Αφηρημένο

Πολλές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους, καθώς και μετασχηματισμένες κυτταρικές γραμμές είναι πολύ πιο ευαίσθητα σε V -ΑΤΡασης από το κανονικό τους ομολόγους. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις διαφορές στην ευαισθησία δεν είναι γνωστές. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης παγκόσμια, δείχνουμε ότι τα περισσότερο ευαίσθητα αποκρίσεις σε κύτταρα HeLa σε χαμηλές δόσεις αναστολέων V-ΑΤΡάση περιλαμβάνουν γονίδια που ανταποκρίνεται στη μείωση ενδοκυτταρικού σιδήρου ή μείωση της χοληστερόλης και ότι η ευαισθησία σε πρόσληψη σιδήρου είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας V-ΑΤΡάση σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Μια από τις πιο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, μελανώματος που προέρχονται SK-Mel-5, υπερ-εκφράζει την εκροή σιδήρου μεταφορέας φερροπορτίνη και έχει μειωμένη έκφραση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην πρόσληψη του σιδήρου, γεγονός που υποδηλώνει ότι καταστέλλει ενεργά κυτταροπλασματική σιδήρου. SK-Mel-5 κύτταρα έχουν αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και ενδέχεται να επιδιώκει να περιορίσει την πρόσθετη παραγωγή των ROS από σίδηρο

Παράθεση:. Straud S, Zubovych Ι, De Brabander JK, Roth MG (2010) Αναστολή των Iron πρόσληψη Υπεύθυνος για την διαφορετική ευαισθησία σε αναστολείς V-ΑΤΡ σε διάφορες γραμμές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 5 (7): e11629. doi: 10.1371 /journal.pone.0011629

Επιμέλεια: Αντώνης Robert White, του Πανεπιστημίου της Μελβούρνης, Αυστραλία

Ελήφθη: 31 Δεκεμβρίου 2009? Αποδεκτές: 19 Ιούν 2010? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιουλίου, 2010

Copyright: © 2010 Straud et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις CA095471 και CA09349 από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI), 5P30 AR41940 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) και να χορηγήσει I-1422 από το Ίδρυμα Robert A. Welch. Η έρευνα διεξήχθη σε μια εγκατάσταση κατασκευάστηκε με την υποστήριξη της Έρευνας εγκαταστάσεις Βελτίωση Πρόγραμμα Επιχορηγήσεων C06-RR15437 από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων (NCRR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι αναστολείς της vacuolar τύπου (η +) – ΑΤΡάσης έχουν (V-ΑΤΡάση) έχουν ερευνηθεί ως δυνητικοί θεραπευτικοί παράγοντες για τον καρκίνο [1], [2], όπως δείχνουν εντυπωσιακή απόκλιση κυτταροτοξικότητα για τα 60 κυτταρικές γραμμές της NCI ΣΥΓΚΡΙΣΗ πίνακα. Επιπροσθέτως, κυτταρικές γραμμές που μετασχηματίζονται με ογκογονίδια είναι πιο ευαίσθητα σε αναστολείς V-ΑΤΡάση από ότι είναι οι γονικές, μη μετασχηματισμένο κυτταρικές σειρές [3], [4]. Πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση του V-ΑΤΡάσης υπομονάδων σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς [1] και V-ΑΤΡασών πιστεύεται ότι παίζουν ένα ρόλο στη μετάσταση [5], [6] και χημειοαντίσταση [2], [7]. Ωστόσο, οι θεμελιώδεις μηχανισμοί που καθορίζουν τα οποία τα καρκινικά κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε αναστολείς V-ΑΤΡ είναι προς το παρόν άγνωστη. Αυτό είναι σημαντικό γνώσης, όπως την αναστολή της ίδιας V-ΑΤΡάση μπορεί να αναστείλει την συναπτική διαβίβαση [8]. Έτσι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική διεργασίες που είναι πιο διαφορικά ευαίσθητα σε αναστολή της ν-ΑΤΡάσης μπορεί να είναι καλύτερη θεραπευτικούς στόχους από το ίδιο το V-ΑΤΡάση.

Ο V-ΑΤΡάση είναι ένα μεγάλο, σύνθετο πρωτεΐνη που μπορεί να μεταφέρει πρωτόνια κατά μήκος των μεμβρανών κατά μια βαθμίδα ρΗ και έτσι παράγει το όξινο περιβάλλον που βρέθηκαν σε ενδοκυτταρικό οργανίδια, η συσκευή Golgi και το δίκτυο trans-Golgi [9]. Αποτελείται από ένα μεγάλο, κυτοσολική εξαμερή ΑΤΡάσης, V

1, ότι ενώνεται με αρκετές διασυνδέσεις με ένα σύμπλοκο αναπόσπαστο μεμβράνη, V

0. Η υδρόλυση του ΑΤΡ από υπομονάδες V

1 μετατρέπεται σε μηχανική περιστροφή σε V

0 πρωτόνια που κινείται από τον κυτοσολικό προς την κοίλη πλευρά της μεμβράνης στην οποία V

0 κατοικεί. Η δραστηριότητα του V-ΑΤΡάση ελέγχεται από πολλαπλούς μηχανισμούς, έτσι ώστε όταν αποσυναρμολογείται, V

1 δεν υδρολύει ΑΤΡ και V

0 δεν περιστρέφεται και πρωτόνια μεταφορών [9]. Ένας αριθμός αναστολέων της V-ΑΤΡάση είναι γνωστό ότι έχουν διακριτές θέσεις σύνδεσης [10].

