Αφηρημένο

Ιστορικό

Η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (IBD) αυξάνει τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου. Προβιοτικά βακτήρια παράγουν ανοσορυθμιστική μεταβολίτες

in vitro

όπως συζευγμένο λινολεϊκό οξύ (CLA), ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ με ισχυρή αντι-καρκινογόνες επιδράσεις. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τις κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αποτελεσματικότητα των προβιοτικών βακτηρίων σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Οι μηχανισμοί του ανοσοποιητικού διαμορφωτικό του VSL # 3 προβιοτικά βακτήρια και CLA ερευνήθηκαν σε μοντέλα ποντικών της φλεγμονής με γνώμονα ορθοκολικό καρκίνο. Παχέος δείγματα συλλέχθηκαν για ιστοπαθολογία, η γονιδιακή έκφραση και κυτταρομετρία ροής αναλύσεις. Immune υποσύνολα κυττάρων στους μεσεντέριους λεμφαδένες (MLN), σπλήνα και του παχέος υμένα λεμφοκύτταρα (LPL) έχουν φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηριστεί. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με CLA ή VSL # 3 ανακτάται ταχύτερα από την οξεία φλεγμονώδη φάση της ασθένειας και είχαν μικρότερη βαρύτητα της νόσου στη χρόνια φάση που φέρει τον όγκο της ασθένειας. Αδενώματος και αδενοκαρκινώματος σχηματισμός επίσης μειώθηκε και από τις δύο θεραπείες. VSL # 3 αύξησε την έκφραση mRNA του ΤΝΡ-α, αγγειοστατίνη και γ PPAR ενώ CLA μειωμένα επίπεδα COX-2. Επιπλέον, VSL # 3 ποντίκια με αγωγή είχε αυξηθεί IL-17 έκφραση σε MLN CD4 + Τ κύτταρα και η συσσώρευση των Treg LPL και της μνήμης CD4 + Τ κύτταρα.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Τόσο CLA και VSL # 3 καταστέλλεται καρκινογένεση του παχέος εντέρου, αν και VSL # 3 έδειξαν μεγαλύτερη αντι-καρκινογόνες και αντι-φλεγμονώδεις δραστηριότητες από CLA. Μηχανιστικά, CLA διαμορφωμένο έκφραση της COX-2 επιπέδων στο βλεννογόνο του κόλου, ενώ οι απαντήσεις VSL # 3 στοχευμένες ρυθμιστικές βλεννογόνου CD4 + Τ κυττάρων

Παράθεση:. Bassaganya-Riera J, Viladomiu Μ, Pedragosa Μ, De Simone C, Hontecillas Ε (2012) Ανοσορυθμιστικές μηχανισμών που διέπουν την πρόληψη της κολίτιδας-Associated Καρκίνος του παχέος εντέρου από τα προβιοτικά βακτήρια. PLoS ONE 7 (4): e34676. doi: 10.1371 /journal.pone.0034676

Επιμέλεια: Τζωρτζίνα Λ Κρατήστε, Πανεπιστήμιο του Αμπερντίν, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 20η Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 6 Μάρτη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 12 Απριλίου, 2012

Copyright: © 2012 Bassaganya-Riera et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Josep Bassaganya-Riera είναι μέλος του διοικητικού συμβουλίου συντακτικής PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος του στις Ηνωμένες Πολιτείες [ ,,,0],1]. Εκτιμάται ότι 50.000 θάνατοι που αποδίδονται στο CRC σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο [2]. Μαζί με τα κληρονομικά σύνδρομα του οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση και κληρονομικά μη-πολυποειδούς, φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD) είναι μεταξύ των τριών πρώτων συνθήκες υψηλού κινδύνου για CRC [3]. Μεταξύ ελκώδη κολίτιδα (UC) ασθενείς, ο ένας από τους δύο κύριους εκδηλώσεις της IBD, ο σχετικός κίνδυνος ανάπτυξης CRC συσχετίζεται με την έκταση και τη διάρκεια της ασθένειας [3], [4]. Σε ασθενείς με ΙΦΝΕ, ο κίνδυνος αυτός αυξάνεται κατά 0,5-1,0% ετησίως μετά από 8-10 ετών [5].

