Αφηρημένο

Η έκφραση του παράγοντα λεμφικών ενισχυτή 1 (Ι.ΕΡ1) συχνά μεταβάλλεται σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να αξιολογήσει την έκφραση Ι.ΕΡ1 στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς και να εξερευνήσετε αλλάξει φαινοτύπων, γονιδιακή έκφραση, και ο πιθανός μηχανισμός μετά γκρέμισε Ι.ΕΡ1 έκφρασης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Ένα σύνολο 106 καρκίνου του παχέος εντέρου και συμφωνημένα paratumorous φυσιολογικούς ιστούς χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της έκφρασης LEF1 χρησιμοποίηση ανοσοϊστοχημείας και qRT-PCR. LEF1 lentivirus χρησιμοποιήθηκε για να knockdown LEF1 έκφρασης για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και γονιδιακή έκφραση. Η δοκιμασία γυμνό ξενομοσχεύματος ποντικού διεξήχθη για την ανίχνευση των αποτελεσμάτων του LEF1 knockdown

in vivo

. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα επίπεδα του LEF1 mRNA και της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά αυξημένη σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με τα συμφωνημένα paratumorous φυσιολογικούς ιστούς και συνδέθηκαν με βάθος διήθηση, λεμφαδένας και απομακρυσμένων μεταστάσεων, προηγμένη ΤΝΜ (όγκος-node-μετάσταση) στάδια, και μικρότερη συνολική επιβίωση. Επιπλέον, LEF1 knockdown μειωμένη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, ικανότητα εισβολής, ΜΜΡ2 και έκφραση ΜΜΡ-9, αλλά απόπτωση. Γυμνό δοκιμασία ξενομοσχεύματος ποντικού έδειξε ότι Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν κατέστειλε το σχηματισμό όγκων και την ανάπτυξη

in vivo

. Επιπλέον, η έκφραση του Notch μονοπατιού που σχετίζονται με πρωτεΐνες RBP-ϋκ και Hes1 μειώθηκε σε κύτταρα knockdown LEF1. Στο σύνολό τους, Ι.ΕΡ1 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε παχέος εντέρου ιστούς και νοκ ντάουν της έκφρασης Ι.ΕΡ1 καρκίνου ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

in vitro

και

in vivo

. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η στόχευση της έκφρασης Ι.ΕΡ1 θα πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω για την πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Wang W-J, Γιάο Υ, Jiang L-L, Χου Τ-Η, Ma J-Q, Liao Ζ-J, et al. (2013) Νοκ ντάουν της Λεμφοειδής Enhancer συντελεστή 1 Αναστέλλει καρκίνου του παχέος εντέρου Εξέλιξη

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76596. doi: 10.1371 /journal.pone.0076596

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 3 Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 2, Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81001090) (https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz.html).The χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης , συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένα από τα πιο κοινά. καρκίνος σε άνδρες και γυναίκες στον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1,2] και η τέταρτη στην Κίνα [3]. Έτσι, ο καρκίνος του παχέος εντέρου παραμένει ένα σημαντικό παγκόσμιο πρόβλημα δημόσιας υγείας, αν και υπάρχει ένα σημαντικά παγκόσμια μείωση στη θνησιμότητα από καρκίνο που σχετίζονται με του καρκίνου του παχέος εντέρου κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, λόγω της σημαντικής προόδου στην έγκαιρη διάγνωση και αποτελεσματικές θεραπείες. Μέχρι σήμερα, η παθογένεση και η μοριακή μηχανισμός που ευθύνεται για την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν πλήρως μελετηθεί και ένας μεγάλος όγκος γνώσεων έχει δημιουργηθεί σχετικά με μοριακές αλλαγές που σχετίζονται με την καρκινογένεση του παχέος εντέρου, η οποία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και η σιωπή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [4]. Ωστόσο, πολύ περισσότερα πρέπει να γίνουν για την ακριβή κατανόηση της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου και την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τον αποτελεσματικό έλεγχο αυτής της ασθένειας.

Για το σκοπό αυτό, η έρευνά μας επικεντρώνεται στην λεμφικών ενισχυτή δεσμευτικό παράγοντα-1 (Ι.ΕΡ1) , ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών υψηλής ομάδα κινητικότητας (HMG).

LEF1

κωδικούς μια πυρηνική πρωτεΐνη 48-kD που εκφράζεται συνήθως σε προ-Β και Τ κύτταρα [5,6] και παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυογένεση και τον καρκίνο ανάπτυξη [7]. LEF1 είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που επηρεάζει πολυάριθμες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η ρύθμιση των Wnt σηματοδότησης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, την κινητικότητα, και η μεταγραφή του γονιδίου [8,9]. Η αλλαγμένη έκφραση του LEF1 πρωτεΐνη έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην ογκογένεση διαφορετικών ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [10]. Μοριακά, LEF1 μπορεί να μεσολαβήσει την έκφραση Wnt γονιδίων μέσω πρόσληψη β-κατενίνης σηματοδοτήσεως προς τον προαγωγό των γονιδίων στόχων [11,12], αλλά η ίδια δεν διαθέτει δικό LEF1 δυναμικό ενεργοποίησης της μεταγραφής της στα κύτταρα. πρωτεΐνη LEF1 περιέχουν πεδία σύνδεσης β-κατενίνης μπορεί να ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή των καρκινικών κυττάρων [13]. Πολλαπλοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν LEF1 έκφρασης, όπως αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών-2, PITX2, και αυξητικό παράγοντα ηπατοκυττάρων [14-16].

Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύθηκε πρώτα LEF1 έκφραση σε ιστούς καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με οι paratumorous ιστούς παχέος εντέρου και στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της LEF1 knockdown στη ρύθμιση της βιωσιμότητας των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και γονιδιακή έκφραση

in vitro

και σε γυμνούς ξενομοσχεύματα ποντικών. Έχουμε διερευνηθούν επίσης τα αποτελέσματα της Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν για τη ρύθμιση του μονοπατιού Notch.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η μελέτη εγκρίθηκε από τη συμπεριφορά της Επιτροπής Ανθρωπίνων Δεοντολογίας το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο, College of Medicine της Xi’an Jiaotong Πανεπιστημίου. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς.

Το ζώο πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση της Ιατρικής Σχολής του Xi’an Jiaotong Πανεπιστημίου.

Ασθενείς και δείγματα

Σε αυτή τη μελέτη, αναδρομικά προσληφθούν 106 ζεύγη χειρουργικά ο καρκίνος του παχέος εντέρου και paratumorous φυσιολογικό δείγματα ιστού (5 cm μακριά από τη βλάβη όγκου) από το πρώτο Affiliated Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή του Xi’an Jiaotong Πανεπιστήμιο μεταξύ Γενάρη του 2006 και Μαρτίου 2007. Αυτά τα δείγματα ιστού ελήφθησαν από 60 άνδρες και 46 γυναίκες ασθενείς με μέση ηλικία 55,5 έτη (εύρος από 30 έως 81 έτη). Οι κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Παθολογική διάγνωση αυτών των δειγμάτων ήταν ανεξάρτητα ξανά επιβεβαιώνεται από δύο παθολόγους με τυφλό τρόπο. Όλοι οι ασθενείς δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με οποιοδήποτε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν την επέμβαση. Τα τελευταία παρακολούθηση των ασθενών-ups διεξήχθησαν στα τέλη του Μαΐου 2012. Οι ασθενείς που χάθηκαν κατά την παρακολούθηση ή θανάτου από αιτίες εκτός από τον καρκίνο του παχέος εντέρου θεωρήθηκαν ως λογοκρισία των δεδομένων κατά τη διάρκεια της ανάλυσης επιβίωσης.

Κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές

Ν

βαθμολογία έκφρασης Ι.ΕΡ1 (μέση τιμή ± SD)

P

αξία

Ηλικία (έτη) & lt? 60.414,87 ± 2.330.502≥60655.21 ± 2.65Tumor differentiationWell504.84 ± 1.940.274Moderate394. 95 ± 2.87Poor175.59 ± 3.02Infiltration depthT

1 + T

2404,12 ± 1.980.002T

3 + T

4665,66 ± 2.56Lymph κόμβο μετάσταση Ν

0464,06 ± 2,12 & lt? 0,001 Ν

1 – 3605,85 ± 2.74Distant metastasisM

0864,69 ± 2.040.004M

1206,31 ± 2.77TNM stageI81.39 ± 3,23 & lt? 0.001II334.14 ± 2.40III455.33 ± 2.25IV207.12 ± 2.69Table 1 . Σύλλογος της έκφρασης Ι.ΕΡ1 με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες από τους ασθενείς.

