Αφηρημένο

Οι τρεις συνδέτες σχισμής και τέσσερις υποδοχείς ROBO τους έχουν θεμελιώδη ρόλο στην ανάπτυξη των θηλαστικών με την προώθηση της απόπτωσης και repulsing παρεκκλίνουσα μετανάστευση των κυττάρων.

σχισμές

και

robos

έχουν αναδειχθεί ως γονίδια καταστολής όγκων υποψήφιος του οποίου η έκφραση αναστέλλεται σε μια ποικιλία επιθηλιακών όγκων. Δείξαμε ότι η έκφραση τους θα μπορούσε να ρυθμίζεται αρνητικά από κορτιζόλης σε φυσιολογικά κύτταρα του ωχρού σωματίου των ωοθηκών. Υποθέσαμε ότι μετά την ωορρηξία η τοπικά παραγόμενης κορτιζόλης θα αναστείλει

SLIT /ROBO

έκφραση στην επιφάνεια των ωοθηκών επιθήλιο (ΟΣΕ) να διευκολύνει την επισκευή του και ότι αυτό το ρυθμιστικό μονοπάτι ήταν ακόμη παρούσα, και θα μπορούσε να χειραγωγηθεί, σε ωοθηκών επιθηλιακής τα καρκινικά κύτταρα. Εδώ εξετάσαμε την έκφραση και ρύθμιση του μονοπατιού σχισμής /ROBO σε ΟΣΕ, επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών και των κυτταρικών γραμμών όγκου ωοθήκης. Βασικοκυτταρικό

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

έκφραση ήταν χαμηλότερη σε πρωτογενείς καλλιέργειες επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα σε σύγκριση με την κανονική ΟΣΕ (

P

& lt? 0,05) και σε φτωχά διαφοροποιημένα SKOV-3 κύτταρα σε σύγκριση με τις πιο διαφοροποιημένη ΠΕΟ-14 κύτταρα (

P

& lt? 0,05). Η κορτιζόλη μείωσε την έκφραση ορισμένων

σχισμές

και

robos

στην κανονική ΟΣΕ και ΠΕΟ-14 κύτταρα (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον αποκλεισμού δραστηριότητα σχισμής /ROBO μειωμένη απόπτωση σε δύο κύτταρα ΡΕΟ-14 και SKOV-3 όγκου (

P

& lt? 0,05). Είναι ενδιαφέρον ότι

SLIT /ROBO

έκφραση θα μπορούσε να αυξηθεί με τη μείωση της έκφρασης του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών χρησιμοποιώντας siRNA (

P

& lt? 0,05). Συνολικά τα ευρήματά μας δείχνουν ότι στην μετά την ωορρηξία φάση ένας ρόλος της κορτιζόλης μπορεί να είναι να αναστέλλει προσωρινά την έκφραση SLIT /ROBO να διευκολυνθεί η αναγέννηση του ΟΣΕ. Συνεπώς, αυτό το μονοπάτι μπορεί να είναι ένας στόχος για την ανάπτυξη στρατηγικών για να χειραγωγήσουν το σύστημα SLIT /ROBO στον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Dickinson RE, Fegan KS, Ren Χ, Hillier SG, Duncan WC (2011) γλυκοκορτικοειδών κανονισμού της SLIT /ROBO όγκου γονίδια καταστολής στη ωοθηκών επιθήλιο επιφανειών και τα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (11): e27792. doi: 10.1371 /journal.pone.0027792

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Απρίλη 2011? Αποδεκτές: 25 Οκτωβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 23 Νοεμ του 2011

Copyright: © 2011 Dickinson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. WCD είναι υποστηρίζεται από μια Σκωτίας Ανώτερος Κλινικός υποτροφία από το Συμβούλιο χρηματοδότησης της Σκωτίας και το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από τον ΥΑΕ (SCD /02). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η εκκρίνεται γλυκοπρωτεΐνη σχισμής και ο υποδοχέας Robo της είχαν αρχικά προσδιοριστεί ως σημαντικά μόρια καθοδήγηση άξονα στην ανάπτυξη

Drosophila

νευρικού συστήματος [1], [2]. Ο ρόλος τους είναι εξελικτικά συντηρημένη ως σπονδυλωτών σχισμή (SLIT1, SLIT2, SLIT3) και ROBO (ROBO1, ROBO2, ROBO3, ROBO4) επίσης αναστέλλουν ανώμαλης μετανάστευσης νευρώνα [3]. Ωστόσο τα περισσότερα μέλη του σπονδυλωτού σχισμής και ROBO οικογένειες εκφράζονται επίσης έξω από το νευρικό σύστημα και έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη μιας ποικιλίας οργάνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστικού αδένα και ωοθήκης [4], [5]. Κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης η αλληλεπίδραση σχισμής /ROBO θεωρείται ότι ρυθμίζει πολλές διαδικασίες που περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, την προσκόλληση και τη μετανάστευση των μη νευρωνικών κυττάρων [6], [7].

