Abstract

προπρωτεΐνης convertases (PC) είναι μία οικογένεια πρωτεϊνών η οποία περιλαμβάνει εννέα εξαιρετικά ειδικό σουμπτιλισίνη-όπως ενδοπεπτιδάσες σερίνης σε θηλαστικά. Το σύστημα των υπολογιστών εμπλέκεται στην καρκινογένεση και τα επίπεδα των mRNAs PC αλλάξει στον καρκίνο, γεγονός που υποδηλώνει την κατάσταση της έκφρασης των υπολογιστών ως πιθανό δείκτη για την πληκτρολόγηση του καρκίνου και την πρόγνωση. Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να εκτιμήσει την αξία των πληροφοριών του προφίλ έκφρασης των γονιδίων PC. Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για την ανάλυση των επιπέδων mRNA όλων των γονιδίων PC καθώς και γονίδια μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ14

, τα οποία είναι υποστρώματα των PCs, σε 30 ζεύγη δειγμάτων ανθρώπινου όγκου καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων ιστών χωρίς παθολογία. Σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των προσωπικών υπολογιστών έχουν αποκαλυφθεί σε ιστούς όγκων: αυξημένη

φουρίνη

επίπεδο mRNA (p & lt? 0.00005) και μειωμένα επίπεδα mRNA της

PCSK2

(p & lt? 0.007),

PCSK5

(p & lt? 0.0002),

PCSK7

(p & lt? 0.002),

PCSK9

(p & lt? 0.00008), και

MBTPS1

(p & lt? 0,00004), όπως καθώς και μια τάση για αύξηση του επιπέδου των

PCSK1

mRNA. Οι τέσσερις διαφορετικές ομάδες δειγμάτων προσδιορίστηκαν με ανάλυση διασποράς των προτύπων έκφρασης των γονιδίων PC σε καρκινικά εναντίον φυσιολογικό ιστό. Τρεις από αυτές τις ομάδες που καλύπτουν το 80% των δειγμάτων που διαθέτουν ισχυρή αύξηση στην έκφραση ενός γονιδίου στον καρκίνο:

φουρίνη

,

PCSK1

, ή

PCSK6

. Έτσι, οι αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων PC έχουν περιορισμένο αριθμό σεναρίων, η οποία μπορεί να αντανακλά διαφορετικές οδούς ανάπτυξης όγκου και κρυπτικά χαρακτηριστικά των όγκων. Αυτό το εύρημα επιτρέπει να εξετάσει τα mRNAs των γονιδίων PC ως δυνητικά σημαντικό καρκινικών δεικτών

Παράθεση:. Ντεμιντγιούκ IV, Shubin AV, Gasanov EV, Kurinov AM, Demkin VV, Vinogradova τηλεόραση, et al. (2013) Μεταβολές στα Gene Expression της προπρωτεΐνης convertases στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα έχουν περιορισμένο αριθμό σεναρίων. PLoS ONE 8 (2): e55752. doi: 10.1371 /journal.pone.0055752

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu », Ιταλία

Ελήφθη: 6 Σεπτέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 30 Δεκέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7η Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Ντεμιντγιούκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Πρόγραμμα της Ρωσικής Ακαδημίας Επιστημών Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, το Πρόγραμμα της Ρωσικής Ακαδημίας Επιστημών «Θεμελιώδη Science στην Ιατρική», ρωσική Ιδρύματος βασικής Έρευνας (αρ έργου. 12-04-00961 και 12 -04-01438), το ομοσπονδιακό πρόγραμμα «R & amp? Α Οδηγίες Προτεραιότητα της Ρωσικής Επιστημονικής-Τεχνολογικής ανάπτυξης Complex στο 2007-2012″ (κατάσταση συμβάσεις 02.522.11.2005 και 16.512.12.2002), το ομοσπονδιακό πρόγραμμα «η ανάπτυξη των φαρμακευτικών και ιατρική βιομηχανία στη Ρωσική Ομοσπονδία μέχρι το 2020 και μετέπειτα »(κρατική σύμβαση 11411.1008700.13.084), και επιχορήγηση του Προέδρου της Ρωσικής Ομοσπονδίας για την Επιστημονική Σχολές (αρ. 5638.2010.4). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