CSV Λήψη CSV

ιστοπαθολογία και ανοσοϊστοχημεία

παραφίνη-ενσωματωμένες ενότητες (5 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν μέσα από μια σειρά βαθμονομημένων αλκοολών. Για ανοσοϊστοχημεία, ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι LEF1 (C12A5, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 100, και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα ελέγχου ταιριαστού ισότυπου ως αρνητικός έλεγχος. Στη συνέχεια, οι τομές βάφτηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη και το χρώμα αναπτύχθηκε με τη χρήση 0,05% 3 ‘, 3’-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική ακολουθούμενη από αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη. Τα τμήματα τελικά αναθεωρηθεί και σκόραρε κάτω από ένα μικροσκόπιο Olympus (BX41? Τόκιο, Ιαπωνία), σύμφωνα με μια προηγούμενη μελέτη χρησιμοποιώντας πολλαπλασιάζοντας το σκορ ένταση και την έκταση της χρώσης βαθμολογίας [17]. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής χρώση), 2 (μέτρια χρώση), ή 3 (ισχυρή χρώση). Η έκταση της χρώσης αξιολογήθηκε εκχωρώντας βαθμολογίες δείγματα με βάση το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων ως εξής: 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) και 4 (76-100%). Ο αριθμός των θετικών κυττάρων αξιολογήθηκε με απαρίθμηση 10 τυχαία πεδία σε μεγέθυνση × 400. Το τελικό σκορ ήταν κυμαίνονταν από 0 έως 12. Μια βαθμολογία 0-2 ορίστηκε ως αρνητική έκφραση, βαθμολογίες 3-5 ως «ασθενής έκφραση», βαθμολογίες 6-9 ως «μέτρια έκφραση» και τα σκορ 10-12 ως «ισχυρή έκφραση «. Για το σκοπό της περαιτέρω ανάλυση των δειγμάτων με 0-5 ορίστηκαν ως αξιοσημείωτα μειωμένη χρώση ή απώλεια της έκφρασης LEF1, ενώ τα δείγματα με βαθμολογία 6-12 ομαδοποιήθηκαν και ορίζονται ως θετική έκφραση.

σε πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από τους ιστούς και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτά τα RNA δείγματα στη συνέχεια αντίστροφα μεταγράφηκαν σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα RT-PCR κιτ (Takara, Dalian, Κίνα). Real-time PCR στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σε iQ5 Multi-χρώμα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ανίχνευσης (Bio-Rad, Hercules, CA) χρησιμοποιώντας SYBR Προμίγματα Ex Taq TM II (Takara). Οι αλληλουχίες εκκινητών για την ενίσχυση LEF1 ήταν: 5′-AGCGAATGTCGTTGCTGAGTGTA-3 ‘και 5′-CTCTTGCAGACCAGCCTGGATAA-3’. Ένα γονίδιο housekeeping GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος, και οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘και 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν ως ένα κύκλο κατωφλίου (

t ΔΟ) αξίας. Οι ΔΟ

t τιμές προσδιορίστηκαν αφαιρώντας το μέσο όρο εσωτερικό γονίδιο καθαριότητας C

t αξία από το μέσο όρο του γονιδίου-στόχου C

t αξία. Δεδομένου ότι η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης των γονιδίων-στόχων και γονιδίων εσωτερικού ελέγχου ήταν ίσα, η σχετική έκφραση του γονιδίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Κάθε μέτρηση διεξήχθη εις τριπλούν.

Κατασκευή φορέας λεντοϊού που μεταφέρουν Ι.ΕΡ1 shRNA

Ένα Ι.ΕΡ1 shRNA φορέας λεντοϊού (U6-vshRNA-CMV-PUR-GFP-GV248-shLEF1) σχεδιάστηκε, συντίθεται , και κατασκευάστηκε από Genechem Co. (Σαγκάη, Κίνα). Επελέγησαν οι ακόλουθες αλληλουχίες στόχο στο ανθρώπινο γονίδιο LEF1, δηλαδή, στοχεύουν 1, GCTGACATCAAGTCTTCCTTG? στόχο 2, GTGAAGAGCAGGCTAAATATT? στοχεύουν 3, GCTGGTCTGCAAGAGACAATT? και στοχεύουν 4, GCTCA TTCCCAACGTGCAAAG. Target 3 επιλέχθηκε για τα επακόλουθα πειράματα. Ο φορέας φακοϊό U6-vshRNA-SHNC, το οποίο κωδικοποιεί μια τυχαία ακολουθία RNAi, χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

Οι κυτταρικές σειρές, καλλιέργεια, γονίδιο επιμόλυνση και θεραπείες

κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον, Caco

2, ΟοΙο205, HCT116, ΗΤ29, και Lovo ελήφθησαν από την Cell Resource Center, Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών (Shanghai, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) (HyClone, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Invitrogen), πενικιλλίνη (100 IU /ml), και στρεπτομυκίνη (0,1 mg /ml) σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Ένα ανθρώπινο κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου SW480 καλλιεργήθηκε σε μέσο RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλλίνη (100 IU /ml), και στρεπτομυκίνη (0,1 mg /ml) σε 5% CO

2 στους 37 ° C, ενώ μία άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου ανθρώπινου κόλον, SW620, καλλιεργήθηκε σε μέσον L-15 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλλίνη (100 IU /ml), και στρεπτομυκίνη (0,1 mg /ml) σε 5 % CO

2 στους 37 ° C. SW480 και SW620 κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό φορείς σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 10 και 100, αντίστοιχα, και στη συνέχεια επιλέγονται σε πουρομυκίνη που περιέχει μέσο ανάπτυξης. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, πουρομυκίνη-ανθεκτικές αποικίες επάνω, επεκτάθηκε και αναλύονται χωριστά

γ-σεκρετάσης DAPT αναστολέα (100 μΜ? Sigma-Aldrich, USA). Χρησιμοποιήθηκε για φαρμακολογικές δοκιμασίες αναστολής, η οποία μπορεί αποτελεσματικά μπλοκ Notch ενδοκυττάρια περιοχή (NICD) εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου. Εν συντομία, αυτά τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 ml μέσο που περιείχε 1% FBS και DAPT. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με ίσες ποσότητες διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO). Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν για στύπωμα Western όπως περιγράφεται παρακάτω.