Τόσο η εκκριτική και οι κλίσεις ενδοκυτταρικά μονοπάτια pH είναι κρίσιμης σημασίας για πολλές λειτουργίες. Ο αυλός του ενδοπλασματικού δικτύου είναι ουδέτερες και ότι το συγκρότημα Golgi είναι όξινο και αυτή η διαφορά χρησιμοποιείται για τη ρύθμιση η σύνδεση του διέφυγε συνοδοί ER στην όξινη Golgi από τον υποδοχέα KDEL, η οποία ανακυκλώνει για να τους απελευθερώσουν στο ουδέτερο ER [11] . ρΗ μειώνεται σε όλη την σύμπλεγμα Golgi, έτσι ώστε οι προορμόνες κονβερτάσες ενεργοποιούνται στο όξινο όψη εξόδου του δικτύου trans-Golgi και στα εκκριτικά κυστίδια, αλλά όχι νωρίτερα στην οδό [12]. Κατά παρόμοιο τρόπο, πολλοί λυσοσωματικής προένζυμα είναι αδρανείς στο ρΗ της εκκριτικής οδού και ενεργοποιούνται μετά την επίτευξη του λυσοσώματος, όπου το ρΗ είναι συνήθως κάτω από 5,0 [13]. Στην οδό ενδοκυτταρικής, ορισμένες συνδέτες, όπως οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL), τους υποδοχείς προσδένονται σε ουδέτερο ρΗ στην επιφάνεια του κυττάρου και απελευθερώνεται όταν οι υποδοχείς φθάνουν όξινα ενδοσώματα [14]. Με αυτόν τον τρόπο LDL αποτελεσματικά παραλαμβάνεται από το κύτταρο και παραδίδει το φορτίο του χοληστερόλης στα λυσοσώματα, ενώ ο υποδοχέας ανακυκλώνει προς την επιφάνεια του κυττάρου να δεσμεύεται περισσότερο συνδετήρα. Αποτελεσματική απορρόφηση του σιδήρου στα κύτταρα απαιτεί επίσης χαμηλό pH στα ενδοσώματα. Τρανσφερρίνη, ο φορέας για εξωκυτταρικό σιδήρου, έχει υψηλή συγγένεια για το σίδηρο και για τον υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας του σε τυπικές εξωκυτταρικό ρΗ πάνω από 7,0. Ο υποδοχέας τρανσφερίνης συνεχώς εσωτερικεύονται και ανακυκλώνει προς την μεμβράνη πλάσματος, που μεταφέρουν τρανσφερίνης σε όξινα ενδοσώματα όπου απελευθερώνει σιδήρου. Iron-free αποτρανσφερίνη έχει υψηλή συγγένεια για τον υποδοχέα σε χαμηλό ρΗ και χαμηλή συγγένεια σε ουδέτερο ρΗ. Έτσι, αποτρανσφερίνη ανακυκλώνει με τον υποδοχέα του πίσω στην πλασματική μεμβράνη όπου απελευθερώνεται και επανακτά την υψηλή συγγένεια για εξωκυτταρικό σιδήρου [15]. Χαμηλό pH χρησιμοποιείται επίσης για να προσδιορίσει την ταυτότητα του ενδοκυτταρικής οργανίδια. Ορισμένες κυτοσολικές πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη ρύθμιση της κυκλοφορίας δεσμεύονται μεμβράνη με την κυτταροπλασματική επιφάνεια των μεμβρανών ενδοσώματος μόνο όταν το εσωτερικό ρΗ του οργανίδιο είναι όξινο [16]. Η οξίνιση των λυσοσώματα είναι επίσης απαραίτητη για τη διαδικασία της αυτοφαγία [17]. Αν και κανονικά εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στην πλασματική μεμβράνη εκτός από ορισμένα κύτταρα που εκκρίνει οξύ, ν-ΑΤΡάσης υπερεκφράζεται στη μεμβράνη ορισμένων καρκινικών κυττάρων του πλάσματος και μπορεί να παίζει ένα ρόλο που ρυθμίζουν κυτοσολική pH [5], [6], [18 ]. Οποιαδήποτε ή όλες αυτές τις ουσιώδεις λειτουργίες μπορεί να είναι πιο ευάλωτες στην αναστολή της ν-ΑΤΡάσης ιδίως υπόβαθρα των καρκινικών κυττάρων.

Για να διερευνηθεί η βάση της διαφορετικής ευαισθησίας καρκινικών κυττάρων σε αναστολείς του V-ΑΤΡάση, εμείς έχουν κάνει χρήση της παρατήρησης ότι τα κύτταρα συχνά ανταποκρίνονται σε στρες με up-ρύθμιση κρίσιμα συστατικά οδών που ανιχνεύονται να επαρκούν, όπως για παράδειγμα η απόκριση της αποτυχίας της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο [19]. Η υπόθεσή μας είναι ότι μια ήπια αναστολή της ν-ΑΤΡάσης θα αποκαλύψει τις πιο ευαίσθητες βιολογικές λειτουργίες για την εν λόγω ένζυμο, το οποίο θα αναφέρεται από τα γονίδια που αυξάνουν την πρώτη μεταγραφή σε απόκριση προς την αναστολή. Δοκιμή αυτή η υπόθεση, έχουμε παρατηρήσει ότι οδούς της ρύθμισης σιδήρου είναι πιο ευαίσθητα σε μερική αναστολή της ν-ΑΤΡάση σε κύτταρα HeLa και ότι μερικές καρκινικές κυτταρικές γραμμές που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο V-ΑΤΡάση αναστολείς μπορεί να γίνει πολύ πιο ανθεκτικά με την προσθήκη εξωγενούς σιδήρου προς το μέσο καλλιέργειας. Αυτό υποδηλώνει ότι τα συστατικά του μεταβολισμού του σιδήρου ή μεταφοράς μπορεί να είναι υποψήφιοι ως θεραπευτικοί στόχοι σε ορισμένους καρκίνους, και αυτοί οι καρκίνοι μπορούν να αναγνωριστούν μέσω ευαισθησία τους σε αναστολείς V-ΑΤΡ ή με αλλαγμένη έκφραση των πρωτεϊνών μεταφοράς σιδήρου.