προπρωτεΐνης convertases (PC) είναι μία οικογένεια πρωτεϊνών η οποία περιλαμβάνει εννέα εξαιρετικά ειδικό σουμπτιλισίνη-όπως ενδοπεπτιδάσες σερίνης σε θηλαστικά (που επισκοπείται στο [1]). Η βασική λειτουργία αυτών των ενζύμων είναι η επεξεργασία και /ή ενεργοποίηση πολλών πρωτεϊνών και πεπτιδίων. Η ενδογενής υποστρώματα των υπολογιστών περιλαμβάνουν νευροπεπτίδια, πεπτιδικές ορμόνες, παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης, μόρια προσκόλλησης, πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας, υποδοχείς, ένζυμα, παράγοντες πήξης του αίματος, και τις πρωτεΐνες του πλάσματος. Επιπλέον, οι παθογόνοι ιοί και τα βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιούν τους υπολογιστές υποδοχής για να ενεργοποιήσετε τις πρωτεΐνες τους, όπως ιικές πρωτεΐνες παλτό ή βακτηριακές τοξίνες. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση των προ-πρωτεΐνες στο σωστό χρόνο και τόπο είναι σαφώς ζωτικής σημασίας για την ομοιόσταση, οι υπολογιστές που εμπλέκονται στον έλεγχο των διαφόρων φυσιολογικών διεργασιών στην υγεία και την ασθένεια. Υπολογιστές ως ένα σύστημα επεξεργασίας διαθέτουν ένα συνδυασμό της εξειδίκευσης και της απόλυσης [2]: κάθε πρωτεΐνη της ομάδας έχει μοναδικές δομικές και λειτουργικές ιδιότητες? συγχρόνως, τις ιδιότητες των PCs αλληλεπικαλύπτονται. Η εξειδίκευση και η εφεδρεία παρατηρούνται όχι μόνο στα επίπεδα της ειδικότητας υποστρώματος και κυτταρικό εντοπισμό, αλλά και για τα προφίλ χρονική /ιστού και, ενδεχομένως, για τους μηχανισμούς ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Στο πλαίσιο αυτό, η αναγνώριση των ατομικών φυσιολογικές ιδιότητες και φυσικοί εταίροι των ενζύμων αυτής της ομάδας δεν είναι ένα εύκολο θέμα, το οποίο μπορεί να λυθεί σωστά μόνο όταν οι υπολογιστές θεωρούνται ως ένα ολοκληρωμένο σύστημα.

Πολλά υποστρώματα των υπολογιστών είναι που συνδέονται με κακοήθεις νόσους. Για παράδειγμα, η άμεση συμμετοχή στην πρόοδο του όγκου και της μετάστασης έχει καταδειχθεί για την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 (IGF-1) και του υποδοχέα του (IGF-1R), αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (ΤΟΡ-β), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα C (VEGF-C), και μήτρα μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) (που επισκοπείται στο [3]). Με την ενεργοποίηση των βασικών σχετίζονται με τον καρκίνο πρωτεΐνες, οι ηλεκτρονικοί υπολογιστές έχουν επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την κινητικότητα και την πρόσφυση καθώς και την εισβολή όγκου, που δείχνουν υπολογιστές ως πολλά υποσχόμενη θεραπευτικών στόχων [4].