μόρια που έχουν σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη είναι συχνά δυσρυθμισμένη στον καρκίνο [8]. Πράγματι, η

σχισμές

και

robos

είναι υποψήφια γονίδια καταστολής όγκου των οποίων η έκφραση είναι μειωμένη σε πολυάριθμους τύπους επιθηλιακών κυττάρων του όγκου, κυρίως μέσω διαγραφής, απώλεια της ετεροζυγωτίας και προαγωγού περιοχή υπερμεθυλίωση [9]. Αυτό περιλαμβάνει καρκίνους που προέρχονται από αναπαραγωγικούς ιστούς συμπεριλαμβανομένου του τραχήλου της μήτρας, του προστάτη και των ωοθηκών βλαστικής σειράς [10] – [13]. Πρόσφατες λειτουργικές μελέτες έχουν επίσης υποστηρίξει τη θεωρία ότι οι σχισμές και robos έχουν δραστηριότητες ογκοκατασταλτικό. Η οδός σχισμής /ROBO προωθείται προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και /ή μειωμένη πολλαπλασιασμό κυττάρων καρκινώματος ινοσαρκώματος, του οισοφάγου, ηπατοκυτταρικό, του παχέος εντέρου, του προστάτη και του μαστού [14] – [17]. SLIT2 επίσης ανέστειλε την εισβολή πολυάριθμων διαφορετικών τύπων κυττάρων όγκου συμπεριλαμβανομένων εκείνων από τον προστάτη, του μαστού, του ενδομητρίου και των ωοθηκών [13], [18], [19].

Το μονοπάτι σχισμής /ROBO έχει πλέον αποδειχθεί ότι έχουν φυσιολογικούς ρόλους σε κανονικές αναπαραγωγικούς ιστούς [6]. Σχισμής /ROBO σηματοδότηση φαίνεται να ρυθμίζουν την αγγειογένεση πλακούντα και λειτουργία τροφοβλάστης με αυτοκρινή και /ή παρακρινή τρόπο [20]. Επιπλέον, οι περισσότερες από τις σχισμές και robos επίσης προσωρινά ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια του κανονικού έμμηνου κύκλου στο ενδομήτριο και εκφράζονται στη σάλπιγγα [21]. Επιπλέον, υπάρχει αυξημένη έκφραση του

σχισμές

και

robos

στο ωχρό σωμάτιο ενήλικα κατά τη διάρκεια της όψιμης ωχρινικής φάσης του κύκλου των ωοθηκών. Αυτή τη στιγμή η αλληλεπίδραση σχισμής /ROBO μπορεί να δρουν για την προώθηση της διάσπασης του διεγείροντας απόπτωση και την αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων του ωχρού σωματίου [22]. Στο ωχρό σωμάτιο και το ενδομήτριο έκφραση σχισμών και robos είναι ορμονικά ρυθμιζόμενη. Υπάρχουν μειώθηκε

SLIT /ROBO

έκφραση στο decidualised ενδομήτριο της πρόωρης εγκυμοσύνης [21]. Επιπλέον, οι ωχρινοτρόπο μόρια, ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη [23] και της κορτιζόλης [24], που είναι αυξημένη στην αρχή της εγκυμοσύνης, να μειώσει την έκφραση του

σχισμές

και

robos

στην ωχρινική κύτταρα [22] .

Περίπου το 90% των κακοηθειών των ωοθηκών έχουν ταξινομηθεί ως επιθηλιακά όγκοι που πιστεύεται ότι προέρχονται από την επιφάνεια του επιθηλίου των ωοθηκών (ΟΣΕ) [25]. Ο κίνδυνος καρκίνου των ωοθηκών συσχετίζεται θετικά με τον αριθμό των ωορρηξιών [26]. Έτσι επαναλαμβανόμενες τραυματισμό και την επακόλουθη επισκευή του ΟΣΕ κατά τη διάρκεια της ωορρηξίας μπορεί να προδιαθέτουν τον ιστό σε νεοπλασία [27]. Η ωορρηξία είναι μια φλεγμονώδης περίπτωση διατάραξη της ΟΣΕ, αλλά απαιτείται ανάλυση. Αυτή η επιδιόρθωση διευκολύνεται από αυξημένη τοπική παραγωγή του αντι-φλεγμονώδη στεροειδή κορτιζόλης μέσω up-ρύθμιση του 11ß-υδροξυστεροειδούς αφυδρογονάση τύπου 1 [28].

Υποθέσαμε ότι ο ΟΣΕ εκφράζουν σχισμές και robos και ότι η κορτιζόλη θα μπορούσε προσωρινά να μειώσει την έκφραση αυτών των γονιδίων καταστολής όγκου για να διευκολύνουν την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων αυτών κατά την διάρκεια της διαδικασίας επιδιόρθωσης. Αν αυτή ήταν η περίπτωση αυτή η οδός μπορεί να έχει ένα ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και εάν παραμένει ενεργό σε κακοήθη κύτταρα OSE αυτό μπορεί να προσφέρει θεραπευτικές στρατηγικές για το χειρισμό αυτών των γονιδίων. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η έκφραση, ο εντοπισμός και η ρύθμιση του μονοπατιού SLIT /ROBO στον ΟΣΕ. Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον οι σχισμές και robos έγιναν έκτροπα εκφράζονται και ορμονικά ρυθμίζονται στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Επιπλέον αναλύσαμε τη λειτουργική σημασία ενός διαταραγμένο οδού σχισμής /ROBO σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

Η οδός σχισμής /ROBO εκφράζεται διαφορικά σε ανθρώπινο ΟΣΕ, των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές

SLIT2 και ROBO1 θα μπορούσε να immunolocalised στο φυσιολογικό ανθρώπινο επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (Εικ. 1Α-C). RT-PCR ανάλυση επιβεβαίωσε την έκφραση του

SLIT2

και

ROBO1

σε πρωτογενείς καλλιέργειες του ΟΣΕ και απέδειξαν ότι υπήρξε κάποια έκφραση

SLIT3

,

ROBO2

και

ROBO4

σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 1D). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την έκφραση αυτών των γονιδίων σε πρωτογενείς καλλιέργειες κακοηθών κυττάρων που προέρχονται από το ασκιτικό υγρό των γυναικών με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών.

