και LNCaPshp53 όπως παρατηρήθηκε με μικροσκοπία φωτός και δοκιμασία κατάτμησης DNA (Σχήμα 2 D & amp? Ε).

[A] Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε συγκέντρωση 20-80 μg /ml GTP για 24 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Οι βιωσιμότητες κυττάρου απεικονίζεται ως ποσοστά? κύτταρα υπό αγωγή με όχημα θεωρήθηκαν ως 100% βιώσιμα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο εκτελέστηκε εις διπλούν, **

ρ

& lt? 0.001 αντιπροσωπεύει σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία GTP. [B] κυττάρων υποβλήθηκαν σε αγωγή με 40 μg /ml GTP για 24, 48, 72 και 96 h και κατανομή των κυττάρων καταγράφηκαν σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS. [C] Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 και 80 μg GTP /ml για 96 ώρες και ο αριθμός των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση προσδιορίστηκαν με μέτρηση κυτταρικού πληθυσμού σε υπο G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο εκτελέστηκε εις διπλούν, **

ρ

& lt? 0.001 αντιπροσωπεύει σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία GTP. [D] Φως μικροσκοπικές εικόνες των κυττάρων LNCaPshV και LNCaPshp53 επεξεργασία με 40 και 80 μg /ml GTP για 96 ώρες. θεραπεία GTP παρουσιάζει μορφολογικές μεταβολές σύμφωνες με απόπτωση σε αμφότερα αυτά τα κύτταρα. [Ε] προσδιορισμό του κατακερματισμού του DNA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 μg /ml συγκέντρωση του GTP για 48 ώρες, συλλέγονται για απομόνωση DNA και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, ακολουθούμενη από οπτικοποίηση των ζωνών κάτω από υπεριώδες φως. Οι λεπτομέρειες περιγράφονται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι.

Η

Προηγουμένως αναφέρθηκε ότι σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη που περιέχει λειτουργικές ρ53, GTP συστατικό θεραπεία EGCG ρυθμίζει προς τα πάνω και ρ53 φωσφορυλίωση της για κρίσιμα υπολείμματα σερίνης και Ρ14

ARF μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των MDM2 σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. [28] Η επεξεργασία των κυττάρων με συγκεντρώσεις LNCaPshV 20-80 μg /ml του GTP επί 24 ώρες επέδειξε μία εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στη ρ21 /WAF1, Βαχ και PUMA, γνωστή κατάντη στόχοι της ρ53, ενώ δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε π-BAD και p-Akt επίπεδα. Σε κύτταρα LNCaPshp53, θεραπεία GTP επίσης κατέληξε σε μία εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στην έκφραση του p21 /WAF1, Βαχ και Puma, αν και όχι στο βαθμό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaPshV, υποδεικνύοντας τόσο ρ53-εξαρτώμενα και ρ53-ανεξάρτητη επαγωγή του προ-αποπτωτικών πρωτεΐνες σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 3Α). Μετά από θεραπεία με GTP σημαντική μείωση του Akt και BAD φωσφορυλίωσης ήταν εμφανές στα κύτταρα LNCaPshp53. Συνεπής με την απόπτωση, χρονο-εξαρτώμενη αυξήσεις διασπασμένης κασπάσης 9 και κασπάσης 3 παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β).

[A] Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20-80 μg /συγκέντρωση του GTP ml για 24 h και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για p53, Akt, π-Akt (Ser473), BAD, π-BAD, p21 /WAF1, PUMA και Bax πρωτεΐνες (Ser136). [Β] Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 40 μg /ml συγκέντρωση του GTP για 3, 6, 9, 12, 24 και 48 ώρες και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για procaspase 9, διασπασμένη κασπάση-9 και διασπασμένη κασπάση 3 πρωτεΐνες. Ένα τυπικό κηλίδα ακτίνη δείχνει εσωτερικού ελέγχου φόρτωσης. Το κυτόχρωμα c απελευθέρωση από μιτοχόνδρια προς κυτοσόλιο προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western σε GTP επεξεργασμένα κύτταρα. Ένα τυπικό κηλίδα ακτίνη δείχνει εσωτερικού ελέγχου φόρτωσης για κυτταρόπλασμα ενώ VDAC ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης για μιτοχόνδρια. [D] Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ συγκέντρωση της ΡΙ3Κ-Akt αναστολέα LY294002 για 8 ώρες και με 40 μg GTP /ml για 16 ώρες μόνα τους, ή LY294002 για 8 ώρες ακολουθούμενη από επεξεργασία GTP σε συνδυασμό ακολουθείται από κηλίδωση Western για ρ-Akt , Akt, π-BAD και BAD πρωτεΐνες. Οι εκφράσεις φυσικών πρωτεϊνών θεωρήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης. [D] μέτρηση κυτταρικός θάνατος έγινε με φωτομετρική ανοσοδοκιμασία ενζύμου τηλέφωνα κιτ Θάνατος Ανίχνευση ELISA. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα κάθε πραγματοποιήθηκε εις διπλούν, **

σ

& lt? 0.001 αντιπροσωπεύει σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. [Ε] Φως μικροσκοπικές εικόνες των κυττάρων LNCaPshV και LNCaPshp53 κατεργάζεται με LY294002 και GTP μόνα τους ή σε συνδυασμό. Οι λεπτομέρειες περιγράφονται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι.

