Αφηρημένο

ΜίάΚίηβ (MDK) είναι ένας αυξητικός παράγοντας δέσμευσης ηπαρίνης που εκφράζεται έντονα σε πολλές κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του πνεύμονα. MDK ενεργοποιεί το μονοπάτι ΡΙ3Κ και επάγει αντι-αποπτωτική δραστηριότητα, με τη σειρά του την αύξηση της επιβίωσης των όγκων. Ως εκ τούτου, η αναστολή της MDK θεωρείται δυνητική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. Στην παρούσα εργασία, παρουσιάζουμε ένα μυθιστόρημα μικρό μόριο ένωση (iMDK) που στοχεύει MDK. iMDK ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του MDK-θετικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα Η441 που φιλοξενούν ένα ογκογόνο

KRAS

μετάλλαξη και H520 πλακωδών κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, και οι δύο εκ των οποίων είναι τύποι καρκίνου του πνεύμονα ανίατες. Ωστόσο, iMDK δεν μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων αδενοκαρκινώματος Α549 πνεύμονα MDK-αρνητικά ή κύτταρα φυσιολογικού ανθρώπινου πνεύμονα ινοβλαστών (NHLF) υποδεικνύοντας την ειδικότητα του. iMDK κατέστειλε την ενδογενή έκφραση του MDK αλλά όχι εκείνη των άλλων αυξητικών παραγόντων όπως ΡΤΝ ή VEGF. iMDK κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Η441 δι ‘αναστολής της οδού ΡΙ3Κ και επαγωγή απόπτωσης. Η συστηματική χορήγηση του iMDK ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού

in vivo

. Αναστολή της MDK με iMDK παρέχει μια πιθανή θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία των καρκίνων του πνεύμονα που οδηγούνται από MDK

Παράθεση:. Hao Η, Maeda Υ, Fukazawa Τ, Yamatsuji Τ, Takaoka Μ, Bao XH, et al . (2013) Αναστολή του αυξητικού παράγοντα MDK /ΜίάΚίηβ από την Ένωση Νέων μικρό μόριο να αντιμετωπίζονται οι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (8): e71093. doi: 10.1371 /journal.pone.0071093

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 23 του Μάρτη, 2013? Αποδεκτές: 25 Ιουν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Hao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) επιχορηγήσεις για JAW (https://report.nih.gov/index.aspx, αριθμός επιχορήγησης: HL095580, HL108907, HL110964), το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Πολιτισμού, την Ιαπωνία, να ΥΝ (https://www.jsps.go.jp/english/index.html, χορηγεί αριθμό: 23591950) και το Πανεπιστήμιο του Cincinnati Μεταδιδακτορικός Υπότροφος Προγράμματος Έρευνας για την ΥΜ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. MN είναι υπάλληλος μιας εμπορικής εταιρείας «SBI Pharmaceuticals Co., Ltd ‘. Ωστόσο, SBI Pharmaceuticals Co., Ltd δεν χρηματοδοτεί αυτή τη μελέτη και δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Απασχόλησης από το SBI Pharmaceuticals Co., Ltd. δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1,2]. Συμβατικά χημειοθεραπευτικά σχήματα στόχευση κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, αλλά επίσης φυσιολογικό πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Επί του παρόντος, η επιβίωση εξής συμβατική χημειοθεραπεία του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (το πιο συχνό τύπο του καρκίνου του πνεύμονα) παρέχει λιγότερο από το ένα έτος διάμεση επιβίωση από τη στιγμή της διάγνωσης [3]. Μοριακή μονοπάτι-ειδικών θεραπειών για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, π.χ., η στόχευση μεταλλαγμένο

EGFR

ή

ALK

συντήξεις, να περιορίσει την τοξικότητα μη-όγκου και παρατείνει το χρόνο επιβίωσης σε σύγκριση με τις συμβατικές χημειοθεραπείες [4] – [6 ]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία μοριακά στοχευμένη θεραπεία για το μεταλλαγμένο

KRAS

καθοδηγούμενου πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα, ο πιο συχνός τύπος αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα στον Καυκάσιο πληθυσμό. Επιπλέον, οι αποτελεσματικές μοριακά στοχευμένες θεραπείες έχουν αναπτυχθεί για αδενοκαρκινώματα, αλλά δεν καρκινώματα πλακωδών κυττάρων. Συνεπώς, ειδικές θεραπείες που στοχεύουν διάφορους τύπους όγκου πνεύμονα είναι απολύτως απαραίτητες [7] – [9].