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

εκφράστηκαν επίσης σε αυτά τα κύτταρα, αλλά ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι είχαν μειωθεί κατά 25-82% σε σύγκριση με πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ΟΣΕ (Σχήμα 2Α.) (

P

& lt? 0,05).

Α) Φως πεδίου μικροσκόπιο της ωοθήκης που δείχνει συγκεκριμένων χρώση για SLIT2 (καφέ) στον ΟΣΕ. Β) Ομοίως θετική ROBO1 (καφέ) χρώση παρατηρήθηκε επίσης στον ΟΣΕ. C) αριθ χρώση παρατηρήθηκε σε αρνητικούς μάρτυρες. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 100 μm. Δ) RT-PCR για

σχισμές

και

robos

σε καλλιεργημένα σωλήνα. Με την εξαίρεση του

SLIT1

και

ROBO3

τα μέλη του

SLIT

και

ROBO

οικογένειες εκφράστηκαν σε σωλήνα. FB = εμβρύου εγκεφάλου θετικός μάρτυρας? -RT = RT αρνητική αρνητικό μάρτυρα.

Η

Α) σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR που δείχνουν αυξημένο

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

σε πρωτογενείς καλλιέργειες μάνικα σε σύγκριση με κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα που καλλιεργήθηκαν από τους ασκίτη των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Β) RT-PCR δείχνει ότι τόσο οι κυτταρικές σειρές SKOV-3 και ΠΕΟ-14 εκφράζεται

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

και

ROBO2

. C) σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR δείχνει

SLIT2

,

SLIT3

και

ROBO2

μεταγραφές ήταν πιο πλούσια σε καλά διαφοροποιημένα ΠΕΟ-14 κυττάρων σε σύγκριση με τη χαμηλή διαφοροποίηση SKOV- 3 κύτταρα. FB = εμβρύου εγκεφάλου θετικός μάρτυρας? -RT = RT αρνητική αρνητικό έλεγχο? – = DNA αρνητική αρνητικό έλεγχο? * =

P

& lt? 0,05? ** =

P

& lt? 0,01? *** =

P

& lt? 0.005

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι τα κακοήθη κύτταρα του ΟΣΕ είχαν μειωμένη έκφραση του

σχισμές

και

robos

εξετάσαμε την έκφρασή τους σε δύο διαφορετικές κυτταρικές γραμμές όγκου ωοθηκών. Η κυτταρική γραμμή ΡΕΟ-14 προέρχεται από ένα καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών και έχει ομοιότητες με περισσότερο καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών και τον καρκίνο των ωοθηκών πρώιμο στάδιο. Σε αντίθεση, η κυτταρική σειρά SKOV-3 προέρχεται από μια κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών και είναι πιο χαρακτηριστικό μιας προηγμένης όγκου [29]. Και οι δύο αυτές κυτταρικές σειρές εκφράζονται

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

και

ROBO2

(Εικ. 2Β). Ωστόσο, παραλληλίζοντας τα αποτελέσματά μας στην καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων,

SLIT2

,

SLIT3

και

ROBO2

έκφραση μειώθηκε κατά μεταξύ 58% και 97% σε φτωχά διαφοροποιημένα SKOV- 3 κύτταρα σε σύγκριση με τα καλά διαφοροποιημένο ΡΕΟ-14 κύτταρα (Σχ 2C). (

P

& lt? 0,05). Αν και ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα μπορεί να διαφέρει σε άλλες απόψεις, καθώς και την κατάσταση διαφοροποίησής τους αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η έκφραση του

σχισμής /ROBO

ογκοκατασταλτικό γονίδιο μονοπάτι μπορεί να μειωθεί κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ή της προόδου του όγκου.

αναστέλλοντας την αλληλεπίδραση σχισμής /ROBO μειώνει την απόπτωση σε κύτταρα όγκου ωοθήκης

Η επίδραση του μονοπατιού σχισμής /ROBO για την επιβίωση των κυττάρων διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο ROBO1 /Fc χίμαιρα, η οποία δρα ως παγίδα συνδέτη να αναστέλλουν την αλληλεπίδραση σχισμής /ROBO, και την άμεση αναστολή της

SLIT2

χρησιμοποιώντας siRNA. Θεραπεία της ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα με την ROBO1 /Fc χίμαιρα δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (

P

& gt? 0,05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, σε αμφότερες τις ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα αποκλεισμού SLIT δράση με την ROBO1 /Fc χίμαιρα μειωμένη απόπτωση με 20-21%, όπως μετράται με ένα ενεργοποιημένο κασπάσης-3/7 δοκιμασίας (

P

& lt? 0,05 ) (Σχ. 3Α). Παροδική επιμόλυνση

SLIT2

siRNA μειώνεται μόνο

SLIT2

έκφρασης και στις δύο ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα. ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα με μειωμένη

SLIT2

έκφραση είχε μια σημαντική μείωση 17-26% σε διασπασμένη κασπάση-3 και -7 δραστηριότητες (

P

& lt? 0,05, ζευγαρωμένα t- δοκιμή) (Σχ. 3Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η μείωση του γονιδίου ατραπού σχισμής /ROBO σχετίζεται με αυξημένη κυτταρική επιβίωση.