Η

Στη συνέχεια, αναλύσαμε τις επιπτώσεις της έκθεσης GTP στην κατάντη μονοπάτι αποπτωτικό, συγκεκριμένα, οι τελεστές της μιτοχονδριακής καταρράκτη θάνατο, αξιολογώντας την απελευθέρωση κυτοχρώματος Ο στο κυτταρόπλασμα. Θεραπεία των κυττάρων LNCaPshV και LNCaPshp53 με GTP αυξηθεί σημαντικά τα επίπεδα του κυτοχρώματος C στο κυτταρόπλασμα που κορυφώθηκε σε 12 ώρες μετά την έκθεση-GTP. Η μετατόπιση του κυτοχρώματος Ο από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο παρατηρήθηκε και στις δύο κυτταρικές γραμμές σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 3Β).

πράσινο τσάι Πολυφαινόλες Αναστέλλουν Akt φωσφορυλίωση και Ser473 μεταγενέστεροι στόχοι στην LNCaPshp53 Κύτταρα

Νωρίτερα αποδείξαμε ότι η ρ53 knockdown οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του Akt και αυξημένη φωσφορυλίωση της σε Ser473. Στη συνέχεια κατεργάζεται αμφότερες τις κυτταρικές σειρές με GTP και /ή LY294002, ένας ειδικός αναστολέας ΡΙ3Κ-Akt. Η φωσφορυλίωση των Ser473 και T308 ενεργοποιεί Akt να φωσφορυλιώνει πρωτεΐνες-στόχους μέσω της δράσης της κινάσης της να προάγει την επιβίωση και αναστέλλουν την απόπτωση [29]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3C & amp? D, η θεραπεία των κυττάρων με LY249002 προκάλεσε μείωση ρ-Akt επίπεδα και είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, αν και η έκταση της απόπτωσης ήταν υψηλότερη σε κύτταρα LNCaPshp53. Ομοίως, η θεραπεία GTP ανέστειλε Akt φωσφορυλίωση στη Ser473, το οποίο ήταν σύμφωνο με αυξημένη απόπτωση, και συνδυασμένη θεραπεία με GTP και LY294002 οδήγησε σε ένα ακόμη υψηλότερο επίπεδο του κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα LNCaPshp53 παρά σε κύτταρα LNCaPshV. Συνέπεια, η φωσφορυλίωση του BAD μειώθηκε σημαντικά, ως αποτέλεσμα της μειωμένης φωσφορυλίωσης της δραστηριότητας της κινάσης της Akt από LY294002 και GTP? Αυτό συσχετίζεται με αυξημένη ταυτοχρόνως κυτταρικό θάνατο των κυττάρων LNCaPshp53. Παρόμοια αποτελέσματα του μικρότερου μεγέθους παρατηρήθηκαν σε κύτταρα LNCaPshV (Σχήμα 3 D & amp? Ε). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι αν και το μέγεθος του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την έκθεση GTP είναι παρόμοια και στις δύο κυτταρικές σειρές, οι οδοί που οδηγούν σε απόπτωση είναι διαφορετικά και μπορεί να επηρεάζεται από την κατάσταση της ρ53.

πράσινο τσάι Πολυφαινόλες επάγουν την Receptor Death μονοπάτι σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη

για να διερευνήσει πιθανούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην GTP-επαγόμενη απόπτωση, είμαστε δίπλα επικεντρώθηκε στην εξωγενή οδό μέσω της FAS. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Α, η θεραπεία με GTP προκάλεσε επαγωγή της FAS εντός 10 λεπτών σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, ακολουθούμενα από τα αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης FADD σε Ser194, ενώ συνολικά επίπεδα FADD παρέμεινε αμετάβλητη. Ωστόσο, τα βασικά επίπεδα της FADD ήταν πολύ υψηλότερες σε κύτταρα LNCaPshp53 σε σύγκριση με κύτταρα LNCaPshV. Αναζητώντας τα ανάντη τελεστές της FAS αυξορρύθμιση αποκάλυψε ότι JNK ενεργοποιήθηκε με GTP, όπως ήταν προφανές από την αύξηση της ρ-JNK κατάστασης.