Αφηρημένο

Ενώ PCTAIRE1 /PCTK1 /Cdk16 υπερεκφράζεται στα κακοήθη κύτταρα και είναι ζωτικής σημασίας στην ογκογένεση, η λειτουργία του στην απόπτωση παραμένει ασαφής. Εδώ ερευνήσαμε το ρόλο της PCTAIRE1 στην απόπτωση, ιδιαίτερα στην εξωγενή οδό κυτταρικού θανάτου. Gene-knockdown του

PCTAIRE1

ευαισθητοποιημένων καρκίνου του προστάτη και των κυττάρων ppc1 Du145, και καρκίνο του μαστού MDA-MB-468 κυττάρων σε TNF-οικογένεια κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων συνδέτη που επάγει απόπτωση TNF που σχετίζονται με (TRAIL). Εν τω μεταξύ, PCTAIRE1-knockdown δεν ευαισθητοποιεί μη κακοήθη κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων διπλοειδείς ινοβλάστες IMR-90 και την αθανατοποιημένη προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή 267B1. PCTAIRE1-knockdown δεν ρυθμίζουν έκφραση του υποδοχέα θανάτου στην κυτταρική επιφάνεια ή να επηρεάσει κασπάσης-8, FADD και flip επίπεδα έκφρασης. PCTAIRE1-νοκ ντάουν έκανε την προώθηση της κασπάσης-8 διάσπαση και υποβάθμιση RIPK1, ενώ RIPK1 mRNA νοκ ντάουν ευαισθητοποιημένα κύτταρα ppc1 να TNF-οικογένειας κυτοκινών. Επιπλέον, ο αναστολέας κινάσης SNS-032, η οποία αναστέλλει δραστικότητα κινάσης PCTAIRE1, ευαισθητοποιημένα κύτταρα ppc1 να TRAIL απόπτωση. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι PCTAIRE1 συμβάλλει στην αντίσταση των καρκινικών κυτταρικών σειρών στην απόπτωση που επάγεται από τον TNF-οικογένεια κυτοκινών, πράγμα που σημαίνει ότι οι αναστολείς PCTAIRE1 θα μπορούσαν να έχουν συνεργικά αποτελέσματα με TNF οικογένειας κυτοκινών για cytodestruction των καρκινικών κυττάρων.

Citation : Yanagi T, Shi R, Aza-Blanc P, Reed JC, Matsuzawa Si (2015) PCTAIRE1-Νοκ ντάουν ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα να TNF Οικογένεια κυτοκίνες. PLoS ONE 10 (3): e0119404. doi: 10.1371 /journal.pone.0119404

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ανδρέας Villunger, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 1 του Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 12η Ιανουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 19, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Yanagi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Teruki Yanagi υποστηρίζεται από JSPs υποτροφίες για έρευνα στο εξωτερικό, Kanae ίδρυμα, και το θεμέλιο της Sumitomo ζωή υπηρεσιών κοινωνικής πρόνοιας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. John C. Reed είναι υπάλληλος του Ομίλου Roche, AG. Οι άλλοι συγγραφείς δεν έχουν καμία οικονομική σύγκρουση συμφερόντων. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η οικογένεια PCTAIRE είναι ένας κλάδος της κινασών που σχετίζονται με την οικογένεια Cdk που περιλαμβάνει PCTAIRE1 (επίσης γνωστή ως εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 16 (Cdk16) και PCTK1), PCTAIRE2 και PCTAIRE3 [1]. PCTAIRE1 εκφράζεται ευρέως σε όλο το σώμα, με υψηλότερα επίπεδα παρατηρήθηκαν σε εγκέφαλο και όρχεις [2]. PCTAIRE1 έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε σπερματογένεση [3] και της ρύθμισης των ενδοκυτταρικά κυστίδια [4,5], καθώς και τη μετατόπιση των πρωτεϊνών μεταφοράς της γλυκόζης [6] και την ανάπτυξη νευριτών [7]. PCTAIRE1 έχει ένα κεντρικό πεδίο κινάσης που δείχνει ομοιότητα αλληλουχίας αμινοξέων με Cdks, και αυτή η περιοχή που πλαισιώνεται από μοναδικές Ν-τερματικά και C-τελικές περιοχές. Οι μηχανισμοί που ευθύνονται για την ενεργοποίηση PCTAIRE1 είναι άγνωστη, αλλά η εξεύρεση ότι η διαγραφή του Ν-τερματικού τομέα καταργεί δραστικότητα κινάσης

in vitro

υποδηλώνει ότι αυτή η περιοχή είναι σημαντική, και μπορεί να δεσμεύεται με άγνωστο συμπαράγοντα ή αλληλεπιδρούν ενδο-μοριακά με η κεντρική περιοχή της κινάσης για την προώθηση της ενεργού διαμορφώσεις της καταλυτικής περιοχής [1,7]. Το Ν-τερματικό πεδίο του PCTAIRE1 φωσφορυλιώνεται από κινάση πρωτεΐνης Α (ΡΚΑ), η οποία αναστέλλει δραστικότητα του [3,8], ενώ η αλληλεπίδραση του Ν-τερματικού τομέα του PCTAIRE1 με κυκλίνη Y δείχθηκε να διεγείρει δραστικότητα κινάσης [3]. PCTAIRE1 αλληλεπιδρά επίσης με το συγκρότημα COPII εμπλέκονται στην εξαγωγή εκκρίνεται πρωτεϊνών από το ενδοπλασματικό δίκτυο [5].

