Αφηρημένο

Ανθεκτική εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων από τη χημειοθεραπεία αμφισβητείται από την ανάπτυξη της πολυανθεκτικής-αντίστασης (MDR) και την αποτυχία να προκαλέσει ανοσογόνες κυτταρικό θάνατο. Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να διερευνηθεί εάν MDR και ανοσογόνα κυτταρικό θάνατο μοιράζονται ένα κοινό βιοχημικό μονοπάτι τελικά επιδέχονται θεραπευτική παρέμβαση. Βρήκαμε ότι η δραστηριότητα mevalonate οδού, Ras και πρωτεΐνη ισοπρενυλιώσεως RhoA, RAS-και RhoA-κατάντη σηματοδότησης δραστηριότητες οδού, υποξία επαγώγιμοι ενεργοποίησης Παράγοντα-1alpha ήταν σημαντικά υψηλότερη σε MDR + σε σύγκριση με MDR-ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, οδηγώντας σε αυξημένη έκφραση Ρ-γλυκοπρωτεΐνης, και προστασία από δοξορουβικίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και ανοσογονικών κυτταρικό θάνατο. Ζολεδρονικό οξύ, ένα ισχυρό aminobisphosphonate στόχο την mevalonate οδό, διέκοψε Το RAS και πορείες προς τα κάτω σηματοδότησης RhoA-εξαρτώμενη, κατήργησε την έκφραση υποξία επαγώγιμοι Factor-1alpha με γνώμονα την P-γλυκοπρωτεΐνη, και να αποκατασταθεί η δοξορουβικίνη-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και ανοσοποιητικές κυτταρικό θάνατο σε MDR + κύτταρα. Ανοσογόνες ανάκτηση κυτταρικό θάνατο τεκμηριώθηκε από την ικανότητα των δενδριτικών κυττάρων σε phagocytise MDR + κύτταρα κατεργασμένα με ζολεδρονικό οξύ συν δοξορουβικίνη, και να προσλάβει κυτοτοξικά κατά του όγκου CD8 + Τ λεμφοκύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι MDR + κύτταρα έχουν μια υπερ-ενεργό mevalonate μονοπάτι που στοχεύεται με ζολεδρονικό οξύ για να ανταγωνιστεί την ικανότητά τους να αντέχουν τη χημειοθεραπεία που προκαλείται κυτταροτοξικότητα και να ξεφύγουν ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο

Παράθεση:. Riganti C, Καστέλλα Β, Kopecka J, Campia Ι, Coscia Μ, Pescarmona G, et al. (2013) ζολεδρονικό οξύ Επαναφέρει δοξορουβικίνη χημειοευαισθησία και Ανοσοποιητικό κυτταρικού θανάτου σε πολυανθεκτικά ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 8 (4): e60975. doi: 10.1371 /journal.pone.0060975

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Ιαν 2013? Δεκτές: 1, Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 12η Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Riganti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ιταλική Ένωση Έρευνας για τον Καρκίνο (AIRC, www.airc.it? MFAG 11475 για να Chiara Riganti, IG 13119 για να Massimo Massaia)? Ιταλικό Υπουργείο Πανεπιστημίων και Έρευνας (www.miur.it? ΠΡΙΝ 2010-2011 στον Massimo Massaia, FIRB 2012 έως Chiara Riganti)? Fondazione Internazionale Ricerche Medicina Sperimentale (www.cerms.it, να Αμαλία Bosia, Massimo Massaia)? Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 έως Chiara Riganti, Αμαλία Bosia? Progetto Immonc να Massimo Massaia). Joanna Kopecka είναι ο αποδέκτης μιας υποτροφίας «Mario και Βαλέρια Rindi» από το Ιταλικό Ίδρυμα για την Έρευνα του Καρκίνου (FIRC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μεβαλονικό (Mev) οδός είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη μεταβολικές καταρράκτης που παράγει στερόλες, όπως χοληστερόλη, και ισοπρενοειδή, όπως πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο (FPP) και γερανυλογερανυλο πυροφωσφορικό (GGPP). Τα τελευταία είναι αναγκαία για την ισοπρενυλίωση και τη δραστηριότητα των μικρών πρωτεϊνών G, όπως Ras και Rho που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση και την αγγειογένεση [1].

Η υπερέκφραση του Mev ενζύμων οδού έχει συσχετιστεί με μια κακή κλινική έκβαση σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [2], [3]. Ενδοκυτταρικά επίπεδα χοληστερόλης μπορεί να διαμορφώνει αντίσταση σε μια ποικιλία αντικαρκινικών φαρμάκων, μέσα σε ένα λειτουργικό φαινότυπο ονομάζεται πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR), η οποία μπορεί να είναι συστατική ή επαγόμενη μετά την έκθεση σε επανειλημμένους κύκλους μη εξάλειψη χημειοθεραπεία [4]. Οι μεμβράνες του MDR + κυττάρων όγκου πλάσματος είναι ιδιαίτερα πλούσια σε χοληστερόλη η οποία διευκολύνει τη δραστικότητα της Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (Pgp) [5], αποτελεί αναπόσπαστο μεταφορέας μεμβράνη εξώθηση φάρμακα χημειοθεραπείας, όπως ανθρακυκλίνες, ταξάνες, Vinca αλκαλοειδή, επιποδοφυλλοτοξίνες, τοποτεκάνη, και μιτομυκίνη C [4]. Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα του MDR + καρκινικά κύτταρα είναι η αυξημένη ισοπρενυλιώσεως και τη δραστηριότητα των G-πρωτεϊνών που είναι επίσης εξαρτάται από το ποσοστό της δραστηριότητας της οδού Mev [6], [7].