εκχύλιση πρωτεϊνών και

κηλίδος Western

Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται από τους ιστούς και τα κύτταρα, και αυτά τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 6% ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου -12%? διαχωρισμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες ηλεκτρονικά διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Danvers, ΜΑ). Οι μεμβράνες κατόπιν αποκλείστηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-LEF1 αντίσωμα (1: 800? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), αντι-ΜΜΡ2 (1: 500? Κυττάρων σηματοδότηση Technology, Danvers, ΜΑ), αντι -MMP7 (1: 100? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-ΜΜΡ9 (1: 100? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-NICD (1: 800? κυττάρων σηματοδότηση Technology), αντι- RBP-ϋκ (1: 100? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-Hes1 (1:50? Santa Cruz Biotechnology), ή αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (1: 1000? Santa Cruz Biotechnology). Τέλος, οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν με ένα σύστημα ανίχνευσης ECL (Millipore) με μια χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz Biotechnology). Western blots επαναλήφθηκαν τρεις φορές για κάθε δείγμα πρωτεΐνης.

Κυτταρική βιωσιμότητα ΜΤΤ δοκιμασία

Κύτταρα (5 × 10

3 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν με 200 μΐ μέσου ανάπτυξης σε ένα 96 -Καλά πλάκα και αναπτύχθηκαν μέχρι 7 ημέρες. Στο τέλος των πειραμάτων, 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ, 0,5 mg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) ήταν προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες, και 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και αναμείχθηκαν με ανακίνηση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Μετά από αυτό, ο ρυθμός απορρόφησης μετρήθηκε σε μήκος κύματος 490 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Κάθε πείραμα έγινε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η κυτταρομετρία ροής προσδιορισμούς κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, κύτταρα (5 × 10

5) αναπτύχθηκαν και συλλέγεται, πλένεται δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% για 24 ώρες στους 4 ° C. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με 150 μΙ ιωδιούχο προπίδιο και 150 μΙ RNase Α (Sigma-Aldrich) διαδοχικά. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στους 37 ° C, τα δείγματα εξετάστηκαν με κυτταρόμετρο ροής (FACS διαμετρήματος, Franklin Lakes, NJ), and Cell Quest λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Για την ανάλυση απόπτωσης, κύτταρα (5 × 10

5 ανά φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία έξι φρεατίων, συλλέγεται, και πλένεται δυο φορές με παγωμένο PBS. Στη συνέχεια, 500 μΙ του ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, 5 μΐ αννεξίνης V-APC, και 5 μΐ 7-AAD (keygen Biotech, Nanjing, Κίνα) προστέθηκαν διαδοχικά στα δείγματα. Μετά την ανάμιξη και επώαση για 15 λεπτά στους 37 ° C, τα δείγματα τρέχουν στην κυτταρομετρία ροής αμέσως. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Tumor κύτταρο Matrigel δοκιμασία εισβολής

Η ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου αξιολογήθηκε με τη χρήση ενός θαλάμου εισβολή Millicell (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) . Τα ένθετα πόρων 8 μm καλύφθηκαν με Matrigel (Becton Dickinson και Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Κύτταρα (5 × 10

4) επαναιωρήθηκαν με 200 μΙ μέσου χωρίς ορό με 5 μg /ml μιτομυκίνη C (Sigma-Aldrich) στην κορυφή του θαλάμου, και ο θάλαμος πυθμένα πληρώθηκε με κανονικό μέσο καλλιέργειας. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα μη εισβάλλοντα κύτταρα στην ανώτερη επιφάνεια αφαιρέθηκαν με ένα βαμβάκι-στυλεό και τα εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου σταθεροποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας 10 τυχαία επιλεγμένα πεδία σε μεγέθυνση 200x

γυμνό ποντίκι προσδιορισμό των κυττάρων του όγκου ξενομοσχεύματος

Άντρας BALB /c γυμνά ποντίκια (ηλικίας μεταξύ 4 και 6 εβδομάδων?. Σαγκάη Πειραματικό Κέντρο ζώων, Σαγκάη, Κίνα) υποδορίως εμβολιάστηκαν με 1 × 10

7 κύτταρα και στεγάζεται σε ένα άνευ παθογόνου εγκατάσταση του Κέντρου ζώων του Xi’an Jiaotong Πανεπιστημίου. Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε με μήκος (L) και το πλάτος (W), μετρούμενη με μία συρόμενη παχύμετρο και υπολογίζεται ως L Χ W

