Αφηρημένο

Λόγω της αυτο-ανανέωσης και ογκογόνων ιδιοτήτων, τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο) έχουν υποθέσει ότι είναι σημαντικοί στόχοι για καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Ωστόσο, η μελέτη των τικ παρεμποδίζεται από το γεγονός ότι η αναγνώριση και καλλιέργεια των τικ είναι ακόμα ένα αντικείμενο εκτεταμένης συζήτησης. Οι Πλωτή τρισδιάστατο σφαιροειδές καλλιέργειες (SC) που αναπτύσσονται σε μέσο άνευ ορού συμπληρωμένο με αυξητικούς παράγοντες υποτίθεται ότι πρέπει να εμπλουτιστεί σε τικ. Δημιουργήσαμε SC από νωπά δείγματα όγκου κλινικές και συγκρίθηκαν τους να απομονώνονται από SC CRC κυτταρικές σειρές, καθώς και να προσφύσεως διαφοροποιημένων ομολόγους. Ασθενής που προέρχεται οθόνη SC ικανότητα αυτο-ανανέωσης και μπορεί να επάγει σειριακή μεταμοσχεύσιμων όγκων σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια, τα οποία μοιάζουν με φαινοτυπικά τον όγκο προέλευσης. Επιπλέον, η αρχική ιστός του όγκου και καθιερωμένες SC διατηρούν πολλές παρόμοιες CRC-σχετικές μεταλλάξεις. Πρωτοβάθμια Επιτροπή Εποπτείας εκφράζει κλειδί βλαστική ικανότητα πρωτεΐνες όπως SOX2, Oct4, Nanog και LGR5 και δείχνουν σημαντικά αυξημένη ικανότητα χημειοαντίσταση σε σύγκριση με προσκολλημένη διαφοροποιούνται ομολόγους τους και να προέρχεται από κυτταρική σειρά SC. Εντυπωσιακά, κύτταρα που προέρχονται από σφαιροειδές ή προσκολλημένη διαφοροποίηση καλλιέργεια συνθήκες εμφανίζονται παρόμοια ικανότητα αυτο-ανανέωσης και εξίσου σχηματίζονται όγκων σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια, υποδηλώνοντας ότι αυτο-ανανέωση και όγκο έναρξη ικανότητα των τικ δεν περιορίζεται σε φαινοτυπικά ανώριμα κύτταρα σφαιροειδές, την οποία περιγράφουν ότι είναι εξαιρετικά πλαστικό και είναι σε θέση να επαναγοράσει τα χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων, ακόμη και μετά από μακρές διαδικασίες διαφοροποίησης. Τέλος, εντοπίσαμε δύο γονίδια ανάμεσα σε μια υπογραφή γονιδιακής έκφρασης σφαίρα που προβλέπουν υποτροπή της νόσου σε ασθενείς με CRC. Εδώ σας προτείνουμε αυτό το SC από νωπό ιστό του όγκου του ασθενούς παρούσα ενδιαφέροντα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που μπορεί να έχει κλινική σημασία για χημειοαντίσταση και υποτροπή της νόσου και ως εκ τούτου αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο για τη δοκιμή νέων CRC-θεραπείες που ξεπεράσει την αντίσταση των ναρκωτικών.

Παράθεση : Qureshi-Baig Κ, Ullmann P, Rodriguez F, Frasquilho S, Nazarov PV, Haan S, et al. (2016) Τι μαθαίνουμε από τα συστήματα σφαιροειδές Πολιτισμού; Insights από Tumorspheres προέρχονται από πρωτογενή Colon καρκινικό ιστό. PLoS ONE 11 (1): e0146052. doi: 10.1371 /journal.pone.0146052

Επιμέλεια: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Καναδάς

Ελήφθη: 11 Αυγούστου 2015? Αποδεκτές: 11η Δεκεμβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 8, Ιανουαρίου, 2016

Copyright: © 2016 Qureshi-Baig et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Όλα τα αρχεία γονιδιακής έκφρασης είναι διαθέσιμα από τη βάση δεδομένων ArrayExpress υπό τον αριθμό πρόσβασης E-mtab-3575

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καρκίνο Fondation (χορηγήσουν F1R-LSC-Πο 13HY2C) για τη χρηματοδότηση αυτής της μελέτης και το Fonds National de la Recherche (FNR) για την υποστήριξη KB και PU πλαίσιο του καθεστώτος επιδότησης AFR. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω την Ολοκληρωμένη Βιοτράπεζα του Λουξεμβούργου (IBBL) για την υποστήριξη αυτής της μελέτης. Οι συγγραφείς είναι επίσης ευγνώμων για την Fondation du Pelican de Mie et Pierre Hippert-Faber υπό την αιγίδα του Fondation de Luxembourg για την υποστήριξη KB και PU. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες : 5-FU, 5-φθοροουρακίλη? CRC, καρκίνο του παχέος εντέρου? TIC, ογκογενή κυττάρων? CSC, καρκίνο βλαστικών κυττάρων? SC, σφαιροειδές πολιτισμούς? SFC, σφαίρα που σχηματίζει κυττάρων? TIC, ογκογενή κυτταρική

Εισαγωγή

ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκονται τύπου καρκίνου για τους άνδρες και τις γυναίκες και τη δεύτερη συνηθέστερη αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις δυτικές χώρες [ ,,,0],1]. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που σημειώθηκε κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, πολλή διαμάχη εξακολουθεί να παραμένει πάνω από τα υπόβαθρα της εμφάνισης καρκίνου, μετάσταση και την εξέλιξη της CRC. Οι δύο κυρίαρχες έννοιες της καρκινογένεσης αξίωμα στοχαστικών (κλωνική μοντέλο εξέλιξης) και ιεραρχική (μοντέλο καρκίνου των βλαστικών κυττάρων) οργάνωση των όγκων. Σύμφωνα με τις τελευταίες, υποσύνολα των κυττάρων, τα λεγόμενα κύτταρα του όγκου-κίνηση (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο), επίσης γνωστή ως καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι υπεύθυνοι για την εξέλιξη του όγκου [2].