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η επιτυχής και βιώσιμη όγκου εκρίζωση κύτταρο εξαρτάται από την ικανότητα των φαρμάκων χημειοθεραπείας για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα με τρόπο που είναι ανιχνεύσιμη από το ανοσοποιητικό σύστημα. Ο όρος ανοσογόνο κυτταρικού θανάτου (ICD) έχει επινοηθεί για να περιγράψει την ικανότητα ορισμένων φαρμάκων, όπως η δοξορουβικίνη (Dox), για να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα και ταυτόχρονα επάγει αντικαρκινική ανοσοαποκρίσεις προκαλούνται από πεθαίνουν κύτταρα όγκου [8]. Μοριακή σημαντικά γεγονότα Dox επαγόμενη ICD είναι η εξωκυττάρια απελευθέρωση της πρωτεΐνης υψηλής κινητικότητας ομάδας 1 κουτί (HMGB1) και της επιφάνειας των κυττάρων μετατόπιση της Καλρετικουλίνης (CRT) από το ενδοπλασματικό δίκτυο, όπου ασκεί λειτουργίες ασβέστιο-αισθητήρα και chaperone. Αυτά τα γεγονότα ενεργοποιούν όγκου φαγοκυττάρωση των κυττάρων από δενδριτικά κύτταρα (DCs) και την επακόλουθη DC διαμεσολαβείται πρόσληψη άλλων ανοσοποιητικού υποπληθυσμών με αντικαρκινική δραστικότητα [9], [10]. Είναι ενδιαφέρον, MDR + κυττάρων είναι συχνά ανθεκτικοί σε ICD [11] δείχνει ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αντέξουν οικονομικά πολλαπλές στρατηγικές για να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν στη χημειοθεραπεία επεξεργασμένο υποδοχής.

Το zoledronic acid (ZA) είναι ένα aminobisphosphonate χρησιμοποιείται ευρέως σε κλινικές για να αποτρέψει την οστική απορρόφηση και τη θεραπεία της νόσου των οστών σε συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του προστάτη, καρκίνο του πνεύμονα και πολλαπλό μυέλωμα. ΖΑ είναι ένας ειδικός αναστολέας του FPP συνθάσης στην οδό Mev και ασκεί πλειοτροπικές επιδράσεις σε καρκινικά κύτταρα και μη-όγκου, όπως οι οστεοκλάστες, τα μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [12], [13]. Αυτά τα αποτελέσματα οφείλονται στην ενδοκυτταρική στέρηση του ισοπρενυλιωμένες πρωτεΐνες και /ή τη συσσώρευση του πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου που αξιοποιείται για την ενεργοποίηση Vγ9Vδ2 Τ κύτταρα, ένα μοναδικό υποσύνολο των μη συμβατικών Τ κυττάρων με ρυθμιστικές και δραστικές λειτουργίες κατά μικροβίων, τόνισε κύτταρα και κύτταρα όγκου [14 ] – [16]

Προηγούμενα δεδομένα έχουν δείξει ότι ΖΑ ενισχύει την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των Dox σε καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα σε φάρμακο [17], [18] και κλινικές μελέτες έχει κινηθεί σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού σε. να επωφεληθούν από αυτή τη συνέργεια [19]. Ωστόσο, επί του παρόντος είναι άγνωστο εάν ZA έχει καμία επίπτωση για MDR ή /και ICD στα καρκινικά κύτταρα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν διπλός: 1) για να διερευνηθεί η δραστηριότητα της οδού της Ras Mev και /RhoA-καθοδικών πορειών σε MDR-και MDR + κύτταρα όγκου σηματοδότησης? 2) την αξιολόγηση της σχέσης, εάν υπάρχει, μεταξύ ΖΑ-επαγόμενη αναστολή Mev οδού, Dox επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και ευαισθησία ICD. Βρήκαμε ότι μια υπερ-ενεργού οδού Mev είναι υπεύθυνη τόσο για την χημειοθεραπεία και ανοσο-αντίσταση? χάρη στην αναστολή των σημάτων εξαρτάται Mev-μονοπάτι, ZA αποκατασταθεί Dox-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και ICD σε MDR + κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

εμβρύου μόσχου (FBS ) και το μέσο καλλιέργειας ήταν από την Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Πλαστικά σκεύη για καλλιέργειες κυττάρων ήταν από Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). ΖΑ ήταν ένα δώρο από τη Novartis (Βασιλεία, Ελβετία). Οι ειδικοί αναστολείς φαρνεσυλ τρανσφεράσης FTI-277, γερανυλογερανυλοπρωτεϊνοτρανσφεράση GGTI-286 και του RhoA κινάσης Y27632 αγοράστηκαν από την Calbiochem (San Diego, CA). αντιδραστήρια ηλεκτροφόρησης λήφθηκαν από Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των κυτταρικών μονοστοιβάδων και προϊόντα λύσης αξιολογήθηκε με το κιτ BCA από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co.