Πρόσφατα ανακαλύψαμε ότι PCTAIRE1 παίζει ζωτικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [9,10]. Δείξαμε επίσης ότι PCTAIRE1-νοκ ντάουν καρκινικά κύτταρα προωθούνται μιτωτική σύλληψη που σχετίζεται με ελαττώματα κεντροσωμάτων δυναμική. Επιπλέον, PCTAIRE1 φωσφορυλιώνει ρ27 στο Ser10, η οποία διευκολύνει την υποβάθμιση ρ27. Ωστόσο, η λειτουργία του PCTAIRE1 στην απόπτωση δεν έχει διευκρινιστεί.

απόπτωση που επάγεται από TRAIL, Fas-συνδέτη (FasL) και προχωρεί ΤΝΡ-άλφα μέσα από μια σειρά με μεσολάβηση υποδοχέα αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης που απαιτούν ελάχιστα την πρωτεΐνη προσαρμογέα FADD και κυστεΐνη πρωτεάσες όπως κασπάσης-8 ή-10. Ενώ αυτές υποδοχέα σύμπλεγμα σηματοδότησης θανάτου συστατικά διατηρούνται σε περισσότερες μορφές καρκίνου, αντίσταση στην απόπτωση παραμένει κοινή. FADD και της κασπάσης-8 είναι μεταξύ των μεσολαβητών της εξωγενούς οδού που είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση πρωτείνης, η οποία προτείνει ένα ρόλο για κινάσες σε αντίσταση σε προ-αποπτωτικών οικογένειας TNF κυτοκίνες. Οι πρωτεϊνικές κινάσες είναι επίσης ελκυστικοί στόχοι για την ανακάλυψη φαρμάκων για τον καρκίνο. Επιπλέον, σημαντικά στοιχεία πρότεινε ένα ρόλο για φωσφορυλίωση πρωτεΐνης σε διαμόρφωση εγγύς γεγονότα σηματοδότησης που επάγεται από υποδοχείς της οικογενείας του TNF θάνατο [11-19], όπως επίσης και για τροποποίηση της δραστικότητας του καλά αναγνωρισμένο κατάντη καταστολείς απόπτωσης όπως FLIP και Bcl-2- και πρωτεΐνες οικογένειας ΙΑΡ [18,20-24]. Από την άποψη αυτή, φωσφορυλίωση του θανάτου που επάγει σύμπλεγμα σηματοδότησης (ΔΙΣΚΟΣ) συστατικά Fas, FADD και της κασπάσης-8, καθώς και τα κασπάσης-8 υπόστρωμα Bid και αντι-αποπτωτικό καταστολείς απόπτωσης επαγόμενης από υποδοχέα θανάτου (c-flip, ΧΙΑΡ) έχει αναφερθεί σε σχέση με την αντίσταση του όγκου σε TRAIL ή Fas [20-22,25].

στην παρούσα μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται περαιτέρω τον ρόλο της PCTAIRE1 στα καρκινικά κύτταρα, και ιδιαίτερα τη λειτουργία του στην εξωγενή κυτταρικό θάνατο μονοπάτι. Παρέχουμε ενδείξεις ότι PCTAIRE1 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο για την αντίσταση στην TNF οικογένειας κυτοκινών σε καρκινικά κύτταρα. Gene knockdown του

PCTAIRE1

ευαισθητοποιημένων προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού σε TNF-οικογένεια κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων συνδέτη που επάγει απόπτωση TNF που σχετίζονται με (TRAIL) και Fas, αλλά δεν ευαισθητοποιεί φυσιολογικά ή μη μετασχηματισμένα κύτταρα να TRAIL. PCTAIRE1-knockdown προωθείται κασπάσης-8 διάσπαση και η υποβάθμιση του υποδοχέα αλληλεπιδρούν πρωτεΐνη κινάση σερίνης-θρεονίνης 1 (RIPK1). Το siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της RIPK1 mRNA ευαισθητοποιημένων επίσης κύτταρα ppc1 να TNF-οικογένειας κυτοκινών. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι PCTAIRE1 θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, και ότι οι αναστολείς PCTAIRE1 θα μπορούσε να έχει συνεργιστικά αποτελέσματα με TNF-οικογένειας κυτοκινών για να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Η κυτταρική βιωσιμότητα κιτ δοκιμασίας κυττάρων Ο τίτλος Glo αγοράσθηκε από την Promega. RNAiMAX λήφθηκε από την Life Technologies. Προσχεδιασμένες σύντομης παρεμβολής-RNA (siRNA) που κατευθύνονται ενάντια στην ανθρώπινη PCTAIRE1 (siRNA ταυτότητες: 1472, 1566, 1656), PCTAIRE2 (s10160), PCTAIRE3 (s10162), κασπάσης-8 (s2427), RIPK1 (s16653), ρ27 (s2837 ) και σκαρφάλωμα-ελέγχου (# 1, # 2) αγοράστηκαν από την Life Technologies. Ανασυνδυασμένο TRAIL αγοράστηκε από Enzo Bioscience. SNS-032 αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals. Αντισώματα έναντι PCTAIRE1 (κουνελιού πολυκλωνικό: HPA001366, Sigma), RIPK1 (610458, BD Transduction Lab), κασπάσης-8 (1C12, # 9746, Cell Signaling Technology), διασπασμένη κασπάση-8 (# 9496, Cell Signaling Technology), φωσφο- κασπάσης-8 (Ser387, # 710535, Life Technologies), FADD (06-711, Millipore), φωσφο-FADD (# 2781, Cell Signaling Technology), Fas /CD95 (CH-11, SY-001, MBL), DR4 (H-130, Santa Cruz), DR5 (Ν-19, Santa Cruz), FLIP (F6550, Sigma), φωσφο-σερίνη (κουνελιού πολυκλωνικό, 61 – 8100, Life Technologies), p27 (μονοκλωνικό G173-524 ποντίκι: BD Pharmagen, ή κουνελιού πολυκλωνικό C-19, Santa Cruz), ΗΑ (Rat, 3F10, Roche), ΗΑ (ποντίκι, 12CA5, Roche), Myc (ποντίκι, 9Ε10, Roche), βήτα-ακτίνη (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Sigma), άλφα-τουμπουλίνης (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, το Β-7, Santa Cruz) και χρένο-συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα (GE Health Care) αγοράστηκαν από τις υποδεικνυόμενες πηγές.