Α) Η αγωγή με το ROBO1 /Fc χίμαιρα μειωμένη κασπάσης-3/7 Δράση, όταν συγκρίνεται με τη θεραπεία PBS /0,1% (w /v) BSA (έλεγχος) και στα δύο ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα. Β) Επιμόλυνση με

SLIT2

siRNA μειωμένη κασπάσης-3/7 Δράση, σε σύγκριση με τη θεραπεία με ένα περιπλεγμένο ελέγχου siRNA. * =

P

& lt?. 0.05

Η

Η κορτιζόλη ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του

σχισμές

και

robos

σε ΟΣΕ και ένα καλά διαφοροποιημένο καρκίνο ωοθηκών κυτταρική γραμμή

τότε διερευνηθεί κατά πόσον η έκφραση του μονοπατιού σχισμής /ROBO στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών ρυθμίστηκε. Σε ανθρώπινα ωχρινικής κυττάρων των ωοθηκών η οδός σχισμής /ROBO μπορούσε να ανασταλεί φυσιολογικώς από κορτιζόλης [22]. Η κορτιζόλη παράγεται τοπικά στο ΟΣΕ, και έχει αντι-φλεγμονώδη ρόλο μετά την ωορρηξία [30], εξετάσαμε αν η κορτιζόλη μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση SLIT /ROBO στον ΟΣΕ.

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

έκφραση μειώθηκε κατά 25-30% σε κορτιζόλης ( 1000 nM) αντιμετωπίζονται πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ΟΣΕ (

P

& lt?. 0,05) (Σχήμα 4Α). Ωστόσο, σε πρωτογενείς καλλιέργειες κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων κορτιζόλης δεν προκάλεσε καμία περαιτέρω μείωση στην έκφραση αυτών των γονιδίων (

P

& gt? 0,05) (Εικόνα 4Β).

Α) Real. -Ώρα ποσοτική PCR δείχνει ότι η κορτιζόλη (1000 nM), σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα αιθανόλη, μειώνεται

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

έκφραση σε πρωτογενείς καλλιέργειες σωλήνα. Β) Η κορτιζόλη δεν μετέβαλε την έκφραση του

σχισμές

και

robos

σε πρωτογενείς καλλιέργειες ωοθηκών επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων. Γ)

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

και

ROBO2

έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη από την κορτιζόλη στο πιο διαφοροποιημένη ΠΕΟ-14 κύτταρα. Δ) Ωστόσο έκφραση αυτών των

σχισμές

και

robos

δεν ρυθμίζονται από κορτιζόλη στα φτωχά διαφοροποιημένα SKOV-3 κύτταρα. Ε) Η κορτιζόλη μειωμένη εκκρίνονται επίπεδα SLIT2 πρωτεΐνης στα κύτταρα ΡΕΟ-14 (έκκριση έλεγχος είναι 0,5 ng /ml). ΣΤ) Η κορτιζόλη δεν επηρέασε τα επίπεδα της εκκρινόμενης SLIT2 πρωτεΐνης στα κύτταρα SKOV-3 (έκκριση έλεγχος είναι 0,5 ng /ml). * =

P

& lt? 0,05? ** =

P

& lt?. 0.01

Η

Οι κυτταρικές σειρές όγκων των ωοθηκών ΠΕΟ-14 και SKOV-3 έχουν επίσης τη δυνατότητα να ανταποκριθεί στη θεραπεία της κορτιζόλης, καθώς εκφράζουν τον υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών (GR). Επιπλέον εκφράζουν την αλατοκορτικοειδούς υποδοχέα (MR), αλλά δεν εκφράζουν τον υποδοχέα προγεστερόνης (PR) (Σχ. 5Α). Στις πιο διαφοροποιημένη ΠΕΟ-14 κύτταρα, η κορτιζόλη μείωσε την έκφραση του

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

και

ROBO2

από 13-31% (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 4C). Επιπλέον κορτιζόλη θεραπεία μείωσε εκκρίνεται συγκέντρωση πρωτεΐνης SLIT2 κατά 53% (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 4Ε). Όπως και οι πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων, η ρύθμιση αυτών των

σχισμές

και

robos

, καθώς και η εκκρίνονται SLIT2 πρωτεΐνη, χάθηκε στις πιο κακοήθεις, και λιγότερο διαφοροποιημένα, SKOV-3 κύτταρα (

P

& gt? 0,05) (Σχήμα 4D, F).. Αυτό υποδεικνύει ότι η κορτιζόλη μπορεί να έχει ένα φυσιολογικό ρόλο στη μείωση της αλληλεπίδρασης SLIT /ROBO κατά την επισκευή του ΟΣΕ και ότι αυτή η οδός μπορεί να εξακολουθεί να είναι ενεργός σε ορισμένες μορφές καρκίνου των ωοθηκών πρώιμο στάδιο.