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο παχύ έντερο ΗΤ29 καρκίνο, Α549 καρκίνου του πνεύμονα, και ο καρκίνος του μαστού MCF7 είναι Dox-ευαίσθητα, MDR-όγκου κυτταρικές γραμμές (ATCC, Rockville, MD). Dox ανθεκτικά ομολόγους (ΗΤ29-DX, Α549-DX και MCF7-DX) δημιουργήθηκαν με καλλιέργεια γονικών κυττάρων παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων Dox για έως 20 περάσματα [11], [20], [21]. Για την παρούσα εργασία, τα κύτταρα ΗΤ29-DX αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιέχει 250 nmol /L Dox, Α549-DX κυττάρων σε μέσο που περιέχει 100 nmol /L Dox, κύτταρα MCF7-DX σε μέσο που περιέχει 0.5 nmol /L, και εκπροσωπείται μοντέλα που αποκτήθηκαν MDR. Η HepG2 κυτταρική γραμμή ανθρώπινου ηπατώματος (ATCC) και τα καρκινικά κύτταρα HP06 και ΗΜΜ χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτότυπα μοντέλα των κυττάρων με ένα ιδιοσυστατικό φαινότυπο MDR και περιγράφηκαν προηγουμένως ([7], [11], [21]? Σε όλα αυτά τα έργα ΗΜΜ κύτταρα ονομάζονται κύτταρα MM98). πρωτογενή κύτταρα HP06 (δώρο του Καθηγητή Anna Sapino, Τμήμα Βιοϊατρικών Επιστημών και Ογκολογίας του Πανεπιστημίου του Τορίνο, Ιταλία) προήλθαν από την περιτοναϊκή μετάσταση μια γυναίκα ασθενή με ένα διηθητικό καρκίνο του μαστού, ενώ τα πρωτογενή κύτταρα ΗΜΜ (κακόηθες μεσοθηλίωμα Βιολογικές Bank, Azienda Ospedaliera Nazionale, Αλεξάνδρεια, Ιταλία) προήλθαν από την υπεζωκοτική συλλογή ενός ασθενούς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο κακόηθες μεσοθηλίωμα, μετά από γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς. Η χρήση των HP06 κυττάρων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Βιοηθικής ( «Comitato της Bioetica d’Ateneo») του Πανεπιστημίου του Τορίνο, στην Ιταλία? η χρήση των κυττάρων HMM εγκρίθηκε από την Επιτροπή Βιοηθικής ( «Comitato Etico Interaziendale») της «Azienda Ospedaliera Nazionale SS. Antonio e Biagio e Cesare Arrigo »της Αλεξάνδρεια, Ιταλία. Πρωτογενή κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε περάσματα 2-4. Όλες οι καλλιέργειες συμπληρώθηκαν με 10% FBS, 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% Τ-γλουταμίνη, και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C και 5% CO

2.

Η ενδοκυτταρική συσσώρευση Dox

περιεχόμενα Ενδοκυτταρικά Dox ανιχνεύθηκαν με φθορισμομετρική με βάση δοκιμασία όπως αναφέρθηκε [20] και εκφράζεται ως nmol mg πρωτεΐνες Dox /κύτταρο σύμφωνα με μία προηγουμένως παρασκευασθείσα καμπύλη βαθμονόμησης.

αλυσίδας πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο αντίδραση (RT-PCR)

το συνολικό RNA εκχυλίστηκε και μεταγράφηκε ανάστροφα με τη χρήση του QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Germany). RT-PCR πραγματοποιήθηκε με IQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Το ίδιο παρασκεύασμα cDNA χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του

MDR1

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί για την ανθρώπινη Pgp, και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (GAPDH), επιλέχθηκε ως γονίδιο καθαριότητας. Οι αλληλουχίες του

MDR1

εκκινητές ήταν: 5′-TGCTGGAGCGGTTCTACG-3 ‘, 5′-ATAGGCAATGTTCTCAGCAATG-3’. Οι αλληλουχίες των εκκινητών GAPDH ήταν: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ‘, 5′-CATGGTGGAATCATATTGGAA-3’. Η σχετική ποσοτικοποίηση του κάθε δείγματος έγινε με σύγκριση του

MDR1

προϊόν PCR με το GAPDH PCR προϊόντος με το Expression Ποσοτικοποίηση Bio-Rad Gene λογισμικού.

De ηονο σύνθεση

χοληστερόλης και ισοπρενοειδή

τα κύτταρα σημάνθηκαν με 1 μΟί /κ.εκ

3Η-οξικό (3.600 mCi /mmol? Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) και η σύνθεση του ραδιοεπισημασμένου χοληστερόλης, FPP και GGPP μετρήθηκε όπως περιγράφεται [22]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως /mg πρωτεΐνες κύτταρο pmol, σύμφωνα με τις σχετικές καμπύλες βαθμονόμησης.

Ras και RhoA ισοπρενυλίωση και δραστικότητα

Να ανιχνευθούν τα ισοπρενυλιωμένες συνδεδεμένη με μεμβράνη πρωτεΐνες Ras ή RhoA και τη μη ισοπρενυλιωμένες κυτοσολικό μορφές, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό MLB (125 mmol /L Tris-HCl, 750 mmol /L NaCl, 1% ν /ν ΝΡ40, 10% ν /ν γλυκερόλη, 50 mmol /L MgCl

2, 5 mmol /L EDTA, 25 mmol /L NaF, 1 mmol /L NaVO

4, 10 μg /ml λευπεπτίνη, 10 μg /ml πεπστατίνη, 10 μg /ml απρωτινίνη, 1 mmol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο? ρΗ 7,5) και φυγοκεντρήθηκε στα 13 000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Ένα κλάσμα του υπερκείμενου ελήφθη για την κηλίδος Western των συνολικών Ras και RhoA, ενώ το υπόλοιπο μέρος υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 100 000 χ g για 1 ώρα στους 4 ° C? τόσο το υπερκείμενο (εκχυλίσματα κυτταρολύματος) και το σφαιρίδιο (μεμβράνη κλάσματα) διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό Laemli (125 mmol /L Tris, 4% β /ο SDS, 20% ν /ν γλυκερόλη και 1% w /v β-μερκαπτοαιθανόλη) και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western, χρησιμοποιώντας ένα αντι-Ras (Millipore, Billerica, ΜΑ) και ένα αντι-RhoA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) αντίσωμα. Για να αξιολογηθεί δραστικότητα Ras και RhoA, το GTP-δεσμευμένο κλάσμα, που λαμβάνεται ως δείκτης της δραστικής G-πρωτεΐνες [23] μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία pull-down (με την πρωτεΐνη σύντηξης Raf-1-GST, αγαρόζης-συζυγή, Millipore) και μια δοκιμασία ELISA (με την G-LISA ™ RhoA Activation Assay Biochem Kit, Cytoskeleton Inc, Denver, CO), αντίστοιχα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

δραστικότητα κινάσης RhoA

δραστικότητα κινάσης RhoA αξιολογήθηκε με την CycLex Rho κινάσης Assay Kit (CycLex Co., Nagano, Ιαπωνία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή [22].