Αποτελέσματα

για να προσδιορίσετε ποια μεταβολικών οδών τονίστηκαν από τις χαμηλές δόσεις των αναστολέων V-ΑΤΡ, καθορίσαμε πρώτα την απόκριση δόσης σε δύο διαφορετικές αναστολείς του V-ΑΤΡ σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Θέλαμε να βρούμε μια συγκέντρωση κάθε αναστολέα που θα δείξει μια επίδραση στην ανάπτυξη, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ανταποκρίνονται στο ερέθισμα, αλλά οι οποίες δεν ήταν τόσο τοξικό ότι η απάντηση θα ήταν να προληφθούν ή να περιπλέκεται από κύτταρα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια του πειράματος. Οι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν είχαν IC50s να βαφιλομυκίνης Α που κυμαίνονταν από 10 ηΜ έως μεγαλύτερες από 10 μΜ και εμείς επιλέξαμε την μετρίως ευαίσθητος κυτταρική γραμμή HeLa (IC50 = 150 ηΜ) για τα πειράματα μας, επειδή σχετικά ρηχά δόσης-απόκρισης της γίνονται πιο ομοιόμορφες αναστολή της ανάπτυξης πειράματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα πειράματα γονιδιακής έκφρασης θα ήταν επίσης περισσότερο αναπαραγώγιμη. Επιλέξαμε επίσης να συγκρίνει δύο αναστολείς του V-ΑΤΡάση που δρουν μέσω διαφορετικών μηχανισμών [20], η βαφιλομυκίνη Α (BAF) και phenylsalicylihalamide (LX1077), για τον έλεγχο για πιθανή εκτός στόχου επιδράσεις της κάθε ένωσης. Συγκεντρώσεις του κάθε ένωσης που ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη κατά 25% περίπου μετά από 48 ώρες (Σχήμα 1) επιλέχθηκαν για τα πειράματα γονιδιακής έκφρασης. κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 ηΜ BAF για 6, 12, ή 24 ώρες, ή 200 ηΜ LX1077 για 12 και 24 ώρες, και το RNA συλλέχθηκε και επεξεργασία για ανάλυση με μικροσυστοιχίας. Ως έλεγχοι, δείγματα κυττάρων HeLa υποβάλλονται σε θεραπεία για το ίδιο χρονικό με 0,1% DMSO (τελική συγκέντρωση του διαλύτη για BAF ή LX1077 σε πειραματικά δείγματα), έτρεξαν παράλληλα με κάθε πειραματική συνθήκη. Κάθε πειραματική συνθήκη επαναλήφθηκε σε ένα ανεξάρτητο πείραμα που πραγματοποιήθηκε σε μια διαφορετική ημέρα.

κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει Bafa ή LX1077 στις συγκεντρώσεις που δείχνονται για 48 ώρες και οι αριθμοί των κυττάρων υπολογίστηκαν. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα σε ελέγχους που έλαβαν θεραπεία με 0,1% DMSO. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι δειγμάτων εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος είναι SEM.

Η

Δύο μεγάλες πορείες για την πρόσληψη των θρεπτικών συστατικών στα κύτταρα εξαρτάται από την οξύτητα στο ενδοσώματα που παρέχονται από τον V-ΑΤΡ. Η αναστολή της ν-ΑΤΡάσης θα παρεμβαίνει με την παράδοση του σιδήρου στο κύτταρο, εμποδίζοντας την απελευθέρωση του σιδήρου από την τρανσφερίνη και εμποδίζει επίσης την πρόσληψη της χοληστερόλης με αναστολή της απελευθέρωσης της LDL από τον υποδοχέα της. Γι ‘αυτό επεξεργασμένα κύτταρα HeLa επί 6 ή 12 ώρες με δεφεροξαμίνη (DFO) για χηλικού άλατος σιδήρου και ξεχωριστά με μέσο χωρίς LDL να μιμηθεί την αναστολή της πρόσληψης εξωγενούς χοληστερόλης μέσω του υποδοχέα της LDL. Οι έλεγχοι αντίστοιχα δείγματα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας. Αυτά τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για μικροσυστοιχίες ακριβώς όπως τα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς του V-ΑΤΡ. Με αυτόν τον τρόπο θα μπορούσαμε να εντοπίσει όλα τα γονίδια που ανταποκρίνεται με αυξημένη μεταγραφή όταν ήταν ελλιπή ή LDL πρόσληψη αποκλείστηκε σιδήρου. Τα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία από το Core Facility Array UT Southwestern DNA Micro χρησιμοποιώντας GCOS λογισμικό με MAS5 ομαλοποίηση και πειραματικών δειγμάτων συγκρίθηκαν με τις DMSO επεξεργασμένα δείγματα, ή, για DFO ή συνθήκες χαμηλής LDL, τα δείγματα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό τρέξιμο μέσον ταυτόχρονα για τον υπολογισμό το μέγεθος της μεταβολής.