ΜίάΚίηβ (MDK) είναι ένας δέσμευσης ηπαρίνης αυξητικός παράγοντας που εκφράζεται υψηλά σε πολλές κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του οισοφάγου, του στομάχου, του παχέος εντέρου, ηπατοκυτταρικού, του μαστού, των νεφρών και του παγκρέατος καρκίνωμα [10] – [15]. MDK συνδέεται με πολλαπλούς υποδοχείς μεμβρανών, ALK, syndecans, PTP και LRP, και στη συνέχεια ενεργοποιεί την κινάση ΡΙ3 (PI3K) και οδών ΜΑΡ κινάσης. Αυτές οι δύο οδοί επάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να ενισχύσει την αγγειογενετική και αντι-αποπτωτική δραστηριότητα [16], [17]. Αναστολή της

MDK από

siRNA καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων των καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν MDK [18], υποδεικνύοντας ότι MDK θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Δεδομένου ότι τα ποντίκια που στερούνται το

Mdk

γονίδιο είναι βιώσιμα [19], με στόχο MDK είναι μια ελκυστική θεραπευτική προσέγγιση, δεδομένου ότι η αναστολή του είναι απίθανο να έχει συστημικές επιβλαβή αποτελέσματα. Η αναγνώριση του πιθανού ρόλου του μονοπατιού MDK στη θεραπεία του καρκίνου του έχει αυξηθεί προσπάθειες για τον εντοπισμό αναστολέων MDK. Matsui et al. προσδιορίζονται συνθετικά πεπτίδια και οι ενώσεις που αναστέλλουν MDK μεσολάβηση κυτταρικής μετανάστευσης

in vitro

? Ωστόσο, αυτά αποδείχθηκε ότι δεν είναι ισχυροί και στερούνται κλινική χρησιμότητα [20].

Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε μια ένωση χαμηλού μοριακού βάρους (iMDK) που κατέστειλε την ενδογενή έκφραση MDK. iMDK ανέστειλε την ανάπτυξη του MDK εκφράζουν Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα που φιλοξενούν ένα ογκογόνο

KRAS

μετάλλαξη και H520 καρκίνο πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα κυττάρων

in vitro

. Επιπλέον, iMDK κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα και κυτταρικό θάνατο που επάγεται με αναστολή της οδού ΡΙ3 κινάσης και διέγερση απόπτωσης σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού που προέρχεται από κύτταρα αδενοκαρκινώματος Η441 πνεύμονα. Στόχευση η έκφραση του MDK παρέχει μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την θεραπεία των MDK εκφράζουν μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

3- [2 – (4-φθοροβενζυλο) ιμιδαζο [2,1-β] [1], [3] θειαζολ-6-υλ] -2Η-χρωμεν-2-όνη (εφεξής iMDK) αγοράστηκε από την ChemDiv (San Diego, CA) διαλύθηκε σε DMSO. PD0325901 (ένας αναστολέας ΜΕΚ) λήφθηκε από signalinginhibitors.com (Wedel, Σλέσβιχ Χολστάιν, Γερμανία).

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Τα ανθρώπινα πνευμονικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος H322, H358, Η441 και Α549 και τα πλακώδη κύτταρα καρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα H520 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (H322, H358, H520) ή υψηλής γλυκόζης τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Η441, Α549 κυττάρων) συμπληρωμένο με 10 % θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό. Τα ανθρώπινα κύτταρα κακοήθους μεσοθηλιώματος ACC-μεσο-1 (μεσο-1) που λαμβάνεται από JCRB Τράπεζας Κυττάρων (Osaka, Japan) και τα κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος SQ5 ευγενώς από τον Δρ Kiura Κατσουγιούκι (Τμήμα Αιματολογίας, Ογκολογίας, και πνευμονολογίας, Okayama University Graduate School της Ιατρικής, Οδοντιατρικής και Φαρμακευτικής Επιστημών, Οκαγιάμα, Ιαπωνία) [21] αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο βοοειδών. Οι κανονικές ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα NHLF κύτταρα που ελήφθησαν από την Clonetics (San Diego, CA) αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο υψηλής γλυκόζης ϋυΐββοοο. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε παγωμένο M-PER Ρυθμιστικού Λύσης που αγοράστηκαν από Thermo Fisher Scientific ( Rockford, IL). Τα κυτταρολύματα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση (20 λεπτά στα 15.000 χ g στους 4 ° C) και συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πρωτεΐνης BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα SDS-PAGE. Η γέλη ηλεκτροφορητικά μεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη μεταφοράς Hybond PVDF (GE Healthcare Ltd., Piscataway, NJ) και επωάστηκαν με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα σύμφωνα με την SuperSignal

® West Pico χημειοφωταύγειας πρωτόκολλο (Pierce, Rockford, IL). Αντίσωμα ειδικό για το αντίσωμα β-ακτίνης ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) και το αντίσωμα ειδικό για την ανθρώπινη MDK και ΡΤΝ (πλειοτροπίνη) ελήφθησαν από την Abcam (Cambridge, UK). Αντίσωμα ειδικό για κασπάση-3, ΡΙ3 p85 κινάση, φωσφορυλιωμένη-ΡΙ3Κ ρ85 (Tyr458) /p55 (Tyr199), ΑΚΤ, φωσφορυλιωμένη-ΑΚΤ (Ser473), ERK1 /2, φωσφορυλιωμένη-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38MAPK, φωσφορυλιωμένη-p38 ΜΑΡΚ (Thr180 /yr182), Bad, ΧΙΑΡ, survivin ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντίσωμα ειδικό για τον VEGF αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα Δευτερεύουσα χρένο ελήφθησαν από Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, ΡΑ).

siRNA μεσολαβεί αναστολή της MDK

A. κύτταρα Η441 τοποθετήθηκαν σε μια 12-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Την επόμενη ημέρα 100 pmol από δύο διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν MDK (D-003677-02-0050 και D-003677-03-0050) ή nontargeting siRNA (Thermo Scientific) επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας 2 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο χρόνος επώασης για αντιδραστήρια διαμόλυνσης ήταν 24 ώρες, στον οποίο χρόνο το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​κανονικό μέσο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για δοκιμασίες ανοσοκηλίδωση και την ανάπτυξη των κυττάρων.

