Αφηρημένο

Up-ρύθμιση του γονιδίου απόπτωσης-ρυθμιστικές

Mcl-1

(μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων-1) λαμβάνει χώρα σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου και συνδέεται με αντοχή φαρμάκου για θεραπείες του καρκίνου. Είναι καλά γνωστό ότι Mcl-1 προ-mRNA υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα γεγονότα για να παράγει δύο λειτουργικά διακριτές πρωτεΐνες, Mcl-1

S (προ-αποπτωτική) και Mcl-l

L (αντι-αποπτωτική)? ο τελευταίος ισομορφή είναι κυρίαρχο σε διαφορετικές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του μαστού και του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε ότι το RNA-πρωτεΐνης δέσμευσης (RBP), και πρωτο-ογκογονίδιο SRSF1 (σερίνη και πλούσια σε αργινίνη παράγοντας ματίσματος 1) επηρεάζει το μάτισμα του Mcl-1 σε αμφότερα MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού και τα κύτταρα JAR χοριοκαρκινώματος? μπορούμε επίσης δείχνουν για πρώτη φορά ότι ένα άλλο RBP SRSF5 επηρεάζει μάτισμα του Mcl-1 στα κύτταρα MCF-7. Επιπλέον, αναφέρουμε ότι SRSF1 εμπλέκεται σε άλλες πτυχές της ρύθμισης Mcl-1 με knockdown του SRSF1, με RNAi, με αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση στα επίπεδα Mcl-1 πρωτεΐνης σε κύτταρα MCF-7, αλλά μια αύξηση στα κύτταρα JAR, αντίστοιχα, με ενδεχομένως επηρεάζουν τη σταθερότητα της πρωτεΐνης και τη μετάφραση των Mcl-l. Τα βασικά ευρήματα από τη μελέτη αυτή τονίζουν τη σημασία της κυτταρικής πλαίσιο των διαφόρων καρκινικών κυττάρων για τη λειτουργία του πολυλειτουργικού RBPs όπως SRSF1 και έχουν συνέπειες για τις θεραπευτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται για τη στόχευση Mcl-1

Παράθεση:. Gautrey HL, Tyson -Capper AJ (2012) κανονισμός του Mcl-1 από SRSF1 και SRSF5 στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (12): e51497. doi: 10.1371 /journal.pone.0051497

Συντάκτης: Justin L. Mott, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Ιουλίου του 2012? Δεκτές: 1 Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Δεκεμβρίου, 2012 |

Copyright: © 2012 Gautrey, Tyson-Capper. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση που χορηγούνται από το Ίδρυμα JGW Patterson και συμπληρωματική χρηματοδότηση από το Newcastle Healthcare Charity (RVI /NGH) και Newcastle upon Tyne Νοσοκομεία του ΕΣΥ φιλανθρωπία (FH). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μια σημαντική διαδικασία που εμπλέκονται στην κανονική ομοιοστασία ανάπτυξη και ιστών, και η απορρύθμιση του μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο. Ένας σημαντικός αριθμός παραγόντων απόπτωσης έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται από εναλλακτικό μάτισμα? Αυτό περιλαμβάνει την οικογένεια Bcl-2 πρωτείνη η οποία ελέγχει την εγγενή (μιτοχονδριακό) κυτταρικό θάνατο οδού [1], [2], Σχήμα 1Α. Η οικογένεια Bcl-2 περιλαμβάνει τόσο προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, και είναι η ισορροπία μεταξύ των δύο η οποία καθορίζει αν η οδός ενεργοποιείται [3], [4]. Η οικογένεια Bcl-2 μπορούν να υποδιαιρεθούν σε τρεις ομάδες με βάση τη δομή και τη λειτουργία τους. Οι αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 περιέχουν πολλαπλές ομολογίας Bcl-2 (ΒΗ) και έτσι είναι δομικά παρόμοια με Bcl-2, το οποίο είναι επίσης ένα μέλος αυτής της ομάδας. Τα προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 διαιρείται σε δύο υποομάδες, η πρώτη ομάδα είναι επίσης δομικά παρόμοιες με Bcl-2 με πολλαπλούς ΒΗ περιοχές, και περιλαμβάνουν τις πρωτεΐνες Bak και Βαχ. Η δεύτερη ομάδα των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών περιέχει μόνο την περιοχή ΒΗ3. Η απόπτωση ενεργοποιείται όταν οι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bak και Βαχ προκαλέσει μιτοχονδριακή διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης. Τα αντι-αποπτωτικά Bcl-2 μελών της οικογένειας αποφευχθεί αυτό με σύνδεση προς τις προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Bak. Η ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες μπορούν να ενεργοποιήσουν την απόπτωση μέσω δύο οδών, πρώτον μέσω της άμεσης ενεργοποίησης του Bak και Βαχ, και, δεύτερον, με τη δέσμευση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, που επιτρέπει την απελευθέρωση του Bak και Βαχ.

Mcl-1 είναι ένα μέλος της οικογένειας Bcl-2 των ρυθμιστών της απόπτωσης. Η υπερέκφραση του Mcl-1 έχει βρεθεί σε ένα ευρύ φάσμα καρκινικών ιστών [5], [6], [7], καθώς επίσης και κυτταρικές γραμμές καρκίνου [8]. Επιπλέον, αυξημένη έκφραση του Mcl-1 έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού [9]. Mcl-1 φαίνεται επίσης ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας που εμπλέκεται στην αντίσταση σε θεραπείες καρκίνου, και προς τα κάτω ρύθμιση του αποδείχθηκε αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης [7], [10], [11], [12].