2 χ 0,5. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 45 ημέρες μετά την υποδόρια ένεση των κυττάρων του όγκου. Γυμνά ποντίκια με όγκους παρατηρήθηκαν από το σύστημα απεικόνισης IVIS (IVIS φάσματος, Xenogen, CA, USA) πριν να θυσιαστούν.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Περιγραφικά δεδομένα αναλύθηκαν με chi-square test του Pearson (δύο όψεων). δεδομένα των μετρήσεων αναλύθηκαν με Μαθητή

t-test

ή ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Ένα

P

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Ι.ΕΡ1 έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές

Σε αυτή τη μελέτη , προσδιορίσαμε πρώτη έκφραση LEF1 πρωτεΐνης σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 71 106 ιστών κόλον και 23 του 106 paratumours φυσιολογικούς ιστούς κόλου εξέφρασαν την πρωτεΐνη LEF1, υποδεικνύοντας ότι οι ιστοί καρκίνου του παχέος εντέρου που εκφράζονται υψηλότερα επίπεδα από αυτά που LEF1 στις paratumours φυσιολογικούς ιστούς κόλου (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 1Α). Προφανώς, η έκφραση LEF1 παρατηρήθηκε στους πυρήνες στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς και paratumours φυσιολογικούς ιστούς κόλου (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης LEF1 συνδέθηκε με βάθος διήθηση, λεμφαδένας και απομακρυσμένων μεταστάσεων, και προηγμένες ΤΝΜ (όγκος-node-μετάσταση) στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου (

P

& lt? 0,01? Πίνακας 1). Η ανάλυση επιβίωσης (5-ετή παρακολούθηση 106 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου) έδειξε ότι ο μέσος ρυθμός επιβίωσης των ασθενών με Ι.ΕΡ1 εξέφρασε όγκου ήταν 48,5 μήνες, η οποία ήταν σημαντικά φτωχότερη από ό, τι τα άτομα με Ι.ΕΡ1-αρνητικούς όγκους (πάνω από 60 μήνες) (

P

& lt? 0,05? Εικόνα 1Β)

(α) χρώση ανοσοϊστοχημεία της Ι.ΕΡ1 για paratumorous ιστούς του παχέος εντέρου (α) και ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου (BD) (γραμμή κλίμακας, 25μm):. ( α) αρνητική έκφραση, (β) ασθενής έκφραση, (γ) μέτρια έκφραση, (δ) ισχυρή έκφραση. (Β) καμπύλη Kaplan-Meier για σύνδεση της πρωτεϊνικής έκφρασης Ι.ΕΡ1 με συνολική επιβίωση των ασθενών. (C) qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των σχετικών επιπέδων έκφρασης του mRNA LEF1 (ιστοί cc: καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου? Φυσιολογικούς ιστούς: ιστοί paratumorous κόλον). Στήλες, σημαίνει (n = 106)? μπαρ, SD? ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με paratumorous ιστούς του παχέος εντέρου.

P

αξία καθορίστηκε με Μαθητή

t-test

. (Δ) Ανάλυση Western blot της έκφρασης LEF1 σε επτά ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα (Caco

2, ΟοΙο205, HCT116, ΗΤ29, Lovo, SW480, SW620 και). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Ομοίως, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA LEF1 αυξήθηκαν σημαντικά σε αυτά τα 106 ζεύγη ιστών καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τις paratumours φυσιολογικούς ιστούς κόλου (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 1C). Επιπλέον, η έκφραση LEF1 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 και SW620 (σχήμα 1Δ). Έτσι, επιλέξαμε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές με νοκ ντάουν Ι.ΕΡ1 έκφρασης για περαιτέρω μελέτη.

Σταθερή νοκ ντάουν της έκφρασης Ι.ΕΡ1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Για να διερευνήσουν το ρόλο της Ι.ΕΡ1 για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε ένας ιός που μεταφέρουν Ι.ΕΡ1 shRNA να μολύνει SW480 και SW620 για νοκ ντάουν της έκφρασης Ι.ΕΡ1. Στόχου 3 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σταθερών Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές. Έχουμε λάβει επιτυχώς κύτταρα νοκ ντάουν σταθερή Ι.ΕΡ1 ονομάζεται shLEF1 και SHNC (με αρνητικό φορέα ελέγχου). Real-time PCR ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση του mRNA LEF1 ανεστάλη μέχρι 70% σε κύτταρα shLEF1 συγκριτικά με κύτταρα SHNC (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 2Α). Ομοίως, τα επίπεδα της πρωτεΐνης LEF1 επίσης χτυπηθεί κάτω σημαντικά σε κύτταρα shLEF1 παρά σε κύτταρα SHNC (Σχήμα 2Β).

(Α) qRT-PCR ανάλυση της έκφρασης LEF1 μετά τη μόλυνση των διαφορετικών φορέων λεντοϊού έκφρασης LEF1 shRNA, *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το μητρικό κύτταρο. (Β) ανάλυση κηλίδας Western της πρωτεϊνικής έκφρασης LEF1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. 1-4 (διαφορετικούς φορείς θέση στόχο) και SHNC (αρνητικός έλεγχος). Στόχου 3 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σταθερών Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές.