Το ανθρώπινο μικροχλωρίδας του εντέρου, η οποία περιέχει περίπου 100 τρισεκατομμύρια μικροβιακών οργανισμών, διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της υγείας υποδοχής , τόσο στο γαστρεντερικό σωλήνα και συστημικά μέσω της απορρόφησης των μεταβολιτών (π.χ. βιταμίνες και βραχείας αλύσου λιπαρά οξέα) [6]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι συγκεκριμένες στελέχη βακτηριδίων εμπλέκεται στη ρύθμιση της εντερικής ομοιόστασης, παρέχοντας ρυθμιστικά σήματα στο επιθήλιο, το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου και στην νευρομυϊκή δραστηριότητα του εντέρου [7], [8]. Επιπλέον, ορισμένες συμβιωτικά και παθογόνους οργανισμούς της ανθρώπινης εντερικής microbiome είναι απαραίτητα στην παθογένεση της IBD και CRC. Ως εκ τούτου, χειραγωγώντας το έντερο βακτηριακή σύνθεση και την τοπική παραγωγή μεταβολίτη με τη χρήση προβιοτικών βακτηρίων έχει διερευνηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη λεωφόρος για θεραπευτική παρέμβαση κατά της CRC. Τα προβιοτικά είναι ζωντανά συμπληρώματα μικροβιακή ζωοτροφών που ευεργετικά επιπτώσεις στην υγεία του ξενιστή. Επικαλούνται την εισαγωγή συγκεκριμένα εξωγενή στελέχη στην εντερική μικροχλωρίδα [8], [9]. Τα στελέχη αυτά επιλέγονται συχνά για συγκεκριμένες ευεργετικές δραστηριότητες, όπως η παραγωγή λιπιδίων όπως το συζευγμένο λινελαϊκό οξύ (CLA) και συζευγμένα ισομερή λινολεϊκού οξέος (CLNA) [10], [11]. Αυτά τα λιπίδια ποικίλουν σε χημική δομή από σύντομη λιπαρά οξέα όπως προπιονικό, οξικό και βουτυρικό να πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) και εμπλέκονται στη ρύθμιση της απόπτωσης και την ανοσολογική απόκριση [10], [12] – [14].

μια προβολή της 36 διαφορετικά στελέχη Bifidobacterium για την ικανότητά τους να παράγουν CLA από το ελεύθερο λινελαϊκό οξύ και CLNA από άλφα-λινολενικό οξύ (LNA) αποκαλύπτει ότι έξι στελέχη (τέσσερα

Bifidobacterium breve

στελέχη, ένα

Β . bifidum

στέλεχος και ένα

Β. pseudolongum

στέλεχος) είναι σε θέση να παράγουν διαφορετικές CLA και CLNA ισομερή

in vitro

[15]. Άλλοι έχουν δείξει ότι τα προβιοτικά βακτήρια μπορούν να συνθέσουν CLA [16] – [18]. CLA-βακτηριακών στελεχών που παράγουν μπορεί να βρεθεί σε ένα εμπορικά διαθέσιμο προβιοτικό σκεύασμα γνωστό ως VSL # 3. Αυτό το προϊόν αποτελείται από τέσσερα στελέχη γαλακτοβακίλλων (

Lactobacillus casei

,

L. Plantarum

,

L. Bulgaricus

, και

L. Acidophilus

) , τρία στελέχη του bifidobacteria (

Bifidobacterium longum

,

Β. breve

,

και B. infantis

) και

Streptococcus thermophilus

. Πρόσφατα, έχουμε αποδείξει ότι VSL # 3 προβιοτικά βακτήρια παράγουν CLA σε τοπικό επίπεδο ότι οι στόχοι περοξειζόμης μακροφάγων που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή υποδοχέας (PPAR) γ να καταστείλει κολίτιδα [19]. Επιπλέον, VSL # 3 μπορεί να παίζει καίριο ρόλο στη διατήρηση της εντερική μικροβιακή ισορροπία με σύνθεση αντιβακτηριακές ουσίες όπως λαντιβιοτικά [20], καθώς και άλλες βακτηριοσίνη σαν ενώσεις [21]. Επιπλέον, VSL θεραπεία # 3 συνδέεται με μία ρύθμιση προς τα κάτω του ενεργοποιημένα με LPS παραγωγής IL-8 και κατέστειλε την έκκριση του TNF-α και IFN-γ [22]. Αυτές οι ανοσορυθμιστικές δράσεις είναι συνεπείς με την ενεργοποίηση του PPAR γ από τους μικροχλωρίδας του εντέρου ακόλουθες VSL # 3 προβιοτικά θεραπεία. Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η ικανότητα των VSL # 3 βακτήρια να διαμορφώνουν βλεννογόνου ανοσολογικές αποκρίσεις και έτσι να βελτιώσει παχέος καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