Ο

Mcl-1

γονίδιο περιέχει τρία εξώνια και κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες, το αντι-αποπτωτικό Mcl-1

L και το προ-αποπτωτικό Mcl-1

S [13], [14]. Το μήκος μεταγραφήματος πλήρους περιέχει και τις τρεις εξώνια κωδικοποιεί Mcl-1

L, το οποίο περιέχει ΒΗ1, 2 και 3, καθώς και έναν τομέα ΤΜ. Αυτό οδηγεί σε ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 που παράγεται. Mcl-1

S έχει το δεύτερο εξόνιο ματίζεται η οποία οδηγεί σε μια κατάντη μετατόπιση στο πλαίσιο ανάγνωσης αφήνοντας μόνο τη περιοχή ΒΗ3 υπόλοιπα (Σχήμα 1Β). Mcl-1

S φαίνεται να ασκεί προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα του με παρόμοιο τρόπο σε άλλες ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες με σύνδεση προς αντι-αποπτωτικά-Bcl 2 πρωτεΐνες, και πιο συγκεκριμένα Mcl-1

S συνδέεται μόνο προς Mcl -1

L [13], [15].

Ένας διακόπτης στο εναλλακτικό μάτισμα του Mcl-1 έχει μέχρι στιγμής αποδειχθεί ότι συμβαίνουν σε καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών, με ύπαρξη μια αύξηση του αντι-αποπτωτικό Mcl-1

L ισομορφή σε καρκινικούς ιστούς [16]. Παρ ‘όλα αυτά, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με το μηχανισμό που ρυθμίζει το διακόπτη στο μάτισμα ή τις πρωτεΐνες παράγοντα ματίσματος που εμπλέκονται στην ένταξη ή τον αποκλεισμό του δεύτερου εξόνιο. Μέχρι στιγμής μόνο δύο μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών SR, SRSF1 και 3, έχουν αναγνωριστεί ως επηρεάζουν εναλλακτικό μάτισμα των Mcl-1 [17]. Που παρουσιάζει ενδιαφέρον για αυτή τη μελέτη ένα φάσμα διαφορετικών παραγόντων ματίσματος έχουν δειχθεί ότι έχουν τροποποιημένη έκφραση σε ιστούς του καρκίνου [18]? αυτά περιλαμβάνουν SRSF1 [19] και SRSF3 [20], τα οποία είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ένα ευρύ φάσμα των καρκίνων και έχουν αναγνωριστεί ως πρωτο-ογκογονίδια και SRSF5 οποίο υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού [21].

Ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνήσει πώς Mcl-1 ρυθμίζεται σε καρκινικά κύτταρα και τον εντοπισμό των κυττάρων ειδικής σύνδεσης RNA πρωτεΐνες (RBPs) που συμμετέχουν στην προώθηση της ένταξης του δεύτερου εξόνιο του

Mcl-1

γονίδιο. Αυτό επιτεύχθηκε με τη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων knockdown μιας σειράς διαφορετικών RBPs που ακολουθείται από τη μέτρηση των επιπέδων των ισομορφών συρραφής-ειδική.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture,

Δύο διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου επελέγησαν αρχικά για αυτή τη μελέτη (Σχήμα 2), MCF-7 κύτταρα καρκίνου του αδενοκαρκινώματος μαστού (που περιγράφεται ως έχουσα ένα φαινότυπο χαμηλής εισβολή

in-vitro

) και κύτταρα χοριοκαρκινώματος JAR? άλλο MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού κυττάρων (που περιγράφονται ως έχουσες έναν εισβάλλοντα φαινότυπο

in-vitro

) προστέθηκε στη μελέτη για σύγκριση (ATCC, LCG). MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM (Sigma-Aldrich) που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου, L-γλουταμίνη και πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη. κύτταρα JAR διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (ATCC, LCG) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου και πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ηΜ ραπαμυκίνης, 35 μg /ml κυκλοεξιμιδίου ή /αναστολέα πρωτεάσης ml 1 μg (Sigma-Aldrich), όπου ενδείκνυται.

(Α) Η εγγενής (μιτοχονδριακό) μονοπάτι κυτταρικού θανάτου ελέγχεται από την οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2, συμπεριλαμβανομένων των ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, Βαχ, Bak και Bid. (Β) Το

Mcl-1

γονίδιο αποτελείται από τρία εξόνια? η αντι-αποπτωτική Mcl-1

L και η προ-αποπτωτική Mcl-1

S ισομορφές της πρωτεΐνης προκύπτουν από την ένταξη και παράκαμψη του εξωνίου 2 (ανοιχτό κουτί), αντίστοιχα.

Η

Top πάνελ δείχνει ισομορφές ματίσματος Mcl σε εμπορικά διαθέσιμα JAR κυτταρολύματος, MCF-7 κύτταρα και τα κύτταρα JAR. Ανίχνευση με western αποτύπωση των παραλλαγών Mcl-1 συναρμογής, SRSF1-6 και το GAPDH ελέγχου φόρτωσης σε 40 μg ολικού κυτταρικού λύματος από MCF-7 και JAR κύτταρα.