Κυτταρική βιωσιμότητα

δοκιμασία

Η441 κύτταρα, κύτταρα Α549, H520 κύτταρα, κύτταρα ΗΕΚ293 και τα κύτταρα NHLF απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε με αναρρόφηση και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας που περιέχει iMDK διαλύθηκε σε DMSO (10, 50, 100, 500 nmol /L). DMSO μόνο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες και συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Τα βιώσιμα κύτταρα αξιολογήθηκε με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου και WST-1 ανιχνεύσεις (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Quebec, Canada) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ανασυνδυασμένη MDK αγοράστηκε από την R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ) και να ανασυσταθεί σε νερό για πειράματα μπλοκ. Για πειράματα μπλοκ MDK, Η441 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco συμπληρωμένο με 1% εμβρυϊκό βόειο θερμοαπενεργοποιημένο τη διάρκεια της νύχτας και το ανασυνδυασμένο MDK (25 ηΜ) ή /και iMDK (25 ηΜ) προστέθηκε για επιπλέον 48 ώρες.

Hoechst χρώση

μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας χρωστική Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR), το οποίο χρωματίζει το DNA. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μg /ml χρωστικής Hoechst και στη συνέχεια ορατά κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (IX81, η Olympus Medical Systems Corp., Τόκιο, Ιαπωνία) [22].

ΤΟΥΝΕΛ χρώση

Τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick-βιοτίνης τέλος επισήμανση χρώσης (TUNEL) διεξήχθη για την ανίχνευση της απόπτωσης που χρησιμοποιούν το σύστημα αδιέξοδο χρωμομετρική TUNEL (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για απόπτωση

τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 0,5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο 1 ημέρα πριν τις θεραπείες. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 0,2% Triton Χ-100 και 1 mg /ml RNase για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο στα 50 μg /ml για τον προσδιορισμό υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA, χρησιμοποιώντας FACScan. Ζεύγη, τα κυτταρικά θραύσματα και αντικείμενα καθήλωση περιορίστηκαν, και υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Cell Quest Ver. 3.3 Κατεβάστε το

Ποντίκι πειράματα

Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας κριτική για τα πειράματα σε ζώα της Okayama University Graduate School της Ιατρικής και Οδοντιατρικής. (Αριθμός αναφοράς Επιτροπή Δεοντολογίας: OKU-2011472). Ανθρώπινα πνεύμονα ξενομοσχεύματα καρκίνου καθιερώθηκαν σε 6 εβδομάδων θηλυκούς BALB /c γυμνά ποντίκια (Charles River Laboratories Ιαπωνία, Kanagawa, Ιαπωνία) με υποδόρια (sc) εμβολιασμό Η441 κύτταρα (1 χ 10

6/50 μΐ) αναμιγνύονται με Matrigel

® (BD Pharmingen, San Diego, CA? 50 μΙ) εντός της ραχιαίας πλευρό [23]. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (η = 8 ανά ομάδα) 14 ημέρες μετά εμβολιασμούς όγκου. Μία ομάδα ποντικών ενδοπεριτοναϊκώς σε επεξεργασία με 100 μΙ διαλύματος που περιείχε iMDK (9 mg /kg) τρεις ημέρες την εβδομάδα (τις ημέρες 1, 3, 5, 8, 10) και μια άλλη ομάδα ποντικών υποβλήθηκε σε επεξεργασία πέντε ημέρες την εβδομάδα (κατά τις ημέρες 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10). DMSO χορηγήθηκε στην ομάδα ελέγχου. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο έως τρεις φορές την εβδομάδα, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως × b

2 χ 0,5, όπου Α και Β ήταν μεγάλες και μικρές διαμέτρους, αντίστοιχα. Την ημέρα 10, το σωματικό βάρος μετρήθηκε και όλοι οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρούνται και προετοιμάζονται για ιστολογική εξέταση. Για την ανάλυση της AST ορού και ALT, ελήφθη αίμα από την καρδιά 48 ώρες μετά την αγωγή με iMDK (9 mg /kg).