οθόνη siRNA και ανάλυση δεδομένων

Η Ambion σιγαστήρα Human Genome Druggable siRNA Βιβλιοθήκη V2 παραδόθηκε σε κύτταρα ppc1 με ανάστροφη επιμόλυνση σε 384 φρεατίων στα 10 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας RNAiMAX (Life Technologies). Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 ng /ml αντι-ΡΑδ αντίσωμα (CH-11) ή DMSO για επιπλέον 24 ώρες, χρόνος μετά τον οποίο η βιωσιμότητα αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας ΑΤΡ-lite (Perkin Elmer) σε έναν αναγνώστη πλάκας Envision (Perkin Elmer Inc.). Πρώτες αναγνώσεις δεδομένων ομαλοποιήθηκαν με το μέσο όρο των αρνητικών μαρτύρων που περιλαμβάνονται σε κάθε πλάκα και τα διπλότυπα κατά μέσο όρο. Η Επίδραση της ενεργοποίησης FAS μετρήθηκε υπολογίζοντας ποσοστά βιωσιμότητας CH-11 /DMSO για κάθε siRNA. Ένα ισχυρό

Z

-score στη συνέχεια εκχωρηθεί σε κάθε siRNA. Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν επίσης για κάθε siRNA χρησιμοποιώντας 2-ουρά T-test υποθέτοντας μια κανονική κατανομή των δεδομένων. Για να παραχθεί ένα τελικό σκορ γονίδιο, που κατά μέσο όρο οι τιμές του Z για τις 2 ή 3 siRNAs που στοχεύουν κάθε γονίδιο, καθώς και μια τιμή Ρ χρησιμοποιώντας δείκτες βιωσιμότητας. Οι τιμές για τα siRNA που δείχνουν υψηλή τυπική απόκλιση (& gt? 0,25). Μεταξύ διπλότυπες είτε DMSO ή CH 11-κύτταρα που υπέστησαν αγωγή απομακρύνθηκαν από την ανάλυση

πλασμίδια

σημειακές μεταλλάξεις του PCTAIRE1 (K194M) ήταν γίνεται με τη μέθοδο PCR μεταλλαξογένεση που βασίζεται σε κατευθυνόμενη σε θέση χρησιμοποιώντας το

Pfu

πολυμεράσης (Agilent). πλασμίδια έκφρασης για διάφορες πρωτεΐνες δομήθηκαν στο φορέα pcDNA3 για επιμόλυνση ή pRDI292-puro φορέα για λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό. Κατάλληλη κατασκευή πλασμιδίων επιβεβαιώθηκε με πέψη ενζύμου περιορισμού και αλληλούχιση DNA. Οι λεπτομέρειες των αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει τις σημειακές μεταλλάξεις είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

ppc1, Du145, MDA-MB-468, T47D, MCF7, IMR- 90, HeLa και ΗΕΚ293Τ κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC. 267B1 και 267B1 κύτταρα /K-ras ήταν ευγενικό δώρα από τον Dr. Dritschilo [26]. Όλα τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν είχαν λιγότερους από έξι μήνες συνεχούς διόδου.

αναλύσεις βιωσιμότητας κυττάρων με χρήση ΑΤΡ μέτρηση

κυττάρων Ο τίτλος Glo χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της βιωσιμότητας του κυττάρου. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες λευκά στερεά σε πυκνότητα 5000 ~ 10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 100 μΙ πλήρους μέσου μετά ή άνευ siRNAs και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις των κυτοκινών ή ενώσεις για 24 ώρες. Κυττάρων διάλυμα Titer Glo προστέθηκε σε 100 μΙ ανά φρεάτιο και οι πλάκες διατηρήθηκαν στο σκοτάδι για 15 λεπτά πριν από τη μέτρηση της φωταύγειας με ένα φωτόμετρο (Luminoskan Ascent? Thermo Scientific).

Ανάλυση απόπτωσης

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης AnnexinV-ΡΙ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Life Technologies) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας μια συσκευή FACS Canto (Becton Dickinson).

παρεμβολή RNA

για παροδική knockdown, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA δίπολα με μια μέθοδο αντίστροφης επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας Lipofectoamine RNAiMAX σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Technologies).

Tet-διεγέρσιμο σύντομο κατασκευάσματα φουρκέτας RNA, φακοϊό και μόλυνση

PCTAIRE1 shRNA # 1 (GCTCTCATCACTCCTTCACTT), PCTAIRE1 shRNA # 2 (GACCTACATTAAGCTGGACAA), και σκαρφάλωμα-ελέγχου (CAACAAGATGAAGAGCACCAA) κλωνοποιήθηκαν εντός του διεγέρσιμου pLKO-Tet-On πουρομυκίνη φορέα [27]. Λεντοϊών υπερκείμενα που παράγονται σύμφωνα με ένα καθιερωμένο πρωτόκολλο [27]. Τα κύτταρα επελέγησαν με 2 μg /ml πουρομυκίνη (ΜΡ Biomedicals). Η επαγωγή του shRNA επιτεύχθηκε με την προσθήκη 100 ng /ml δοξυκυκλίνης στο μέσο.