Α) RT-PCR δείχνει ότι η ΠΕΟ -14 και SKOV-3 κύτταρα εξέφρασαν

GR

και

MR

αλλά όχι

PR

. Ο όγκος του μαστού κυτταρική γραμμή ΗΤΒ-19 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και -RT χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Β) σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR αποδεικνύοντας ότι η επιμόλυνση με το

GR

siRNA μείωσε

GR

έκφραση στις δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με το κωδικοποιημένο (sc) ελέγχου siRNA. Γ) Επιβεβαίωση ότι

GR

siRNA δεν επηρέασε

MR

έκφρασης στην ΠΕΟ-14 και κύτταρα SKOV-3. Δ) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου σημειώνοντας αύξηση σε ποσοστό

SLIT2

,

ROBO1

και

ROBO2

έκφραση μετά από

GR

γκρεμίσουμε από το

GR

siRNA στην ΠΕΟ-14 κύτταρα. Ε) Απόδειξη ότι

GR

siRNA επιμολυσμένα SKOV-3 κύτταρα, επίσης, είχε αυξηθεί

SLIT2

και

ROBO1

έκφρασης. * =

P

& lt? 0,05

Η

Χειραγώγηση της

σχισμές

και

robos

στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με στόχο την υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών

Έτσι, αν και τα γλυκοκορτικοειδή έχουν ένα θεωρητικό αρνητικές συνέπειες για πρώιμο καρκίνο κυττάρων των ωοθηκών, αυτό σημαίνει ότι ο χειρισμός του GR, με στόχο την αύξηση

σχισμής /ROBO

γονιδιακής έκφρασης, είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος. Ως εκ τούτου, «γκρέμισε»

GR

χρησιμοποιώντας το

GR

siRNA της κορτιζόλης-απόκρισης ΠΕΟ-14 κύτταρα. Επιμόλυνση του

GR

siRNA για 48 ώρες προκάλεσε σημαντική μείωση 63% στο

GR

έκφρασης (

P

& lt? 0.001) (Εικ. 5Β) χωρίς επηρεασμό

MR

έκφραση (Εικ. 5C). Αυτό αύξησε την έκφραση του

SLIT2

,

ROBO1

και

γονίδια ROBO2

ογκοκατασταλτικό (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 5D). Επιπλέον, η επιμόλυνση του

GR

siRNA οδήγησε σε μια παρόμοια μείωση του

GR

έκφραση στα κορτιζόλης-αδιάφορη κύτταρα SKOV-3 (

P

& lt? 0,01) ( Σχ. 5Β). Είναι σημαντικό ότι η έκφραση του

SLIT2

και

γονίδια καταστολής ROBO1

όγκου ενισχύεται επίσης από το

GR

siRNA επιμόλυνση (

P

& lt? 0,05) (Εικ . 5Ε).

ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με μιφεπριστόνη (RU486), η οποία λειτουργεί ως ανταγωνιστής GR. επεξεργασία RU486 μόνη της δεν επηρεάζει την έκφραση του

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ή

ROBO2

είτε σε κυτταρική σειρά (

P

& gt? 0,05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εντούτοις, η αγωγή RU486 είχε καταργήσει τη μεσολάβηση της κορτιζόλης αρνητική ρύθμιση του

σχισμής /ROBO

έκφραση σε ΡΕΟ-14 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχουν ανεξάρτητες επιδράσεις συνδέτη του GR στην έκφραση σχισμής /ROBO και επιβεβαιώνει ότι ακόμη και σε ασθενώς διαφοροποιημένες καρκινικά κύτταρα χειραγώγηση του GR μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση των γονιδίων καταστολής των όγκων.

Συζήτηση

στη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι το κανονικό ενήλικα άνθρωπο ΟΣΕ εκφράζει, σε επίπεδο RNA,

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία δείξαμε επίσης ότι SLIT2 και ROBO1 εκφράζονται επίσης στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Καθώς κάθε μια από τις σχισμές είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με κάθε μία από τις robos, με την πιθανή εξαίρεση της ROBO4, είναι πιθανό ότι η αλληλεπίδραση σχισμής /ROBO συμβαίνει στο OSE. Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη καθώς αυτά τα μόρια εκφράζονται σε άλλα κύτταρα των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένης της λουτεΐνης κοκκιωδών, theca λουτεΐνη και ωχρινική ινοβλάστες κύτταρα του ωχρού ενηλίκων σωμάτιο [22] και τα κύτταρα προ-κοκκιώδη και ωοκύτταρα του αρχέγονου θυλάκια εντός του αναπτυσσόμενου εμβρύου ωοθήκη [5 ]. Η κανονική ωοθήκη είναι, επομένως, μια περιοχή των φυσιολογικών αυτοκρινείς ή παρακρινείς δράσεις του συστήματος SLIT /ROBO.

Βρήκαμε ότι σε κανονική ΟΣΕ το σύστημα SLIT /ROBO μπορεί να ρυθμίζεται από κορτιζόλης. Η κορτιζόλη μείωσε την έκφραση του

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

σε πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων ΟΣΕ . Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η ίδια συγκέντρωση κορτιζόλης μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του

SLIT2

και

SLIT3

σε πρωτογενείς καλλιέργειες luteinised κοκκιώδη κύτταρα και ωχρινική μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα [22]. Μετά την ωορρηξία, υπάρχει μια αύξηση στην τοπική παραγωγή κορτιζόλης στο OSE που μπορεί να ενθαρρύνει την επισκευή των ιστών και ανανέωση [28]. Πάνω από το εύρος των φυσιολογικώς σχετικές συγκεντρώσεις σε κύτταρα ΟΣΕ κορτιζόλης έχει αποδειχθεί ότι έχει αντιφλεγμονώδη δράση και μπορεί να μπλοκάρει την ιντερλευκίνη-1 διεγείρεται ΜΜΡ-9 έκφραση [30], [31]. Επιπλέον, έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η κορτιζόλη, ρυθμίζοντας αρνητικά την έκφραση σχισμές και robos, αναστέλλει την απόπτωση και διευκολύνει τη μετανάστευση των κυττάρων [22]. Αυτό σημαίνει ότι μετά την ωορρηξία ένα από τα αποτελέσματα της τοπικής παραγωγής κορτιζόλης μπορεί να είναι να μειώσει προσωρινά την έκφραση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων SLIT /ROBO για να διευκολύνουν την επισκευή του κατεστραμμένου ΟΣΕ.