Η

Gene νοκ ντάουν με RNAi

Όλα τα κύτταρα αντίστροφη επιμολυσμένα με Silencer® Επιλέξτε siRNA (Ambion? Πίνακας 1),

σιλανσιέ

® Αρνητικό ελέγχου siRNA (Ambion),

σιλανσιέ

® Επιλέξτε GAPDH θετικού ελέγχου siRNA (Ambion ) και siPORT ™

NeoFX

™ Transfection Agent (Ambion) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρωτόκολλο βελτιστοποιηθεί σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 5.9 × 10

4 MCF-7 κύτταρα και 4 × 10

4 κύτταρα JAR απλώθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων. κύτταρα JAR επιμολύνθηκαν με 4 ul /ml και MCF-7 και MDA-MB-231 κυττάρων με 2 υΐ /κ.εκ siPORT ™

NeoFX

™ παράγοντα μορφομετατροπής? Όλα τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 6 ηΜ siRNA. Κύτταρα και siRNA επωάστηκαν μαζί στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2. RNA συλλέχθηκε 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και την πρωτεΐνη συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Σε όλα τα πειράματα τα επίπεδα του knockdown με RNAi αξιολογήθηκαν στο επίπεδο του RNA και της πρωτεΐνης με PCR και ανοσοστύπωση, όπως περιγράφεται.

Η

Western ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα πλύθηκαν σε παγωμένο PBS και, στη συνέχεια, συλλέγονται σε ρυθμιστικό RIPA (25 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% δεοξυχολικό νάτριο και 0.1% SDS) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης που ακολουθείται από την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος και στη συνέχεια μετουσιώνεται με θερμότητα σε 95 ° C για 5 λεπτά. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) πηκτώματα και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά πάνω σε ένα νιτροκυτταρίνη μεμβράνες. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα με PBS που περιέχει 10% ξηρό γάλα σε σκόνη, και ανιχνεύτηκαν είτε με ποντικού αντι-Mcl-1 (1:500, Santa Cruz), αντι-GAPDH (1:1000, Santa Cruz), αντι-ποντικού SF2 /ASF (1:1000, SRSF1, Zymed), αντι-SC35 (1:100, SRSF2, Abgent), ποντικού αντι-SRp20 (1:1000, SRSF3, Zymed), αντι-SRp75 (1:500, SRSF4, Abcam), κατσίκα αντι-SRp40 (1:500, SRSF5, Zymed), κουνελιού αντι-SRp55 (1:2000, SRSF6, Aviva Systems Biology) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση σε PBS προστέθηκαν τα κατάλληλα συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα αραιωμένα σε PBS. ECL ή Super Signal Femto ECL (Pierce) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της πρωτεΐνης. Όπου ενδείκνυται, πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τεκμηρίωσης UVP γέλη και ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ. Τα δεδομένα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με δοκιμή πολλαπλής συγκρίσεως Tukeys ».

Απομόνωση RNA και Ημι-ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη με στήλες RNeasy σπιν (Qiagen) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Ενα μα του συνολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας oligo (dT) εναρκτήρες και Superscript II αντίστροφης μεταγραφάσης (RT) (Invitrogen, Life Technologies). PCRs διεξήχθησαν με το cDNA, ειδικοί εκκινητές (Πίνακας 2) και PCR κύριο μείγμα (Promega). Εκκινητές για Mcl-1 είχαν σχεδιαστεί να είναι από κάθε πλευρά του εξονίου 2, έτσι ώστε να μπορούν να ανιχνεύουν τόσο Mcl-1

S και Mcl-1

L και διακρίνει τις δύο ισομορφές κατά μέγεθος. (Σχήμα 3Α). Οι αρνητικοί έλεγχοι, η οποία έλειπε RT κατά την διάρκεια της προετοιμασίας του cDNA συμπεριλήφθηκαν για την παρακολούθηση γενωμική μόλυνση. Τα προϊόντα cDNA διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 1.5% (w /v) γέλες αγαρόζης, οπτικοποιούνται υπό υπεριώδες μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο.

MCF-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G ) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNAs, ή σε αγωγή με φορέα (λιπιδίων) μόνο (V), ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (UT). (Α) Ημι-ποσοτική RT-PCR δείχνει τόσο Mcl-1 συγκολλημένα παραλλαγές. (Β) Ημι-ποσοτική RT-PCR δείχνει knockdown του RNA πρωτεΐνες πρόσδεσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNA. (C) Ημι-ποσοτική RT-PCR δείχνει επίπεδα των ισομορφών ματίσματος Mcl-1 (Mcl-1

L και Mcl-1

S) και το GAPDH ελέγχου φόρτωσης 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNA. (D) Mcl-1

επίπεδα L μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR στο ίδιο δείγμα που φαίνεται στο (Β). (Ε) Mcl-1

επίπεδα S μετράται με PCR πραγματικού χρόνου στο ίδιο δείγμα που φαίνεται στο (Β). (F Mcl-1

επίπεδα S στο δείγμα των επαναλήψεων μετριέται με PCR πραγματικού χρόνου (μέσος όρος (n = 3) ± SEM) ** P≤0.01?.. * P≤0.01

Η

Real-Time PCR

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας απογραφεί δοκιμασίες TaqMan® (Applied Biosystems) και TaqMan® Οικουμενική Master Mix II (Applied Biosystems). επελέγησαν δοκιμασίες Taqman που ήταν ειδικά για κάθε μία από τις παραλλαγές ματίσματος του Mcl-1 όπως οι ανιχνευτές σχεδιάστηκαν ώστε να καλύπτουν τα όρια εξονίου ειδικά για κάθε παραλλαγή ματίσματος (Mcl-1