Για ανοσοϊστοχημεία, οι τομές διαδοχικά αποπαραφινοποιήθηκαν μέσα από μια σειρά ξυλόλιο, διαβαθμισμένη αιθανόλη, και τα βήματα εμβάπτιση σε νερό. Αφού αυτόκλειστο σε ρυθμιστικό κιτρικού 0,2% για 15 λεπτά, οι τομές επωάστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 30 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Ένα κύριο αντίσωμα ειδικό για φωσφορυλιωμένη-ΡΙ3Κ ρ85 (Tyr458) /p55 (Tyr199) ελήφθη από την Cell Signaling Technology. Τα αντισώματα για MDK και CD31 /PECAM-1 ήταν από Abcam. Το αντίσωμα για VEGF ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αραίωση 1:200 αντισώματος που ακολουθείται από τρεις πλύσεις με TBS. Τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με στρεπταβιδίνη-βιοτίνη σύμπλοκο (Envision System σημασμένο πολυμερές, υπεροξειδάση κοχλιαρίας [HRP], Dako, Carpinteria, CA) για 60 λεπτά σε μια αραίωση 1:100. Ανοσοαντιδράσεις οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) διάλυμα υποστρώματος-χρωμογόνου (Dako Cytomation Liquid DAB Substrate Chromogen System, Dako) και με αιματοξυλίνη. Οι τομές εμβαπτίζονται σε ένα λουτρό αιθανόλης και ξυλόλιο και στερεώθηκαν για εξέταση.

Στατιστική ανάλυση

στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ μέσων και διαμέσους των ομάδων μελέτης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p & lt? 0,05 (#) ή ρ & lt? 0,01 (*)

Αποτελέσματα

Η αναστολή της MDK μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων Η441 αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα

Για. να βρει μια κυτταρική γραμμή NSCLC που εξαρτάται από MDK για την κυτταρική ανάπτυξη, αξιολογήσαμε την ενδογενή έκφραση της πρωτεΐνης MDK σε τέσσερα διαφορετικά NSCLC κυττάρων l Ines και (Normal Human ινοβλαστών πνεύμονος) κύτταρα NHLF. εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ293 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για έκφραση MDK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, MDK ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293, Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα και κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος H520 αλλά όχι σε Α549, H322 και H358 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, τα κύτταρα SQ5 πνεύμονα πλακώδους καρκινώματος ή MESO 1-κακοήθη κύτταρα μεσοθηλιώματος . MDK δεν εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα NHLF. Η κυτταρική γραμμή Η441 προέρχεται από ένα NSCLC όγκου πνεύμονα που έχει μια

KRAS

μετάλλαξη. Ενεργός

RAS

είναι η συνηθέστερη μετάλλαξη που σχετίζεται με πνευμονική αδενοκαρκινώματα στον Καυκάσιο πληθυσμό και αποτελεσματικές θεραπείες για την ασθένεια αυτή δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί [24]. Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα Η441 εξαρτώνται MDK για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, μπορούμε αναστέλλεται MDK χρησιμοποιώντας siRNA και εξετάστηκαν κυτταρικής ανάπτυξης υπό την παρουσία και απουσία του MDK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, δύο διαφορετικά siRNAs MDK καταστέλλεται MDK σε Η441 κύτταρα σε σύγκριση με μη-στόχευση siRNA. Η αναστολή της ανάπτυξης ήταν σημαντικά προκαλείται από την καταστολή της MDK (ρ & lt? 0,01? Σχήμα 1Γ). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η στόχευση MDK είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του MDK εκφράζουν μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα.

MDK ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293, Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και κύτταρα καρκινώματος πλακωδών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα H520 αλλά όχι στα άλλα είδη κυττάρων συμπεριλαμβανομένων NHLF (Normal Human ινοβλαστών πνεύμονος) κύτταρα. Πρωτεΐνη έκφραση MDK και μ-ακτίνη επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωση όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Α MDK κατεστάλη από δύο διαφορετικά siRNAs MDK (MDK siRNA1 και MDK siRNA2) σε κύτταρα Η441. Η έκφραση της πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωση όπως περιγράφεται στην αναστολή Α Β ανάπτυξη σε κύτταρα Η441 μετά γονίδιο MDK σίγηση ήταν σημαντικά αυξημένη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p & lt?. 0,01 (*)

Η

iMDK αναστέλλει την ενδογενή έκφραση MDK σε Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα

Για να βρείτε μια θεραπευτική ένωση που αναστέλλει την έκφραση MDK, εμείς αναπτύχθηκε για πρώτη φορά μια κυτταρική γραμμή MDK ανταποκριτού από σταθερώς επιμόλυνση ΗΕΚ293 κυττάρων με ένα μόρφωμα υποκινητή MDK-συγχωνευμένο λουσιφεράσης. Χρησιμοποιήσαμε αυτό τροποποιημένη κυτταρική σειρά για τη διαλογή 44.000 ενώσεων στον Discovery Center Drug στο Πανεπιστήμιο του Cincinnati. Ανίχνευση της δραστικότητας λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να πιστοποιηθούν αναστολείς MDK. Σε αυτή την εξέταση, προσδιορίσαμε μία ένωση (3- [2- (4-φθοροβενζυλο) ιμιδαζο [2,1-β] [1], [3] θειαζολ-6-υλ] -2Η-χρωμεν-2-όνη? Εφεξής iMDK, Σχήμα 2Α) που αναπαραγώγιμα ανέστειλε την ενδογενή πρωτεΐνη MDK Expre σχάσης. Αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα των iMDK για την ικανότητά του να αναστέλλει ειδικά την έκφραση του MDK σε Η441 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, iMDK ανέστειλε την ενδογενή MDK με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά δεν αναστέλλει ΡΤΝ (πλειοτροπίνη), η οποία έχει σημαντική ομολογία με MDK [17]. Ούτε iMDK παρεμποδίζει άλλο παράγοντα ανάπτυξης, VEGF, σε Η441 κύτταρα του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα 48 ώρες μετά τη θεραπεία.