Genes θεωρήθηκαν να δείξουν σημαντικά αυξημένη έκφραση αν και τα δύο δείγματα σε ένα χρονικό σημείο είτε με BAF ή LX1077 είχε μια τιμή μεταβολής Ρ μικρότερη από 0.002 και ο μέσος όρος των δύο δειγμάτων αυξήθηκε περισσότερο από 2-φορές. Στις περισσότερες περιπτώσεις, BAF επαγόμενη μεταγραφή περισσότερο από LX1077, αν και τα γονίδια ανταποκρίνονται σε BAF ανταποκρίθηκαν επίσης να LX1077. Τα γονίδια που αυξημένη μεταγραφή νωρίτερο παρουσιάζονται στους Πίνακες S1, S2 και στον Πίνακα 1. Πίνακας S1 παρουσιάζει 47 γονίδια που αυξημένη έκφραση όταν κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς V-ΑΤΡάση ή με μέσο χαμηλής χοληστερόλης και αντιπροσωπεύουν την απόκριση στην αναστολή της V-ΑΤΡάση ότι οφείλεται σε αποκλεισμό παράδοση των εξωγενών χοληστερόλης. Η ανταπόκριση των περισσοτέρων από αυτά τα γονίδια είναι ταχύτερη σε παρουσία των αναστολέων V-ΑΤΡάση ό, τι είναι σε μέσο που στερείται LDL, ίσως επειδή μέσο που στερείται LDL δεν εμποδίζει την παράδοση της χοληστερόλης από τα σωματίδια LDL που είτε δεσμεύονται στον υποδοχέα τους κατά τη κυτταρική επιφάνεια ή που έχουν ήδη τεθεί στην οδό ενδοκυτταρικής στο χρόνο προστέθηκε το μέσο με ανεπάρκεια LDL. Η πλειοψηφία των γονιδίων φαίνεται στον Πίνακα λειτουργία S1 σε λιπίδιο βιοσυνθετικές οδούς και 23 είναι γνωστά στόχοι SREBP1 ή 2 [21]. Με την εξαίρεση των EGLN1 και STARD4, κανένα από τα γονίδια που αυξάνουν τη μεταγραφή από νωρίς σε απόκριση σε χαμηλή LDL ανταποκρίνεται στην δεσφεριοξαμίνη χηλικοποιητή του σιδήρου. EGLN1 κωδικοποιεί prolylhydroxylase σιδήρου εξαρτώμενη που καταστέλλει δραστικότητα HIF-1α υπό νορμοξικές συνθήκες [22] και δεν είναι γνωστό ότι είναι ευαίσθητα στην δραστικότητα του βιοσυνθετική οδό της χοληστερόλης. Ωστόσο, σε ζύμη και θηλαστικά υπάρχει cross-talk μεταξύ βιοσύνθεσης χοληστερόλης και τα μονοπάτια της προσαρμογής στην υποξία [23], [24]. STARD4 κωδικοποιεί μία κυτοσολική πρωτεΐνη μεταφοράς χοληστερόλης που είναι ένας στόχος SREBP [21] και επίσης ρυθμίζεται αυξητικά από ER στρες [25] και μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω μόνο έμμεσα από τον χηλικοποιητή του σιδήρου. Είναι ενδιαφέρον, αυξημένη μεταγραφή του INSIG1, το οποίο κωδικοποιεί ένα αρνητικός ρυθμιστής των παραγόντων μεταγραφής SREBP που ελέγχουν την βιοσύνθεση της χοληστερόλης, είναι ένας από τους ταχύτερα αποκρίσεων σε αναστολείς V-ΑΤΡάση. Αυτό είναι πιθανώς ένας αρνητικός μηχανισμός ανάδρασης για τον περιορισμό της μεταγραφικής απόκρισης άπαξ λιπιδίων μεταβολικές οδούς έχουν αυξημένη παραγωγή της ενδογενούς χοληστερόλης [26].

Η

Πίνακας S2 απαριθμεί 64 γονίδια που αυξημένη μεταγραφή ταχύτερα όταν συμπλοκοποιείται σιδήρου και επίσης αντιδρούν στην αναστολή της ν-ΑΤΡάσης. Αυτά είναι γονίδια σε μονοπάτια που πιθανώς ανταποκρίνονται στην αναστολή της απελευθέρωσης του σιδήρου από την τρανσφερίνη σε ενδοσώματα όταν το V-ΑΤΡάση αναστέλλεται. Τουλάχιστον 29 από αυτά τα γονίδια είναι γνωστά στόχοι του HIF-1α και ανταποκρίνονται σε υποξία. Όπως θα περίμενε κανείς, αυτά τα γονίδια λειτουργούν σε πολλά μονοπάτια. Αλδολάση C είναι ένας στόχος HIF-1α [27] και είναι έντονα αυξητικά με V-ΑΤΡάση αναστολέων. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε ανιχνεύσει μια πρόωρη αύξηση της αλδολάσης Ο σε κύτταρα κατεργασμένα με μέσο χαμηλής LDL, αλδολάση C είναι επίσης ένας γνωστός στόχος του SREBPs [21]. Αλδολάση C προσδένεται στο V-ΑΤΡάση [28] και σε ζυμομύκητες είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση της γλυκόζης της δραστικότητας V-ΑΤΡάση [29], [30]. Από αλδολάσης C αποκρίνεται σε υποξία σε επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα και σε αναστολείς V-ΑΤΡάση σε κύτταρα HeLa, ενώ η πιο άφθονη γλυκολυτικού ενζύμου αλδολάσης Α δεν το κάνει, είναι πιθανό ότι μια κύρια λειτουργία των αλδολάσης C σε απόκριση στην έλλειψη σιδήρου ή υποξία είναι για τη ρύθμιση της V-ΑΤΡάση ως μέρος του μηχανισμού για την εξασφάλιση της ομοιόστασης του σιδήρου. HIF-1α καταστέλλεται κατά κύριο λόγο με το να υδροξυλιώνεται σε προλίνη από prolyhydroxylases σίδηρο-εξαρτώμενη, το οποίο στοχεύει για την υποβάθμιση [31]. Με ανοσοστύπωμα βρήκαμε ότι επώαση κυττάρων HeLa σε 15 ηΜ BAF για 1 ώρα σταθεροποιημένο HIF-1α (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι οδοί ρυθμίζεται από HIF-1α είναι από τα πιο ευαίσθητα στην αναστολή του V-ΑΤΡάση. Έτσι, οι αναστολείς V-ΑΤΡάση παρέχουν ένα πιο αποτελεσματικό μέσο για την εμπλοκή HIF-1α οδούς πειραματικά.

Ο Πίνακας 1 παρουσιάζει 7 γονίδια που αυξημένη μεταγραφή σε απόκριση σε αναστολείς V-ΑΤΡάση, αλλά όχι σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με χαμηλή LDL μέσο ή με το χηλικοποιητή σιδήρου. Αυτά είναι υποψήφιοι για οδούς που ανιχνεύουν την έλλειψη δραστηριότητας V-ΑΤΡ ανεξάρτητα από την επίδραση στην τρανσφερίνης ή LDL. Άλλα από CLCN6, αυτά τα γονίδια δεν είναι έντονα ρυθμίζεται προς τα πάνω και αρκετές από αυτές εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη και μπορεί να είναι ένα πρώιμο τμήμα της αναστολής της ανάπτυξης που θα προκύψει μετά τη μακρά επώαση στους αναστολείς. CLCN6 είναι ένα κανάλι χλωριούχο βρέθηκαν σε νευρώνες και τα επιθηλιακά κύτταρα [32], [33], και εντοπίζεται στο αργά ενδοσώματα [33]. Χλωριούχο κανάλια σε endosomes εργάζονται σε συνεννόηση με V-ΑΤΡ και έτσι CLCN6 ρύθμιση προς τα πάνω μπορεί να είναι μια απάντηση στην απώλεια της λειτουργίας αργά ενδοσώματος. SREBF2 (SREBP2) είναι ένας κύριος ρυθμιστής της βιοσύνθεσης της χοληστερόλης και είναι κατά κύριο λόγο ρυθμιζόμενη μετα-μεταγραφή από την κυκλοφορία μεμβράνη και πρωτεόλυση [34]. Η μικρή αύξηση της μεταγραφής είναι πιθανή εξισορροπείται από την αύξηση στην έκφραση του αναστολέα της ενεργοποίησης SREBP, INSIG1.