S – εξωνίου όριο 1-3, Mcl-1

L – εξωνίου όριο 1- 2), και δοκιμασία Taqman GAPDH επιλέχθηκε ως ένας ενδογενής έλεγχος. η δοκιμασία διεξήχθη σε τετράδα και η ενίσχυση PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα PCR OneStepPlus πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

miRNA Απομόνωση και σε πραγματικό χρόνο PCR

Ολικό RNA εξήχθη με TRIzol®, καταβυθίστηκε με 100% αιθανόλη και στη συνέχεια καθαρίστηκε σε στήλες RNeasy σπιν (Qiagen) χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό μόνο RPE. Ολικό RNA εκλούστηκε από τις στήλες με RNase ελεύθερη νερό. Η αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής διεξήχθη σε 10 ng ολικού RNA, με τη χρήση TaqMan® microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), και αλληλουχία συγκεκριμένο RT εκκινητές από τις TaqMan® Small RNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ξεχωριστές αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκαν για κάθε δοκιμασία Μικρές RNA TaqMan® σε κάθε δείγμα RNA. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας απογραφεί TaqMan® Μικρές RNA Αναλύσεις και TaqMan® Οικουμενική Master Mix II (Applied Biosystems). Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος PCR OneStepPlus πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems).

Προσδιορισμός απόπτωσης

MCF-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντίστροφη siRNA σε 96 φρεατίων, και μετά επωάστηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα MCF-7 μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα τοποϊσομεράσης, ετοποσίδη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο στέρησης ορού (1% FCS) για 18 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με 200 μΜ Ετοποσίδη (Sigma Aldrich) για 6 ώρες [22]. επίπεδα κασπάσης μετρήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας κασπάση-Glo 3/7 δοκιμασία (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία ίσοι όγκοι της κασπάσης-Glo 3/7 αντιδραστήριο προστέθηκαν στα φρεάτια και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και στη συνέχεια μετρήθηκε η φωταύγεια σε ένα φωτόμετρο (BMG).

Αποτελέσματα

Mcl -1 Splice ισομορφές και SR Πρωτεΐνες σε Κυτταρικές Γραμμές

RBPs εμπλέκονται στον έλεγχο της εναλλακτικής συμβάν ματίσματος σε Mcl-1 διερευνήθηκαν τόσο JAR και τα κύτταρα MCF-7. Το σκεπτικό για τη χρήση αυτών των δύο κυτταρικών σειρών βασίστηκε στην παραδοχή ότι έχουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης για Mcl-1

L και Mcl-1

S. κύτταρα JAR παράγουν τόσο Mcl-1

L και Mcl-1

S, ενώ τα κύτταρα MCF-7 παράγουν μόνο υψηλά επίπεδα Mcl-1

L (Εικόνα 2, πλαίσιο κορυφής). Κυτταρολύματα από τις ίδιες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2) αξιολογήθηκαν επίσης για την έκφραση μιας επιλογής του RBPs (πρωτεΐνες SR, SRSF1-6), είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην επιλογή και θέση ματίσματος προβλέπεται να έχει πιθανές θέσεις δέσμευσης RNA στο εξώνιο 2 του

Mcl-1

γονίδιο (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder). Συγκρίσεις των επιπέδων έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών SR στις γραμμές MCF-7 και των κυττάρων JAR έδειξε μόνο μικρές αυξήσεις σε SRSF2, 3 και 6 στα κύτταρα MCF-7. Παρά την ύπαρξη παρόμοια επίπεδα έκφρασης, αυτές οι SR πρωτεΐνες μπορούν ακόμη να εμπλέκονται στην εναλλακτική συρραφή του Mcl-1, καθώς η δράση των πρωτεϊνών SR ελέγχονται από συνδυασμένη συγκέντρωση και την ενεργοποίηση μελών τους πυρηνικό εκτός από τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης τους.

mRNA επίπεδα των Mcl-1 Splice ισομορφές μετά την εξόντωση του RNA πρωτεΐνες

για τον προσδιορισμό των RBPs που εμπλέκονται στην ένταξη του δεύτερου εξόνιο του Mcl-1, siRNA χρησιμοποιήθηκε για την νοκ ντάουν υποψήφιες πρωτεΐνες σε MCF Βιβλιοδεσία -7 κύτταρα. Η RBPs SRSF1, 2, 5, 6 και SR ρυθμιστικής πρωτεΐνης SREK1 (SFRS12) είχε δύο διαφορετικά siRNA που στοχεύουν ακολουθία τους, ενώ SRSF3, 4 και Tra2β είχε ένα siRNA. Μία σημαντική παράμετρος ήταν να ελέγξει πρώτα ότι νοκ ντάουν των επιμέρους SRSFs από RNAi δεν επηρεάζει την έκφραση των άλλων μελών της οικογένειας (Σχήμα S1). Το Σχήμα 3Β δείχνει την εξουδετέρωση των RBPs σε κύτταρα MCF7 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και δείχνει ότι τα επίπεδα του mRNA για κάθε RBP μειώθηκε κατά τουλάχιστον ένα siRNA. Μια αρχική οθόνη του αποτελέσματος του siRNA με τη μεσολάβηση knockdown τόσο από ημι-ποσοτική PCR (Εικόνα 3C) και πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 3D και 3Ε) έδειξε ότι σε 72 ώρες μετά τα επίπεδα επιμόλυνση των Mcl-1

S αυξηθεί όταν κύτταρα αφαιρέθηκαν από SRSF1 (1 και 2) και SRSF5 (1)? μια μικρή αύξηση του Mcl-1