TICs προηγουμένως έχουν περιγραφεί στην το πλαίσιο των αιμοποιητικών κακοηθειών [3]. Λίγα χρόνια αργότερα, τικ εντοπίστηκαν επίσης σε ένα ευρύ φάσμα των συμπαγών όγκων, όπως του μαστού [4,5], του δέρματος [6], του εγκεφάλου [7-9], το πάγκρεας [10], του πνεύμονα [11] και του παχέος εντέρου [ ,,,0],12,13]. Οι ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο που ορίζεται από (1) αυτο-ανανέωσή τους, (2) διαφοροποίηση και (3) την ικανότητα του όγκου-κίνηση. Έχουν περιγραφεί να διαδώσει όγκους που είναι ικανά να ανακεφαλαιώνει την ετερογένεια των πρωτογενών όγκων [3]. Η υψηλή ογκογόνο δυναμικό των τικ επιδεινώνεται από την ισχυρή αντοχή τους σε ράδιο- και χημειο-θεραπεία. TICs είναι σε θέση να αποφύγει βλάβη DNA κατά τη διάρκεια ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας με μείωση των ROS και ενισχυμένη δραστηριότητα των κινασών σημείου ελέγχου του DNA [14]. Το υπόλοιπο υποσύνολο των τικ θα μπορούσε να προκαλέσει το σχηματισμό νέων όγκων, οδηγώντας έτσι σε ταχεία υποτροπή της κακοήθειας [15]. Ως αποτέλεσμα, TIC-ειδικές επεξεργασίες θα μπορούσε δυνητικά να οδηγήσει σε μειωμένο κίνδυνο υποτροπής του όγκου και μια βελτιωμένη πρόγνωση για τους ασθενείς CRC. Είναι ενδιαφέρον, διάφορες πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν την κλινική σημασία της στοχοθέτησης TIC που σχετίζονται με τα γονίδια [16].

Παρά τις σημαντικές προόδους στον τομέα της έρευνας TIC του παχέος εντέρου, η απομόνωση, ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των τικ του παχέος εντέρου παραμένει ελλιπώς εγκατεστημένος. Διαφορετικές στρατηγικές μπορούν να υιοθετηθούν για να αποκτήσουν TICs του παχέος εντέρου από καρκινικό ιστό. Οι τεχνικές απομόνωσης για TICs βασίζονται είτε σε ανοσογονικές ή λειτουργικές τους ιδιότητες [17]. Η αντιγονική προσέγγιση εκμεταλλεύεται μία ποικιλία δεικτών κυτταρικής επιφάνειας, για παράδειγμα προμινίνη-1 (κοινώς γνωστό ως CD133), CD44, CD34, CD24, επιθηλιακά-ειδικό αντιγόνο (EpCAM /ESA), CD166, CD29, Lgr5, CD49f και ALDH -1 [17]. Λειτουργική απομόνωση των τικ βασίζεται σε διαφορετικά χαρακτηριστικά, όπως αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη, χημειοαντίσταση, αυτο-ανανέωση, ασύμμετρη διαίρεση, και pluripotency. Κατά τα τελευταία χρόνια σφαιροειδές καλλιέργειες (SC) που βασίζονται στην αγκύρωση ανεξάρτητη ιδιότητες ανάπτυξης βλαστοκυττάρων, έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εμπλουτισμό για TICs στον εγκέφαλο [18,19], του μαστού [5,20], και του παχέος εντέρου [12,21 22] ιστού. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η SC διατηρούν πιο πιστά τα χαρακτηριστικά της αρχικής όγκων, συμπεριλαμβανομένων των προφίλ γονιδιακής έκφρασης, η ετερογένεια του όγκου και της μορφολογίας του όγκου, σε σύγκριση με την τακτική των πολιτισμών προσκολλημένη [12,19,21-25]. Επιπλέον, σφαιροειδή αντικατοπτρίζει την κυτταρική έννοια 3D και σχετικές παθοφυσιολογικών κλίσεις του

in vivo

όγκους [26]. Ωστόσο, με την οποία δοκιμασίες σχηματισμού βαθμό σφαίρα ευνοούν τον εμπλουτισμό των τικ δεν είναι πλήρως σαφής ακόμα. Πρώτον, αξίζει να σημειωθεί ότι τα σφαιροειδή περιέχουν επίσης διαφοροποιημένα κύτταρα του όγκου [21,22,27,28]. Δεύτερον, μερικές μελέτες για CRC θα μπορούσε πράγματι να αποδείξει ότι η SC διαθέτει TIC χαρακτηριστικά [12,21,29-31], ενώ άλλοι δεν μπορούσε να βρει κανένα εμπλουτισμό κατά τη σύγκρισή τους με προσφύσεως διαφοροποιημένη πολιτισμών [31-36]. Είναι σημαντικό ότι οι περισσότερες από τις προαναφερθείσες μελέτες βασίζονται σε κυτταρικές σειρές. Μπορεί να σκεφτεί ότι οι ασυνεπείς παρατηρήσεις που αποκτήθηκε με κυτταρικές σειρές μπορεί να οφείλεται σε φαινοτυπική διαφορές μεταξύ των επιλεγμένων κλώνων που θα μπορούσαν να έχουν συμβεί για μεγάλες χρονικές περιόδους της κυτταρικής καλλιέργειας [37].

Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αντικρουόμενα αποτελέσματα, αποφασίσαμε να χαρακτηρίσει SC από διαφορετικές αφετηρίες, υπό το πρίσμα του εμπλουτισμού TIC. Σε αντίθεση με τις παραδοσιακές κυτταρικές γραμμές, που λαμβάνονται από ασθενή πρωτογενείς καλλιέργειες αντικατοπτρίζουν την ετερογενή φύση της βιολογίας του όγκου, όπως υπάρχει σε ασθενείς. Έτσι, η σημασία αυτής της μελέτης είναι να χαρακτηρίσει δημιουργείται SC προέρχεται απευθείας από φρέσκα χειρουργικά δείγματα και τη σύγκρισή τους με προσκολλημένη διαφοροποιούνται ομόλογό τους, καθώς και να SC που προέρχεται από κυτταρικές σειρές CRC. Θέλουμε να καθορίσει εάν SC εμφανίζουν χαρακτηριστικά του βλαστική ικανότητα, συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, τα βλαστικά έκφρασης δείκτη κυττάρων, το δυναμικό διαφοροποίησης, την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ογκογενετικότητας

in vivo

.

Υλικό και Μέθοδοι

Δημιουργία του πρωτογενούς SC και διαφοροποιημένων ομολόγους τους

δείγματα ιστών Ανθρώπινο παχύ έντερο συλλέχθηκαν από το Ολοκληρωμένο Βιοτράπεζα του Λουξεμβούργου (IBBL, www.ibbl.lu), σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Όλα τα ανθρώπινα δείγματα που χρησιμοποιούνται στο πεδίο εφαρμογής αυτής της εργασίας δωρήθηκαν ελεύθερα και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από το δότη για τη χρήση αυτού του δείγματος στην έρευνα. Δεοντολογική έγκριση ελήφθη από το Comité National d’Ethique de Recherche, το Λουξεμβούργο (Αναφορά 201009/09). Φρέσκο ​​εκτομή ιστού του όγκου του παχέος εντέρου από 35 ασθενείς CRC συλλέχθηκε και αμέσως υποβάλλονται σε επεξεργασία σε πολιτισμό. Ο ιστός εκπλύθηκε αρκετές φορές σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) -F12 χωρίς ορό συμπληρωμένο με αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό παράγοντα (Invitrogen). Τα δείγματα κόβονται σε 1-2 mm

3 τεμάχια που ακολουθείται από επώαση σε κολλαγενάση τύπου IV (0.05 mg /ml? Invitrogen) και υαλουρονιδάση (2 μg /mL? Sigma) για 1 ώρα στους 37 ° C. Εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων ελήφθη με ανάμιξη κάθε 15 λεπτά και με διήθηση μέσω κελί σουρωτήρι 70 μm (BD Biosciences). Πρωτογενή SC κόλον διατηρήθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλές προσάρτησης (ULA) σκάφη κυτταρικής καλλιέργειας (Corning) σε μέσο βλαστοκυττάρων άνευ ορού που περιέχει DMEM-F12 συμπληρωμένο με Β-27 (1χ) και Ν-2 (1χ) συμπληρώματα (Invitrogen), BSA (4 mg /mL? Roth), μη-απαραίτητα αμινοξέα (1χ? Sigma), γλυκόζη 0,15% (Sigma), ινσουλίνη (4 U /L? Sigma), ηπαρίνη (4 μg /mL), Ν-ακετυλοκυστεϊνη ( 1 mM? Sigma), EGF (20 ng /mL? Biomol), bFGF (20 ng /mL? Miltenyi Biotec), και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (1χ? Lonza). Αυτό το μέσο θα περαιτέρω θα αναφέρεται ως μέσο βλαστοκυττάρων (SCM). Για σκοπούς χαρακτηρισμού, που χρησιμοποιείται μόνο νωρίς το πέρασμα SC μέσα σε αυτή τη μελέτη (όχι περισσότερο από 15 περάσματα).

Εμείς παράγεται προσκολλημένη αναπτυσσόμενη καλλιέργεια διαφοροποιημένων από το SC σε πολύ πρώιμο περάσματα. Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκαν συνθήκες διαφοροποίησης: νωρίς σφαιροειδή διαχωρίστηκαν και καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 συμπληρωμένου με 10% FCS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε τακτά σκάφη κυτταρικής καλλιέργειας. Σε αντίθεση με την SC, διαφοροποιημένη πολιτισμών αυξηθεί ως προσκολλημένα κύτταρα. Αυτές οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν υπό συνθήκες διαφοροποιούνται για τουλάχιστον 5 περάσματα πριν χρησιμοποιηθούν για πειράματα.

καλλιέργειες σφαιροειδές που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές CRC

ΗΤ29, HCT116, LS174T, κυτταρικές σειρές SW480, SW620 και CRC ελήφθησαν είτε από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, ΗΠΑ) ή τη Συλλογή γερμανική μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ, Braunschweig, Germany) και διατηρείται σε συνιστώμενες συνθήκες καλλιέργειας. Για την καλλιέργεια του SC, κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε DMEM-F12 άνευ ορού συμπληρωμένο με Β-27 (1 χ? Invitrogen), ινσουλίνη (4 U /L? Sigma), ηπαρίνη (4 μg /ml? Sigma), EGF ( 20 ng /mL? Biomol), bFGF (20 ng /mL? Miltenyi Biotec), και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (1χ? Lonza). ταυτότητα γραμμή κυττάρων επιβεβαιώθηκε από μικρής διαδοχική επανάληψη του γονότυπου σε DSMZ.

3D σφαιροειδές δοκιμασία εισβολής

5000 κύτταρα SC απλώθηκαν σε στρογγυλό πυθμένα των 96 φρεατίων ULA σε 100 μλ DMEM- F12 μέσο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Μετά από 3 ημέρες σχηματισμού σφαίρας, 10% FCS και /ml κολλαγόνου 1,25 mg (PureCol, CellSystems) προστέθηκαν. Μετά από 1 ώρα από τη στερεοποίηση, η αναστολή σφαιροειδές /κολλαγόνου επικαλύφθηκε με 100 μL /φρεάτιο DMEM-F12 με 10% FCS. Εισβολή παρακολουθήθηκε με τη μέτρηση της μέγιστης διαμέτρου σφαιροειδούς απόφυση μετά από 7 ημέρες.