Πίνακας 2 παρουσιάζει τα αποτελέσματα της λήψης ενός λιγότερο περιοριστική ανάλυση των γονιδίων που αλλάζουν σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με 15 ηΜ BAF για 6 ώρες. Όλα τα γονίδια που έδειξαν στατιστικά σημαντική μεταβολή (αλλαγή P τιμή & gt? 0,00025), ανεξάρτητα από την κατεύθυνση της αλλαγής αναλύθηκαν με Ingenuity Πορείες για να καθορίσει ποια κανονικών μονοπατιών στη Βάση Δεδομένων Ingenuity εμπλουτίστηκαν σε γονίδια που άλλαξαν σε απόκριση BAF. Μονοπάτια που ανταποκρίθηκαν σημαντικά στην BAF περιείχε πολύ λίγα γονίδια που μειωμένη έκφραση, επιβεβαιώνοντας την υπόθεσή μας ότι η έγκαιρη αντίδραση θα αυξηθεί γονιδιακής έκφρασης. Μέχρι στιγμής οι πλήττονται περισσότερο σημαντικά μονοπάτια ήταν βιοσύνθεση στεροειδών, ακολουθούμενη από την γλυκόλυση, και εμπλέκονται τα γονίδια ως επί το πλείστον εντοπίζονται επίσης από πιο περιοριστική ανάλυση μας.

Η

Μετά μεγαλύτερα διαστήματα της θεραπείας με αναστολείς V-ΑΤΡ, 52 γονίδια που είχαν αυξηθεί σε απόκριση έως 12 ώρες καλλιέργειας σε μέσο χαμηλής LDL έδειξε επίσης αυξημένη έκφραση σε κύτταρα σε αγωγή για 24 ώρες με αναστολείς V-ΑΤΡάση (Πίνακας S3). Οκτώ από τα χοληστερόλης γονιδίων που αποκρίνονται που ρυθμίζεται προς τα πάνω νωρίτερα πια παρουσίασε αύξηση και 15 νέα χοληστερόλης γονιδίων που αποκρίνονται έδειξαν αυξημένη μεταγραφή, με 6 από αυτά που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε λιπιδίων βιοσυνθετικές οδούς. 104 «ανταποκρίνεται σιδήρου» γονίδια (Πίνακας S4) αυξήθηκαν σε κύτταρα σε αγωγή με αναστολείς V-ΑΤΡάση για 24 ώρες, συμπεριλαμβανομένου ενός αριθμού γονιδίων που κωδικοποιούν γλυκολυτικά ένζυμα ή καταστολείς της μιτοχονδριακής λειτουργίας, παράγοντες μεταγραφής και πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη. STXBP1, το οποίο κωδικοποιεί το Munc-18 ρυθμιστής της σύντηξης μεμβρανών, έδειξε μέτρια αύξηση σε απόκριση είτε καταστρέφουν χοληστερόλη ή σιδήρου και μια ισχυρότερη αύξηση στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς της V-ΑΤΡάση. Αυτό είναι ένα από τα πολύ λίγα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την κυκλοφορία μεμβράνη που αυξήθηκαν σε απόκριση αναστέλλοντας την V-ΑΤΡάση (HIP1R, SV2A και OPTN ήταν οι άλλοι). Εξήντα δύο γονίδια αυξημένη έκφραση τουλάχιστον δύο φορές σε απάντηση στην αναστολή της ν-ΑΤΡάσης για 24 ώρες, αλλά δεν απάντησε στην ανεπάρκεια της χοληστερόλης μέσο ή DFO (Πίνακας S5). Αυτό το σύνολο των γονιδίων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Ingenuity Pathways να προσδιορίσει τις μεταβολικές οδούς στις οποίες τα γονίδια ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (Σχήμα 2). Μέχρι στιγμής η πιο σημαντική ανταπόκριση ήταν στα γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των λιπιδίων και στεροειδών.

Τα γονίδια στον Πίνακα S4 αναλύθηκαν με Ingenuity Pathways να τους τοποθετεί σε κανονικές οδούς. Το ποσοστό των γονιδίων στην οδό εκπροσωπούνται σε αυτό το σύνολο δεδομένων, καθώς και τη σημασία της αλλαγής φαίνονται.

Η

Όπως θα περίμενε κανείς, αν και οι δύο αυξήσεις και μειώσεις στην έκφραση των γονιδίων θεωρείται, μετά από 24 ώρες σε BAF υπάρχει μια περίπλοκη απάντηση που περιλαμβάνει μια σειρά από μονοπάτια που ελέγχουν την ανάπτυξη και την αντίδραση στο στρες (Πίνακας S6). Η πιο σημαντική από αυτές είναι η NRF2 διαμεσολαβούμενη απόκριση οξειδωτικό στρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι αναστολή της V-ΑΤΡάση αυξάνει αντιδραστικά είδη οξυγόνου. Ως σημαντικά στοιχεία της μιτοχονδριακής αναπνοής οδού απαιτούν σιδήρου, και η αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης μπορεί να παράγει ROS, αλλαγές στην NRF2 μεσολάβηση μονοπάτια θα μπορούσε να είναι μια δευτερεύουσα συνέπεια της αναστολής των εισαγωγών σιδήρου από τρανσφερίνης.