διαδικασίες των ζώων και πειραματικές δίαιτες

C57BL /6 ποντίκια άγριου τύπου (n = 60) χρησιμοποιήθηκαν για DSS επαγόμενη μελέτη CRC. Σε μια μελέτη παρακολούθησης, χρησιμοποιήσαμε επίσης IL-10 με ανεπάρκεια (IL-10 – /-) και άγριου τύπου ποντικοί σε μία /SvEv φόντο 129 (n = 60). Για κάθε πείραμα, οι ποντικοί τράφηκαν με καθαρισμένο ΑΙΝ-93g τρωκτικό δίαιτες (Πίνακας S1) με ή χωρίς 1% CLA για 24 ημέρες πριν την επαγωγή του καρκίνου που σχετίζονται με φλεγμονή, κατά την οποία όλες οι απαιτήσεις όπου επιτυγχάνεται ή υπερβαίνεται. Το συμπλήρωμα CLA χορηγείται περιείχε ένα μείγμα 50:50 το

cis

-9,

trans

-11 CLA και

trans

-10,

cis

-12 ισομερή (Clarinol, Loders Croklaan BV).

Ηθική Δήλωση

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των ζώων και Χρήση Επιτροπή Virginia Tech Θεσμικών (IACUC) και συνάντησε ή υπέρβαση απαιτήσεις της Υπηρεσία Δημόσιας Υγείας /Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας και την Πράξη καλή μεταχείριση των ζώων.

Στοματική θεραπεία με προβιοτικά βακτήρια

Για κάθε πείραμα, περίπου το ήμισυ των ποντικών έλαβε 0,5 mL του VSL # 3 προβιοτικά λύση καθημερινά από orogastric διασωλήνωση χρησιμοποιώντας βελόνα μπάλα άκρη καθετήρα. Το προβιοτικό διάλυμα παρασκευάζεται καθημερινά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) σε ρΗ 7,1 σε στείρες συνθήκες σε μια τελική συγκέντρωση του 0,0072 g VSL # 3 /mL, που αντιστοιχεί σε 1,2 δισεκατομμύρια βακτήρια ανά ποντικό /ημέρα, μια δόση που έχει δείξει αποτελεσματικότητα σε αποικισμό του παχέος εντέρου και τελικό ειλεό [23], [24]. Περαιτέρω, αυτή η δόση είναι βιολογικώς σχετικό αφού βασίζεται σε μια ημερήσια πρόσληψη περίπου 3600 δισεκατομμύρια βακτηρίδια για έναν ενήλικο άνθρωπο βάρους 70 kg. VSL # 3 είναι ένα εμπορικό προβιοτικό μείγμα αποτελούμενο από τέσσερα στελέχη γαλακτοβακίλλων (

Lactobacillus casei

,

L. Plantarum

,

L. Bulgaricus

, και

L. acidophilus

), τρία στελέχη του bifidobacteria (

Bifidobacterium longum, Β breve και Β infantis

) και

Streptococcus thermophilus

.

πρόκληση καρκίνου του παχέος

Ένα προηγουμένως καθιερωμένο πρωτόκολλο ακολουθήθηκε για να προκαλέσει χημικά φλεγμονή γνώμονα CRC [25], [26]. ποντίκια άγριου τύπου προκλήθηκαν με αζοξυμεθάνιο (10 mg /kg) επί εβδομάδες 6 της μελέτης, ακολουθούμενη από μια 2.0% θειικού νατρίου δεξτράνης (DSS) κατεργασία στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες που ξεκινούν την εβδομάδα 7. IL-10 με ανεπάρκεια 129 /ποντίκια SvEv προκλήθηκαν με μία μόνο δόση των 5 × 10

7 cfu

Helicobacter typhlonius

από του στόματος καθετηριασμό για να επιταχύνει την καρκινογένεση κόλον όπως φαίνεται προηγουμένως [27]. Νόσος δείκτες δραστηριότητας και του ορθού βαθμολογίες αιμορραγίας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μία τροποποίηση ενός προηγουμένως δημοσιευμένου επιδεινώνεται βαθμολογίας [28]. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία κατά τη στιγμή του σχηματισμού του όγκου, που αντιστοιχούν σε ημέρες 68 (C57BL /6 στέλεχος) ή 18 ημέρες μετά τη μόλυνση με

H. typhlonius

(129 /SvEv στέλεχος).

Ιστοπαθολογία

Παχέος τομές σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη ουδέτερου, αργότερα ενσωματωμένο σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και έπειτα (6 μm) και χρωματίστηκαν με H & amp? Ε για ιστολογική εξέταση. διαφάνειες ιστού εξετάστηκαν σε ένα μικροσκόπιο Olympus (Olympus America Inc., Dulles, VA). Άνω και κάτω τελεία βαθμολογήθηκαν για διήθηση λευκοκυττάρων, επιθηλιακά διάβρωση, βλεννογόνου πάχος, αδενοκαρκινώματα και αδενωμάτων.