Western ανάλυση κηλίδος

τα κύτταρα λύθηκαν σε MLB ρυθμιστικό διάλυμα, επεξεργασία με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν στις 13 000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. 10 μg κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western και διερευνήθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: anti φωσφο- (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 (Millipore)? αντι-ERK 1/2 (Millipore)? αντι-υποξία επαγώγιμοι Παράγοντα-1α (HIF-1α? BD Bioscience, San Jose, CA)? αντι-Pgp (Santa Cruz Biotechnology Inc.)? αντι-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc.), που ακολουθείται από τις δευτερεύουσες συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα (Bio-Rad). Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ).

Για να εκτιμηθεί η φωσφορυλίωση HIF-1α, ολόκληρο το υλικό κυτταρικής λύσεως ανοσοκατακρημνίσθηκε με πολυκλωνικό αντι-HIF-1α αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology Inc.), τότε ανιχνεύθηκαν για 1 ώρα με συζευγμένο με βιοτίνη αντι-φωσφοσερίνης αντισώματα (Sigma Chemical Co.) ακολουθούμενο από πολυμερικό στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση αρμορακίας συζυγών (Sigma Chemical Co.).

HIF-1α μεταγραφική δραστικότητα

πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το Nuclear Kit Extract (Active Motif, Rixensart, Belgium). Η δραστικότητα του HIF-1 σε 10 μg πυρηνικών εκχυλισμάτων αξιολογήθηκε με την Transam ™ HIF-1 Transcription Factor Assay Kit (Active Motif). Για κάθε σειρά πειραμάτων, κενό (με διπλά απεσταγμένο νερό), αρνητικός έλεγχος (με μεταλλαγμένο ολιγονουκλεοτίδιο) και δοκιμασία ανταγωνισμού (χρησιμοποιώντας 20 pmol του άγριου τύπου ολιγονουκλεοτίδιο με πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων ΗΜΜ αναπτύχθηκαν σε 3% O

2 για 24 h) συμπεριλήφθηκαν. Σε υποξικές συνθήκες, η δράση του HIF-1 ήταν 257,53 ± 3,77 mU /mg prot? στην δοκιμασία ανταγωνισμού, η αντίστοιχη δραστηριότητα HIF-1 μειώθηκε στο 33,14 ± 1,39 mU /mg prot (n = 5). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως mU απορροφητικότητα /mg πρωτεΐνες του κυττάρου.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα πειράματα για τη μέτρηση της σύνδεσης του HIF-1α για την «Υποξία ανταποκρινόμενο στοιχείο» του

MDR1

υποκινητή ήσαν εκτελέστηκε όπως αναφέρθηκε αλλού [24].

δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) μετρήθηκε στο εξωκυτταρικό μέσο και στο προϊόν λύσης κυττάρου, όπως περιγράφεται [20]. Για να μετρηθεί η εξωκυτταρική απελευθέρωση της HMGB1, 20 μL του μέσου καλλιέργειας κυττάρων βράστηκαν, επιλύονται με SDS-PAGE και ανιχνευτή με ένα αντι-HMGB1 αντίσωμα (Sigma Chemical Co.). Οι κηλίδες προ-χρώση με Red Ponceau για να ελέγξετε την ίση φόρτωση των πρωτεϊνών. Η απελευθέρωση ΑΤΡ μετρήθηκε σε 100 μL του μέσου καλλιέργειας κυττάρων με την ΑΤΡ δοκιμασία βιοφωτεινότητας Kit (FL-ΑΑ, Sigma Aldrich Co.), χρησιμοποιώντας ένα ΗΤ Synergy Multi-Detection Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol ΑΤΡ /ml, σύμφωνα με την προηγουμένως οριστεί καμπύλη τιτλοδότησης.

Ανάλυση της κυτταρικής επιφάνειας CRT

Τα κύτταρα επωάστηκαν για 45 λεπτά (4 ° C) με ένα αντι- αντίσωμα CRT (Affinity Bioreagents, Rockford, IL), όπως αναφέρεται στο [11] και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα FACS-Calibur (BD Biosciences). Για κάθε ανάλυση 100.000 γεγονότα συλλέχθηκαν. Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων CRT-φθορισμού (ιωδιούχο προπίδιο-αρνητικά) υπολογίστηκε με το λογισμικό Cell Quest (BD Biosciences). Πειράματα ελέγχου που περιλαμβάνονται επώαση κυττάρων με μη-άνοσο ισοτυπικού αντισώματα που ακολουθείται από την κατάλληλη δευτερογενές αντίσωμα. Η κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με βιοτινυλίωση προσδιορισμούς [25], χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης πρωτεΐνης Cell Surface από Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL). Η είσοδος της βιοτίνης σε κύτταρα αποκλείστηκε ελέγχοντας την απουσία κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών (GAPDH, ακτίνη) σε βιοτινυλιωμένη εκχυλίσματα (δεν φαίνεται).

δενδριτικών κυττάρων (DCs) παραγωγή και

in vitro φαγοκυττάρωση

δοκιμασία

ΑΧ δημιουργήθηκαν από δείγματα περιφερικού αίματος που λαμβάνονται από υγιείς δότες ευγενική παραχώρηση από την τοπική Τράπεζα αίματος (Fondazione Strumia, Τορίνο, Ιταλία), όπως έχει ήδη αναφερθεί [11]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν την ημέρα 6 και επιβεβαιώθηκαν ως ανώριμα DCs από τη μορφολογία και ανοσοφαινότυπο.