S παρατηρήθηκε επίσης όταν τα επίπεδα Tra2β μειώθηκαν κατά siRNA. Αν και το δεύτερο siRNA που στοχεύουν SRSF5 (2) δεν παράγει μια παρόμοια αύξηση των Mcl-1

S, το νοκ ντάουν της SRSF5 δεν ήταν τόσο αποτελεσματική όσο με SRSF5 (1) siRNA. Επίπεδα Mcl-1

L RNA μετρήθηκαν επίσης (Σχήμα 3C και 3D), αλλά καθώς τα επίπεδα έκφρασης του Mcl-1

L mRNA ήταν τόσο υψηλά οι μικρές αλλαγές που παράγεται από το διακόπτη σε μάτισμα δεν παρατηρήθηκαν σε η συνολική έκφραση mRNA. Μετά την αρχική οθόνη του siRNAs οι knockdowns επαναλήφθηκαν με SRSF1 (1 και 2) και SRSF5 (1) siRNAs (n = 3), και το Σχήμα 2F δείχνει σημαντική αυξητική ρύθμιση των Mcl-1

S mRNA 72 ώρες μετά την επιμόλυνση αυτών των siRNAs στην κυτταρική σειρά MCF-7.

για να αξιολογηθεί ποια RBPs εμπλέκονται σε αυτή την εναλλακτική περίπτωση μάτισμα σε κύτταρα JAR, η ίδια ομάδα των siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για να knockdown των RBPs σε αυτά τα κύτταρα. Το Σχήμα 4Α δείχνει το knockdown επιτυγχάνεται με αυτά τα siRNAs στα κύτταρα JAR 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ο διακόπτης σε μάτισμα εκτιμήθηκε με μέτρηση των επιπέδων του mRNA των Mcl-1 με ημι-ποσοτική PCR (Σχήμα 4Β) και πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 4C και 4D) μετά από 72 ώρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια μεγάλη αύξηση στο επίπεδο των Mcl-1

S μετά SRSF1 είχε χτυπηθεί κάτω από δύο SRSF1 (1) ή SRSF1 (2). Mcl-1

επίπεδα L μετρήθηκαν επίσης στην οθόνη, αλλά όπως τα κύτταρα MCF-7 δεν παρατηρήθηκε μεταβολή λόγω των υψηλών επιπέδων του Mcl-1

mRNA L παρόν. Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων της αρχικής οθόνης οι knockdowns με SRSF1 (1 και 2) επαναλήφθηκαν (n = 3) και παρουσίασαν σημαντική αύξηση στα επίπεδα του Mcl-1

S mRNA μετά knockdown του SRSF1 (Σχήμα 4Ε).

κύτταρα JAR επιμολύνθηκαν με SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNAs, ή σε αγωγή με φορέα (λιπιδίων) μόνο (V), ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (UT) . (Α) Ημι-ποσοτική RT-PCR δείχνει knockdown του RNA πρωτεΐνες πρόσδεσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNA. (Β) Ημι-ποσοτική δείχνει επίπεδα RT-PCR των ισομορφών ματίσματος Mcl-1 (Mcl-1

L και Mcl-1

S) και το GAPDH ελέγχου φόρτωσης 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNA. (C) Mcl-1

επίπεδα L μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR στο ίδιο δείγμα που φαίνεται στο (Β). (D) Mcl-1

επίπεδα S μετράται με PCR πραγματικού χρόνου στο ίδιο δείγμα που φαίνεται στο (Β). (Ε) Mcl-1

επίπεδα S στο δείγμα των επαναλήψεων μετράται με PCR πραγματικού χρόνου (μέση (η = 3) ± SEM). * P≤0.01.

Η

Πρωτεΐνη Επίπεδα Mcl-1 Splice ισομορφές μετά την εξόντωση του RNA Πρωτεΐνες

Για να προσδιορίσετε αν ο διακόπτης στο μάτισμα που παρατηρείται στο mRNA μεταφράστηκε σε πρωτεΐνες Βιβλιοδεσία, ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει το πρότυπο έκφρασης του Mcl-1

L και Mcl-1

S σε MCF-7 και JAR κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα του Mcl-1

S και Mcl-1

L πρωτεϊνών δεν μπορεί να απεικονιστεί, για τους σκοπούς της ποσοτικοποίησης, συγχρόνως έκθεσης (Σχήμα S4), λόγω των χαμηλών επιπέδων του ενδογενούς Mcl- 1

S. Εξόντωση SRSF1 και SRSF5 σε κύτταρα MCF-7 παρουσιάζεται στην Εικόνα 5Α, μαζί με την προκύπτουσα παραγωγή μικρών ποσοτήτων Mcl-1

S, αναπαράγει τις παρατηρήσεις που έγιναν από Mcl-1

επιπέδων S mRNA (Σχήμα 3Β και 3D). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης των Mcl-1

L εμφανίζονται επίσης μετά από νοκ ντάουν. Τα επίπεδα του Mcl-1

L μετά από θεραπεία με SRSF5 siRNA δεν αλλάζουν σημαντικά από τους ελέγχους, που είναι συνεπής με τα επίπεδα mRNA του Mcl-1

L μετά SRSF5 knockdown (Σχήμα 3Β και 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα των Mcl-1

L μειώθηκαν σημαντικά μετά SRSF1 χτυπήθηκε κάτω σε σύγκριση με τους ελέγχους στα κύτταρα MCF-7. Αυτή η μείωση που παρατηρήθηκε στα επίπεδα της πρωτεΐνης δεν παρατηρήθηκε σε Mcl-1