απομόνωση RNA και σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης κυτοκινών

Ολικό RNA από κόλον απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNA Qiagen κιτ απομόνωσης (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το εκμαγείο cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης iScript cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA) και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12] .

ανοσοφαινοτυπική

σπλήνα και μεσεντερικοί λεμφαδένες (MLN) αποκόπηκαν και μονοκύτταροι εναιωρήματα ιστών επαναιωρήθηκαν σε PBS και απαριθμήθηκαν με την Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA). δείγματα του παχέος εντέρου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για lamina propria λεμφοκυττάρων (LPL) απομόνωση. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα (6 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες, φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C στις 3000 rpm για 3 λεπτά, και πλύθηκαν με PBS που περιέχει 5% ορό και 0,09% νατραζίδιο (ρυθμιστικό FACS). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για μακροφάγων εκτίμηση με συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα πρωτογενή αντισώματα προς κύτταρο και μακροφάγων δεικτών Τ.

Στατιστική ανάλυση

Για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας του μοντέλου, ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ήταν εκτελούνται χρησιμοποιώντας το γενικό γραμμικό μοντέλο διαδικασία του λογισμικού Στατιστικής Ανάλυσης (SAS), και την αξία πιθανότητας (

P

) & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όταν το μοντέλο ήταν σημαντική, ANOVA ακολούθησε Προστατευόμενη λιγότερο σημαντική διαφορά μέθοδο των πολλαπλών σύγκριση του Fisher.

Αποτελέσματα

VSL # 3 και της ενεργότητας της νόσου βελτιώνουν τα CLA σε ποντίκια με CRC

και στα δύο μοντέλα, VSL # 3 και CLA θεραπείες μειωμένη βαθμολογίες δραστηριότητας της νόσου που σχετίζεται με κολίτιδα σχετιζόμενη CRC σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία. Στην αζοξυμεθάνιο επαγόμενης μοντέλο CRC, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με είτε CLA ή VSL # 3 ανακτάται ταχύτερα από την οξεία φλεγμονώδη φάση της ασθένειας (ημέρα 1-26) και είχε χαμηλότερη σοβαρότητα της νόσου στη χρόνια φάση που φέρει όγκο της νόσου (ημέρα 63 -68). Συνολικά, VSL # 3 μεταχείριση προβιοτικά βακτήρια ήταν πιο αποτελεσματικό από CLA στη μείωση της φλεγμονής και η μείωση της δραστηριότητας της νόσου και στα δύο μοντέλα (Σχήμα 1Α και το Σχήμα 2Α). Σύμφωνα με αυτά τα κλινικά ευρήματα, VSL # 3 και CLA βελτιώνονται σημαντικά ακαθάριστα παθολογίας στο παχύ έντερο, σπλήνα και ΜΙΝ σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου ανεπεξέργαστα στην αζοξυμεθάνιο που προκαλείται CRC (Εικόνα 1Β-C). Στο IL10 – /- μοντέλο, το προβιοτικό μείγμα VSL # 3 αλλά δεν CLA μειώθηκε βλάβες που σχετίζονται με φλεγμονή στο ΕΚΑΤ, του παχέος εντέρου και του σπλήνα του

H. typhlonius

μολυσμένα ποντίκια σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2Β-D).

C57BL /6J ποντικών (η = 60) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το VSL # 3 προβιοτικά (n = 20), CLA- συμπληρωμένο (1 g /100 g) (n = 20) ή δίαιτες ελέγχου (n = 20) για 32 ημέρες και προκλήθηκαν ip με αζοξυμεθάνιο (10 mg /kg), ακολουθούμενη από 2% θειικού νατρίου δεξτράνης (DSS) στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες για την επαγωγή κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος (CRC). Ο δείκτης δραστηριότητας της νόσου, μια σύνθετη βαθμολογία αντικατοπτρίζει τα κλινικά συμπτώματα της νόσου (δηλαδή περιπρωκτική ακαθαρσίες, πρωκτική αιμορραγία, διάρροια, και ανόρθωση των τριχών) εκτιμήθηκε καθημερινά για τα ποντίκια που υποβάλλονται στην πρόκληση DSS (Α). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 68. Colon και μεσεντερικοί λεμφαδένες (ΜΙΝ) (Β & amp? C) ήταν μακροσκοπικά σκόραρε για τη φλεγμονή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Σημεία με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