Εκχύλιση του συνολικού RNA και ποσοτική RT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το RNeasy συν μίνι κιτ (Qiagen). Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά και τα δείγματα αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση με RT-PCR. RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Superscript III (Life Technologies) και συμπληρωματικό DNA δείγματα αναλύθηκαν με το πράσινο SYBR σύστημα (Promega). Εκκινητές ειδικούς για την ανθρώπινη PCTAIRE1, PCTAIRE2, PCTAIRE3, RIPK1 και καθαριότητας έλεγχο ανθρώπινου GAPDH παρατίθενται παρακάτω

Ανθρώπινο PCTAIRE1

Προώθηση:. Αντίστροφη

5′-GCAGTGACCCTGGAGAGG-3 ‘

: 5′-TCAAGTCCTCGTGCACAATC-3 ‘

Ανθρώπινο PCTAIRE2

Προώθηση: 5′-TGTTATTGGAGGGAGCCTTG-3′

Αντίστροφη: 5′-TCTCACCATCTGATGCCATTT-3 ‘

Ανθρώπινο PCTAIRE3

Προώθηση: 5′-ATGGCATCCACCTCCTGA-3 ‘

Αντίστροφη: 5′-TCTGCTGACATGCGACTCTT-3′

Ανθρώπινο RIPK1

Προώθηση: 5′-GTGTACAAGGGGCCCAACT-3 ‘

Αντίστροφη: 5′-CGGCTGTGTCTCAGTCTGTT-3′

Ανθρώπινο GAPDH

Προώθηση: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘

Αντίστροφη:. 5′-ATGGGATTTCCATTGATGAC-3 ‘

Όλα τα πειράματα έγιναν εις διπλούν και κανονικοποιούνται σε σχέση με τα επίπεδα του GAPDH

SDS-PAGE, ανοσοαποτύπωση και ανοσοκαταβύθιση

τα κύτταρα πλύθηκε δύο φορές με PBS και συλλέχθηκαν με δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet Ρ-40, 0.1% SDS, 5 mM NaF και EDTA-free πλήρης ταμπλέτα κοκτέιλ πρωτεάσης (Roche). Τα κύτταρα αφέθηκαν σε πάγο για 20 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε σε 14,000 χ

g

για 10 λεπτά. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών Bio-Rad (Bio-Rad). Για Laemmli SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE πήγματα βαθμίδωσης 4-15% (Life Technologies) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad). Phos-tag SDS-PAGE διεξήχθη με προκατασκευασμένα πηκτώματα phostag (πηκτές πολυακρυλαμιδίου 12,5% που περιέχει 50 μΜ ακρυλαμίδιο Phos-tag, Wako). Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα ακρυλαμιδίου Phos-tag πλύθηκαν με τρεχούμενο ρυθμιστικό διάλυμα (25 mM Tris, 192 mM γλυκίνη, 0,1% SDS) που περιείχε 5 mM EDTA για 10 λεπτά με ήπια ανακίνηση, και στη συνέχεια πλένεται και πάλι με τρεχούμενο ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς EDTA για 10 λεπτά σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Wako Chemical). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα σε Τπδ-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (TBS) με 0,05% Tween-20 και 5% άπαχο ξηρό γάλα, μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα σε ρυθμιστικό αποκλεισμού. Οι μεμβράνες εκπλύθηκαν τρεις φορές σε TBS με 0.05% Tween-20 και επωάστηκαν με δευτερεύον HRP-συζευγμένο αντισωμάτων για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μία μέθοδος ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (GE Health Care) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση.

Για ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ), τα κύτταρα λύθηκαν σε 1% ρυθμιστικό διάλυμα ΝΡ40 που περιέχει 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl , 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet Ρ-40, 5 mM NaF και EDTA-free δισκίο πλήρης κοκτέιλ πρωτεάσης. Τρία χιλιοστόγραμμα λύματος πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαταβύθιση με ολονύκτια επώαση στους 4 ° C και 2 μg του δεδομένου αντισώματος. Την επόμενη ημέρα, 30 μΙ πρωτεΐνης G ρητίνης (Life Technologies) προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα στους 4 ° C. Οι IPs στη συνέχεια πλύθηκαν τέσσερις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος ρυθμιστικό διάλυμα λύσης οπότε προστέθηκε, και τα σφαιρίδια έβρασαν για 10 λεπτά στους 100 ° C.

κλωνογονική δοκιμασία για την αξιολόγηση του Fas /ευαισθησίας TRAIL

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα 35 mm στα 1,0 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο ή PCTAIRE1 στόχευσης siRNAs. Μετά από 2 ημέρες, αγωνιστική αντι-Fas ab (CH-11) ή TRAIL προστέθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες πριν από τον καθορισμό και χρώση με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες χρώμα. Για στερέωση, τα κύτταρα επωάστηκαν με μεθανόλη στους -20 ° C για 20 λεπτά, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες χρώμα σε 25% μεθανόλη για 15 λεπτά.

ανάλυση FACS του Ραδ /DR4 /DR5 έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια

ppc1 και MDA-MB-468 κύτταρα (1,0 χ 10

5), που είχαν αντίστροφης-επιμολύνθηκαν με siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1 και σκαρφάλωμα ελέγχου σπάρθηκαν σε 6 πιάτα cm. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την αντίστροφη-επιμόλυνση, προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας TripleExpress (Gibco), και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα FACS (1% FBS σε PBS). Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS σε 3,0 χ 10

5 κύτταρα /100 μΙ. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι επί πάγου με συγκεντρώσεις κορεσμού του φυκοερυθρίνη-επισημασμένο αντι-DR4, αντι-DR5 (eBioscience), FITC-επισημασμένο-Fas αντι (BD Pharmagen), ή ανοσοσφαιρίνη G1 ισότυπο αντισώματα ελέγχου για 1 ώρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνολικά 10.000 γεγονότα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για κάθε θεραπεία.