Σε πολλές επιθηλιακών καρκίνων υπάρχει μια σχετική απώλεια της έκφρασης των μελών της οικογένειας σχισμής /ROBO [9]. Για παράδειγμα μειωμένη έκφραση του

SLIT

και

ROBO

μεταγραφές έχει παρατηρηθεί σε οισοφαγικού πλακώδους κυττάρου, ηπατοκυτταρικό, του πνεύμονα, του προστάτη και καρκίνωμα του μαστού [10], [15], [16], [ ,,,0],32], [33]. Αυτή η μείωση στην έκφραση, ωστόσο, δεν είναι καθολική και ορισμένες μορφές καρκίνου, όπως τα γλοιώματα [34] και υποτροπιάζουσες καρκίνο του ενδομητρίου [35] να διατηρήσουν ή να αυξήσουν την οδό σχισμής /ROBO. Ωστόσο μεταβολές στην έκφραση αυτής της οδού σε κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα από καρκίνο των ωοθηκών δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί.

καλλιεργημένα κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα από το ασκιτικό υγρό των ασθενών με προχωρημένο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και σε σύγκριση έκφραση σχισμής /ROBO να ότι στην κανονική ΟΣΕ. Βρήκαμε μειωμένη έκφραση του

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

σε κακοήθη κύτταρα. Αν και πιστεύουμε ότι αυτές οι καλλιέργειες είναι καθαρές καλλιέργειες κακοηθών κυττάρων των ωοθηκών [36], είναι πιθανό ότι μπορεί να υπάρχουν μη-κακοήθη κύτταρα μολυσματικής σε ορισμένες καλλιέργειες. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση επίσης τα καλά διαφοροποιημένο ΡΕΟ-14 κυττάρων με τα ελάχιστα διαφοροποιημένα SKOV-3 κύτταρα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, οι περισσότερες κακοήθη κύτταρα είχαν χαμηλότερη έκφραση των σχισμών και μερικά από τα robos. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι ο καρκίνος των ωοθηκών μπορεί να προστεθεί στον κατάλογο των όγκων με μειωμένη έκφραση σχισμής /ROBO.

πήγε για να ερευνήσει τι επηρεάζει λιγότερο ενεργό σχισμής /ROBO μονοπάτι μπορεί να έχει για τη λειτουργία των κυττάρων. Πρόσφατες μελέτες έχουν υπονοείται ότι SLIT2 μπορεί να εμποδίσει την εισβολή των κυττάρων του ενδομητρίου και των ωοθηκών κυτταρικών γραμμών όγκου [19]. Δείξαμε επίσης ότι η αναστολή της σχισμής /ROBO σηματοδότηση σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών ωχρινική προωθείται μετανάστευση των κυττάρων [22]. Επιπλέον το κλείδωμα της δράσης σχισμή στο ωχρινική κύτταρα από το κανονικό ωοθήκη ανέστειλε απόπτωση και μειωμένη σε Caspase-3/7 Δράση [22]. Υπήρξε μια μείωση της κασπάσης-3/7 απόπτωση σε ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα όταν σχισμής /ROBO σηματοδότηση αναστέλλεται αναστέλλοντας δραστηριότητα SLIT χρησιμοποιώντας ένα ROBO1 /Fc χίμαιρα και σύνθεση SLIT2 χρησιμοποιώντας τεχνολογία siRNA. Αυξημένη απόπτωση, σχετίζεται με μειωμένη έκφραση του Bcl-2 και Bcl-XL αντι-αποπτωτικό μόρια, παρατηρήθηκε σε SLIT2 επιμολυσμένα ινοσαρκώματα και καρκινώματα του οισοφάγου πλακωδών κυττάρων [16]. SLIT2 μπορούσε επίσης να επάγει απόπτωση σχετίζεται με την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 σε μαστού και του πνεύμονα όγκου κυτταρικές γραμμές [37]. Συνολικά μια μείωση της δραστηριότητας σχισμής /ROBO σχετίζεται με αυξημένη επιβίωση των κυττάρων και τη μετανάστευση και αυτό είναι πιθανό να είναι σχετικές στον καρκίνο των ωοθηκών και την εξέλιξη της.

Εάν η οποία διαμεσολαβείται από γλυκοκορτικοειδές αναστολή της οδού σχισμής /ROBO είναι ακόμα εκδηλώνεται με κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα στον καρκίνο των ωοθηκών τότε κορτιζόλης μπορεί να έχει επιπτώσεις στην επιβίωση των κυττάρων και τη μετανάστευση που θα ήταν επιζήμια για τον ασθενή. Σε πρωτογενείς καλλιέργειες μας του προχωρημένου καρκίνου των ωοθηκών, καθώς και η χαμηλή διαφοροποίηση SKOV-3 ωοθηκών κυτταρική σειρά καρκίνου, χάθηκε η ρύθμιση της σχισμές και robos με κορτιζόλη. Ωστόσο, διατηρήθηκε στο πιο διαφοροποιημένη ΡΕΟ-14 κυτταρική γραμμή όγκου. Αυτό σημαίνει ότι η οδός μπορεί να είναι ακόμη ενεργός στα πρώιμα στάδια του καρκίνου των ωοθηκών ή σε λιγότερο κακοήθεις φαινοτύπους. Είναι ενδιαφέρον ότι τα γλυκοκορτικοειδή θα μπορούσε να αναστείλει την απόπτωση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ινοσαρκώματος [38] και σε κυτταρικές γραμμές όγκου ωοθήκης και κύτταρα από το ασκιτικό υγρό των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [39]. Η δεξαμεθαζόνη μπορεί επίσης να περιορίσει την απόπτωση που επάγεται από χημειοθεραπεία σε μια ποικιλία διαφορετικών τύπων όγκων συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του προστάτη, του τραχήλου της μήτρας και των ωοθηκών κύτταρα καρκινώματος [40] – [42]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της γλυκοκορτικοειδούς σχισμές και robos μπορεί ακόμη να είναι δυνατή σε ορισμένες κακοήθη κύτταρα.