Βακτηριακές-free 129 /SvEv και IL-10 γονίδιο ανεπάρκεια (IL- 10 – /-) 129 /SvEv ποντικοί σε μία /SvEv φόντο 129 (n = 60) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το VSL # 3 προβιοτικά (n = 20), CLA-συμπληρωμένο (1 g /100 g) (n = 20) ή δίαιτες ελέγχου (n = 20) για 32 ημέρες και στη συνέχεια μολύνθηκαν με

H. typhlonius

προκειμένου να αναπτυχθεί πειραματικά καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέονται με κολίτιδα. Ο δείκτης δραστηριότητας της νόσου, μια σύνθετη βαθμολογία αντικατοπτρίζει κλινικά συμπτώματα της νόσου, αξιολογήθηκε καθημερινά για ποντίκια που υποβάλλονται σε πρόκληση DSS (Α). Του παχέος εντέρου, σπλήνα και μεσεντερικοί λεμφαδένες (ΜΙΝ) (Β-Δ) έχουν μακροσκοπικά σκόραρε για τη φλεγμονή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Σημεία με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

VSL # 3 και CLA πρόληψη του παχέος ιστολογικές αλλοιώσεις σε ποντίκια με CRC

Όσον αφορά την αζοξυμεθάνιο /DSS μοντέλο κολίτιδας που σχετίζεται με CRC, θεραπεία CLA, αλλά όχι VSL χορήγηση # 3, μειωμένη διήθηση λευκοκυττάρων και του κόλου πάχος του βλεννογόνου (Σχήμα 3 Α & amp? Β). Είναι ενδιαφέρον, VSL # 3 ήταν πιο αποτελεσματικό από το CLA στη μείωση διείσδυση λευκοκυττάρων στο πάχος του βλεννογόνου σε IL-10 – /- ποντίκια μολυσμένα με

H. (Amp Σχήμα 4 A &? Β) typhlonius

. Επιπλέον, και οι δύο VSL # 3 και CLA θεραπείες μειωθεί αδενώματος και αδενοκαρκινώματος του σχηματισμού σε σύγκριση με τον έλεγχο. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν συνεπή και για τα δύο μοντέλα CRC (Εικόνα 3 C & amp? Α και το Σχήμα 4 C & amp? D).

C57BL /6J ποντικών (η = 60) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το VSL # 3 προβιοτικά (n = 20) , CLA-συμπληρωμένο (1 g /100 g) (n = 20) ή με έλεγχο δίαιτες (n = 20) για 32 ημέρες και προκλήθηκαν ip με αζοξυμεθάνιο (10 mg /kg), ακολουθούμενη από 2% θειικού νατρίου δεξτράνης (DSS) στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες για την επαγωγή κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος (CRC). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 68. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ιστολογική εξέταση τυφλωμένη και βαθμολογήθηκαν 1-4 επί διείσδυση λευκοκυττάρων (Α), και πάχυνση του βλεννογόνου τοιχώματος (Β), τα αδενοκαρκινώματα (C) και αδενώματα (D). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Σημεία με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

Βακτηριακές-free 129 /SvEv και IL-10 γονίδιο ανεπάρκεια (IL- 10 – /-) 129 /SvEv ποντικοί σε μία /SvEv φόντο 129 (n = 60) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το VSL # 3 προβιοτικά (n = 20), CLA-συμπληρωμένο (1 g /100 g) (n = 20) ή δίαιτες ελέγχου (n = 20) για 32 ημέρες και στη συνέχεια μολύνθηκαν με

H. typhlonius

προκειμένου να αναπτυχθεί πειραματικά καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέονται με κολίτιδα. Μετά την νεκροψία, όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ιστολογική εξέταση τυφλωμένη και βαθμολογήθηκαν 1-4 επί πύκνωση του βλεννογόνου τοιχώματος (Α), διήθηση λευκοκυττάρων (Β), αδενώματα (C) και αδενοκαρκινώματα (D). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Σημεία με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

VSL # 3 και CLA ρυθμίζουν την έκφραση του παχέος φλεγμονωδών και καρκινογένεση δείκτες