Συγχρονισμός

Για να συλλάβει τα κύτταρα HeLa σε πρώιμη φάση S, διπλή μέθοδο μπλοκ θυμιδίνης εφαρμόστηκε [10]. Εν συντομία, θυμιδίνη (2.5 mM) προστέθηκε σε καλλιέργεια για 14 ώρες, και τα κύτταρα απελευθερώθηκαν από το μπλοκ με έκπλυση τρεις φορές με PBS. Μετά από 8 ώρες, θυμιδίνη προστέθηκε και πάλι. Μετά από μια δεύτερη θεραπεία για 14 ώρες, τα κύτταρα απελευθερώνονται από το μπλοκ.

Ποσοτική Μέτρηση και στατιστική ανάλυση

Μέσα και τυπική απόκλιση (SD) υπολογίστηκαν στατιστικά από τρεις προσδιορισμούς. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των διαφόρων δειγμάτων προσδιορίστηκε με t-test του Student. P & lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση PCTAIRE1 κινάσης με siRNA βιβλιοθήκη

διαλογής

Για τον προσδιορισμό υποψήφιος καταστολείς ή ενισχυτές του Fas-επαγόμενη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα, θα βελτιστοποιηθεί δύο τύποι εξέταση υψηλής απόδοσης (HTS) δοκιμασίες για siRNA διαλογή βιβλιοθήκης. Χρησιμοποιώντας ppc1 κυττάρων καρκίνου του προστάτη, διαπιστώσαμε ότι η διέγερση με αντι-Ραδ CH11 αντίσωμα χαμηλή δόση (3 ng /ml) δεν οδήγησε σε κυτταροτοξικότητα, ενώ η διέγερση με αντι-Fas αντίσωμα υψηλή δόση (25 ng /ml) σκοτώθηκαν αυτά τα κύτταρα όγκου. Χρησιμοποιώντας τα siRNA ελέγχου για την επικύρωση της δοκιμασίας, διαπιστώσαμε ότι 3 από 3 siRNAs που στοχεύουν FLIP ευαισθητοποιημένα ppc1 κύτταρα σε χαμηλή δόση (3 ng /ml) αντι-Fas αντίσωμα, ενώ 3 από 3 siRNAs που στοχεύουν FADD ανέστειλε ppc1 θανάτωσης που προκαλείται από υψηλές δόσεις ( 25 ng /ml) αντι-Fas αντίσωμα. Μετά από τη χρήση αυτών των siRNAs ελέγχου για να βελτιστοποιήσει τις αναλύσεις HTS με συντελεστή & gt ενός Ζ ‘? 0,5, έχουμε τότε σε διαλογή μία βιβλιοθήκη 16.800 siRNAs που στοχεύουν 5600 γονίδια (κάλυψη 3 φορές), η οποία αποτελεί τη λεγόμενη «druggable γονιδίωμα». κύτταρα ppc1 σε 384 φρεατίων «αντίστροφη» επιμολυσμένα με siRNAs, τότε 2 ημέρες αργότερα CH11 αντίσωμα προστέθηκε και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογείται με δοκιμασία βιοφωταύγειας για τον προσδιορισμό των επιπέδων ΑΤΡ μία ημέρα αργότερα (S1 Σχ., S1 συνόλου δεδομένων). Η επίδραση της ενεργοποίησης FAS μετρήθηκε υπολογίζοντας αναλογίες βιωσιμότητα Ραδ /DMSO για κάθε siRNA. Για να παραχθεί ένα τελικό σκορ γονίδιο, που κατά μέσο όρο οι τιμές του Z για τις 2 ή 3 siRNAs που στοχεύουν σε κάθε γονίδιο. Για την χαμηλή δόση οθόνης (3 ng /ml), η κινάση PCTAIRE1 ταυτοποιήθηκε ως καταστολέας της Fas-επαγόμενη απόπτωση.

Gene νοκ ντάουν της PCTAIRE1 ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα με TNF-οικογένειας κυτοκινών

για να αξιολογηθεί περαιτέρω ο ρόλος της PCTAIRE1 για TNF-οικογένειας κυτοκινών στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη ppc1, χρησιμοποιήσαμε siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1. Ανοσοκηλίδωση εκτελέσθηκε αρχικά για να επιβεβαιωθεί knockdown στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 1Α). Χρησιμοποιώντας 3 siRNAs που χτύπησε επιτυχώς έκφραση PCTAIRE1, παρατηρήσαμε ευαισθητοποίηση των κυττάρων ppc1 σε αντι-Fas αντίσωμα (CH-11), TRAIL, και ΤΝΡ-άλφα (Σχ. 1 Β και C, και S2A Εικ.). Αηηβχίην πειράματα χρώση επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα αυτά τα αποτελέσματα, και στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ένα αποπτωτικό μηχανισμό συμμετείχε (Εικ. 1D). Σε αντίθεση με Fas (CH-11), TRAIL και TNF, PCTAIRE1 knockdown δεν ευαισθητοποιήσει κύτταρα ppc1 με άλλες οδούς κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένων των ερεθισμάτων που κινεί οδούς απόπτωσης από το ενδοπλασματικό δίκτυο (θαψιγαργίνη) και τα μιτοχόνδρια (σταυροσπορίνη) (S2B Σχ. Και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). είχαν κατέληξε σε παρόμοια συμπεράσματα όταν αξιολογήθηκε κλωνογονική επιβίωση, με όλες τις 3 siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1 ευαισθητοποίηση κυττάρων ppc1 να Fas (CH-11) και TRAIL (Εικ. 1 Ε και F). Σε αντίθεση, siRNA μεσολάβηση knockdown του PCTAIRE2 ή PCTAIRE3 δεν ευαισθητοποιεί ppc1 κυττάρων σε Fas, TRAIL ή TNF (S2C-Η Εικ.). Εκτιμήσαμε επίσης την επίδραση της PCTAIRE1-knockdown για την χημειοευαισθησία των κυττάρων στη σισπλατίνη και πακλιταξέλη. κύτταρα ppc1 με PCTAIRE1-knockdown επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης και πακλιταξέλης, και την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων δεν έδειξε σημαντική συνεργιστική κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε κύτταρα ppc1 (S2I-Ν Σχ.). Εκτιμήσαμε περαιτέρω siRNA μεσολάβηση PCTAIRE1-knockdown σε άλλες κυτταρικές γραμμές, και βρήκαν ότι σε κύτταρα καρκίνου του μαστού MDA-MB-468 PCTAIRE1-knockdown ήταν αποτελεσματική στην αποκατάσταση της ευαισθησίας σε Fas ή TRAIL (S3A-F Σχ.). Εντούτοις, όπως θα αναμενόταν για την ετερογένεια παρατηρήθηκε σε ανθρώπινους καρκίνους, η επίδραση του PCTAIRE1 knockdown δεν ήταν ομοιόμορφη σε ότι λιγότερο ισχυρή επιδράσεις παρατηρήθηκαν με τα κύτταρα του καρκίνου του μαστού MCF7 ανθρώπινο (S3G-Ι Σχ.).