Τα πρώτα στοιχεία σχετικά με τη σύνδεση των υπολογιστών με καρκίνο δημοσιεύθηκαν το 1987 [5]. Από τότε, πολλές μελέτες ανέλυσαν την έκφραση του Υ στον καρκίνο και τις συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης PC και τις ιδιότητες του καρκίνου με χρήση διαφόρων πειραματικών προσεγγίσεων [6] – [21]. Συνολικά, τα δεδομένα που λαμβάνονται κατέδειξαν μεταβληθέντα επίπεδα του PC mRNAs στον καρκίνο. Οι συσχετίσεις μεταξύ των προφίλ έκφρασης PC και επιθετικότητα του καρκίνου [9], [12], [16], το ποσοστό επιβίωσης [18], και νευροενδοκρινείς διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων [6], [7], [13] έδειξαν. Αυτό μας επιτρέπει να προτείνουμε την κατάσταση έκφρασης του συστήματος του υπολογιστή ως πιθανό δείκτη για την πληκτρολόγηση του καρκίνου και την πρόγνωση.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο διαδεδομένη ογκολογικές παθήσεις, η οποία προκαλεί 1,4 εκατομμύρια θανάτους ετησίως [22]. Δεν αποτελεί έκπληξη, τα στοιχεία έκφρασης PC πρώτα ελήφθησαν για αυτό το είδος του καρκίνου [5] – [7]. Αυτά καθώς και πιο πρόσφατες δημοσιεύσεις [8], [11] – [13] κατέδειξε αλλοιωμένη έκφραση

φουρίνη

,

PCSK1

,

PCSK2

, και

PCSK6

γονίδια στον καρκίνο του πνεύμονα. (Στο εξής, σύμβολα γονίδιο ακολουθήσουν τις συστάσεις της Επιτροπής Ονοματολογίας HUGO Gene, www.genenames.org. Οι αντίστοιχες κοινές ονομασίες πρωτεΐνη δίνονται στον Πίνακα 1.) Υψηλή

φουρίνη

έκφραση βρέθηκε σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινώματα (NSCLCs) έναντι των μικρών κυττάρων του πνεύμονα καρκινώματα (SCLCs) [5], [8] και συσχετίζεται με την επιθετικότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα [12].

PCSK1

και

PCSK2

έκφραση είναι σε μεγάλο βαθμό ανιχνευθεί σε καρκίνους με χαρακτηριστικά νευροενδοκρινικών, ειδικότερα, SCLC [6] – [8], [11], [13]. Ταυτόχρονα,

PCSK6

έκφραση δεν είναι απαραίτητα παρατηρείται στον καρκίνο του πνεύμονα, παρόλο που είναι πιο κοινή σε NSCLC από ό, τι SCLC [8]. Έτσι, η απόκριση του συστήματος υπολογιστή ποικίλλει ανάλογα με τους τύπους καρκίνου του πνεύμονα. έρευνες της γονιδιακής έκφρασης που περιλαμβάνει την ανάλυση μικροσυστοιχιών (συμπεριλαμβανομένης της ολικής μεταγραφικό αυτά) καταδεικνύουν μια σημαντική ετερογένεια των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα [13], [23] – [26], και οι αποκάλυψαν διαφορές συσχετίζονται με το επιτόκιο των ασθενών επιβίωσης [23], [24 ], [26]. Συνολικά, αυτό προτείνει ο καρκίνος του πνεύμονα, όπως ένα σύστημα ελέγχου για να εκτιμήσει την αξία των πληροφοριών της προσέγγισης που βασίζεται σε προφίλ έκφρασης των γονιδίων PC.

Η

Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα εργασία για πρώτη φορά αξιολόγησε τα επίπεδα του mRNA της όλα τα γονίδια PC στον καρκίνο του πνεύμονα χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή ακολουθούμενη από μία ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR). Επιπλέον, μελετήσαμε την έκφραση γονιδίων των δύο μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (ΜΜΡ2 και ΜΜΡ14), οι οποίες αποτελούν βασικούς παράγοντες για την εισβολή καρκίνου και μετάσταση [27] και τα υποστρώματα των υπολογιστών [28] – [30].

Υλικά και μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η έρευνα εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της Blokhin Cancer Research Center (Μόσχα, Ρωσία), και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή που συμμετέχουν στη μελέτη.