Η

Νοκ ντάουν της έκφρασης Ι.ΕΡ1 ανέστειλε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

in vitro

και όγκου σχηματισμό και την ανάπτυξη

in vivo

η

Σταθερά επιμολυσμένα LEF1 shRNA σπάρθηκαν και αναπτύχθηκαν σε πουρομυκίνη που περιέχει μέσο ανάπτυξης για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι τα κύτταρα SW480-shLEF1 και τα κύτταρα SW620-shLEF1 μεγάλωσε πολύ πιο αργή από ό, τι τα κύτταρα SW480-SHNC και τα κύτταρα SW620-SHNC, αντίστοιχα (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 3Α). Η κατανομή κυτταρικού κύκλου ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής έδειξε μια παρατεταμένη και εμφανή καθυστέρηση της εξέλιξης G0 /G1 φάση προς φάση S σε κύτταρα shLEF1 σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων SHNC (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 3Β και 3C). Επιπλέον, αναλύσαμε περαιτέρω κατά πόσον η μειωμένη κύτταρο όγκου βιωσιμότητα οφείλεται στην επαγωγή της απόπτωσης και διαπίστωσε ότι SW480 και SW620 κυττάρων με σταθερή επιμόλυνση LEF1 shRNA είχαν σημαντικά περισσότερες απόπτωσης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3D και 3Ε).

(Α) δοκιμασία ΜΤΤ. **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα SHNC. (Β και Γ) κυτταρομετρίας ροής διανομή του κυτταρικού κύκλου. Στήλες, σημαίνει (n = 3)? μπαρ, SD? **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα SHNC. (Δ και Ε) ροής δοκιμασία κυτταρομετρίας απόπτωση. Κυττάρων αυθόρμητη απόπτωση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Στήλες, σημαίνει (n = 3)? μπαρ, SD? ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SHNC

Η

Επίσης, πραγματοποιήσαμε ένα γυμνό δοκιμασία ξενομόσχευμα ποντίκι για να αξιολογηθεί ο ρόλος της Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν

in vivo.

. Σαράντα πέντε ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, ξενομοσχεύματα LEF1 knockdown του όγκου έδειξε μια μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα όγκων ελέγχου SHNC. Επιπλέον,

in vivo

απεικόνισης έδειξαν ότι και οι δύο τύποι των ποντικών δεν είχαν παρατηρήσιμες μεταστάσεις όγκων στα απομακρυσμένα όργανα (Σχήμα 4Α). Οι μέσες όγκοι της μάζας του όγκου που προέρχονται από κύτταρα SW480-shLEF1 και τα κύτταρα SW620-shLEF1 ήταν πολύ μικρότερες από εκείνες των ξενομοσχευμάτων όγκου που προέρχονται από κύτταρα SW480-SHNC και τα κύτταρα SW620-SHNC, αντίστοιχα (

P

& lt? 0.001 ? Σχήμα 4Β). Το βάρος του όγκου έδειξε επίσης ότι knockdown έκφρασης LEF1 ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων κόλου σε γυμνά ποντίκια (Σχήμα 4C), επειδή το βάρος των όγκων μάζας σε SW480 και SW620 κυττάρων που εκφράζουν shLEF1 ήταν σημαντικά ελαφρύτερα από εκείνα στα ποντίκια ελέγχου. Αυτά τα ευρήματα πρότεινε ότι Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν ανέστειλε το σχηματισμό και την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκων in vivo.

(Α)

Σε

vivo

ανάλυση απεικόνισης. Ανάπτυξη των όγκων που σχηματίζονται από κύτταρα shLEF1 και τον έλεγχο των κυττάρων SHNC σε άτριχα ποντίκια φωτογραφήθηκε από IVIS. (Β) Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3 ημέρες από την ημέρα 9 μετά τον εμβολιασμό με τη μέτρηση του μήκους του όγκου και το πλάτος. Στήλες, σημαίνει (n = 6)? μπαρ, SD? ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SHNC. (Γ) Το βάρος του όγκου συγκρίθηκε την ημέρα 45 μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων. Στήλες, σημαίνει (n = 6)? μπαρ, SD? ***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο SHNC

Η

Knockdown έκφρασης LEF1 μειώθηκε εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων και έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9

Μετά από αυτό, προσδιορίσαμε την επίδραση της Ι.ΕΡ1 νοκ ντάουν για τη ρύθμιση της εισβολής των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου με τη χρήση της δοκιμασίας εισβολή Matrigel. Εμείς κατεργασία των κυττάρων με Μιτομυκίνη C για να εξαλειφθεί η επίδραση της αυξημένης πολλαπλασιασμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι αριθμοί των κυττάρων SW480 εισβάλλουν-shLEF1 και τα κύτταρα SW620-shLEF1 ήταν πολύ χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων SW480-SHNC και τα κύτταρα SW620-SHNC (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 5Α και 5Β). Επιπλέον, knockdown έκφρασης LEF1 θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά τα επίπεδα της ΜΜΡ-2 και πρωτεΐνη ΜΜΡ-9, αλλά όχι ΜΜΡ-7 πρωτεΐνης σε κύτταρα shLEF1 σε σύγκριση με εκείνη του καρκίνου του παχέος εντέρου SHNC κύτταρα (Σχήμα 5C).