( Α) κύτταρα ppc1 επιμολύνονται με κωδικοποιημένα RNA ή τρία διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1 (siRNAs 1472, 1566, 1656). Τα προϊόντα λύσης από κύτταρα στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA παρασκευάστηκαν, κανονικοποιημένη για ολικό περιεχόμενο πρωτεΐνης, και δείγματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-PCTAIRE1 (κορυφή) ή αντι-άλφα-τουμπουλίνης (κάτω) αντισώματα. (Β, C) κύτταρα ppc1 επιμολύνονται με RNA ελέγχου (μοβ «x») ή διάφορες siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1 (μπλε διαμάντια, 1472? Κόκκινα τετράγωνα, 1566, πράσινα τρίγωνα, 1656). Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με είτε αντι-Fas αντίσωμα (CH-11) (Β) ή TRAIL (C) σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως υποδεικνύεται. Μετά από 24 ώρες, κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν ως υποκατάστατο δείκτη της βιωσιμότητας κυττάρων με τη χρήση κυττάρων αντιδραστηρίων Titer Glo, και τα δεδομένα εκφράζονται ως η αναλογία μεταξύ των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν με και χωρίς αντι-Fas (Β), και TRAIL (C). αναλύσεις (D) Η απόπτωση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Αηηβχίην. κύτταρα ppc1 επιμολύνονται με αγωνίζομαι RNA των siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντίσωμα αντι-Ραδ (100 ng /ml) ή TRAIL (50 ng /ml) για 4 ώρες. * P & lt? 0.05, *** P & lt? 0.001 από t-test. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD (η = 3). (Ε, F) δοκιμασίες κλωνογονιδιακή επιβίωση. κύτταρα ppc1 σπάρθηκαν σε 6 φρεατίων (35 mm) πιάτα σε 1,0 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και στη συνέχεια ανάστροφης επιμολυσμένα με σκαρφάλωμα ελέγχου ή PCTAIRE1 στόχευση siRNAs όπως υποδεικνύεται. Μετά από 48 ώρες, αντι-Fas αντίσωμα (Ε, 10 ng /ml) ή TRAIL (F, 20 ng /ml) προστέθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες πριν από μονιμοποίηση και χρώση με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες χρώμα. (G, H) κύτταρα ppc1 διαμολύνθηκαν με RNA ελέγχου ή τρία διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με Fas (G, 10 ng /ml) ή TRAIL (Η, 10 ng /ml). Μετά από 3 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, κανονικοποιημένη για ολικό περιεχόμενο πρωτεΐνης, και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για διασπασμένη κασπάση-8. Το μερικώς διασπάστηκε 43/41 μπάντες kDa και πλήρως διασπασμένου 18 μπάντα kDa υποδεικνύονται, όπως και οι δείκτες μοριακού βάρους (kDa). Η κηλίδωση επανελέγχθηκε με βήτα-ακτίνης αντίσωμα ως έλεγχος φόρτωσης. (Ι) κύτταρα ppc1 επιμολύνθηκαν με αγωνίζομαι ελέγχου ή siRNA PCTAIRE1 στόχευση (si-1472). Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα ή όχι διεγέρθηκαν με αντι-Fas αντίσωμα (CH-11, 10 ng /ml). Μετά από 3 ώρες, κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-κασπάση 8 αντίσωμα, που ακολουθείται από ανοσοκηλίδωση με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Τα κόκκινα βέλη δείχνουν μη-ειδικές ζώνες.