Καθώς η προς τα πάνω ρύθμιση των σχισμών έχει δειχθεί ότι έχει ανασταλτικά αποτελέσματα επί της ανάπτυξης όγκου και εισβολής είναι δυνατόν ώστε ο χειρισμός του γλυκοκορτικοειδούς οδού έχει θεραπευτική χρησιμότητα. RU486, ένας ανταγωνιστής GR και PR, μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε προστάτη και του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα [43], [44]. Ο αποκλεισμός της δραστηριότητας κορτιζόλης στο ΠΕΟ-14 και κύτταρα SKOV-3, τα οποία στερούνται PR, χρησιμοποιώντας RU486 δεν επηρέασε την έκφραση του

σχισμές

και

robos

είτε σε κυτταρική γραμμή. Ωστόσο RU486 έκανε καταργήσει την αρνητική ρύθμιση της

SLIT /ROBO

έκφρασης στην ΠΕΟ-14 κύτταρα.

Το πιο σημαντικό, όταν ανέστειλε την ενδογενή

GR

έκφρασης, χρησιμοποιώντας siRNA, υπήρχε μια αύξηση στην έκφραση ορισμένων

σχισμές

και

robos

στις δύο ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα. Αυτό σημαίνει ότι το

σχισμές

και

robos

θα μπορούσε να ρυθμιστεί, στο μεταγραφικό επίπεδο, από την Ελλάδα και ότι ένα σημαντικό ρόλο για την GR στον έλεγχο

SLIT /ROBO

έκφραση μπορεί είναι συνδέτη ανεξάρτητη. βιοπληροφορική ανάλυση μας αποκάλυψε πολλά GR-απόκρισης και των σχετικών στοιχείων (GREs) στις περιοχές υποκινητή του

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

και

ROBO4

. Περιέργως, σε κύτταρα νευροβλαστώματος, το ενεργοποιημένο GR αλληλεπιδρά άμεσα με ρ53 και ρ53 αναστέλλει την εξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [45]. Ωστόσο GR μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκου σε άλλους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του δέρματος [46]. Συνεπώς, η ακριβής λειτουργία του GR στον καρκίνο θα μπορούσε να εξαρτάται από τον τύπο του όγκου.

Συνοπτικά, αυτή η μελέτη προσέφερε περαιτέρω απόδειξη ότι η οδός σχισμής /ROBO έχει ένα ρόλο στην κανονική φυσιολογία των ωοθηκών και ρυθμίζεται από τις ορμόνες, συμπεριλαμβανομένων γλυκοκορτικοειδή. Εχουμε επίσης δείξει ότι οι σχισμές και robos φαίνεται να εκφράζεται με παρεκκλίνοντα στον καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, η μείωση αυτής της οδού θα μπορούσε να αυξήσει την ογκογένεση και την εξέλιξη μέσα από μια κακή ρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης και της απώθησης της κυτταρικής μετανάστευσης. Συνολικά αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η μείωση του μονοπατιού σχισμής /ROBO είναι σημαντική στην κακοήθη ανάπτυξη και την εξέλιξη. Αυτή η έρευνα δείχνει επίσης ότι η στόχευση φυσιολογική ρύθμιση τους με στεροειδή μπορεί να έχει χρησιμότητα στον καρκίνο των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων και ιστών συλλογή

Όλα τα κύτταρα και τους ιστούς ελήφθησαν με ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση μετά την έγκριση από την υγειονομική επιτροπή Δεοντολογίας Έρευνας Lothian. Ανθρώπινα κύτταρα ΟΣΕ ελήφθησαν από τις ωοθήκες της προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (n = 5) που υποβάλλονται σε εκλεκτική χειρουργική επέμβαση για μη-κακοήθεις γυναικολογικές παθήσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα ελήφθησαν από το ασκιτικό υγρό των γυναικών (n = 8) με χειρουργική επέμβαση για την προηγμένη επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Κανονική ανθρώπινου ωοθηκικού ιστού είχαν συγκεντρωθεί για μια δωρεάν μελέτη [47]. Η SKOV-3 και ΠΕΟ-14 κυτταρικές γραμμές ευγενώς από τον Π Pujol, INSERM, Μονπελιέ, Γαλλία και Σ Langdon, Πανεπιστήμιο του Εδιμβούργου, Εδιμβούργο, Ηνωμένο Βασίλειο.