Η κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό

Τα προσκολλημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και SC σε ULA πλάκες 6-φρεατίων στα αντίστοιχα τους μέσον. Μετά από 5 ημέρες, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν σε μονού κυτταρικού εναιωρήματος, χρωματίστηκαν με Trypan blue και μετρήθηκαν με μια συσκευή μέτρησης κυττάρων (CEDEX, Roche).

In vitro

περιορίζοντας δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρας αραίωση

SC διαχωρίστηκαν σε TrypLE Express (Gibco) με σιφωνισμό πάνω και κάτω για 1 λεπτό, επωάστηκαν στους 37 ° C για 3 λεπτά και διέρχεται μέσω ενός κυττάρου σουρωτήρι 40 μm (BD Biosciences) για να ληφθεί εναιωρήματα μονών κυττάρων.

Ενιαία

δοκιμασία κυττάρων: Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 κυττάρου ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων σε τελικό όγκο 100 μΙ. Ενιαία αποδοτικότητα κύτταρο σπορά ήταν περίπου 30% και μόνο φρεάτια που περιείχαν αρχικά μεμονωμένα κύτταρα αξιολογήθηκαν για μεταγενέστερες αναλύσεις. Τα σφαιροειδή μετρήθηκαν μετά από 10-14 ημέρες, ανάλογα με το ρυθμό ανάπτυξης των διαφόρων πρωτογενών SC. 50-60 μονά κύτταρα ανά συνθήκη αναλύθηκαν για τον σχηματισμό σφαίρας και των σφαιρών μόνο μεγαλύτερο από 50 μm σε μέγεθος συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις. Το λογισμικό ακραία περιοριστική ανάλυση αραίωσης ΕΛΔΑ (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) [38] χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η εκτιμώμενη συχνότητα αρχέγονων κυττάρων για δοκιμασίες απλού κυττάρου.

δοκιμασία 1.000 κύτταρο

:. 1000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε μία πλάκα 6 φρεατίων ULA και σφαιροειδή μετρήθηκαν μετά από 7 ημέρες

ανοσοφθορισμού

ανοσοφθορισμού διεξήχθη επί κυτοστροβιλίσματα ( EZ Cytofunnels) (Thermo Scientific) για SC και σε καλυπτρίδες για καλλιέργειες προσκολλημένων κυττάρων. Τα δείγματα μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη μεθανόλη για 10 λεπτά στους -20 ° C, αποκλείστηκαν με ένα διάλυμα 3% BSA /PBS που ακολουθείται από επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με το πρωτογενές αντίσωμα. Δευτερογενής αντίσωμα εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου? δείγματα τοποθετείται με DAPI περιέχουν Fluoromount G (Southern Biotech) και αναλύθηκαν σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss LSM 510 Meta). Να πιστοποιήσει ότι η χρώση ήταν θετική σε όλη την σφαιροειδές, πραγματοποιήθηκαν z-στοίβες. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο S1A Πίνακα.

φθορισμού ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογή και κυτταρομετρία ροής

Για κυτταρομετρία ροής, τα δείγματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Shmelkov κ.ά., 2008), και εκτελείται σε ένα FACS canto II. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα S1B.

σε πραγματικό χρόνο qPCR

AllPrep κιτ εκχύλισης (Qiagen, Hilden, Germany) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση RNA. cDNA ελήφθη με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης μεταγραφής kit (Applied Biosystems). Absolute Blue qPCR SYBR Green χαμηλό ROX Mix (Thermo Scientific), 2,5 pmol του κάθε εκκινητή και 5 ng του cDNA ανά αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν και η αντίδραση διεξήχθη σε 7500 FAST πραγματικού χρόνου σύστημα ανίχνευσης PCR (Applied Biosystems) ανακυκλωτή με τις ακόλουθες ρυθμίσεις : 40x (95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 sec). Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου που μας ενδιαφέρει κανονικοποιήθηκαν έναντι πολλαπλών γονιδίων αναφοράς [39] χρησιμοποιώντας το qbase + λογισμικού [40], σύμφωνα με τις οδηγίες MIQE. Τα χρησιμοποιούμενα γονίδια αναφοράς ήταν: EFF1A1, Β-ακτίνη, 28S, YWHAZ. Τα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για RT-qPCR φαίνονται στον Πίνακα S1c.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα που προέρχονται από SC ή διαφοροποιημένων καλλιέργειες σπάρθηκαν σε διαφορετικές πυκνότητες 250, 100, 50, 20 κύτταρα /καλά στην διαφοροποίηση μέσο που περιέχει ορό. Μετά από 10 ημέρες, οι αποικίες χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

δοκιμασίες χημειοευαισθησία

Για να εκτιμηθεί χημειοαντίσταση εφαρμόσαμε διάφορες δοκιμασίες. Η πρώτη δοκιμασία βασίστηκε σε ένα 3D σύστημα σφαιροειδές, όπου κύτταρα που προέρχονται από SC ή διαφοροποιημένων ομολόγους σπάρθηκαν σε στρογγυλού πυθμένος πλάκα 96 φρεατίων ULA σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο εντός DMEM-F12 άνευ ορού συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Μετά από 3 ημέρες σχηματισμού σφαιροειδή, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) (Sigma) προστέθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις. μέγεθος Σφαίρα μετρήθηκε κάθε 24 ώρες για 5 ημέρες και στην σφαίρα συρρίκνωση αξιολογήθηκε με προσδιορισμό της σχετικής μέγεθος σφαίρας ελέγχου και αντιμετωπίζονται συνθήκες. Η δεύτερη δοκιμασία βασίστηκε σε ένα 2D σύστημα μονοστιβάδα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο πολλαπλασιασμού των κυττάρων WST-1 (Roche, Germany). Για το σκοπό αυτό, 30.000 κύτταρα τόσο του SC και τα διαφοροποιημένα ομολόγους απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 200 μΐ μέσου DMEM-F12, συμπληρωμένο με 10% FCS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη μέσο με ή χωρίς 50 μΜ 5-FU. WST-1 προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 1:10 μετά από 5 ημέρες και επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C και η σχετική επιβίωση προσδιορίστηκε. Επιπλέον πραγματοποιήσαμε μόνο κύτταρο και σχηματισμού αποικιών δοκιμασίες παρουσία 5μΜ 5-FU για την αξιολόγηση των χημειοαντίσταση.