Η

Η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 που προκαλείται από υποδοχείς της οικογενείας του TNF θάνατο συνοδεύεται από πρωτεολυτική επεξεργασία του ~ 50 kDa προ-κασπάσης-8 μορίου αρχικά για να αποδώσει ~ 43Α /41 kDa ημικατεργασμένων μορίων και τελικά για την παραγωγή των υπομονάδων ~ 18 και ~ 10 kDa του καταλυτικώς δραστική πρωτεάση. Χρησιμοποιήσαμε ανοσοκηλίδωση την παρακολούθηση των αποτελεσμάτων του siRNA με τη μεσολάβηση του knockdown PCTAIRE1 για την πρωτεολυτική επεξεργασία της προ-κασπάσης-8. Το siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση του PCTAIRE1 σε κύτταρα ppc1 πράγματι αυξήθηκε στερέωσαν και TRAIL επαγόμενη επεξεργασία της κασπάσης-8 σε σύγκριση με τον έλεγχο της RNA (Εικ. 1 G και Η). Παρατηρήσαμε επίσης τη συναρμολόγηση του κασπάσης-8 σύμπλοκο FADD /(επάγει θάνατο σύμπλεγμα σηματοδότησης: DISC) σε Fas-αγωγή ppc1 κυττάρων με PCTAIRE1 knockdown (Εικ 1θ.). Αντιστρόφως, knockdown της κασπάσης-8 confered Fas-αντίσταση ppc1 κυττάρων με PCTAIRE1-knockdown (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα siRNA μεσολάβηση PCTAIRE1-knockdown επιδράσεις στην εξωγενή οδό κυτταρικού θανάτου ήταν επίσης αναπαραχθεί χρησιμοποιώντας tetracycline- επαγώγιμοι φορείς shRNA εισήγαγε φακοϊό μόλυνση [27]. Στα κύτταρα ppc1 που είχαν σταθερά μολυνθεί με δύο διαφορετικούς Τα siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1 (shRNA # 1 και # 2), την καλλιέργεια με το ανάλογο τετρακυκλίνης δοξυκυκλίνη οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα PCTAIRE1 πρωτεΐνη (Εικ. 2Α). Συσχετίζοντας με τις μειώσεις αυτές στην πρωτεΐνη PCTAIRE1, δοξυκυκλίνη αποκατέστησε επίσης την ευαισθησία ppc1 προς Fas και TRAIL, όπως υποδεικνύεται από τα αποτελέσματα του προσδιορισμού κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 2Β-Ε). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με δύο άλλες κυτταρικές γραμμές όγκου (MDA-MB-468 και Du145 κύτταρα) που είχαν σταθερά μεταγωγή με τετρακυκλίνη επαγώγιμο φορείς PCTAIRE1 shRNA (S4 και S5 Σχ.). Από τα αποτελέσματα αυτά, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι PCTAIRE1 προσδίδει αντοχή Fas /TRAIL σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα.

(Α) κύτταρα ppc1 σταθερά περιέχουν επαγώγιμους Τα siRNAs που στοχεύουν διαφορετικές τοποθεσίες στο PCTAIRE1 mRNA (shRNA # 1, # 2) ή scramble- ελέγχου καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες με δοξυκυκλίνη (Dox, 100 ng /ml). προϊόντα λύσης πρωτεϊνών που παράγονται, κανονικοποιημένη για ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης, και αναλύθηκαν με SDS-PAGE /ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντισώματα για PCTAIRE1 (επάνω) και βήτα-ακτίνης (κάτω). (B, C) τα κύτταρα ppc1 καλλιεργήθηκαν με (ON) ή χωρίς (OFF) 100 ng /ml Dox για 48 ώρες, στη συνέχεια διεγέρθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις είτε αντι-Fas αντίσωμα CH-11 (Β) ή TRAIL (C). Μετά από 24 ώρες, κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν, και τα δεδομένα εκφράζονται ως αναλογία σε σχέση με κύτταρα καλλιεργημένα χωρίς αντι-Fas ή TRAIL (μέση ± SD? N = 3). (D, E) δοκιμασίες κλωνογονιδιακή επιβίωση. κύτταρα ppc1 σταθερώς περιέχουν επαγώγιμους Τα siRNAs (σκαρφάλωμα ή shRNA # 2) καλλιεργήθηκαν με (ON) ή χωρίς (OFF) 100 ng /ml Dox για 48 ώρες, στη συνέχεια διεγείρονται με αντι-Fas αντίσωμα (CH-11, 10 ng /ml) ή TRAIL (20 ng /ml). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες πριν από τον καθορισμό και χρώση με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες χρώμα.

Η

Τα μετασχηματισμένα κύτταρα είναι κατά προτίμηση εξαρτώνται από PCTAIRE1 για την αντίσταση στην διαδρομή

Μεταξύ των TNF-οικογένεια κυτοκινών, TRAIL θεωρείται η πιο πολλά υποσχόμενη όπλο για την καταπολέμηση των καρκινικών κυττάρων, επειδή η ευαισθησία TRAIL παρατηρείται κυρίως σε όγκο, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα [28,29]. Επιπλέον, ιστοπαθολογικές αναλύσεις των πρωτογενών του προστάτη και του μαστού ιστούς αποκάλυψε ότι PCTAIRE1 ανοσοχρώση ήταν πολύ χαμηλή σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά αισθητά υψηλότερο σε καρκίνους [10]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι PCTAIRE1-νοκ ντάουν δεν θα επηρεάσει την εξωγενή οδό κυτταρικό θάνατο στα φυσιολογικά κύτταρα. Για την υποστήριξη αυτής της δυνατότητας, εξετάσαμε την knockdown του PCTAIRE1 στην ανθρώπινη γραμμή διπλοειδή ινοβλαστών IMR-90. Σε αυτά τα κύτταρα siRNA μεσολάβηση PCTAIRE1-knockdown δεν επηρέασε την ευαισθησία TRAIL, όπως αξιολογείται με μέτρηση των επιπέδων ΑΤΡ (Εικ. 3Α και D). Για να εξεταστεί περαιτέρω ο ρόλος των PCTAIRE1 σε κανονικά έναντι μετασχηματισμένων κυττάρων, εφαρμόσαμε PCTAIRE1-siRNAs με αφαλατοποιημένα 267B1 φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη και του K-ras τους (V12) μετασχηματίζονται ισογονιδιακές ομόλογό, 267B1 /K-ras κύτταρα [26], που ακολουθείται από επιβεβαίωση του siRNA αποτελεσματικότητα χρησιμοποιώντας ανοσοκηλιδώσεως (Εικ. 3Β και C). Ευαισθησία στο TRAIL εκτιμήθηκε από τα επίπεδα του ΑΤΡ, η οποία ανέφερε ότι 267B1 /K-ras κύτταρα με PCTAIRE1 νοκ ντάουν ήταν εξαιρετικά ευαίσθητα σε TRAIL σε σύγκριση με τον έλεγχο 267B1 /K-ras κύτταρα με αγωνίζομαι-siRNA (Σχ. 3F). Σε αντίθεση, μη μετασχηματισμένα 267B1 κυττάρων με PCTAIRE1-knockdown δεν έδειξε σημαντική αλλαγή στην ευαισθησία TRAIL σε σύγκριση με ανακατώσει ελέγχου κύτταρα (Σχ. 3Ε). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι τα μετασχηματισμένα κύτταρα εξαρτώνται κατά προτίμηση επί PCTAIRE1 για την αντίσταση στην TRAIL.