αρχική πρόθεση μας στην επιδίωξη αυτών των μελετών ήταν να διερευνήσει τα αίτια της διαφορικής απόκρισης σε αναστολείς V-ΑΤΡάση δει σε καρκινικά κύτταρα. Επειδή οι μεγάλες άμεσες απαντήσεις στην αναστολή του V-ΑΤΡάση ήταν στην έλλειψη σιδήρου ή χοληστερόλη, ερευνήσαμε αν αυτά ήταν υπεύθυνα για την υπερευαισθησία κάποιων καρκινικών κυττάρων σε αναστολείς V-ΑΤΡάση (Σχήμα 3). Μετρήσαμε την δόση-απόκριση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που προέρχονται HeLa, που προέρχεται μελανώματος κυτταρικές γραμμές SK-MEL-5 και SK-Mel-28 μη-μικροκυτταρικό γραμμή καρκίνου του πνεύμονα Η1299, ο καρκίνος του μαστού MCF-7 και Morris ηπατώματος (ΜΗ) κυττάρων σε, BAF παρουσία ή απουσία 150 μΜ κιτρικού σιδήρου. BAF είχαν πολύ παρόμοιες συγκεντρώσεις IC50 για HeLa, MCF7 και Η1299. Τόσο MH και SK-Mel-5 κύτταρα ήταν 10 φορές πιο ευαίσθητη από HeLa, και SK-Mel-28 ήταν ιδιαίτερα αναίσθητη (Σχήμα 3). Για Hela, SK-MEL-5 και SK-Mel-28 δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση της προσθήκης της χοληστερόλης που παραδίδεται σε κύτταρα με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη, η οποία προσθέτει χοληστερίνη απ ‘ευθείας με τη μεμβράνη του πλάσματος [26]. Η προσθήκη σιδήρου στο μέσο γίνεται κύτταρα HeLa 20 φορές πιο ανθεκτική στην αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από 20 έως 200 nm βαφιλομυκίνης, αλλά υπό την προϋπόθεση λίγη προστασία στα κυτταροτοξικά αποτελέσματα που παρατηρούνται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (Σχήμα 3). Η χοληστερόλη ήταν προστατευτικό για τα κύτταρα HeLa, αλλά όχι για τους BAF-ευαίσθητα SK-Mel-5 κύτταρα ή BAF ανθεκτικά SK-Mel-28 (Σχήμα 4). Αυτό δείχνει ότι οι κυτταροστατικά αποτελέσματα των αναστολέων V-ΑΤΡάση σε κύτταρα HeLa είναι σε μεγάλο βαθμό οφείλεται στην αναστολή της πρόσληψης σιδήρου και χοληστερόλη, αλλά τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα οφείλονται σε μια εναλλακτική λύση, και ακόμη άγνωστη, η λειτουργία. Συμπληρώνοντας Η1299, MCF7 ή την πιο ευαίσθητη κυτταρική γραμμή μελανώματος SK-MEL-5 με σίδηρο τους προστατεύονται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις BAF παρόμοιο με κύτταρα HeLa (Εικόνα 3). Στην πραγματικότητα, MCF7 ή SK-Mel-5 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με σίδηρο και βαφιλομυκίνης είχε μια απόκριση δόσης αξιοσημείωτα παρόμοια με τα κύτταρα HeLa που έλαβαν μόνο βαφιλομυκίνης, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητοι στην αναστολή της πρόσληψης σιδήρου. Ούτε σίδηρος ούτε χοληστερόλης είχαν οποιαδήποτε προστατευτική επίδραση στο εξαιρετικά ανθεκτικό κυτταρική γραμμή SK-Mel-28 ή το αρκετά ευαίσθητο MH κυτταρική γραμμή.

Η δόση-απόκριση των έξι καρκινικές κυτταρικές γραμμές να BAF παρουσία ή απουσία 150 μΜ κιτρικός σίδηρος προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στην επεξήγηση του σχήματος 1.

η

Οι καμπύλες απόκρισης δόσης από HeLa, SK-MEL-5 και SK-Mel-28 κύτταρα για να BAF παρουσία ή απουσία εξωγενούς χοληστερόλης χορηγηθούν σε κύτταρα με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στην επεξήγηση του σχήματος 1.

η

για να διερευνηθεί ο μηχανισμός της κυτταροτοξικότητας που επάγεται από BAF σε SK-Mel-5 και κύτταρα HeLa , εμείς κατεργασμένα κύτταρα κάθε γραμμής με 0 έως 1000 ηΜ BAF για 24 ώρες και στη συνέχεια διερευνήθηκε η διάσπαση της PARP ή κασπάσης 3 ως σήματα για την επαγωγή της απόπτωσης (Εικόνα 5). Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές BAF επαγόμενη απόπτωση μετά από 24 ώρες? Ωστόσο, η συγκέντρωση που απαιτείται ήταν πάνω από 20 φορές χαμηλότερη για SK-Mel-5 από τα κύτταρα HeLa, πολύ παρόμοια με τις διαφορές στην θανατηφόρες δόσεις για τις δύο κυτταρικές σειρές. Έτσι, η κυτταροτοξικότητα που προκύπτει από την αναστολή της V-ΑΤΡάση στην υπερευαισθησία κυτταρική σειρά SK-Mel-5 είναι μέσω της επαγωγής της απόπτωσης.