Ποντίκια προκλήθηκαν με αζοξυμεθάνιο και DSS υποβλήθηκαν σε ευθανασία κατά τη φάση που φέρει όγκο της νόσου. Εκείνοι οι ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με είτε CLA ή VSL # 3 έδειξαν αυξημένη έκφραση mRNA του CD36 και PPAR γ. στο κόλον (Σχήμα 5 Α & amp? C). Επιπλέον, από του στόματος χορήγηση CLA σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται κολονικής έκφραση COX-2 (Σχήμα 5Β), ενώ VSL # 3 μεταχείριση ρυθμίζεται αυξητικά τα επίπεδα mRNA αγγειοστατίνης στο περιφερικό κόλον (Σχήμα 5D), ένα πρωτεολυτικό θραύσμα του πλασμινογόνου με αντι-αγγειογενετική δράση σε ποντίκια με CRC. Τέλος, μια προς τα άνω ρύθμιση του κόλου ΤΝΡ-α βρέθηκε σε CLA και VSL # 3 ποντίκια με αγωγή σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου χωρίς αγωγή (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

C57BL /6J ποντικών (η = 60) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το VSL # 3 προβιοτικά (n = 20), CLA-συμπληρωμένο (1 g /100 g) (n = 20) ή δίαιτες ελέγχου (n = 20) για 32 ημέρες και προκλήθηκαν ip με αζοξυμεθάνιο (10 mg /kg), ακολουθούμενη από 2% θειικού νατρίου δεξτράνης (DSS) στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες για την επαγωγή κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος (CRC). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 68. Η έκφραση του CD36 (Α), της κυκλοοξυγενάσης 2 (COX2) (Β), περοξυσώματος γ υποδοχέα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΚ γ) (C) και αγγειοστατίνη (D) εκτιμήθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Σημεία με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

VSL # 3 και CLA Modulate φαινότυπο και παραγωγή κυτοκινών των μακροφάγων και των CD4 + T κυττάρων υποσύνολα στο MLN και του κόλου LP

Εκείνοι υγιή ποντίκια που έλαβαν VSL # 3 είχε μεγαλύτερη ποσοστά IL-17 που εκφράζουν CD4 + Τ κυττάρων σε MLN σε σύγκριση με την χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6Α). Ομοίως, η θεραπεία CLA αύξησε τον πληθυσμό της IL-17 που εκφράζουν CD4 + Τ κυττάρων στη σπλήνα και των δύο υγιείς και CRC ποντικούς (Σχήμα 6Β). Μεγαλύτερη ποσοστά των CD4

+ FoxP3

+ και CD4

+ CD44

+ CD62L

+ LP Τ κύτταρα, που αντιστοιχούν σε βλεννώδεις ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg) και CD4

+ Τ μνήμης κύτταρα αντίστοιχα, βρέθηκαν σε VSL # ποντίκια 3-αγωγή (Σχήμα 6C & amp? D).

C57BL /6J ποντικών (η = 60) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το VSL # 3 προβιοτικά (n = 20), CLA- συμπληρωμένο (1 g /100 g) (n = 20) ή δίαιτες ελέγχου (n = 20) για 32 ημέρες και προκλήθηκαν ip με αζοξυμεθάνιο (10 mg /kg), ακολουθούμενη από 2% θειικού νατρίου δεξτράνης (DSS) στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες για την επαγωγή κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος (CRC). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 68. MLN (A-C), σπλήνα (D) και LPL (Ε-Ρ) από ποντίκια άγριου τύπου για τον εντοπισμό του ανοσοφαινότυπου ανοσοκύτταρα υποσύνολα με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Σημεία με αστερίσκο είναι σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Χρόνια εντερική φλεγμονή που συμβαίνουν σε IBD προκαλεί επίμονη βλάβη και αυξημένη διαπερατότητα του βλεννογόνου κατά μήκος της γαστρεντερικής οδού, παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) [29]. Χειρισμός κολικά βακτήρια με προβιοτικά έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική στην ρύθμιση της ομοιόστασης του εντέρου εν μέρει μέσω της παραγωγής των βακτηριακών μεταβολιτών [30]. VSL # 3 προβιοτικά βακτήρια μπορούν να παράγουν CLA τοπικά στο έντερο, μία ένωση η οποία κάτω διαμορφώνει φλεγμονώδεις αποκρίσεις ενεργοποιώντας PPAR γ [31]. Επιπλέον, CLA παρεμποδίζει ή καλυτερεύει πειραματικές IBD σε ποντικούς και χοίρους [12], [13], [32]. Επιπλέον, PPAR αγωνιστές γ έχουν δείξει κλινική αποτελεσματικότητα κατά της ανθρώπινης UC [33], [34]. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι το προβιοτικό μείγμα VSL # 3 καταστέλλει εντερική φλεγμονή με την παραγωγή CLA τοπικά στο κόλον και ενεργοποίηση PPAR γ σε μακροφάγα [19]. Αυτή η μελέτη προσπάθησε να ερευνήσει τους μηχανισμούς της CLA και VSL # 3 σε μοντέλα ποντικών της κολίτιδας που σχετίζεται με CRC.