(AC) ανθρώπινοι διπλοειδείς ινοβλάστες IMR-90 (Α), 267B1 αθανατοποιημένα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (Β), και Κ-ras μεταμορφωθεί 267B1 κύτταρα (267B1 /K-ras) (C) επιμολύνθηκαν με κωδικοποιημένα RNA ή τρία διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1 (siRNAs: SI-1472, SI-1566, si-1656). Τα προϊόντα λύσης των κυττάρων 72 ώρες μετά την επιμόλυνση παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-PCTAIRE1 (κορυφή) ή αντι-βήτα-ακτίνης (κάτω) αντισώματα. (D-F) IMR-90, 267B1 και κύτταρα 267B1 /K-ras επιμολύνθηκαν με siRNAs. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με TRAIL σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως υποδεικνύεται. Μετά από 24 ώρες, κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν, και τα δεδομένα εκφράζονται ως αναλογία μεταξύ των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν με και χωρίς TRAIL (μέση ± SD? Η = 3)

Η

PCTAIRE1-knockdown ρυθμίζει την έκφραση της πρωτεΐνης RIPK1.

για τη διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο PCTAIRE1 καταστέλλει την απόπτωση που επάγεται από TRAIL /Fas, εξετάσαμε την επίδραση της PCTAIRE1 knockdown επί της έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών που έχουν ενοχοποιηθεί στην παθολογική οδό σηματοδότησης υποδοχέα οικογένειας TNF κυτοκίνης. Επειδή PCTAIRE1-νοκ ντάουν ευαισθητοποιημένα κύτταρα ppc1 στα ερεθίσματα υποδοχέα θανάτου (Fas, TRAIL), αλλά όχι παραγόντων που πυροδοτούν άλλες οδούς κυτταρικού θανάτου, έχουμε την υποψία ότι PCTAIRE1 μπορεί να εμποδίσει ένα κεντρικό βήμα στο Fas και σηματοδότηση του υποδοχέα TRAIL. Το κρίσιμο γεγονός για την έναρξη της οδού απόπτωση που επάγεται από τον TNF-οικογένειας κυτοκινών είναι η ενεργοποίηση της κασπάσης-8, η οποία απαιτεί την πρωτεΐνη προσαρμογέα FADD, και σε αντίθεση με FLIP. Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, PCTAIRE1-knockdown ενεργοποιημένης κασπάσης-8 επεξεργασίας (Σχ. 4Α), αλλά PCTAIRE1-knockdown δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης του FADD, procaspase-8 ή C-FLIP (S6a Εικ.). Μέτρηση των επιπέδων επιφανείας κυττάρου (με FACS) ή ολικό κυτταρικό επίπεδο (με ανοσοκηλίδωση) του Fas, TRAIL υποδοχέα 1 (υποδοχέας θανάτου 4, DR4) ή TRAIL υποδοχέα 2 (υποδοχέας θανάτου 5, DR5) έδειξε επίσης δεν επαναλήψιμη διαφορά μεταξύ ελέγχου και PCTAIRE1-knockdown κυττάρων (S6a και Β Σχ., και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, ενώ η φωσφορυλίωση της κασπάσης-8 και FADD φέρεται να εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα σε TNF οικογένεια κυτοκινών [11,12,30], ανιχνεύσαμε καμία αξιοσημείωτη μεταβολή στα επίπεδα φωσφορυλιώσεως της κασπάσης-8 (Ser387) ή FADD (Ser194) σε PCTAIRE1 υπερεκφράζουν /νοκ ντάουν κύτταρα ppc1 (S6C-F Εικ.).

(Α) κύτταρα ppc1 επιμολύνονται με RNA έλεγχο ή τρία διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν PCTAIRE1. Μετά από 48 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ, κανονικοποιούνται για ολικό περιεχόμενο πρωτεΐνης, και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) κύτταρα ppc1 επιμολύνθηκαν με υποδεικνύεται siRNAs για 48 ώρες, οπότε τα προϊόντα λύσης των κυττάρων συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό 1χ Laemmli και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης για RIPK1 (επάνω) και βήτα-ακτίνης (μέση). (C, D) κύτταρα ppc1 επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα siRNAs. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 (10 μΜ) για 5 ώρες πριν από την παρασκευή των κυτταρολυμάτων (C: ρυθμιστικό 1χ Laemmli, D: ρυθμιστικό RIPA). (Ε) κύτταρα ppc1 διαμολύνθηκαν με RNA ελέγχου ή siRNA που στοχεύει RIPK1. Μετά από 48 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA, κανονικοποιούνται για ολικό περιεχόμενο πρωτεΐνης, και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (F, G) κύτταρα ppc1 διαμολύνθηκαν με RNA ελέγχου ή siRNA που στοχεύει RIPK1. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με είτε αντι-Fas αντίσωμα (CH-11) (F) ή TRAIL (G) σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως υποδεικνύεται.