καλλιέργειας κυττάρων και θεραπείες

πρωτογενή κύτταρα ΟΣΕ και πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε μέσο καλλιέργειας που αποτελείται από Medium 199 (Invitrogen, Paisley, UK) και MCDB105 (Sigma-Aldrich Corp., Gillingham, UK) (ρΗ 7,3, 1:01 vv

-1) συμπληρωμένο με 15% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό, 50 IU /ml πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνης και 2 mM L-Γλουταμίνη. ΡΕΟ-14 και SKOV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο ίδιο μέσο, ​​ωστόσο ήταν συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS. Για τα κύτταρα μελέτες θεραπείας κορτιζόλης σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες φρέσκο ​​μέσο που περιέχει είτε 1,000 ηΜ κορτιζόλη [22], [30], [31] σε αιθανόλη με ή το ισοδύναμο όγκο αιθανόλης (0.001% ν /ν) προστέθηκε στα κύτταρα. Σε άλλα πειράματα 50 μΜ RU486 [24] (Sigma) με και χωρίς κορτιζόλη χρησιμοποιήθηκε. Κάθε αγωγή διεξήχθη σε τεχνικά τριπλούν. Μετά από 24 ώρες 1 ml μέσου απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C για το ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) πείραμα και RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα όπως περιγράφεται παρακάτω.

Για την ROBO1 /μελέτες θεραπείας Fc κύτταρα σπάρθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες φρέσκο ​​μέσο που περιέχει είτε ανασυνδυασμένη ROBO1 αρουραίου /Ρο χίμαιρα (R &? D Systems, Inc., Abingdon, UK? 1 μg /ml) ή το ισοδύναμο όγκο PBS /0.1% (w /v) BSA προστέθηκε στο κύτταρα. Θεραπείες πραγματοποιήθηκαν σε τεχνικό τετραπλούν. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα τα κύτταρα αναλύθηκαν για απόπτωση με τη χρήση της δοκιμασίας 3/7 κασπάση-Glo, όπως περιγράφεται παρακάτω.

σύντομης παρεμβολής RNA τεχνολογία

Είκοσι τέσσερις ώρες πριν από την επιμόλυνση ΡΕΟ-14 ή SKOV-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο, έτσι ώστε τα κύτταρα ήταν 50% συρρέοντα κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Σύντομης παρεμβολής RNA ολιγονουκλεοτίδια κατά GR και SLIT2 καθώς ως αρνητικός μάρτυρες, χωρίς σημαντική ομοιότητα αλληλουχίας με αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδίου, ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Warrington, Ηνωμένο Βασίλειο). Αυτοί διαμολύνθηκαν παροδικά στα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Oligofectamine σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών (Invitrogen). Εν συντομία, τα siRNA ολιγονουκλεοτίδια αραιώθηκαν σε τελική συγκέντρωση 200 ηΜ σε Ορίί-ΜΕΜ Ι μειωμένου ορού Media (Invitrogen) και σε συνδυασμό με αραιωμένο Oligofectamine για να επιτρέψει τα σύμπλοκα siRNA:Oligofectamine να σχηματίσει σε θερμοκρασία δωματίου. Το συγκρότημα siRNA:Oligofectamine στη συνέχεια προστέθηκε στάγδην σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 48-72 ώρες. Για τα πειράματα ανάλυση έκφρασης τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και κάθε διαμόλυνση έγινε εις τριπλούν. Για τα πειράματα δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3/7 Οι κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και κάθε διαμόλυνση διεξήχθη εις τετραπλούν.

Έκφραση ανάλυση

RNA εκχυλίστηκε από κάθε φρεάτιο των κυττάρων χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini (QIAGEN Ltd., Crawley, UK) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δεοξυριβονουκλεάση Ι (QIAGEN). RNA χρησιμοποιήθηκε σαν εκμαγείο για τη σύνθεση cDNA με τη χρήση ανάστροφης Taqman αντιδραστήρια μεταγραφάσης (Applied Biosystems). Εκκινητές ειδικούς για το

σχισμές

και

robos

έχουν προηγουμένως περιγραφεί λεπτομερώς [22]. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Eppendorf Mastercycler κλίση επιτρέπεται θερμοκυκλοποιητή (PerkinElmer, Inc., Waltham, ΜΑ) χρησιμοποιώντας GoTaq Flexi DNA πολυμεράση (Promega Ltd., Southampton, UK). Το PCR thermocycle αποτελούμενο από μία αρχική μετουσίωση 5 λεπτά στους 95 ° C που ακολουθείται από 35 κύκλους των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, θερμοκρασία ανασύνδεσης για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και μια τελική επέκταση 10 λεπτών σε 72 ° ΝΤΟ. Τα προϊόντα PCR κατέστησαν ορατά επί 2% (w /v) γέλη αγαρόζης με βρωμιούχο αιθίδιο προστίθεται.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

RNA εκχυλίστηκε και αντίστροφη μεταγραφή όπως περιγράφηκε παραπάνω. Μία πρότυπη καμπύλη δημιουργήθηκε με σειριακές αραιώσεις του cDNA που συντίθεται από ανθρώπινο εμβρυϊκό εγκέφαλο ολικού RNA (Stratagene Ευρώπη, Amsterdam, The Netherlands). Real-time PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια εις διπλούν 10 μl αντιδράσεις χρησιμοποιώντας το

Ισχύς

SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή και χρησιμοποιώντας το γρήγορο σε πραγματικό χρόνο εργαλείο σύστημα PCR ΑΒΙ 7500HT (Applied Biosystems) . Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ίδια όπως για την ανάλυση έκφρασης και έχουν περιγραφεί προηγουμένως [22].