Η κλινική απόκριση στο μοντέλο /DSS ΑΟΜ είχε δικόρυφη κατανομή στην οποία η πρώτη κορυφή αντιστοιχούσε σε οξεία φλεγμονή λόγω της πρόκλησης DSS που ακολουθείται από μια περίοδο κλινική ανάρρωση χαρακτηρίζονται από χαμηλότερη χρόνια φλεγμονή. Η δεύτερη κορυφή της ασθένειας εμφανίστηκε στις ημέρες 48 που αντιστοιχεί στο σχηματισμό όγκων. Αυτό το πρότυπο είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών από την ομάδα μας, η οποία χαρακτηρίζεται από τις αντι-καρκινογόνες ιδιότητες του CLA [25]. CLA και VSL # 3 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή έδειξαν επίσης χαμηλότερο μακροσκοπικές βλάβες που σχετίζονται με φλεγμονή και σημαντικά βελτιωμένη κολική ιστοπαθολογία και στα δύο πειραματικά μοντέλα. Παρ ‘όλα αυτά, ενώ VSL # 3 ήταν η ένωση που εμπόδισε τον πλέον αποτελεσματικό τρόπο το σχηματισμό όγκου, αυτό δεν εμπόδισε τη διήθηση λευκοκυττάρων σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες στο μοντέλο καρκίνου του παχέος αζοξυμεθάνιο επαγόμενη, υποδηλώνοντας ένα πιθανό ρόλο των διηθητικών λευκοκυττάρων στα αντι-καρκινογόνες δράσεις του VSL # 3. Σε μια μελέτη παρακολούθησης, χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό μοντέλο κολίτιδας που σχετίζεται παχέος καρκινογένεση, IL-10 – /- ποντίκια σε ένα υπόβαθρο 129 /SvEv μολύνθηκαν με

H. typhlonius

, επιταχύνοντας έτσι την παχέος εντέρου φλεγμονή που η IL10 – /- αναπτύσσονται αυθόρμητα και την προώθηση του παχέος καρκινογένεση [27]. Σε αυτό το μοντέλο, τόσο VSL # 3 και CLA βελτιώνονται βαρύτητα της νόσου, αλλά μόνο το προβιοτικό μείγμα ήταν αποτελεσματική στη μείωση της φλεγμονής βλάβες που σχετίζονται με MLN, σπλήνα και του παχέος εντέρου. Αυτή η συνέπεια των αποτελεσμάτων σε δύο μοντέλα αποδεικνύει ότι η αποτελεσματικότητα του VSL # 3 για την αποκατάσταση του βλεννογόνου ομοιόσταση και εξασθένηση κολίτιδα σχετιζόμενη CRC δεν είναι εξαρτώμενες από το μοντέλο.

έκφραση γονιδίων μας αναλύσεις έδειξαν μια ρύθμιση προς τα πάνω του κόλου ΤΝΡ-α σε CLA και VSL # 3 ποντίκια με αγωγή σε σύγκριση με την χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου, η οποία μπορεί να είναι ενδεικτική ανοσοδιέγερση και την ενίσχυση της επιθηλιακής ικανότητα επούλωσης. Πιο συγκεκριμένα, ο TNF-α ασκεί ισχυρή αντικαρκινική δράση διεγείροντας ανοσοαποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένων αυξορρύθμιση των αντιγόνων ανθρώπινου αντιγόνου λευκοκυττάρων σε κυττάρου όγκου επιφάνειες [35], ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα [36] διέγερση κυτταροτοξικών Τ κυττάρων και φυσικών κυττάρων φονέων (ΝΚ) [37] – [40], καθώς και τα επιθηλιακά επούλωση [41]. Επιπλέον, τα ποντίκια CLA-αγωγή παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), ένα ένζυμο που εμπλέκεται στην αλληλουχία του αραχιδονικού οξέος και προσταγλανδίνης μεσολάβηση φλεγμονής. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τις κατασταλτικές επιδράσεις του CLA στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου λόγω αλλαγών σε αυτό το καταρράκτη και στην ενεργοποίηση του PPAR γ, και οι δύο μηχανισμοί που αφορούν την αναστολή της έκφρασης COX-2 και επάγει απόπτωση [42], [43]. Τα επίπεδα αγγειοστατίνης, ένα πρωτεολυτικό θραύσμα του πλασμινογόνου και μια ενδογενής αναστολέας αγγειογένεσης [44], ήταν μεγαλύτερο στην ομάδα VSL # 3 σε σύγκριση με τον έλεγχο τρέφονται ποντίκια, δείχνοντας ότι τα αντι-καρκινογόνο δράση του VSL # 3 μπορεί να διαμεσολαβείται, εν μέρει, από καταστέλλεται αγγειογένεση. Όπως φαίνεται σε προηγούμενες μελέτες [45], [46], αυτή η ανασταλτική συμπεριφορά της αγγειοστατίνης στην αγγειογένεση μπορεί να σχετίζεται έμμεσα με αντι-καρκινογόνες αποτελεσματικότητα. Τα ευρήματά μας επεκτείνουν τα ευρήματα μιας πρόσφατης έκθεσης καταδεικνύουν ότι τα προβιοτικά VSL # 3 μπορεί να μετριάσει χρόνιας φλεγμονής σε αρουραίους, η καθυστέρηση της μετάβασης από φλεγμονή σε δυσπλασία και καρκίνο [47].