HeLa και SK-Mel-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BAF για 24 ώρες και στη συνέχεια παρασκευάζονται για ανοσοκηλίδωση με αντισώματα προς διασπασμένη PARP ή διασπασμένη κασπάση 3. Οι διασπώνται πρωτεΐνες εμφανίζονται σε πολύ χαμηλότερες συγκεντρώσεις των BAF σε SK Mel 5–κυττάρων σε σύγκριση με HeLa, με τη διαφορά συγκέντρωσης μεταξύ της εμφάνισης της διασπασμένης πρωτεΐνης παρόμοιο με το διαφορές στις θανατηφόρες δόσεις για τις δύο κυτταρικές σειρές. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Τόσο SK-Mel-5 κύτταρα και κύτταρα MCF7 ήταν πιο ευαίσθητα σε BAF από κύτταρα HeLa και αυτή η διαφορά στην ευαισθησία καταργήθηκε με τη συμπλήρωση του μέσου καλλιέργειας με σιδήρου (Σχήμα 3). Έτσι ερευνήσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε σίδηρο πρόσληψη, την αποθήκευση ή εκροής σε αυτές τις κυτταρικές σειρές και τα κύτταρα HeLa (Εικόνα 6). SK-Mel-5 κύτταρα εξέφρασαν λιγότερο υποδοχέα τρανσφερίνης από οποιαδήποτε από τις άλλες δύο κυτταρικές σειρές και πολύ χαμηλά επίπεδα DMT1, μεταφορέα υπεύθυνος από την κίνηση του σιδήρου κατά μήκος της μεμβράνης ενδοσώματος στο κυτταρόπλασμα. Είναι αξιοσημείωτο ότι, SK-MEL-5 κύτταρα εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του μεταφορέα εκροής σιδήρου, φερροπορτίνη, που μεταφέρει σίδηρο σε όλη τη μεμβράνη πλάσματος και έξω από το κύτταρο. Φερροπορτίνη δεν ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε από τις άλλες δύο κυτταρικές σειρές. SK-Mel-5 κύτταρα εξέφρασαν λιγότερο φερριτίνης από τα κύτταρα HeLa, συνεπής με την κατοχή χαμηλά επίπεδα κυτταροπλασματικής σιδήρου. Στο σύνολό τους, αυτό το μοτίβο έκφρασης πρότεινε ότι SK-Mel-5 κύτταρα ενεργά τη διατήρηση σχετικά χαμηλά κυτταροπλασματικά επίπεδα σιδήρου. Σε αντίθεση, τα κύτταρα MCF7 είχαν επίπεδα του υποδοχέα τρανσφερίνης που είναι παρόμοια με τα κύτταρα HeLa, αυξημένη έκφραση DMT1 και πολύ χαμηλά επίπεδα της πρωτεΐνης αποθήκευσης σιδήρου, φερριτίνη. Αυτό είναι ένα πρότυπο έκφρασης συνεπής με ένα κύτταρο που έχει χαμηλά επίπεδα κυτταροπλασματικού σίδηρο και έχει αυξητικά μηχανισμοί μεταφοράς σιδήρου σε απάντηση. Έτσι, SK-Mel-5 κύτταρα και κύτταρα MCF7, αν και τόσο υπερευαίσθητοι σε BAF οφείλεται στην αναστολή της πρόσληψης σιδήρου, διέφεραν στους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν αυτήν την ευπάθεια.

Η έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης 1, φεριτίνη και φερροπορτίνη στην HeLa και SK-Mel-5 κύτταρα σε παρουσία ή απουσία της DFO μετρήθηκε με ανοσοστύπωμα. Σε σχέση με τα κύτταρα HeLa, SK-MEL-5 έχουν μειωμένη έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης και της φερριτίνης και μεγάλη αύξηση στην έκφραση της εκροής πρωτεΐνης σιδήρου φερροπορτίνη. TfR, υποδοχέα τρανσφερίνης. DMT1, δισθενούς μετάλλου μεταφορέα 1. FPN1, φερροπορτίνη 1. FTH, φερριτίνη Η βαριά αλυσίδα. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Οι διαφορές στην έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης και φερροπορτίνη σε SK-Mel-5 κύτταρα που δεν οφείλονταν σε μια ανικανότητα να ρυθμίσουν αυτές τις πρωτεΐνες σε απόκριση σε σίδηρο. Όταν SK-Mel-5 κύτταρα ή κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DFO να χηλικού άλατος σιδήρου, τόσο προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης (Εικόνα 7). Σε απάντηση προς DFO, έκφραση υποδοχέα τρανσφερίνης σε SK-Mel-5 κύτταρα που ήταν πολύ παρόμοια με εκείνη του HeLa, υποδεικνύοντας ότι οι μηχανισμοί για την έκφραση του υποδοχέα σε απόκριση προς σιδήρου ήταν ανέπαφη σε SK-Mel-5 κύτταρα. επεξεργασία DFO μείωσε την έκφραση της φερροπορτίνη και φερριτίνης σε SK-Mel-5 κύτταρα, όπως θα περίμενε κανείς για ένα κύτταρο προσπαθεί να διατηρήσει τα επίπεδα του κυτταρικού σιδήρου. Έτσι, οι μηχανισμοί για τη ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών από σίδηρο ήταν επίσης άθικτο σε SK-Mel-5 κύτταρα. Όταν SK-Mel-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΒΑΡ, αύξησαν επίσης την έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης και μειωμένη φερριτίνη. Ωστόσο, φερροπορτίνη έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη. Από χηλικούς σίδηρος μειώθηκε φερροπορτίνη έκφραση σε SK-Mel-5 κύτταρα, αυτή η απόκριση οφειλόταν σε κάποια άλλη επίδραση της αναστολής του V-ΑΤΡάση.

Θεραπεία της HeLa ή SK-Mel-5 κυττάρων με 100 μΜ DFO για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση του υποδοχέα τρανσφερίνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, και μια μείωση στην φερροπορτίνη και φερριτίνης σε SK-Mel-5 κύτταρα. επεξεργασία BAF είχε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα, με την εξαίρεση ότι φερροπορτίνη έκφραση σε SK-Mel-5 κυττάρων αυξήθηκε κατά BAF. κύτταρα HeLa δεν εκφράζουν φερροπορτίνη και SK-Mel-5 κύτταρα είχαν πολύ χαμηλή έκφραση του DMT1. TfR, υποδοχέα τρανσφερίνης. DMT1, δισθενούς μετάλλου μεταφορέα 1. FPN1, φερροπορτίνη 1. FTH, φερριτίνη Η βαριά αλυσίδα. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ένας πιθανός λόγος για ένα κύτταρο να συμπιέσει ενεργά κυτταροπλασματικά επίπεδα σιδήρου θα είναι για την προστασία από την παραγωγή των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) από σίδηρο. Για να διερευνηθεί εάν SK-Mel-5 κύτταρα που θα μπορούσαν να παράγουν περισσότερο ROS, εμείς επισημασμένου SK-Mel-5 και κύτταρα HeLa με βαφές που αυξάνουν φθορισμού παρουσία των ROS. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις της φωτογραφικής μηχανής και εντάσεις φθορισμού των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό J Image. SK-Mel-5 κύτταρα που παρήγαγαν σημαντικά περισσότερα ROS από κύτταρα HeLa, μετρούμενη με δύο χρωστικές (Σχήμα 8).

A. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με το ευαίσθητο ανιχνευτή H2O2 DCF, ή υπεροξειδίου ευαίσθητο ανιχνευτή DHE, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις της φωτογραφικής μηχανής. κύτταρα Β φθορισμού περιγράφονται στις J Εικόνα και ο φθορισμός μέσα σε μεμονωμένα κύτταρα μετρήθηκε και γράφημα με GraphPad Prism.

Η

Από SK-Mel-5 κύτταρα φαίνεται να έχουν χαμηλά επίπεδα ενδοκυτταρικού σιδήρου και ήταν υπερευαισθησία να BAF, η οποία θα μείωνε περαιτέρω την πρόσληψη σιδήρου, διερευνήσαμε την ευαισθησία του SK-MEL-5 κύτταρα προς χηλικοποιητή του σιδήρου DFO (Σχήμα 9). Όπως αναμενόταν, SK-MEL-5 κύτταρα ήταν υπερευαίσθητοι σε DFO σύγκριση με τα κύτταρα HeLa. Στην πραγματικότητα, η DFO ήταν κυτταροστατικό μόνο για κύτταρα HeLa, ενώ ήταν κυτταροτοξική για SK-Mel-5. Η προσθήκη εξωγενούς σιδήρου στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας του SK-MEL-5 ή HeLa κύτταρα είχαν καμία επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις συγκεντρώσεις της DFO δείχνεται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους και μετά 72 ώρες τα κύτταρα μετρήθηκαν. Δύο φρεάτια για κάθε συγκέντρωση μετρήθηκαν, και οι μέσοι αριθμοί των δύο ανεξάρτητα πειράματα απεικονίστηκαν γραφικά +/- SEM, η = 2.

Η

Τρεις παρατηρήσεις πρότεινε ότι φερροπορτίνη έκφραση θα μπορούσε να προκληθεί από ROS σε SK- Mel-5 κύτταρα. SK-Mel-5 κύτταρα είχαν τόσο αυξημένη παραγωγή ROS και αυξημένη φερροπορτίνη έκφρασης. Μία από τις κύριες οδούς που προκαλούνται από θεραπεία BAF κυττάρων HeLa επί 24 ώρες ήταν το αντιοξειδωτικό απόκριση που διαμεσολαβείται από NRF2, υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία θα μπορούσε να αυξήσει BAF ROS. BAF που προκαλείται όχι καταπιεσμένη φερροπορτίνη έκφραση σε SK-Mel-5 κύτταρα, ενώ η μείωση των επιπέδων σιδήρου με DFO μειώθηκε φερροπορτίνη έκφρασης. Εάν φερροπορτίνη έκφραση προκλήθηκε με ROS, στη συνέχεια επεξεργασία SK Mel-5-κυττάρων με το αντι-οξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) θα αναμένεται να μειωθεί φερροπορτίνη έκφρασης. Όταν SK-Mel-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις NAC, φερροπορτίνη έκφραση μειώθηκε (Σχήμα 10). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η SK-Mel-5 κύτταρα είναι ευάλωτα σε αναστολή της πρόσληψης σιδήρου, επειδή διατηρούν χαμηλά αποθέματα σιδήρου, ίσως για να προστατεύσουν τον εαυτό τους από την παραγωγή τοξικά επίπεδα των ROS.

SK Mel-5-κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NAC όπως περιγράφεται στις μεθόδους και στη συνέχεια σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση με αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών δείχνονται. TfR, υποδοχέα τρανσφερίνης. FPN1, φερροπορτίνη 1. FTH, φερριτίνη Η βαριά αλυσίδα. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Αν και ένας αριθμός κυτταρικών σειρών που προέρχονται από όγκους ή κυτταρικές γραμμές που μετασχηματίζονται με ογκογονίδια είναι πολύ ευαίσθητα σε αναστολείς V-ΑΤΡάση, προβλήματα τοξικότητας σε ζώα, ιδιαίτερα νευροτοξικότητα, εμπόδισαν την ανάπτυξη αυτών των αναστολέων ως αντι-καρκινικοί παράγοντες. Το προφανές πρόβλημα είναι ότι το V-ΑΤΡάση είναι ένα σημαντικό ένζυμο που ευθύνεται για πολλές θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες και αναστέλλοντας θα έχει πολλές επιδράσεις σε πολλούς τύπους κυττάρων. Αυτό με τη σειρά υποδηλώνει ότι η υπερευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε αναστολείς V-ΑΤΡάση πρέπει να οφείλεται σε μια ευπάθεια σε μία ή περισσότερες από τις πολλές διαδικασίες που απαιτούν την V-ΑΤΡάση και ότι ο εντοπισμός αυτές τις ευπάθειες θα μπορούσε να αποκαλύψει θεραπευτικοί στόχοι που μπορούν να αξιοποιηθούν με λιγότερες τοξικές αποτελέσματα επί των φυσιολογικών ιστών. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αναστολή της πρόσληψης του σιδήρου από τους αναστολείς V-ΑΤΡάση είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της διαφορετικής ευαισθησίας της καρκινικών κυτταρικών σειρών σε αυτούς τους αναστολείς, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μηχανισμοί που ελέγχουν τα επίπεδα ενδοκυτταρικού σιδήρου μπορεί να είναι χρήσιμοι θεραπευτικοί στόχοι για ορισμένους όγκους.