In vivo

προσδιορισμούς σχηματισμού όγκου

Μη παχύσαρκοι διαβητικοί /σοβαρή-συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) ελήφθησαν από Harlan Laboratories Ολλανδία και τα πειράματα που εκτελούνται σύμφωνα με όλους τους ισχύοντες νόμους και κανονισμούς μετά την έγκριση από τη φροντίδα των ζώων του ιδρύματος και την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου του Λουξεμβούργου (Αριθμός άδειας: 14-MDM -02). Ογκογενή χωρητικότητα SC σε NOD /SCID ποντικών αξιολογήθηκε με παρασκευή σειριακών αραιώσεων των κυττάρων (10. 000, 1000, 100 και 10 κύτταρα? Δόση 5-6 ενέσεις /κύτταρο). Ενιαία κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μL 1: 1 μικτά μέσης και matrigel άνευ ορού (BD Biosciences) και εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό του 6-εβδομάδων ποντικούς. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε 1-2 φορές την εβδομάδα και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο L * W

2/2. Τυχόν ποντίκια που εμφανίζουν έντονα σημάδια της απώλειας βάρους ή δυσφορία ή το μέγεθος του όγκου που φτάνουν τους 1000 mm

3 απομακρύνθηκαν από τη μελέτη και την ευθανασία για να αποφευχθεί η άσκοπη πόνο και δυσφορία, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας. Για σειριακή μεταμοσχεύσεις, οι όγκοι αφαιρέθηκαν, σε διάσταση στον πολιτισμό και την εκ νέου ένεση στο δεύτερο παραλήπτη ποντίκια. Τμήματα των παραγόμενων ξενομοσχευμάτων χρωματίστηκαν με ηωσίνη και αιματοξυλίνη και αναλύονται από έναν παθολόγο. Για να συγκριθούν άμεσα SC με διαφοροποιημένα ομόλογό τους, επιλέξαμε τη χαμηλότερη δόση που δοκιμάστηκε (10 κύτταρα /ένεση για T20 και 100 κύτταρα /ένεση για ΗΤ29? Η = 5) και κύτταρα που προέρχονται από διαφοροποιημένα ή σφαιροειδές καλλιέργειες εγχύθηκαν στο δεξί και αριστερό πλευρό αντίστοιχα .

μικροσυστοιχίες και μετάλλαξης προφίλ

Οι μικροσυστοιχίες έγιναν στο Ινστιτούτο του Λουξεμβούργου Υγείας (LIH) μετά ποιότητας του RNA και έλεγχος καθαρότητας χρησιμοποιώντας ένα 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). γονίδιο τσιπ Affymetrix συστοιχίες v2.0 Human Gene ST ετοιμάστηκαν σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. δεδομένων των μικροσυστοιχιών ήταν έτοιμη τροφή χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Στιβαρή multiarray Ανάλυση (RMA) με GC-διόρθωσης με χρήση εμπορικού λογισμικού Partek Γονιδιωματική Σουίτα (έκδοση 6.6, Copyright 2015, Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Τρεις επαναλήψεις έτρεξαν για όλες τις συνθήκες για μικροσυστοιχίες εκτός T18 για το οποίο τρέξαμε 4 τεχνικές επαναλήψεις. Έπρεπε να αποσύρει ένα δείγμα της κυτταρικής γραμμής HCT116, λόγω της χαμηλής ποιότητας του μετά την υβριδοποίηση. Τα δεδομένα αναλύθηκαν και τα αποτελέσματα οπτικοποιούνται στην Ε /Bioconductor (έκδοση 3.1.2). δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα στη βάση δεδομένων ArrayExpress υπό τον αριθμό πρόσβασης E-mtab-3575. Top μεταλλάξεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον πίνακα TruSeq αμπλικονίου-Καρκίνου (TSACP) με την πλατφόρμα MiSeq σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές Illumina με τα ακόλουθα κριτήρια: βάθος & gt? 1000 και συχνότητα παραλλαγή & gt? 0.05. Για ηθικούς λόγους, δεν ήταν σε θέση να συμπεριλάβει το μεταλλάξεων προφίλ για T6 ασθενή.

γονίδιο Διαφορικές έκφρασης και επιβίωσης ανάλυση

μικροσυστοιχίες (βάση δεδομένων ArrayExpress, αριθμός πρόσβασης E-mtab-3575) πραγματοποιήθηκαν σε σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα (βλέπε συμπληρωματικό υλικό και το τμήμα μεθόδων). Διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ SC και τις αντίστοιχες διαφοροποιημένες ομολόγους προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας γραμμική μοντελοποίηση με εμπειρική Μπεϋζιανή προσέγγιση πραγματοποιήθηκε στο

limma

πακέτο (https://www.bioconductor.org/packages/απελευθέρωση /Bioc /html /limma. html). Μια κοινή γονιδιακή υπογραφή σφαίρα μεταξύ της πρωτοβάθμιας και της κυτταρικής σειράς που προέρχεται SC προσδιορίσθηκε ως σημείο τομής των up-γονιδίων που ρυθμίζονται με το FDR & lt? 0.05 και log-φορές αλλαγή log2FC & gt? 0,6. Δύο ανεξάρτητες διαθέσιμων στο κοινό σύνολα δεδομένων από μια συλλογή διαθέσιμη στη βάση δεδομένων PROGgeneV2 [41] που περιέχει δεδομένα σχετικά με τη συνολική επιβίωση των ασθενών CRC χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν καμπύλες επιβίωσης: GSE17536 [42] που αποτελείται από 177 δείγματα ασθενών και GSE29621 [43] που αποτελείται από 64 ασθενείς δείγματα. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση με κακή επιβίωση των ασθενών σε αυτά τα 2 σύνολα δεδομένων ανάμεσα σε μια συλλογή διαθέσιμη στην προαναφερθείσα εργαλείο. Το σύνολο δεδομένων GSE39582 που αποτελείται από 566 δείγματα ασθενών χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί η επίδραση του γονιδίου που προσδιορίζονται σφαίρα υπογραφή για την ελεύθερη νόσου επιβίωση.