MDR-ΗΤ29 και MDR + ΗΤ29-dx και ΗΜΜ κύτταρα πράσινου-βάφτηκαν με PKH2-FITC (Sigma Chemical Co.), πλένεται δύο φορές και επωάστηκαν με σε αναλογία 1:01 για 18 ώρες στους 37 ° C. Συν-καλλιέργειες στη συνέχεια βάφτηκαν για 20 λεπτά στους 4 ° C με ΑΡΟ-συζευγμένο HLA-DR αντίσωμα (Miltenyi Biotec, Tetrow, Γερμανία) για να σηματοδοτήσει DCs. κυτταρομετρία ροής δύο χρωμάτων πραγματοποιήθηκε με FACScan ταξινομητή κυττάρων και λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson). Τουλάχιστον 10.000 συμβάντα είχαν συσσωρευθεί ειδικά backgating στο DC μορφολογία (περιοχή 1: FSC έναντι SSC). Καρκινικών κυττάρων φαγοκυττάρωση εκτιμήθηκε ως το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται διπλό (FITC συν APC). Τα καρκινικά κύτταρα δεν εκφράζουν σημαντικές ποσότητες του HLA-DR, και εξαιρούνται από την περιοχή 1 από τη μορφολογία τους. Σε κάθε ομάδα πειραμάτων, ένας προσδιορισμός φαγοκυττάρωσης διεξήχθη με συν-επώαση DCs και τα καρκινικά κύτταρα στους 4 ° C, αντί των 37 ° C, και το ποσοστό των διπλών χρωματισμένων κυττάρων που λαμβάνεται μετά την επώαση στους 4 ° C, αφαιρέθηκε από τις τιμές παρατηρήθηκαν σε 37 ° C. Ο ρυθμός φαγοκυττάρωση εκφράστηκε ως φαγοκυτταρικής δείκτης, που υπολογίζεται όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [9].

Σε αναλύσεις που βασίζονται σε μικροσκοπία φθορισμού, PKH2-FITC πράσινο-χρωματισμένο καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες ή 24 ώρες στους 37 ° C με 1 × 10

5 ΑΧ σε αναλογία 1:01. Συν-καλλιέργειες κυτταρόνημα στα 1500 × g για 5 λεπτά πάνω σε γυαλί ολισθήσεις, μονιμοποιήθηκαν με 4% β /ο παραφορμαλδεϋδη, πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με ένα πολύκλωνο αντίσωμα ποντικού αντι-MHCII (Thermo Fisher Scientific Inc.). Μετά την πλύση, τα δείγματα επωάστηκαν με ένα αντίσωμα IgG Alexa fluor 350 conjuganted κατσίκας αντι-ποντικού (Invitrogen) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλένεται, τοποθετείται με Gel Όρος Υδατικά Τοποθέτηση και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού, όπως περιγράφεται ανωτέρω.

DC διαμεσολαβείται CD8 + διέγερση Τ-κυττάρων

Μετά την φαγοκυττάρωση των καρκινικών κυττάρων, DCs πλύθηκαν και συν-καλλιεργήθηκαν με αυτόλογα Τ κύτταρα, που απομονώνονται από CD14-κύτταρα με ανοσομαγνητικά διαλογή με την Pan Τ Kit κελί απομόνωσης (Miltenyi Biotec). DC και Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες σε μία αναλογία 1:05 σε πλήρες μέσο συμπληρωμένο με IL-2 (10 U /mL). Την ημέρα 10, CD107 έκφρασης στο CD8 + Τ κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό της ενεργοποίησης του όγκου-ειδικά κυτταροτοξικά Τ κύτταρα [26]. Τουλάχιστον 100.000 γεγονότα στην πύλη λεμφοκυττάρων αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν με τη ροή δύο χρωμάτων κυτταρομετρία. Όγκου κυτταρικού θανάτου που επάγεται από τα CD8 + Τ κύτταρα επίσης ποσοτικά με CFSE σήμανσης, μετρώντας το ποσοστό των κυττάρων ΗΤ29-DX διπλά θετικά για CFSE και ιωδιούχο προπίδιο όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [14], [15].

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα στο κείμενο και τα στοιχεία παρέχονται ως μέσοι όροι ± SD. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) με

P

& lt? 0,05 καθώς η σημασία cut-off. Ο συντελεστής r υπολογίστηκε με Fig.P λογισμικού (Fig.P Software Inc., Hamilton, Καναδάς).

Αποτελέσματα

Συσχέτιση

MDR1

έκφρασης και της δραστηριότητας της οδού Mev

κατακράτηση η ενδοκυτταρική Dox,

MDR1

επίπεδα mRNA, και σύνθεσης της χοληστερόλης μετρήθηκαν ως δείκτες της δραστηριότητας Pgp, της έκφρασης Pgp, και η δραστηριότητα της οδού Mev σε ΗΤ29, Α549, κύτταρα MCF7 (MDR-κύτταρα) , ΗΤ29-DX, Α549-DX, κύτταρα MCF7-DX (επίκτητη MDR + κύτταρα) και κύτταρα HepG2, HP06, ΗΜΜ κύτταρα (συστατικός + κύτταρα MDR), αντίστοιχα. Και οι δύο αποκτώνται και συστατική MDR + κύτταρα διατηρούνται σημαντικά λιγότερο Dox (Σχήμα 1Α) και έδειξαν υψηλότερη

MDR1

επίπεδα του mRNA (Σχήμα 1Β) από MDR-κύτταρα. σύνθεση της χοληστερόλης ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη σε MDR + από ό, τι MDR-κύτταρα (Σχήμα 1 C). Οι διαφορές μεταξύ αποκτήσει και συστατική MDR + κύτταρα δεν ήταν στατιστικά σημαντικές, έστω και αν ο τελευταίος είχε την τάση να διατηρούν λιγότερο Dox, να εκφράσω την πιο

MDR1

επίπεδα mRNA, και να παράγουν περισσότερη χοληστερίνη από το πρώτο. Μια πολύ σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του ρυθμού της σύνθεσης της χοληστερόλης και

MDR1

επίπεδα του mRNA (Σχήμα 1D).