Α. Δομή του iMDK (3- [2- (4-φθοροβενζυλο) ιμιδαζο [2,1-β] [1], [3] θειαζολ-6-υλ] -2Η-χρωμεν-2-όνη). B. MDK αλλά όχι ΡΤΝ ή VEGF καταστάλθηκε από iMDK δοσοεξαρτώμενο σε Η441 κύτταρα 48 ώρες μετά τη θεραπεία. ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

Η

iMDK αναστέλλει κυτταρική βιωσιμότητα του MDK εκφράζουν μη-μικρών κυττάρων πνεύμονα

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η αποτελεσματικότητα και ειδικότητα της iMDK στην καταστολή MDK καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν, υποβάλλαμε σε αγωγή και τις δύο MDK-θετικών και MDK-αρνητικά κύτταρα με iMDK και αξιολογείται η βιωσιμότητα των κυττάρων. MDK εκφράζεται σε κύτταρα εμβρυϊκού νεφρού ΗΕΚ293, Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και κύτταρα πλακώδες καρκίνωμα πνεύμονα H520 αλλά όχι σε κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Α549 ή κύτταρα μη μετασχηματισμένα NHLF (Σχήμα 1Α). Αυτές οι πέντε κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα εύρος συγκεντρώσεων iMDK (0 έως 500 ηΜ) και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Η αναστολή της ανάπτυξης από iMDK ήταν δοσοεξαρτώμενο επάγεται στο MDK-θετικά ΗΕΚ293, Η441 και Η520 κύτταρα, αλλά όχι το MDK-αρνητικά κύτταρα Α549 ή μη μετασχηματισμένα κύτταρα NHLF (Σχήμα 3Α, S1). Μορφολογικά, η καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Η441 ήταν δοσοεξαρτώμενο παρατηρήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία με iMDK (Σχήμα 3Β). Η καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης με iMDK μερικώς δεσμεύεται δια προκατεργασίας με ανασυνδυασμένη MDK (25 ηΜ) στις MDK-θετικών κυττάρων Η441? Ωστόσο, προκατεργασία με ανασυνδυασμένη MDK δεν μετέβαλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων στα MDK-αρνητικά κύτταρα Α549 (Εικόνα S2). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η κατασταλτική επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη από iMDK προκαλείται τουλάχιστον εν μέρει από την αναστολή της έκφρασης MDK.

Β. Η αναστολή της ανάπτυξης από iMDK αυξήθηκε στο MDK-θετικά ΗΕΚ293, Η441 και Η520 κύτταρα, αλλά όχι το MDK-αρνητικά κύτταρα Α549 ή φυσιολογικά κύτταρα NHLF μετά από 48 ώρες θεραπείας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε ως ρ & lt? 0.01 (*). Δόση εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης από iMDK παρατηρήθηκε μορφολογικά σε Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Εμφανίζονται είναι μικροφωτογραφίες φάσης-αντίθεσης των κυττάρων Η441 48 ώρες μετά τη θεραπεία iMDK (γραμμή κλίμακας δείχνει 100 μm).

Η

iMDK προκαλεί απόπτωση σε Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα

Για να κατανοήσουμε το μηχανισμός με τον οποίο iMDK αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων Η441, αξιολογήσαμε τα κύτταρα για απόπτωση 48 ώρες μετά τη θεραπεία με iMDK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ιδιαίτερα συμπυκνωμένο και εν μέρει αποσπασματική πυρήνες παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Η441, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα NHLF μετά τη θεραπεία με iMDK, υποδεικνύοντας ότι iMDK επαγόμενη απόπτωση σε MDK εκφράζουν Η441 κύτταρα. TUNEL θετικά κύτταρα επίσης αυξήθηκαν σημαντικά σε Η441 κύτταρα ώρες μετά τη θεραπεία iMDK με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την επαγωγή απόπτωσης από iMDK. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, διασπασμένο μορφές της κασπάσης-3, ένας δείκτης της απόπτωσης που επάγεται από iMDK ακόμη και στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις (5 ηΜ) σε κύτταρα Η441 48 ώρες μετά τη θεραπεία. υπο-G

0 /G

περιεχόμενο 1 DNA των κυττάρων Η441 ήταν ιδιαίτερα αυξήθηκε από 1,24% (έλεγχος DMSO) έως 37,00% (10 ηΜ) και 60,91% (25 ηΜ) 72 ώρες μετά την αγωγή με iMDK. Ωστόσο, υπο-G