Η στατιστική ανάλυση

χρησιμοποιήθηκε [44] GraphPad Prism 5 λογισμικού για στατιστική ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε αταίριαστο Student t test για να συγκρίνει 2 προϋποθέσεις και 2-way ANOVA δοκιμασία με Bonferroni μετα-τεστ για να συγκρίνουν τα αποτελέσματα της θεραπείας την πάροδο του χρόνου. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Αποτελέσματα

Δημιουργημένο SC προέρχονται από πρωτογενή ιστό του όγκου διατηρούν τα χαρακτηριστικά της αρχικής όγκων

Θα αξιολογηθεί πρώτα η δυνατότητα για τον εμπλουτισμό για TICs σε δείγματα CRC χρησιμοποιώντας αρκετές από τις προηγουμένως αναφερθείσες δυνητικές δείκτες επιφάνειας. Η έκφραση του υποτιθέμενου δεικτών βλαστοκυττάρων CD44, CD24, EpCAM, CD166 και CD133 αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Βρήκαμε ότι οι βιοψίες ασθενών είναι πολύ ετερογενείς όσον αφορά δεικτών φαινοτυπική (S1 σχήμα), αμφισβητώντας την αξιοπιστία τους για τον προσδιορισμό των τικ. Εμείς περαιτέρω αποφασίσαμε να λύσουμε τα κύτταρα απ ‘ευθείας από τον ασθενή ή κυτταρική γραμμή που προέρχεται από SC σύμφωνα με έκφραση CD133 τους και εκτελούνται λειτουργικές δοκιμασίες απλού κυττάρου. Η συχνότητα που σχηματίζουν σφαίρα κυττάρων (ΜΔΕ) ήταν παρόμοια μεταξύ των CD133 χαμηλής, μέσης και υψηλής πληθυσμού (S1 Σχήμα), γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση CD133 δεν συσχετίζεται με αυξημένη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας. Κατά μήκος της ίδιας γραμμής, αρκετές

in vivo

μελέτες δείχνουν ότι τα κύτταρα CD133 + και CD133- σχηματίζουν όγκους με παρόμοια απόδοση [34,45,46]. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι υποθετική δείκτες TIC δεν είναι αξιόπιστες για την ταυτοποίηση των τικ στο σύστημά μας.

SC μπορεί να αντανακλούν ετερογένεια των όγκων όπως υπάρχει σε ασθενείς και έχουν περιγραφεί για να εμπλουτιστεί σε τικ. Συλλέξαμε φρέσκο ​​ιστό καρκίνου του κόλου από 35 ασθενείς οι οποίοι δεν είχαν λάβει χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. Μετά ενζυμική πέψη, εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων τοποθετήθηκε σε SCM με σκοπό την προώθηση της ανάπτυξης σφαιροειδής. δείγματα όγκου 5 από 35 ασθενείς (15% απόδοση) οδήγησε σε σταθερή πρωτογενή SC που μπορέσαμε να διατηρήσει σε καλλιέργεια για παρατεταμένες περάσματα (πάνω από 20 διελεύσεις) (Εικόνα 1

A

και S2 Πίνακα). Τα υπόλοιπα ιστοί καρκίνου του παχέος εντέρου δεν οδήγησε σε σχηματισμό σφαίρα ή απώλεσαν την ιδιότητά σχηματισμού σφαίρας τους μετά από μερικά περάσματα. Είναι αξιοσημείωτο ότι το ποσοστό επιτυχίας που παρατηρείται είναι συγκρίσιμη με άλλες προσπάθειες για τη δημιουργία SC από ορθοκολικό καρκινικό ιστό [47,48]. Οι βιοψίες που οδήγησε σε σταθερή SC ήταν διαφόρων ιστολογικών σταδίων του CRC (S2 Πίνακας). Τρία βασικά T6 SC, T18 και T20, που αντιπροσωπεύουν το στάδιο IIIC, το στάδιο IIA και το στάδιο IVA CRC αντίστοιχα, επιλέχθηκαν για το χαρακτηρισμό (S2 Πίνακας). Είναι ενδιαφέρον, SC προέρχεται από T6 και οι ασθενείς T20 έδειξε αυξημένο επεμβατική ικανότητα σε σχέση με τον πολιτισμό T18 σφαιροειδές, η οποία προέρχεται από ένα προγενέστερο στάδιο, δηλαδή το στάδιο ΙΙ (Σχήμα 1

Β

και 1

C

). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η SC προέρχεται από πρωτοπαθείς όγκους μπορεί να διατηρήσει τις επεμβατικές ιδιότητες των καρκινικών καταγωγής τους. Ωστόσο, η παρατήρηση αυτή θα πρέπει να εξεταστεί περαιτέρω σε πολύ μεγαλύτερες μελέτες κοόρτης. Αξιοσημείωτα, αρκετές CRC-σχετικές μεταλλάξεις ανιχνεύσιμο στον όγκο προέλευσης ήταν επίσης παρόντα στην πρωτογενή SC (S2 Εικ). Εμείς επιπλέον ιδρύθηκε προσκολλημένη διαφοροποιημένη ομολόγους του πρωτογενούς SC (Σχήμα 1