Α. Η ενδοκυτταρική δοξορουβικίνη (Dox) συγκεντρώσεις σε MDR-κύτταρα (ΗΤ29, Α549 και MCF7), στα αντίστοιχα MDR + ομολόγους αποκτήθηκαν (κύτταρα ΗΤ29-DX, κύτταρα Α549-DX, MCF7-DX), και ιδιοσυστατικό MDR + κύτταρα (HepG2, HP06, ΗΜΜ ). Σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις εντοπίστηκαν σε κύτταρα με επίκτητη MDR

vs

MDR-κύτταρα (ΗΤ29-dx

vs

ΗΤ29: * p & lt? 0,002? Α549-dx

vs

Α549: * p & lt? 0,001? MCF7-dx

vs

MCF7: * p & lt? 0.001), και σε κύτταρα με συστατική MDR

vs

MDR-κύτταρα (μέση τιμή των ενδοκυττάριων δοξορουβικίνη σε HepG2 /HP06 /HMM

vs

μέση τιμή στην ΗΤ29 /Α549 /MCF7: ° ρ & lt? 0.001). Β

MDR1

έκφραση του mRNA. Σημαντικά υψηλότερα

MDR1

επίπεδα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα με επίκτητη MDR

vs

MDR-κύτταρα (ΗΤ29-dx

vs

ΗΤ29: * p & lt? 0,002? Α549-dx

vs

Α549: * p & lt? 0,002? MCF7-dx

vs

MCF7: * p & lt? 0.001), και σε κύτταρα με συστατική MDR

vs

MDR-κύτταρα (μέση τιμή της

MDR1

επίπεδα στα HepG2 /HP06 /HMM

vs

μέση τιμή στην ΗΤ29 /Α549 /MCF7: ° ρ & lt? 0.001). Γ ρυθμό σύνθεσης της χοληστερόλης. Σημαντική υψηλότερη δραστηριότητα μετρήθηκε σε κύτταρα με επίκτητη MDR

vs

MDR-κύτταρα (ΗΤ29-dx

vs

ΗΤ29: * p & lt? 0,002? Α549-dx

vs

Α549: * p & lt? 0,002? MCF7-dx

vs

MCF7: * p & lt? 0.002), και σε κύτταρα με συστατική MDR

vs

MDR-κύτταρα (μέση τιμή της σύνθεσης της χοληστερόλης σε HepG2 /HP06 /HMM vs μέση τιμή στην HepG2 /HP06 /ΗΜΜ: ° ρ & lt? 0.001). Δ άμεση συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού σύνθεσης χοληστερόλης και τα επίπεδα έκφρασης του

MDR1

σε μεμονωμένες κυτταρικές σειρές (r

2 = 0,95). Για πίνακες Α, Β, και Γ μπάρες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

ZA αναστέλλει μονοπάτια Mev εξαρτώμενη από τη σηματοδότηση σε MDR + κύτταρα

ZA χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί η επίδραση της Mev αναστολή της πορείας ΗΤ29, ΗΤ29-DX και HMM κύτταρα τα οποία επελέγησαν ως πρωτότυπο μοντέλα της MDR-απέκτησε MDR + και συστατική MDR + καρκινικά κύτταρα, αντίστοιχα.

ZA προκάλεσε δόσης (Εικόνα 2Α, αριστερό πάνελ ) και χρονο-εξαρτώμενη (Σχήμα 2Α, δεξί πλαίσιο) μείωση της σύνθεσης της χοληστερόλης, με σημαντική αναστολή σε 1 mmol /L η οποία ήταν πιο εμφανής σε κύτταρα MDR + ΗΤ29-dx και ΗΜΜ από MDR-ΗΤ29 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Μία μmol /L είναι επίσης παρόμοια με την συγκέντρωση στον ορό που παρατηρήθηκε σε ασθενείς που λαμβάνουν ΖΑ σε κλινικά εγκεκριμένες δόσεις [27], [28] και ως εκ τούτου αυτή η συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε σε όλη τη μελέτη.

MDR-ΗΤ29, και MDR + ΗΤ29 -dx και HMM κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς (CTRL) ή με ζολεδρονικό οξύ (ZA). Για πάνελ Β-Ε, ΖΑ (1 mmol /L) χρησιμοποιήθηκε για 48 ώρες, FTI-277 (10 mmol /L, FTI), GGTI-286 (10 mmol /L, GGTI), Y27632 (10 μmol /L, Y276) για 24 ώρες. Α

Αριστερό πλαίσιο

: δοσοεξαρτώμενη αναστολή της σύνθεσης της χοληστερόλης σε κύτταρα κατεργασμένα με 0,01-10 μmol /L ZA για 24 ώρες. Η αναστολή ήταν στατιστικά σημαντική σε ΗΤ29 (* p & lt? 0.001), ΗΤ29-DX (° ρ & lt? 0,01) κύτταρα δ ΗΜΜ (

◊p & lt? 0.005)

vs

αρχικές τιμές (0).

Δεξιά

πίνακα: εξαρτώμενη από το χρόνο αναστολή της σύνθεσης της χοληστερόλης σε κύτταρα κατεργασμένα με 1 mmol /L ZA για 24-72 ώρες. Η αναστολή ήταν στατιστικά σημαντική σε ΗΤ29 (* p & lt? 0.001), ΗΤ29-DX (° ρ & lt? 0.0001) και τα κύτταρα HMM (

◊p & lt? 0.001)

vs

αρχικές τιμές (0). Και για τις δύο πάνελ: ΗΤ29-DX /HMM

vs

ΗΤ29: * p & lt? 0.001. Β MDR + κύτταρα συντίθεται υψηλότερες ποσότητες FPP (

αριστερό πλαίσιο

) και GGPP (

δεξί πάνελ

) από ό, τι MDR-κύτταρα (* p & lt? 0.005). ΖΑ μείωσε σημαντικά τη σύνθεση FPP

vs μη επεξεργασμένα κύτταρα

(CTRL) (ΗΤ29: * p & lt? 0,001? ΗΤ29-DX: ° ρ & lt? 0,002? ΗΜΜ:

◊p & lt? 0.001) και τη σύνθεση GGPP

vs (CTRL) κύτταρα χωρίς θεραπεία

(ΗΤ29: * p & lt? 0,02? ΗΤ29-DX: ° ρ & lt? 0.001? ΗΜΜ:

◊p & lt? 0.005). κύτταρα Γ MDR + εμφανίζεται μια άνιση κατανομή μεταξύ ισοπρενυλιωμένες δεσμευμένο σε μεμβράνη (

Μ

) και μη ισοπρενυλιωμένες του κυτταροπλάσματος (

C

) Ras (

αριστερό πλαίσιο

) και RhoA (

δεξιά

πίνακα) σε σύγκριση με το MDR-κύτταρα. επεξεργασία ZA αύξησε το ποσό της κυτοσολικής Ras και RhoA.