0G

1 DNA περιεχόμενο των κυττάρων NHLF ήταν ελάχιστα αυξήθηκε από 0,32% (έλεγχος DMSO) έως 0,52% (10 ηΜ) και 1,51% (25 nm) μετά από κατεργασία με iMDK (Εικόνα 4D) . Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι iMDK επάγει εκλεκτικά απόπτωση σε MDK εκφράζουν Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα NHLF που δεν εκφράζουν MDK.

iMDK δοσοεξαρτώμενο αυξημένη απόπτωση σε Η441 κύτταρα, αλλά όχι κανονικά κύτταρα NHLF . Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις iMDK για 72 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με χρωστική Hoechst 33342 και αναλύθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (γραμμή κλίμακας δείχνει 50 μm). Η απόπτωση προκλήθηκε σε κύτταρα Η441 48 ώρες μετά τη θεραπεία iMDK σε συγκέντρωση 25 ηΜ (άνω πάνελ, γραμμή κλίμακας δείχνει 200 ​​μm). TUNEL θετικά κύτταρα αυξήθηκαν με επεξεργασία iMDK με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (κάτω πίνακας). χρώση TUNEL εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε ως ρ & lt? 0,05 (#). Α διασπασμένη κασπάση 3, ένας δείκτης της απόπτωσης, αυξήθηκαν σε κύτταρα Η441 μετά από θεραπεία iMDK. κύτταρα Η441 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με iMDK στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και συγκομιδής για ανάλυση ανοσοστυπώματος όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Δ iMDK που προκαλείται από υπο-G

0 /G

1 περιεχόμενο DNA σε κύτταρα Η441. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με iMDK για 72 ώρες και το περιεχόμενο DNA μετρήθηκε με ιωδιούχο προπίδιο λεκέ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

Η

iMDK καταστέλλει την ΡΙ3Κ και επάγει τα αποπτωτικά μονοπάτια σε Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα

ΡΙ3Κ εμπλέκεται στην ογκογένεση με την ενεργοποίηση ΑΚΤ, η οποία με τη σειρά του αυξάνει αντι-αποπτωτικών παραγόντων, όπως ΧΙΑΡ και survivin, και μειώνει ένα προ-αποπτωτικό παράγοντα BAD [25] – [27]. Από MDK ενεργοποιεί δράση ΡΙ3Κ [16], [28], επιδιώξαμε να καθοριστεί αν η οδός ΡΙ3Κ καταστάλθηκε από iMDK μεσολάβηση αναστολή MDK σε Η441 κύτταρα. Η φωσφορυλίωση των ΡΙ3Κ και ΑΚΤ κατεστάλησαν με iMDK σε δοσο (Σχήμα 5Α) και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Β), υποδεικνύοντας ότι η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ αναστέλλεται από iMDK. Αντι-αποπτωτικά παράγοντες, ΧΙΑΡ και survivin, μειώθηκαν ενώ το προ-αποπτωτικό παράγοντα, BAD, προκλήθηκε με iMDK σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5), υποδεικνύοντας ότι το αποπτωτικό μονοπάτι επάγεται από iMDK. MDK είναι επίσης γνωστή για την ενεργοποίηση της ERK (α ΜΑΡΚ) σε φυσιολογικά μη ογκογόνα κύτταρα [16], [28]? Ωστόσο, ERK και p38MAPK δεν ανεστάλησαν από iMDK σε Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (Σχήμα S3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι iMDK καταστέλλει την ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού αλλά όχι η οδός ΜΑΡΚ και τη σειρά του προκαλεί απόπτωση σε κύτταρα Η441.

A. Δοσοεξαρτώμενο, φωσφορυλίωση ΡΙ3Κ και ΑΚΤ και την έκφραση της survivin και ΧΙΑΡ, αντι-αποπτωτικών παραγόντων, μειώθηκαν ενώ η έκφραση του BAD, ένα προ-αποπτωτικό παράγοντα, αυξήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία με iMDK. Ορατή είναι ανοσοαποτύπωμα πραγματοποιείται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Β Time-εξαρτώμενο, φωσφορυλίωση ΡΙ3Κ και ΑΚΤ και την έκφραση της survivin και ΧΙΑΡ μειώθηκαν, ενώ η έκφραση του BAD αυξήθηκε με κατεργασία με iMDK σε συγκέντρωση 50 ηΜ. Ανοσοστύπωμα εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους.