L mRNA (Σχήμα 3Β και 3C), ως εκ τούτου η μείωση της SRSF1 μπορεί να επηρεάζουν τη μετάφραση ή τη σταθερότητα του Mcl-1, καθώς και το εναλλακτικό γεγονός ματίσματος. Τα αρχικά δεδομένα από πειράματα ανοσοκαθίζησης υποδηλώνουν SRSF1 μπορεί να δεσμεύεται με Mcl-1 mRNA σε κύτταρα MCF-7 (Σχήμα S3 και Μέθοδοι S1)? Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με προηγούμενες ενδείξεις ότι SRSF1 πρωτεΐνης: Υπάρχουν συγκροτήματα Mcl-1 RNA [17]

(Α) κύτταρα MCF-7 επιμολύνθηκαν με SRSF1 (1 και 2), SRSF5 (1 και 2. ), GAPDH (G) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNAs, ή σε αγωγή με φορέα (λιπιδίων) μόνο (V), ή ήταν χωρίς θεραπεία (UT). SRSF1, 5, Mcl-1 και πρωτεΐνη GAPDH επίπεδα προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωση 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNAs, χρησιμοποιώντας 30 μικρογραμμάρια ολικού υλικού λύσεως των κυττάρων. Ιστογράμματα δείχνουν πυκνομετρική ανάλυση των Mcl-1

L και Mcl-1

έκφραση της πρωτεΐνης S. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM. ** Δείχνει P≤0.01? * Υποδηλώνει P & lt? 0,05. (Β) κύτταρα JAR επιμολύνθηκαν με SRSF1 (1 και 2), GAPDH (G) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNAs, ή σε αγωγή με φορέα (λιπιδίων) μόνο (V), ή ήταν χωρίς θεραπεία (UT). SRSF1, Mcl-1 και GAPDH επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωση 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNAs, χρησιμοποιώντας 30 μg ολικού κυτταρικού λύματος. (Γ) Μετά την επιμόλυνση με κύτταρα NC siRNA MCF-7 SRSF1 (1) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 μΜ ετοποσίδη ή DMSO ελέγχου για 6 ώρες. Η επαγωγή της απόπτωσης αξιολογήθηκε με μέτρηση caspase3 /7 δραστηριότητα * υποδηλώνει Ρ & lt?.. 0.05

Η

Σχήμα 5Β δείχνει το αποτέλεσμα στα επίπεδα πρωτεΐνης του Mcl-1 μετά από αγωγή με SRSF1 siRNA σε κύτταρα JAR. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα mRNA, μειώσεις των επιπέδων SRSF1 σαν αποτέλεσμα την αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης του Mcl-1

S. Σε αντίθεση, Mcl-1

επίπεδα πρωτεΐνης L αυξήθηκε μετά την κατεργασία με SRSF1 siRNA, ενώ τα αντίστοιχα αποτελέσματα mRNA δεν παρουσίασαν καμία μεταβολή στα επίπεδα μετά knockdown (Σχήμα 4Β και 4C). Κατά συνέπεια, σε αντίθεση με την κυτταρική σειρά MCF-7, Mcl-1

επίπεδα πρωτεΐνης L αυξήθηκε σε απόκριση προς SRSF1 siRNA αντί να μειώσουν, η αύξηση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 4Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι SRSF1 μπορεί να εμπλέκεται και σε άλλες πτυχές της ρύθμισης Mcl-1 όπως μεταφραστικού ελέγχου ή σταθερότητα της πρωτεΐνης σε κύτταρα JAR. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του Mcl-1

L και Mcl-1

S εξετάστηκαν επίσης μετά knockdown με τις άλλες RBPs χρησιμοποιείται στην οθόνη RNA τόσο στα MCF-7 και JAR κύτταρα, αλλά δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές (τα δεδομένα δεν φαίνεται).

επόμενο διερευνηθεί αν knockdown του SRSF1, η οποία οδήγησε σε μια τέτοια δραματική αλλαγή στο Mcl-1

L και Mcl-1

αναλογίες πρωτεΐνη S στα κύτταρα MCF-7, θα μπορούσε επηρεάσει την επαγωγή της απόπτωσης. Πραγματοποιήσαμε πρώτα μία δοκιμασία ΜΤΤ για να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα των κυττάρων μπορεί να επηρεαστεί από knockdown του SRSF1 στα κύτταρα MCF-7 (Σχήμα S2 και Μέθοδοι S2). Απόπτωση προκλήθηκε τόσο στον αρνητικό έλεγχο και SRSF1 (1) siRNA επεξεργασμένα κύτταρα με κατεργασία με ετοποσίδη (200 μΜ), και μετρήθηκε με αξιολόγηση του προκύπτοντος κασπάσης 3/7 δραστηριότητα (Σχήμα 5C). Η ποσοστιαία αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 ήταν ελαφρώς υψηλότερο μετά την νοκ ντάουν της SRSF1 επιδεικνύοντας μεγαλύτερη επαγωγή της απόπτωσης.