T

: το ποσό της Ras και RhoA σε λύματα ολόκληρων κυττάρων. Δ Ω μειωμένη δραστηριότητα Ras, μετρούμενη ως ποσό Ras-GTP, και φωσφο (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) -ERK1 /2 ποσού. Τα δεδομένα GAPDH φαίνονται να επιβεβαιώσει ισοδύναμη πρωτεΐνη φόρτωσης. Ε MDR κύτταρα + είχαν σημαντικά υψηλότερα ποσά των RhoA-GTP (

ανοιχτό μπαρ

) και κινάσης RhoA (

εκκολαφθεί μπαρ

) από ό, τι MDR-κύτταρα (* p & lt? 0.005)? ΖΑ μειώθηκε τόσο RhoA-GTP και RhoA κινάσης

vs μη επεξεργασμένα κύτταρα

(CTRL) (ΗΤ29-DX: ° ρ & lt? 0,02? ΗΜΜ:

◊p & lt? 0,02). Τα αποτελέσματα φαίνονται στο πάνελ C και D είναι αντιπροσωπευτικά 3 πειραμάτων. Στο πάνελ Α, Β, και Ε τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 πειραμάτων.

Η

Σύμφωνα με την υπερ-ενεργού οδού Mev, MDR + ΗΤ29-dx και κυττάρων ΗΜΜ έδειξαν υψηλότερη FPP (Εικόνα 2Β , αριστερό πάνελ) και GGPP (Σχήμα 2Β, δεξί πάνελ) η σύνθεση από MDR-ΗΤ29 κύτταρα. Αμφότερα τα κύτταρα MDR-και MDR + είχαν ανιχνεύσιμες ποσότητες ισοπρενυλιωμένες, δεσμευμένη σε μεμβράνη Ras και μη ισοπρενυλιωμένες, κυτοσολική Ras, αν και η πρώτη ήταν σε μεγάλο βαθμό κυρίαρχη σε MDR + κύτταρα ως συνέπεια της αυξημένης προσφοράς FPP ευνοώντας Ras ισοπρενυλίωση (Σχήμα 2C, αριστερό πάνελ ). Οι δεσμευμένες σε μεμβράνη και κυτοσολικές RhoA έδειξε επίσης ένα παρόμοιο μοτίβο σε MDR + ΗΤ29-dx και ΗΜΜ

vs

MDR-ΗΤ29 κύτταρα ως συνέπεια της αυξημένης παραγωγής GGPP και RhoA ισοπρενυλίωση (Σχήμα 2C, δεξιό πλαίσιο).

Η περίσσεια του συνδεδεμένου με μεμβράνη Ras και RhoA οδήγησε σε αυξημένη δραστηριότητα των αντίστοιχων μονοπατιών κατάντη σηματοδότησης: ενδοκυτταρικά επίπεδα GTP-δεσμευμένη Ras (Σχήμα 2D), ένα δείκτη της ενεργοποίησης Ras, και /2 φωσφορυλίωση ERK1 (Εικόνα 2D ), καθώς και τα ποσά των GTP-δεσμευμένη RhoA (Σχήμα 2Ε) και τη δραστικότητα του RhoA κινάσης (Σχήμα 2Ε) ήταν υψηλότερες σε MDR + ΗΤ29-dx και ΗΜΜ κύτταρα από MDR-ΗΤ29 κύτταρα.

θεραπεία ZA κατήργησε τις διαφορές μεταξύ MDR-και MDR + κύτταρα. Με την αναστολή FPP και σύνθεση GGPP (Σχήμα 2Β), ZA μειώθηκε τα ποσά των περιεχομένων Ras και RhoA (Σχήμα 2C), ενδοκυτταρική Ras-GTP και RhoA-GTP δεσμευμένη σε μεμβράνη, και τη δραστηριότητα των κατάντη οδών σηματοδότησης αυτών (Σχήμα 2D-Ε ). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν περισσότερο εμφανής σε MDR + ΗΤ29-DX και HMM κύτταρα από MDR-ΗΤ29 κύτταρα σύμφωνα με τη δραστηριότητά τους μονοπάτι MeV.

ZA μειώνει την έκφραση της Pgp με τη μείωση των HIF-1α ενεργοποίηση μέσω Ras /ERK1 /2 και RhoA /Rho-α προς τα κάτω ρύθμιση της κινάσης

HIF-1α, ένας κύριος ρυθμιστής πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων

MDR1

[29], μπορεί να γίνει συστατικά ενεργοποιείται ακόμα και κάτω από ορθοξικές συνθήκες κατά Serin φωσφορυλίωση από RhoA κινάσης [30 ] και κινάσες ΜΑΡ [31]. Φωσφορυλιωμένη (pHIF-1α) και μη φωσφορυλιωμένου HIF-1α ήταν μη ανιχνεύσιμες με στύπωμα Western σε MDR-ΗΤ29 κύτταρα, ενώ και οι δύο pHIF-1α και HIF-1α εκφράστηκαν σε MDR + ΗΤ29-dx και κυττάρων ΗΜΜ (Σχήμα 3Α). HIF-1α ήταν μεταγραφικά ενεργή σε MDR + κύτταρα, όπως φαίνεται από τα σημαντικά υψηλότερες ποσότητες πυρηνικών HIF-1 συνδέεται προς ειδική αλληλουχία DNA στόχο αυτού (Σχήμα 3Β). ΖΑ δεν είχε καμία επίδραση στην MDR-κύτταρα, ενώ μείωσε το ποσό των pHIF-1α και μείωσε την ολική HIF-1α επίπεδα και δραστηριότητα σε MDR + κύτταρα (Σχήμα 3Α-Β).