Η

iMDK καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα και επάγει την απόπτωση σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού

Προκειμένου να προσδιοριστεί αν η συστηματική χορήγηση του iMDK καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, iMDK (9 mg /kg) ενδοπεριτοναϊκώς είτε 3 ή 5 φορές την εβδομάδα σε γυμνά ποντίκια που φέρουν ξενομοσχεύματα που προέρχονται από Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Πνεύμονα ξενομοσχευμάτων όγκου συνέχισε να αναπτύσσεται κατά τον έλεγχο (DMSO αγωγή) ομάδα, ενώ η αύξηση του όγκου των πνευμόνων συνελήφθη στις ομάδες iMDK-θεραπεία. Ο όγκος των όγκων στην ομάδα iMDK αγωγή ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 6Α και 6Β). MDK και φωσφορυλιωμένη ΡΙ3Κ παρατηρήθηκαν σε όγκους του πνεύμονα των ποντικών ελέγχου, αλλά όχι στις iMDK αγωγή ποντίκια (Σχήμα 6C), συνεπής με το

in vitro

μελέτες (Σχήμα 5). DNA κατακερματισμού ανιχνεύεται με χρώση TUNEL προκλήθηκε σε όγκους ποντικών iMDK αγωγή αλλά όχι σε εκείνες από ποντικούς αναφοράς (Σχήμα 6D), υποδεικνύοντας ότι επάγει απόπτωση iMDK

in vivo

επίσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία της iMDK δεν επηρέασε τα επίπεδα του σωματικού βάρους και του ορού του AST και ALT στα ποντίκια (Εικόνα S4), γεγονός που υποδηλώνει ότι iMDK δεν προκαλεί συστηματική τοξικότητα.

A. Όγκος των όγκων που προέρχονται από Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα μειώθηκε μετά από αγωγή με iMDK (9 mg /kg) σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. DMSO χρησιμοποιήθηκε για την ομάδα ελέγχου. iMDK χορηγήθηκε 3 φορές /εβδομάδα ή 5 φορές /εβδομάδα, όπως φαίνεται. Οκτώ ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα. Ο όγκος του όγκου παρακολουθήθηκε καθημερινά μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων Η441. Η ανάπτυξη του όγκου εκφράζεται ως μέσο μέγεθος όγκων? μπάρες αντιπροσωπεύουν SD. Η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε ως ρ & lt? 0.01 (*). Β Ορατή είναι μια εικόνα των όγκων ξενομοσχεύματος προέρχονται από κύτταρα Η441, τα οποία αποκόπηκαν από τους ποντικούς ξενομοσχεύματος 10 ημέρες μετά την αγωγή με iMDK. Έκφραση των MDK και φωσφορυλίωση ΡΙ3Κ (pPI3K) μειώθηκαν κατά την επεξεργασία iMDK σε ξενομοσχεύματος όγκους. Η έκφραση ενός αγγειογένεσης CD31 δείκτη /PECAM-1 αναστέλλεται από iMDK αν και έκφραση ενός παράγοντα VEGF αγγειογένεση ανάπτυξης δεν μεταβλήθηκε. Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τα τμήματα του όγκου ξενομοσχεύματος, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Έλεγχος είναι από την ομάδα στην οποία χορηγήθηκε DMSO. (Γραμμή κλίμακας δείχνει 100 μm). iMDK απόπτωση που επάγεται

in vivo

. χρώση TUNEL με τους όγκους ξενομοσχεύματος αγωγή DMSO (έλεγχος) ή iMDK εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (γραμμή κλίμακας δείχνει 200 ​​μm).

Η

Από MDK είναι γνωστό ότι επάγει την αγγειογένεση [29], επιδιώξαμε αν η αναστολή της αγγειογένεσης με iMDK μπορούσε εν μέρει να συμβάλει στη μείωση των όγκων του πνεύμονα

in vivo

. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6C, η έκφραση του VEGF, μία άλλη ανάπτυξη της αγγειογένεσης παράγοντα [30], δεν είχε μεταβληθεί, συνεπής με το

in vitro

μελέτη (Σχήμα 2)? Ωστόσο, η έκφραση του CD31 /PECAM-1, ένας δείκτης της αγγειογένεσης [30], ήταν μειωμένη σε όγκους του πνεύμονα αντιμετωπίζονται από iMDK, υποδεικνύοντας ότι iMDK αναστέλλει την αγγειογένεση ανεξάρτητα του VEGF και με τη σειρά καταστέλλει πνεύμονα ογκογένεση

in vivo

. Αυτές

in vivo

αποτελέσματα δείχνουν ότι iMDK είναι πιθανό να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική αντι-ογκογόνο /αγγειογενετικών φαρμάκων που στοχεύουν MDK εκφράζουν τον καρκίνο του πνεύμονα χωρίς παρενέργειες.

Συζήτηση

Η επιτυχία των μικρών μορίων αναστολής ειδικά λειτουργία EGFR στην μετάλλαξη

EGFR

καθοδηγούμενου αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα έχει προωθήσει μοριακό στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο του πνεύμονα [4], [5], [31], [32]. Από την άλλη πλευρά, στοχευμένες θεραπείες για μεταλλαγμένο

KRAS

αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και καθοδηγούμενου από πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, δεν έχουν αναπτυχθεί άλλες από τη χημειοθεραπεία που στοχεύουν αμφότερα τα καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [7] – [9]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε εντοπίσει ένα μικρό μόριο ένωσης iMDK που αναστέλλει την έκφραση του MDK, ενός όγκου προαγωγής παράγοντα ανάπτυξης. iMDK ανέστειλε την PI3K /AKT οδό και κατέστειλε

KRAS

-mutated αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα από επαγωγή της απόπτωσης

in vitro

και

in vivo

. iMDK δεν θέτει σε κίνδυνο την βιωσιμότητα των φυσιολογικών κυττάρων που πολλαπλασιάζονται NHLF. Περαιτέρω, καμία εμφανής συστημική τοξικότητα παρατηρήθηκε σε ποντικούς που iMDK αγωγή, υποστηρίζοντας την πιθανή χρησιμότητα iMDK για θεραπεία του αδενοκαρκινώματος MDK-εξαρτώμενη πνεύμονα.