( Α και Β) δοκιμασία εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Εκπρόσωπος εικόνες χρώσης, × 200. Ποσοτική ανάλυση του εισέβαλαν κυττάρων όγκου μεταξύ LEF1 knockdown και κύτταρα ελέγχου. Στήλες, σημαίνει (n = 3)? μπαρ, SD? **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SHNC. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western για ΜΜΡ2, ΜΜΡ-7 και ΜΜΡ-9 πρωτεΐνης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Νοκ ντάουν της έκφρασης Ι.ΕΡ1 ανέστειλε Π.Ε.Π.-Ικ δραστηριότητα

Μέχρι σήμερα, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι Wnt και Notch μονοπατιού συνεργατικά ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ογκογένεση στα έντερα [18]. Να αποκαλύψει τις πιθανές συγκλίνουσες σημεία και να αποσαφηνίσει το δυναμικό μηχανισμό με τον οποίο Ι.ΕΡ1 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση, ανιχνεύσαμε την έκφραση του Notch ενδοκυττάρια περιοχή (NICD) /Π.Ε.Π.-Ικ /Hes1 γονίδια οδού σε αυτά τα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Δεν βρήκαμε καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης NICD στο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα με διαφορετικές θεραπείες? Ωστόσο, τα επίπεδα του-Ικ RBP πρωτεΐνες και Hes1 μειώθηκαν σε κύτταρα SW480-shLEF1 και τα κύτταρα SW620-shLEF1 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 6Α).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των NICD, RBP-ϋκ και της έκφρασης Hes1. (Β) Ανάλυση Western blot της έκφρασης LEF1 μετά από επεξεργασία με αναστολέα Notch μονοπάτι DAPT (100 μΜ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

αδημοσίευτα δεδομένα μας έδειξαν αυξημένη δραστικότητα του πλήρους μήκους υποκινητή LEF1 κατόπιν συν-επιμόλυνση NICD cDNA σε SW480, HepG2, ΗΕΚ293, Α549 και κύτταρα HeLa ? Έτσι, χρησιμοποιείται DAPT, έναν αναστολέα του μονοπατιού Notch, να παρεμποδίζουν την έκφραση NICD σε SW480 και SW620 κυττάρων. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι NICD προς τα κάτω ρύθμιση επηρεάζεται η έκφραση των πρωτεϊνών Hes1 και Ι.ΕΡ1 (Σχήμα 6Β), υποδηλώνοντας μια αμοιβαία ρύθμιση μεταξύ Ι.ΕΡ1 και Notch μονοπατιού.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, η πρώτη μας ανέλυσε το έκφραση του LEF1 mRNA και της πρωτεΐνης σε δείγματα ιστών καρκίνου του παχέος εντέρου και στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της LEF1 knockdown για τη ρύθμιση της μεταβολής της βιωσιμότητας των κυττάρων όγκου, κατανομή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και γονίδιο εκφράσεις

in vitro

και σε ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικού . Βρήκαμε ότι τα επίπεδα του LEF1 mRNA και της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά αυξημένη στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς και συνδέονται με το βάθος διήθηση, λεμφαδένας και απομακρυσμένων μεταστάσεων και βραχύτερη γενική επιβίωση. LEF1 knockdown μειωμένη βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων, ικανότητα εισβολής, και έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ-9, αλλά επήγαγε απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. LEF1 knockdown κατέστειλε το σχηματισμό όγκων και της ανάπτυξης σε γυμνά ποντίκια. Επιπλέον, η έκφραση του RBP-Ικ και Hes1 μειώθηκε σε κύτταρα knockdown LEF1. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι LEF1 θα μπορούσε να αξιολογηθεί περαιτέρω ως στόχος για την πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση και η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης LEF1 συνέβαλε στην ανάπτυξη του καρκίνου [10,13,19]. Πράγματι, η τρέχουσα μελέτη μας ανέλυσε την έκφραση του LEF1 mRNA και της πρωτεΐνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του παχέος εντέρου paratumorous ιστούς και διαπίστωσε ότι LEF1 υπερεκφράστηκε σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα επίπεδα έκφρασης LEF1 σχετίστηκαν με βάθος διείσδυσης, λεμφαδένα, και απομακρυσμένων μεταστάσεων, και προχωρημένα στάδια ΤΝΜ του καρκίνων του παχέος εντέρου, καθώς και η κακή συνολικό ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα τελευταία δεδομένα ήταν διαφορετικά από τα στοιχεία που αναφέρθηκαν από Kriegl, L et al [20], αλλά ήταν παρόμοιες με άλλη προηγούμενη μελέτη [21]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι LEF1 μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για την πρόβλεψη της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Για να κατανοηθεί περαιτέρω ο ρόλος του LEF-1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου, έχουμε χτυπηθεί κάτω LEF1 έκφραση σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, SW480 και SW620. Ερευνήσαμε περαιτέρω το ρόλο του LEF1 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. αποδιοργάνωση κυτταρικού κύκλου ορίζεται ως ένας επαγωγέας που οδηγούν σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την πρόοδο του καρκίνου που ακολουθείται από την ογκογένεση, για παράδειγμα, Shtutman et al διαπιστώνεται ότι η κυκλίνη D1 ήταν ένα από τα γονίδια του συμπλόκου στόχου β-κατενίνης /LEF1 [22], η οποία ήταν υπεύθυνη για πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη του όγκου. Σύμφωνα με αυτή τη μελέτη, τα τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν ότι μειορρύθμιση του LEF1 αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του κόλου