Συλλογή δειγμάτων ιστού

δείγματα ιστών όγκου του καρκίνου και των παρακείμενων ιστών χωρίς ιστολογική παθολογία (αναφέρεται περαιτέρω ως φυσιολογικό ιστό) ελήφθησαν από 30 ασθενείς με διάγνωση μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα και του μη μικροκυτταρικού καρκίνωμα του πνεύμονα (όγκου στάδιο Ι-ΙΙΙ) κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης (Σχήμα 1, Πίνακας S1). Σε κάθε περίπτωση εντοπισμού ενός κύριου κόμβου όγκου προσδιορίστηκε. Αν ένας όγκος προέρχεται από το μικρότερο βρόγχους σε περιφερειακά τμήματα των πνευμόνων και δεν είχε καμία σχέση με αυλό των βρόγχων, εντοπισμός της θεωρήθηκε περιφερειακό. Αν ένας όγκος προέρχεται από ένα μεγάλο βρόγχο, ο εντοπισμός της θεωρήθηκε κεντρική. Τα δείγματα φυσιολογικού ιστού ελήφθησαν από το ύψος της εκτομές (η απόσταση μεταξύ του όγκου και των φυσιολογικών ιστών δεν ήταν λιγότερο από 20 mm). Όλοι οι ασθενείς ήταν υπό ιατρική παρακολούθηση στο Blokhin Cancer Research Center (Μόσχα, Ρωσία) κατά τη διάρκεια μιας περιόδου από τον Μάιο του 2004 έως το Νοέμβριο του 2005. Κανένας από αυτούς τους ασθενείς έλαβαν το ραδιόφωνο ή χημική θεραπεία για τη στιγμή της έρευνας.

SCC , πλακώδες καρκίνωμα πνεύμονα? ADC, αδενοκαρκίνωμα? ADC /SCC, τόσο ADC και τα κύτταρα SCC βρέθηκαν στον ιστό του όγκου? SCLC, μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα? P, περιφερειακή θέση του όγκου? C, κεντρική τοποθεσία του όγκου? Υ, όγκου με κερατινοποίηση? Ν, του όγκου χωρίς κερατινοποίηση? ‘-‘, χωρίς δεδομένα. Ο χάρτης θερμότητας παρουσιάζεται στο ημερολόγιο

2 κλίμακας. Γκρίζα κύτταρα δείχνουν δείγματα με μη ανιχνεύσιμο mRNA τόσο του όγκου και των φυσιολογικών ιστών.

Η

Κάθε δείγμα χωρίστηκε σε δύο τμήματα. Η πρώτη ήταν αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για απομόνωση mRNA. Το δεύτερο τμήμα χρησιμοποιήθηκε για ιστολογική εξέταση μετά αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση των τομών παραφίνης. δείγματα όγκων ιστός περιείχε περισσότερο από το 70% των κακοήθων κυττάρων. Σε κανονική δείγματα ιστών, δεν κακοήθη κύτταρα βρέθηκαν. Για SCC δειγμάτων προσδιορίστηκε παρουσία keratinazation. Ύπαρξη κερατινοποίησης αφέθηκε να παραπέμψει ένα δείγμα σε μια ομάδα καλά διαφοροποιημένο καρκίνο.

απομόνωση RNA και τον καθαρισμό

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από ομογενοποιημένο όγκου ή φυσιολογικούς ιστούς με λύση ισοθειοκυανικής γουανιδίνης και οξύ -φαινόλη εκχύλιση με επακόλουθη απομάκρυνση του πολυσακχαρίτη προσμίξεων [31]. Επιπρόσθετος καθαρισμός διεξήχθη με καταβύθιση του RNA χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA). Περαιτέρω κατεργασία με ϋΝάση Ι (Promega, USA) έγινε σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Τα ληφθέντα δείγματα RNA που χαρακτηρίζεται ηλεκτροφορητικά σε γέλη αγαρόζης 1%. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρία.

σύνθεση διπλής έλικας cDNA

(Α V = C ή G, ή) (Syntol, Ρωσία) χρησιμοποιήθηκαν ολιγονουκλεοτίδια AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG και AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT

30VN στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής. Για την πρώτη σύνθεση cDNA κλώνου, 1 μα RNA απομονώθηκε επωάστηκε με αντίστροφη μεταγραφάση PowerScript (Clontech, USA) όπως περιγράφεται από τους Υ Zhu et al. [32]. Το ληφθέν μείγμα της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε για την σύνθεση δεύτερου κλώνου που ακολουθείται από PCR χρησιμοποιώντας το DNA πολυμεράσης Advantage 2 (Clontech, USA) και AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT εκκινητή υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 1.5 λεπτό? έως 17 κύκλοι των 95 ° C για 20 s? 65 ° C για 20 s? και 72 ° C για 3 λεπτά. Για να αποκτήσετε ίσες ποσότητες όλων των προϊόντων ενίσχυσης, ο αριθμός των κύκλων διέφερε (κοινώς, 15 κύκλοι).