Α. Ανίχνευση φωσφορυλιωμένου (pHIF-1α) και το συνολικό HIF-1α σε MDR-ΗΤ29, και MDR + ΗΤ29-dx και ΗΜΜ κυττάρων μετά από επώαση 48 ωρών χωρίς (CTRL) ή με 1 mmol /L ΖΑ (ΖΑ). Β δράση του HIF-1 ήταν υψηλότερη (* p & lt? 0.001) σε κύτταρα MDR + ΗΤ29-DX και HMM από τα κύτταρα ΗΤ29. Μετά τη θεραπεία ΖΑ (όπως αναφέρθηκε στο Α), μία σημαντική μείωση της δραστηριότητας HIF-1 παρατηρήθηκε σε ΗΤ29-DX (° ρ & lt? 0.001) και κύτταρα ΗΜΜ (

◊p & lt? 0.001). Γ χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση του HIF-1α στο

MDR1

υποκινητή σε κύτταρα MDR-και MDR +, αντιμετωπίζονται όπως αναφέρεται στο σημείο α.

pro MDR1

: προϊόν PCR από ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα.

Είσοδος: προϊόν PCR από μη ανοσοκαταβυθίζονται δείγματα (γονιδιακό DNA).

Δεν Ab

: δείγματα επωάζονται απουσία του αντι-HIF-1α αντίσωμα. «-«: Κενό. Δ κηλίδωση Western ανίχνευση Pgp σε κύτταρα επεξεργασία όπως περιγράφεται στο ΑΕ Η ενδοκυτταρική doxorubicin μετρήθηκε spectrofluorimetrically: σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις ανιχνεύθηκαν σε ΗΤ29-DX και ΗΜΜ

vs κύτταρα

ΗΤ29 (* ρ & lt? 0.002), σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις στο ΖΑ-κατεργασμένων κυττάρων

vs

χωρίς θεραπεία (CTRL) ομολόγων (ΗΤ29-DX: ° ρ & lt? 0,02? ΗΜΜ:

◊p & lt? 0,02). Τα αποτελέσματα φαίνονται στους πίνακες Α, C και D είναι αντιπροσωπευτικά 3 πειραμάτων. Για πάνελ Β και Ε οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

HIF-1α ήταν μόνιμα συνδεδεμένο με το υποξία Response Element των

MDR1

προαγωγό σε MDR + κύτταρα ΗΤ29-DX και κυττάρων ΗΜΜ, αλλά όχι σε MDR-ΗΤ29 κύτταρα (Σχήμα 3C). Αυτό εξηγεί γιατί η έκφραση της πρωτεΐνης Pgp ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε MDR + κύτταρα (Σχήμα 3D) και γιατί αυτά τα κύτταρα έδειξαν σημαντικά χαμηλότερη κατακράτηση Dox από MDR-κύτταρα (Σχήμα 3Ε).

Θεραπεία

ZA αποτελεσματικά ακύρωσε HIF-1α που δεσμεύουν για το

MDR1

υποκινητή (Σχήμα 3C) και της έκφρασης Pgp (Εικόνα 3D), και αύξησε σημαντικά ενδοκυτταρικά επίπεδα Dox στο MDR + ΗΤ29-DX και HMM κύτταρα τα οποία έγιναν συγκρίσιμες με εκείνες που παρατηρήθηκαν σε MDR-ΗΤ29 κύτταρα ( Σχήμα 3Ε). Ενδοκυτταρική Dox διατήρηση σε MDR + κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη όταν ZA χορηγήθηκε πριν Dox, αλλά ούτε και

αντίστροφα

, ούτε όταν τα δύο φάρμακα χρησιμοποιούνται μαζί (Σχήμα S1).

Για την παροχή περαιτέρω στοιχεία ότι το ΖΑ-επαγόμενη Pgp κάτω ρύθμιση σε MDR + κυττάρων ήταν εξαρτάται pHIF-1α καταστολής μέσω ERK1 /2 και RhoA αναστολής κινάσης, side-by-side πειράματα πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία ειδικών αναστολέων της ERK1 /2 κινασών (PD98059) , RhoA κινάση (Y27632) και HIF-1 (YC-1). Σε MDR + ΗΜΜ κύτταρα αυτοί οι αναστολείς παρουσίασαν τα ίδια αποτελέσματα των ZA σε όρους pHIF-1α επίπεδα (Σχήμα 4Α), ο HIF-1 μεταγραφικής δραστικότητας (Σχήμα 4Β), της έκφρασης Pgp (Σχήμα 4C), και κατακράτηση Dox (Εικόνα 4D).

Α. Φωσφο (Ser) -HIF-1α (pHIF-1α) και το συνολικό HIF-1α έκφραση σε κύτταρα ΗΜΜ αφεθεί χωρίς θεραπεία (CTRL) ή θεραπεία για 24 ώρες στους 10 μmol /L με το ERK1 /2 PD98059 αναστολέα κινάσης (PD), RhoA αναστολέας κινάσης Y27632 (Y27), αναστολέα HIF-1α YC-1 (YC), και 1 mmol /L ZA για 48 ώρες. Τα δεδομένα GAPDH φαίνονται να επιβεβαιώνουν ισοδύναμο ανά πρωτεΐνη λωρίδα φόρτωσης. Β δράση του HIF-1 σε κύτταρα ΗΜΜ αφεθεί χωρίς θεραπεία (CTRL) ή επεξεργασμένα όπως αναφέρεται στον πίνακα Α Όλες οι διαφορές μεταξύ αντιμετωπίζονται

vs

μη επεξεργασμένα κύτταρα είναι στατιστικά σημαντική (* p & lt? 0,01).