in vitro

με την αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 αποπτωτικά, παρατείνοντας τη φάση G0 /G1, G2 και μειώνοντας /S φάσης σε Ι.ΕΡ1-γκρέμισε SW480 και SW620 κυττάρων

in vitro

και σε ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικού, η οποία επιβεβαίωσε δύο άλλες προηγούμενες μελέτες στον άνθρωπο του ενδομητρίου και του παχέος εντέρου [9,23].

Επιπλέον, η σημερινή μας μελέτη έδειξε ότι η υπερέκφραση LEF1 στις πρωτογενείς ιστούς CRC συνδεόταν με μακρινή μετάσταση των ασθενών CRC, η οποία είναι συνεπής με αρκετές προηγούμενες μελέτες τεκμηριώνουν ότι LEF1 χαρακτηρίστηκε ως βιοδείκτη για τον καρκίνο του παχέος εντέρου για μεταστάσεις στο ήπαρ [21]. Πράγματι, οι τρέχουσες

in vitro

δεδομένα μας επιβεβαίωσαν ότι knockdown έκφρασης LEF1 ανέστειλε την ικανότητα εισβολής των SW480 και SW620 κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα. Στο μοριακό επίπεδο, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 ΜΜΡ7 και συνδέονται με τη διαδικασία κυτταρική μετανάστευση, επηρεάζοντας την ανάπτυξη και την εξέλιξη [24,25] καρκίνου. Βρήκαμε ότι knockdown έκφρασης LEF1 κατέστειλε ΜΜΡ2 και έκφραση ΜΜΡ-9, αλλά όχι ΜΜΡ-7, υποδηλώνοντας ότι η επιλεκτική διαμόρφωση των MMPs με LEF1 θα μπορούσε να έχει τη βιολογική σημασία στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αντίθεση, LEF1 ήταν σε θέση να ρυθμίζουν ΜΜΡ-7 έκφραση και δραστικότητα σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [26], ενώ μια άλλη προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η κυκλοφορούσα ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε δυνητικά ταξινόμηση των ασθενών σε χαμηλού κινδύνου και υψηλού κινδύνου, καλοήθης νόσος, και ο καρκίνος του μαστού [24]. Ωστόσο, δοκιμασία ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού μας δεν έδειξε καμία μετάσταση όγκου τόσο στο LEF-1 knockdown και τα ξενομοσχεύματα του όγκου ελέγχου? Έτσι, πρόσθετες μελέτες είναι σαφώς απαραίτητο.

Επιπλέον, η οδός Notch συχνά ενεργοποιείται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, όπως ο καρκίνος του εγκεφάλου, μαστικούς αδένες, του τραχήλου, του πνεύμονα, της κεφαλής και του αυχένα, του παχέος εντέρου, των νεφρών, πάγκρεας, και οξεία μυελοειδή [27,28]. Αναστολή της Notch μονοπατιού που επάγεται καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση και μειωμένη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [29]. Μια πρόσφατη δημοσίευση έδειξε ότι η οδός Wnt ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την Notch μονοπάτι [30]. Ο σταυρός ομιλία μεταξύ των Notch και οδών Wnt μπορεί να προκαλείται εν μέρει από την ειδική ρύθμιση του Notch φωσφορυλίωσης GSK-3β-εξαρτώμενη. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Notch έχει έμμεσα συσχετισθεί με την ενεργοποίηση Notch και πυρηνικής μετατόπισης, καθώς και κυτταρικό μετασχηματισμό. Επιπλέον, Jagged1, ένα από τα προσδέματά Notch, μπορεί να ενεργοποιηθεί από τη β-κατενίνης κατά τη διάρκεια του σχηματισμού έκτοπη θύλακα της τρίχας σε ενήλικες επιδερμίδα [31].