Επίδραση των SRSF1 Νοκ ντάουν για τη σταθερότητα και την μετάφραση των Mcl-1

L

Mcl-1 περιέχει πολλαπλά κατάλοιπα εντός της Ν-τερματικής περιοχής που μπορούν να υποβληθούν σε μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, όπως ουβικιτινίωση και φωσφορυλίωση [23]. Αυτές οι τροποποιήσεις μπορούν να επηρεάσουν την σταθερότητα της πρωτεΐνης Mcl-1. Ως εκ τούτου, πήγε για να αξιολογηθεί η σταθερότητα της πρωτεΐνης Mcl-1 μετά από knockdown του SRSF1 στις δύο κυτταρικές σειρές. θεραπεία Κυκλοεξιμίδιο χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει τη μετάφραση σε πρωτεΐνες και Mcl-1

επίπεδα πρωτεΐνης L αξιολογήθηκαν κατά τη διάρκεια των ακόλουθων 7 ώρες. Το Σχήμα 6Α δείχνει ένα πολύ παρόμοιο ρυθμό απώλειας Mcl-1

L στα κύτταρα MCF-7 μετά την αγωγή με SRSF1 siRNA σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο siRNA. Αυτό υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει μεταβολή στη σταθερότητα του Mcl-1

L μετά knockdown του SRSF1 στα κύτταρα MCF-7. Αντίθετα, η θεραπεία των κυττάρων JAR με κυκλοεξιμίδιο (Σχήμα 6Β) είχε ως αποτέλεσμα ελαφρώς βραδύτερο ρυθμό απώλειας Mcl-1

L μετά knockdown του SRSF1, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να υπάρχει μια μικρή αύξηση στην Mcl-1

L πρωτεϊνική σταθερότητα.

(Α) MCF-7 και (Β) κύτταρα JAR επιμολύνθηκαν με SRSF1 (1 και 2) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNA. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 35 μg /ml κυκλοεξιμίδη και πρωτεΐνη δείγματα συλλέχθηκαν μετά από 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5 και 7 ώρες για να εκτιμηθεί η σταθερότητα της πρωτεΐνης. Mcl-1

επίπεδα L πρωτεΐνη στη συνέχεια μετρήθηκαν με ανοσοκηλίδωση. (C) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν με SRSF1 (1 και 2), GAPDH (G) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNA, ή σε αγωγή με φορέα (λιπιδίων) μόνο (V), ή ήταν χωρίς θεραπεία (UT). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ηΜ ραπαμυκίνη για περαιτέρω 24 ώρες. Κηλίδωση Western στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του SRSF1, Mcl-1

L και GAPDH. (D) Τα επίπεδα Mir-29b μετράται με PCR πραγματικού χρόνου στο JAR και κυτταρικές σειρές MCF-7 (μέση (η = 3) ± SEM), ** P≤0.01. Εξόντωση SRSF1 σε κύτταρα MCF-7 (Ε) και τα κύτταρα JAR (F) εκτιμήθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR σε SRSF1 (1) και αρνητικό δείγμα αναφοράς (NC) siRNA (άνω πλαίσια). Επίπεδα mir-29b μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε SRSF1 (1) και αρνητικό δείγμα αναφοράς (NC) siRNA επεξεργασμένα κύτταρα MCF-7 από (Ε) και τα κύτταρα JAR από (F) μαζί με GAPDH (G) siRNA, όχημα ( λιπιδίων) μόνο (V), και μη επεξεργασμένα κύτταρα (UT) (κάτω πάνελ) (μέση (n = 3) ± SEM).

η

Δεδομένου ότι η μείωση των επιπέδων της Mcl-1

L στα κύτταρα MCF-7 μετά SRSF1 knockdown δεν φαίνεται να επηρεάζουν την σταθερότητα της πρωτεΐνης, μπορεί να είναι ένα μεταφραστικό αποτέλεσμα. SRSF1 έχει ήδη αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην έναρξη της μετάφρασης mTOR, όπου η παρουσία του σχετικά με τα αποτελέσματα του RNA σε ενισχυμένη πρόσληψη του συμπλόκου mTOR με το mRNA [24], [25], [26], [27], [28]. Επιπλέον, Mcl-1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι ελέγχεται μεταφραστικά από mTOR και το μονοπάτι σηματοδότησης mTOR [24], [25], [26], [27], [28]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτό, κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με την ραπαμυκίνη αναστολέα mTOR. Σχήμα 6C επιβεβαιώνει την μείωση των Mcl-1

L μετά από θεραπεία με ραπαμυκίνη και δείχνει τη μείωση αυτή της Mcl-1

L να είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε μετά SRSF1 knockdown. Περαιτέρω, η προσθήκη της ραπαμυκίνης στα SRSF1 knockdown κυττάρων δεν προκάλεσε καμία περαιτέρω μείωση των επιπέδων του Mcl-1

L.

Μια πρόσφατη έκθεση πρότεινε επίσης έναν άλλο μηχανισμό με τον οποίο μπορεί να ελέγχει SRSF1 μετάφραση , μέσω της επεξεργασίας των miRNAs [29]. Ένα από τα miRNAs διαπιστωθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά την υπερέκφραση της SRSF1 ήταν mir-29b. Αυτό miRNA έχει ήδη δειχθεί ότι εμπλέκεται στη μεταγραφική αναστολή της Mcl-1 [30]. Υπό το πρίσμα αυτό υποθέσαμε την αύξηση που παρατηρήθηκε στην Mcl-1

επίπεδα L πρωτεΐνη στα κύτταρα JAR μπορεί, εν μέρει, να οφείλεται σε μειωμένα επίπεδα mir-29b. Καθώς η knockdown του SRSF1 στα κύτταρα MCF-7 δεν έδειξαν παρόμοια αύξηση των επιπέδων των Mcl-1

L πρωτεΐνη, αλλά στην πραγματικότητα μια μείωση, δεν θα περιμένουμε Mir-29b να εμπλέκεται στη ρύθμιση του Mcl -1