Real-time PCR

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και ανιχνευτές της TaqMan Gene Expression σύστημα Δοκιμασίες (Applied Biosystems, USA) (Πίνακας 1). TaqMan Προ-Αναπτύχθηκε Αντιδραστήριο Προσδιορισμού GAPDH 20 × (Applied Biosystems, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του γονιδίου αναφοράς, αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική (

GAPDH

). PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ανακυκλωτή Chromo4 Dyad Μαθητής (BioRad, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή με το ακόλουθο πρόγραμμα: 50 ° C για 2 λεπτά? 95 ° C για 10 λεπτά? 45 κύκλοι των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 60 s? Ο όγκος της αντίδρασης ήταν 20 μΙ. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε τουλάχιστον δύο φορές εις διπλούν. Ο κύκλος όριο ορίστηκε με τη χρήση του Opticon Monitor 3 λογισμικό (BioRad, USA).

Πειραματική επεξεργασίας δεδομένων

Τα πειραματικά δεδομένα που λαμβάνονται για τα γονίδια υπό μελέτη ομαλοποιήθηκαν σε

GAPDH

επιπέδων mRNA χρησιμοποιώντας τον τύπο:, και τα αποτελέσματα ήταν ο μέσος όρος (Πίνακας S1). Οι τιμές για όγκο και φυσιολογικούς ιστούς ορίστηκαν ως Expr

T και Expr

Ν, αντίστοιχα. Η Expr

T για να Expr

αναλογία Ν (Λόγος

Τ /Ν) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης υπολογίστηκαν για κάθε γονίδιο.

Σε μερικά δείγματα, τα mRNA ορισμένων γονιδίων δεν ανιχνεύονται σε όγκο ή φυσιολογικούς ιστούς σε ένα από τα δύο ανεξάρτητα πειράματα. Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι τιμές Expr και Ratio υπολογίστηκαν από τα δεδομένα του άλλου πειράματος. Σε μερικά δείγματα, σε πραγματικό χρόνο PCR απέτυχε να ανιχνεύσει mRNAs ορισμένων γονιδίων σε όγκο ή φυσιολογικούς ιστούς και στα δύο πειράματα? Σε αυτές τις περιπτώσεις ο C

T ορίστηκε ίση με 42 στην Λόγος

Τ /υπολογισμούς Ν. Αν mRNAs ήταν ανιχνεύσιμα σε όγκο και φυσιολογικούς ιστούς και στα δύο πειράματα, ο Λόγος

Τ /Ν τιμές δεν έχουν υπολογιστεί.

Στατιστικές αναλύσεις

Wilcoxon ταιριάζουν ζεύγη τεστ rank-sum χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημασία της διαφοράς μεταξύ των επιπέδων mRNA των γονιδίων στον όγκο και φυσιολογικούς ιστούς. Kruskal-Wallis μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης διεξήχθη για να αξιολογηθεί η επίδραση του τύπου του όγκου, το στάδιο, και τα χαρακτηριστικά ΤΝΜ στα επίπεδα mRNA των υπό μελέτη γονιδίων. Spearman συντελεστές συσχέτισης rank υπολογίστηκαν για να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ των ζευγών των προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Cluster ανάλυση των προτύπων έκφρασης γονιδίων και τα προφίλ έκφρασης πραγματοποιήθηκαν για την Expr και Λόγος