Μια

και ενότητα Υλικά και Μέθοδοι). Η σύγκριση της SC με τις αντίστοιχες διαφοροποιημένες τους ομολόγους τους από τον ίδιο ασθενή θα μπορούσε να επιτρέψει τη μελέτη SC-συγκεκριμένες ιδιότητες σε σχέση με τικ. Στην παρουσία του ορού, SC αλλάζουν φαινότυπο τους και να αναπτυχθούν ως ένα συγκολλητικό στρώμα κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, προσκολλημένη διαφοροποιημένη ομολόγους έδειξε αυξημένο πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με το SC (S3 Εικ). Εκτός από τη χρήση πρωτογενούς ιστού όγκου, δοκιμάσαμε επίσης την ικανότητα των κυτταρικών γραμμών CRC για το σχηματισμό SC. κυτταρικές γραμμές ΗΤ29, HCT116, LS174T, SW480 και SW620 οδήγησε σε σφαίρες κατά τη διάρκεια αρκετών διόδους ενώ διατηρείται σε SCM (Εικ 1Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπής στην SC προέρχονται από πρωτογενή ιστό, ΗΤ29 και HCT116- προέρχονται SC εμφανίζεται ένα χαμηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σχέση με τη γονική προσκολλημένα ομόλογό τους (S3 Εικ). Αυτή η παρατήρηση, η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες [35,36], αποκαλύπτει ότι κατά τη διαφοροποίηση, τικ αποκτήσουν αυξημένη πολλαπλασιαστικές ιδιότητες. Στα ακόλουθα πειράματα, που επικεντρώθηκε στην εκτενή χαρακτηρισμό των 3 SC ιδρύθηκε από πρωτογενές υλικό των ασθενών και 2 SC προέρχεται από κυτταρικές σειρές CRC, δηλαδή ΗΤ29 και HCT116.

(

α

) Μορφολογικά χαρακτηριστικά 2 κυτταρικές σειρές CRC (ΗΤ29, HCT116) και 3 πρωτοπαθείς όγκους του ασθενούς (Τ6, T18, T20) που καλλιεργούνται ως SC (S, αριστερό πάνελ) και διαφοροποιημένες τους ομολόγους τους (

D

, δεξί πάνελ). (

β

) 3D σφαιροειδή δοκιμασία εισβολή SC προέρχονται από πρωτογενή όγκο T6 ιστού, T18 και T20. Εκπρόσωπος φωτογραφίες των ενσωματωμένων σφαιροειδή μετά από 7 ημέρες της εισβολής. (

γ

) Ποσοτικοποίηση της μέγιστης διαμέτρου σφαιροειδούς έκφυση (μm) μετά από 7 ημέρες από την εισβολή. Αντιπροσωπευτική εικόνα των 3 ανεξάρτητα πειράματα, γραμμή κλίμακας = 100 μm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (η = 8)? * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

πολιτισμών σφαιροειδές δείχνουν έκφραση βλαστική ικανότητα των πρωτεϊνών

Για να διερευνήσει λεπτομερέστερα τις φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ των SC και των αντίστοιχων διαφοροποιημένη ομολόγους , αναλύσαμε την έκφραση των βασικών βλαστική ικανότητα πρωτεϊνών όπως SOX2, Oct4, Nanog και LGR5 καθώς ΟΚ20, ένα κλειδί επιθηλιακών δείκτης διαφοροποίησης. Η μεταγραφή παράγοντες Oct4, SOX2 και Nanog είναι γνωστή ως πλοίαρχος ρυθμιστές της pluripotency και είναι υπεύθυνοι για τη διατήρηση ενός αδιαφοροποίητη κατάσταση [49], καθώς και ευνοώντας την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των τικ [50]. SC εμφανίζονται υψηλά επίπεδα βλαστική ικανότητα των πρωτεϊνών ενώ ΟΚ20 ήταν μόλις και μετά βίας εκφράζεται (Σχήμα 2

Α

). Είναι σημαντικό, τα προσκολλημένα διαφοροποιούνται ομολόγους εξέφρασε ΟΚ20 και έχασε την έκφραση των βασικών βλαστική ικανότητα των πρωτεϊνών. Ομοίως με τα επίπεδα της πρωτεΐνης, η έκφραση των γονιδίων κλειδί βλαστική ικανότητα αυξήθηκε σε σύγκριση με το SC διαφοροποιημένες καλλιέργειες (Εικόνα 2

B

). Είναι ενδιαφέρον ότι,

LGR5

εκφράζεται έντονα σε πρωτογενή SC, σε αντίθεση με SC που λαμβάνονται από κυτταρικές γραμμές CRC (Σχ

2Α και 2Β

). Εκτιμήσαμε επίσης την έκφραση της β-κατενίνης, ένα λειτουργικό δείκτη της CRC βλαστική ικανότητα, και βρήκε μια υψηλότερη έκφραση σε SC (Σχήμα 2

Β

). Συνολικά, αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η SC οθόνη υψηλότερα επίπεδα βλαστική ικανότητα και χαμηλότερα επίπεδα των επιθηλιακών δεικτών διαφοροποίησης.

(

α

) χρώση ανοσοφθορισμού της SC αποκαλύπτει μια αυξημένη έκφραση των βασικών βλαστική ικανότητα των πρωτεϊνών SOX2, Oct4 και LGR5, και μια μειωμένη έκφραση του δείκτη διαφοροποίησης CRC ΟΚ20 σε σύγκριση με προσκολλημένα διαφοροποιημένων ομολόγους. NTERA-2 κύτταρα ανθρώπινου εμβρύου καρκινώματος χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για χρώση και έδειξε παρόμοια ένταση σήματος για όλα τα αξιολόγηση των δεικτών πλειοδυναμίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεγέθυνση 40x. (

β

) Η γονιδιακή έκφραση των βασικών βλαστική ικανότητα των γονιδίων του SC και διαφοροποιημένων ομολόγων. Αντιπροσωπευτική εικόνα των 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001, ns = μη σημαντικό

Η

πολιτισμών σφαιροειδές και προσκολλημένη διαφοροποιημένη ομολόγους εμφανίζουν παρόμοια αυτο- την ανανέωση και τον όγκο έναρξη ικανότητα