Η ικανότητα της VSL # 3 και CLA για να ρυθμίζουν ανοσοαποκρίσεις και την πρόληψη CRC εκτιμήθηκε επίσης με την εξέταση της κατανομής των υποσυνόλων ανοσοκυττάρων στο βλεννογόνο του κόλου και συστημικά. VSL # 3 θεραπεία ενισχυμένης τα ποσοστά των IL-17 που εκφράζουν CD4 + Τ κυττάρων στο βλεννογόνου επαγωγική τοποθεσία (δηλαδή, MLN) και Foxp3 εκφράζουν CD4 + Τ κύτταρα στην περιοχή τελεστή σε ποντικούς με CRC, υποδηλώνοντας ένα πιθανό ρόλο στη διαμόρφωση της πλαστικότητας μεταξύ Th17 και Treg στο ΕΚΑΤ και παχέος LP. Τα αποτελέσματα από μια πρόσφατη μελέτη που προσδιορίζονται κατά διαστήματα νηματοειδών βακτηρίων στο συμβιωτικό μικροχλωρίδα του εντέρου ως επαγωγείς της πόλωσης Th17 στο βλεννογόνο του εντέρου [48]. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι οι αλλαγές στη σύνθεση του microbiome παχέος εντέρου που προκαλούνται από προβιοτικά βακτήρια μπορεί να ασκήσει παρόμοια αποτελέσματα. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας καταδεικνύουν την ικανότητα του CLA και VSL # 3 για τη βελτίωση της φλεγμονής που προκαλείται από καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει διαμόρφωση της πόλωσης του βλεννογόνου CD4 + Τ κυττάρων και διαμόρφωση της γονιδιακής έκφρασης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακας S1.

Σύνθεση πειραματικές δίαιτες.

1 ανά kg δίαιτα: 3 g νικοτινικό οξύ, 1,6 g pantotenate ασβεστίου, 0,7 g πυριδοξίνη HCl, 0,6 g θειαμίνη HCl, 0,6 g ριβοφλαβίνη, 0,2 g φολικού οξέος, 0,02 g D-βιοτίνη, 2,5 g βιταμίνης Β-12 ( 0,1% σε μαννιτόλη), 15 gd, Ι-α τοκοφερόλη (500 IU /g), 0,8 g παλμιτικής βιταμίνης Α (500.000 IU /g), 0,2 g χοληκαλσιφερόλη (500.000 IU /g), 0.075 g βιταμίνης Κ (φυλλοκινόνη) και 974.705 g σακχαρόζης.

2 ανά kg δίαιτα: 357 g ανθρακικού ασβεστίου, 196 g μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 70,78 g κιτρικό κάλιο, 74 g χλωριούχου νατρίου, 46,6 g θειικό κάλιο, 24,3 g οξειδίου του μαγνησίου, 6,06 g κιτρικού τρισθενούς σιδήρου, 1,65 g ανθρακικού ψευδαργύρου, 0,63 g μαγγανίου ανθρακικό, 0,31 g ανθρακικού χαλκού, 0,01 g ιωδικό κάλιο, 0,01025 g σεληνικό νάτριο, 0.00795 g paramolybdate αμμωνίου, 1,45 g νάτριο μετα-πυριτικό, 0,275 g θειικού χρωμίου κάλιο, 0,0174 g χλωριούχου λιθίου, 0,0815 g βορικού οξέος, 0,0635 g νατρίου φθορίδιο, 0,0318 g ανθρακικού νικελίου, υδροξείδιο, τετραένυδρο, 0,0066 g βαναδικού αμμωνίου, και 220.716 g σακχαρόζης.

3Antioxidant

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034676.s001

(DOCX)