Τ /Ν τιμές με τη μέθοδο Ward χρησιμοποιώντας Spearman συντελεστές βαθμό συσχέτισης με το μέτρο απόσταση. Όλες οι παραπάνω στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Statistica 8.0 (StatSoft, USA). χάρτες θερμότητας χτίστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο λογισμικού Matrix2png [33].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σε αυτό το έργο, ποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για την ανάλυση των επιπέδων του mRNA όλων των γονιδίων PC (που απαριθμούνται στον πίνακα 1), καθώς και γονίδια που μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ14

σε 30 ζεύγη δειγμάτων ανθρώπινου όγκου καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Πίνακας S1, Εικόνα 1). Έκφραση του

MBTPS1

,

PCSK7

,

ΜΜΡ2

, και

ΜΜΡ14

παρατηρήθηκε σε όλα τα δείγματα ιστού του όγκου και φυσιολογικό? και

PCSK5

, σε όλα σχεδόν τα δείγματα. Αντιστρόφως,

PCSK4

mRNA ανιχνεύθηκε μόνο σε δύο δείγματα όγκου. Τα προφίλ έκφρασης άλλων γονιδίων ήταν πιο πολύπλοκη.

PCSK9

μεταγραφή βρέθηκε σε 29 δείγματα φυσιολογικού ιστού, αλλά μόνο σε 18 αυτά όγκου.

PCSK6

έκφραση ανιχνεύθηκε σε περίπου δύο τρίτα των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών? και

PCSK2

, σε 15 και 11, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε Οι πιο έντονες διαφορές μεταξύ φυσιολογικού και καρκινικού ιστού έκφρασης για

φουρίνη

και

PCSK1

. Τα δείγματα όπου ανιχνεύθηκαν mRNAs από τα γονίδια αυτά είχαν διπλάσια πιο συχνές σε όγκο από ό, τι σε φυσιολογικούς ιστούς, ενώ η έκφραση τους ήταν μη ανιχνεύσιμη σε σημαντικό κλάσμα των δύο όγκων (21/30 για

PCSK1

και 8/30 για

φουρίνη

) και φυσιολογικά δείγματα (26/30 και 20/30, αντίστοιχα). Συνολικά, τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των μεμονωμένων γονιδίων PC στο ανθρώπινο πνεύμονα, από τη μία πλευρά, και η υψηλή διακύμανση πρότυπα έκφρασης τους (δηλαδή, οι συνδυασμοί των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων) μεταξύ των ατόμων, από την άλλη πλευρά.

Τα στοιχεία που προκύπτουν είναι, σε γενικές γραμμές, σε καλή συμφωνία με δημοσιευμένα αποτελέσματα.

PCSK4

δείχθηκε να περιοριστεί σε μεγάλο βαθμό στην όρχεων και κυττάρων των ωοθηκών γεννητικά [34] – [36]. PCSK1 και PCSK2, οι κύριοι ενεργοποιητές της προορμόνες και proneuropeptides εντός της ρυθμιζόμενης εκκριτική οδό, εντοπίζονται σε μεγάλο βαθμό σε νευρικά και ενδοκρινικά κύτταρα [37]. Όλα τα άλλα γονίδια που μελετήθηκαν (που κωδικοποιούν τις δύο υπολογιστές και MMPs) που συνήθως αναφέρονται ως καθολικά ή εκφράζεται ευρέως. Καθώς και άλλοι συγγραφείς, βρήκαμε mRNA της

MBTPS1

,

PCSK5

,

ΜΜΡ2

, και

ΜΜΡ14

σε όλα ή σχεδόν όλα τα δείγματα όγκων και φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα (π.χ. [38], [39], των συνόλων δεδομένων GDS1650, GDS1673, και GDS2491 στην έκφραση του γονιδίου της βάσης δεδομένων Omnibus σε www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Σε περίπτωση PCSK6, σε πλήρη συμμόρφωση με άλλα δημοσιευμένα στοιχεία ([8], GDS1650, GDS1673, και GDS2491), βρήκαμε το mRNA όχι σε όλα, αλλά μεγάλο μέρος των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματά μας σχετικά με

PCSK9

είναι επίσης σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα στοιχεία (GDS1673), αν και η τρέχουσα πληροφορίες σχετικά με την έκφραση αυτού του γονιδίου στον πνεύμονα είναι λιγοστές. Βρήκαμε