Δεν ήταν ενδιαφέρονται για τον προσδιορισμό λειτουργικές διαφορές σε σχέση με TIC ιδιότητες μεταξύ SC και προσκολλημένη διαφοροποιημένη ομολόγων. Στην αρχή, προσπαθήσαμε να εκτελέσει δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρας με επίστρωση διαφορετικές πυκνότητες κυττάρων. Πολλές μελέτες για TICs δείχνουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης χρησιμοποιώντας δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρας από τη σπορά υψηλούς αριθμούς κυττάρων ανά φρεάτιο. Ωστόσο, από την εμπειρία μας, και όπως έχει ήδη αναφερθεί από άλλους [33], επιμετάλλωση υψηλές πυκνότητες κυττάρων οδηγεί σε σφαίρα σχηματισμό με τον συνυπολογισμό και σύντηξη που ακολουθείται από μετέπειτα πολλαπλασιασμό και όχι μέσω της ικανότητας αυτο-ανανέωση των κυττάρων, έτσι παραποίηση της σφαίρας που σχηματίζει αποτελέσματα ικανότητα ( S4A σχήμα). Έτσι, για να εξασφαλισθεί πραγματική κλωνικότητα και όχι σύντηξης ή συσσωμάτωση των κυττάρων πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού σφαίρας στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Το 3 σταθερά πρωτογενή SC και το 2 SC προέρχεται από κυτταρικές σειρές CRC Όλες οι εμφανιζόμενες ικανότητα αυτο-ανανέωσης που διατηρήθηκε επί πολλά περάσματα (Σχήμα 3

Α

). Για T6 ασθενή, υπήρχε μία σφαίρα που σχηματίζει κυττάρων (SFC) σε 9.14 κύτταρα για τη διέλευση 1, 1 SFC στις 7.51 τα κύτταρα για τη διέλευση 2, και 1 SFC στις 11.66 κύτταρα για τη διέλευση 3 (S3 Πίνακας). Εντυπωσιακά, T20, που προέρχεται από έναν ασθενή ο οποίος είχε ήδη μετάσταση κατά τον χρόνο της εκτομής, έδειξαν αυξημένη συχνότητα σε σύγκριση με SFC Τ6 και Τ18 (S3 πίνακα). Είναι ενδιαφέρον ότι η συχνότητα SFC ανεβαίνει από νωρίς δίοδοι (πέρασμα 5) για να αργά περάσματα (δίοδος 15-25), υποδηλώνοντας έτσι ότι οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε συνθήκες βλαστοκυττάρων εμπλουτίζοντας εμφανίζουν αυξημένη TIC συμπεριφορά συναρτήσει του χρόνου (Σχήμα 3

B

). Ακόμα και μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια στο ΕΑΜ, SC που μεταφέρονται σε διαφοροποίηση συνθήκες καλλιέργειας εξακολουθούν να έχουν την ικανότητα να προσκολλώνται και μορφολογικά μοιάζουν με το διαφοροποιημένο ομόλογό ή την γονική κυτταρική σειρά (Σχήμα 1

Μια

και S5D σχήμα).

(

α

) τα ποσοστά σχηματισμού Σφαίρα προσδιορίστηκαν πάνω από τη σπορά και μόνο τα κύτταρα της πρόωρης πέρασμα SC αυξηθεί από πρωτογενή ιστό του όγκου και κυτταρικές σειρές CRC αρκετές γενεές (Γεν.). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. (

β

) Αυτο-ανανέωση ικανότητας της πρώιμης (πέρασμα 5) και αργά (πέρασμα 15-25 ανάλογα με τον όγκο) SC από πρωτογενή ιστό του όγκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος με διάστημα εμπιστοσύνης 95%.

Η

Στη συνέχεια, μελετήσαμε την ογκογόνο δυναμικό της SC. Πρωτογενής SC παράγεται από ιστό όγκου των ασθενών Τ6, Τ18 και Τ20 ήταν σε θέση να επάγουν το σχηματισμό όγκων σε ποντίκια NOD /SCID με αριθμούς κυττάρων που κυμαίνονται από 10.000 κύτταρα σε 10 κύτταρα ανά ένεση (Εικόνα 4

A

). TIC συχνότητα κυμαίνεται από 1 στους 6 προς 1 σε 22 σφαιροειδές κύτταρα ανάλογα με το αντίστοιχο δείγμα του ασθενούς (S4 Πίνακας). Παρομοίως, SC που λαμβάνονται από κυτταρικές γραμμές CRC κίνησε επίσης την ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια με τους αριθμούς των κυττάρων που κυμαίνονται από 10.000 κύτταρα σε 100 κύτταρα (S6a Σχ και S4 Πίνακα), αν και HCT-116 SC είχαν μία χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης όγκου σε σύγκριση με το πρωτογενές SC (S4 Πίνακα) . Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, το βάρος του όγκου συσχετίζεται με ωραία εγχέεται αριθμούς κυττάρων (Σχ

4Β

και S6B Εικ). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι πρωτογενείς SC ιδρύθηκε από δείγμα όγκου του Τ20 ασθενής ήταν σε θέση να επάγουν το σχηματισμό όγκων σε ποντίκια πολύ πιο γρήγορα με υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης όγκου σε σύγκριση με Τ6 και Τ18 SC (Εικόνα 4

A

και S4 Πίνακα). Ο φαινότυπος των Τ20 που προέρχεται SC, η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλή συχνότητα SFC, συχνότητα εμφάνισης όγκου και υπογραμμίζει τον πολλαπλασιασμό του όγκου και ανακεφαλαιώνει την επιθετική φύση του πρωτογενούς όγκου του Τ20 ασθενούς. Έξι έως δεκαπέντε εβδομάδες μετά την πρωτογενή μεταμόσχευση, οι όγκοι αφαιρέθηκαν, διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα και σειριακά μεταμοσχεύθηκαν σε δευτερογενείς ποντικούς δέκτες. Ενέσεις 10.000 και 1000 κύτταρα επέτρεψε τον σχηματισμό ενός όγκου σε δευτερογενείς ποντικούς δέκτες. 0.05.