MDK είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί όχι μόνο την ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού, αλλά και το ΜΑΡΚ μονοπάτι σε πρωτογενείς καλλιέργειας νευρώνων [16] και του μυοκαρδίου [28]? Ωστόσο, στη μελέτη μας iMDK ανέστειλε μόνο το μονοπάτι ΡΙ3Κ αλλά όχι το μονοπάτι ΜΑΡΚ, και στην πραγματικότητα ενεργοποίησε το μονοπάτι ΜΑΡΚ σε Η441 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (Σχήμα S3). Ο μηχανισμός με τον οποίο iMDK αναστέλλει μόνο την οδό της ΡΙ3Κ, αλλά όχι το μονοπάτι ΜΑΡΚ είναι άγνωστη. Η προς τα πάνω ρύθμιση του μονοπατιού ΜΑΡΚ μπορούσε να είναι αντισταθμιστική ενεργοποίηση από τον προς τα κάτω ρύθμιση του μονοπατιού ΡΙ3Κ στα κύτταρα Η441. Η θεραπεία των κυττάρων Η441 με τον αναστολέα ΜΑΡΚ (PD0325901) ή τον αναστολέα ΡΙ3Κ /ΑΚΤ (LY294002) δεν επηρέασε την έκφραση των MDK (Σχήμα S5 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι η καταστολή της MDK με iMDK δεν διαμεσολαβείται μέσω του ΜΑΡΚ και τις οδούς ΡΙ3Κ /ΑΚΤ.

Από MDK εκφράζεται έντονα σε ηπατοκυτταρικό, γαστρικό, του παχέως και του προστάτη [17], ο αναστολέας MDK iMDK μπορεί να είναι χρήσιμη για την αγωγή μη-πνευμονικών όγκων, καθώς και. Επίσης, η έκφραση MDK συνδέεται με διάφορες φλεγμονώδεις ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της ρευματοειδούς αρθρίτιδας και αθηροσκλήρωσης [19], [33].

Mdk

-knockout ποντικοί είναι ανθεκτικοί στην ανάπτυξη της ρευματοειδούς αρθρίτιδας προλαμβάνοντας φλεγμονώδη μετανάστευση λευκοκυττάρων και τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών [33]. Τα ποντίκια knockout είναι επίσης ανθεκτικά στο σχηματισμό νέου έσω χιτώνα, ένα κοινό χαρακτηριστικό της αθηροσκλήρωσης και επαναστένωσης [34]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι iMDK μπορεί να είναι χρήσιμη για την αγωγή αυτών των μη ογκογόνων νόσων, καθώς και.

Εκτός iMDK, εντοπίσαμε μια άλλη ένωση μικρού μορίου το οποίο κατέστειλε επίσης την έκφραση του MDK. Η άλλη ένωση έχει Cl αντί για F στη δομή του μορίου iMDK και ασκεί παρόμοια επίδραση δόσης στα iMDK (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι iMDK μπορεί να τροποποιηθεί δομικά να είναι πιο αποτελεσματικές και ασφαλείς. Δεδομένου ότι η έκταση της αναστολής του

MDK

RNA ήταν μικρότερη από εκείνη του MDK πρωτεΐνης (τα δεδομένα δεν φαίνονται), iMDK μπορούν να στοχεύουν άμεσα την πρωτεΐνη MDK. Βιοτίνη-tagged iMDK ή ραδιοϊσότοπο επισημασμένο iMDK θα πρέπει να ταυτοποιηθούν μόρια ή παράγοντες που συνδέουν άμεσα με iMDK, η οποία θα οδηγήσει στην κατανόηση του μηχανισμού (ες) με την οποία iMDK αναστέλλει την έκφραση MDK.

Εν ολίγοις, έχουμε διαπιστώσει ότι η iMDK αναστολέας MDK καταστέλλει μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα εκφράζει MDK

in vitro

και

in vivo

χωρίς να βλάπτουν τα φυσιολογικά κύτταρα. Αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες, συμπεριλαμβανομένης της αναγνώρισης των άμεσων στόχων iMDK, επιπλέον δομική τροποποίηση και την επικύρωση της ασφάλειας, iMDK φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία για

KRAS

μεταλλαγμένο πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων και, ενδεχομένως, για τη θεραπεία άλλων καρκίνων και χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. αναστολή

ανάπτυξη από iMDK αυξήθηκε στα κύτταρα MDK εκφράζουν. iMDK προκαλούμενη αναστολή ανάπτυξης σε MDK-θετικά κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα και Η441 εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ293 αλλά όχι σε MDK-αρνητικά κύτταρα καρκινώματος Α549 πνεύμονα. μπαρ, SD.