L σε κύτταρα MCF-7. Ως αποτέλεσμα μπορεί να αναμένεται να είναι υψηλότερη σε κύτταρα JAR συγκριτικά με κύτταρα MCF-7 τα αρχικά επίπεδα του mir-29b. Για να διερευνηθεί αυτό το Mir-29b μετρήθηκε σε μη επεξεργασμένα JAR και MCF-7 κύτταρα με πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 6D). Αυτό έδειξε, αντίθετα με τις προσδοκίες, ότι επίπεδα mir-29b ήταν σημαντικά υψηλότερα στα κύτταρα MCF-7 σε σύγκριση με τα κύτταρα JAR. Για να εκτιμηθεί εάν η knockdown του SRSF1 επηρεάζονται τα επίπεδα της mir-29b, ως υπερ-έκφραση έχει προηγουμένως δειχθεί να το κάνει αυτό [29], siRNA χρησιμοποιήθηκε για την knockdown SRSF1 σε κύτταρα MCF-7 (Σχήμα 6Ε) και κύτταρα JAR (Εικόνα 6F). Η knockdown αρχικά πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα MCF-7 καθώς έδειξε τα υψηλότερα αρχικά επίπεδα του mir-29b (Σχήμα 6D). Αν και η αγωγή με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης και μόνο φάνηκε να οδηγήσει σε μείωση του Mir-29b σε κύτταρα MCF-7, knockdown του SRSF1 είχε μικρή επίδραση στα επίπεδα του mir-29b και στους δύο τύπους κυττάρων, σε σύγκριση με τους αρνητικούς siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα ( Σχήμα 6Ε και 6F).

κανονισμός του Mcl-1 με SRSF1 και 5 διερευνήθηκε επίσης σε μια δεύτερη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού χρησιμοποιώντας MDA ΜΒ-231-κύτταρα, που περιγράφεται ως έχον επεμβατική φαινότυπο

in vitro

. Η ενδογενής επίπεδα πρωτεΐνης Mcl-1 εκτιμήθηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 7Α), υποδεικνύοντας ότι MDA-MB-231 κύτταρα εκφράζουν κυρίως την Mcl-1

L πρωτεΐνη ισομορφή, αλλά σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι τα κύτταρα MCF-7. Για να προσδιοριστεί αν τα ίδια RBPs εμπλέκονται στην μάτισμα Mcl-1 σε MDA-MB-231 κύτταρα siRNA κατά SRSF1 και 5 χρησιμοποιήθηκε για να καταστρέφουν τα κύτταρα αυτών των δύο πρωτεϊνών. Το Σχήμα 7Β δείχνει μία μείωση των επιπέδων RNA του SRSF1 και 5 μετά από 48 ώρες, και μια επακόλουθη αύξηση στα επίπεδα του Mcl-1

S mRNA μετά από 72 ώρες. Πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση επανειλημμένων επιμολύνσεων κατέδειξε επίσης μία σημαντική ρύθμιση προς τα άνω του Mcl-1

S mRNA 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τόσο SRSF1 και 5 siRNAs. Τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν επίσης με ανοσοκηλίδωση μετά knockdown του SRSF1 και 5. Το σχήμα 7C δείχνει γκρεμίσουμε του SRSF1 και 5 πρωτεΐνες 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Λόγω των χαμηλών επιπέδων Mcl-1

L και Mcl-1

S στην κυτταρική σειρά MDA-MB-231 Σούπερ Signal Femto ECL χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των δύο ισομορφές, αλλά αυτό απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε σημαντική αλλαγή στις δύο ισομορφές μετά από νοκ ντάουν της SRSF1 ή 5, αν και υπήρξε μια μικρή μείωση σε πρωτεΐνες Mcl-1 μετά από νοκ ντάουν και των δύο πρωτεϊνών SR (Σχήμα 7C). Καθώς η οδός mTOR φαίνεται να είναι σημαντική στη ρύθμιση της Mcl-1 σε κύτταρα MCF-7 αυτό διερευνήθηκε επίσης στα κύτταρα MDA-MB-231. Η ραπαμυκίνη χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει το μονοπάτι mTOR σε αυτή την κυτταρική γραμμή, αλλά η δραματική μείωση που παρατηρήθηκε στα κύτταρα MCF-7 με θεραπεία ραπαμυκίνης και SRSF1 knockdown δεν ήταν λιγότερο εμφανής με τα κύτταρα MDA-MB-231.

(Α) Ανίχνευση του Mcl-1 παραλλαγών ματίσματος και πρωτεΐνες GADPH σε MCF-7 και MDA-MB-231, χρησιμοποιώντας 40 μg ολικού κυτταρικού λύματος από δύο τύπους κυττάρων. Ιστογράμματα δείχνουν πυκνομετρική ανάλυση των Mcl-1

L και Mcl-1

έκφραση της πρωτεΐνης S. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM. (Β) Ημι-ποσοτική RT-PCR δείχνει knockdown του RNA πρωτεΐνες πρόσδεσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNA. MDA-MB-231 κύτταρα επιμολύνθηκαν με SRSF1, GAPDH (G) και αρνητικό έλεγχο (NC) siRNAs, ή σε αγωγή με φορέα (λιπιδίων) μόνο (V), ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (UT). Ημι-ποσοτική RT-PCR δείχνει επίπεδα των ισομορφών ματίσματος Mcl-1 (Mcl-1

L και Mcl-1

S) και το GAPDH ελέγχου φόρτωσης 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα siRNA. Mcl-1

επίπεδα S στο δείγμα των επαναλήψεων μετριέται με PCR πραγματικού χρόνου (μέση (n = 3) ± SEM).