φουρίνη

mRNA σε περίπου το ήμισυ του συνόλου των δειγμάτων, η οποία είναι σε συμφωνία με δεδομένα που λαμβάνονται από την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών (GDS1650, GDS1673, και GDS2491), αλλά σε αντίθεση με τα δημοσιευμένα στοιχεία που αποκτήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Nothern [5] , [8]. Ο λόγος αυτής της διαφοράς μπορεί να εξηγηθεί από τα χαρακτηριστικά των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν. Οι μεγαλύτερες ανησυχίες ασυνέπεια

PCSK7

. Υπάρχουν λίγα στοιχεία για την έκφρασή του στον πνεύμονα. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται μέχρι στιγμής που λαμβάνεται με την τεχνολογία μικροσυστοιχιών και δεν ταιριάζουν μεταξύ τους. Βρήκαμε

PCSK7

mRNA σε όλα τα δείγματα μας, Gruber με τους συναδέλφους που βρίσκονται σε 14 από τις 40 μη νοσούντων δείγματα πνεύμονα ([40] και GDS1673), και Stearman με τους συναδέλφους δεν το βρείτε σε οποιοδήποτε από 20 όγκων και 19 δείγματα φυσιολογικού ιστού πνεύμονος ([41] και GDS1650). Επίσης, δεν φαίνεται δυνατό να εξηγήσει τους λόγους των διακρίσεων, αλλά φαίνεται πιθανότατα να οφείλεται σε διαφορές στις πειραματικές πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται:. QPCR και διάφορες γενιές των τσιπ Affymetrix

Έτσι, τα ληφθέντα και τα δημοσιευμένα στοιχεία καταδεικνύουν υψηλή διακύμανση στη γονιδιακή έκφραση PC μεταξύ των ατόμων. Αυτό δίνει κανένα λόγο να αναμένουμε ότι τα επίπεδα του mRNA των υπολογιστών σε όγκο ή και μόνο φυσιολογικό ιστό μπορεί να έχει οποιαδήποτε προγνωστική αξία ή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πληκτρολόγηση του καρκίνου. Πράγματι, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που αναλύθηκαν ή πρότυπα έκφρασης τους έχουν αποκαλυφθεί για τις ομάδες των φυσιολογικών ή καρκίνο δείγματα με παρόμοια κλινικά χαρακτηριστικά. Παρομοίως, η ανάλυση του συμπλέγματος απέτυχε να αποκαλύψει τις ομάδες των δειγμάτων με παρόμοια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης

Παράλληλα, έχουμε βρει μέτρια αλλά σημαντική (ρ & lt? 0,05). Κατά ζεύγη συσχετισμοί μεταξύ των προφίλ έκφρασης των γονιδίων που μελετήθηκαν (Πίνακας 2). Σημειώστε ότι τα σύνολα των συσχετιζόμενων προφίλ διέφερε ουσιαστικά για όγκων και φυσιολογικών ιστών. Υποθέτοντας ότι τα αποκάλυψε συσχετίσεις δείχνουν την συντονισμένη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, μπορεί κανείς να προτείνει ότι η ρύθμιση της έκφρασης των προσωπικών υπολογιστών και MMPs έχει τροποποιηθεί στον καρκίνο του πνεύμονα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί, αυτό ισχύει για τη μεγάλη πλειοψηφία των γονιδίων PC. Επιπλέον, οι συσχετισμοί μεταξύ των προφίλ των αλλαγών στην έκφραση σε όγκο έναντι φυσιολογικών ιστών (διαφορική προφίλ έκφρασης) μπορεί να αποδοθεί με τους μηχανισμούς που διέπουν την έκφραση αλλάζει κοινό για διάφορα γονίδια.

Η

Ανάλυση του mRNA επίπεδα των υπό μελέτη γονιδίων έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των όγκων και των φυσιολογικών ιστών: το μέσο επίπεδο του

φουρίνη

mRNA αυξήθηκε (p & lt? 0.00005)? τα επίπεδα mRNA της

PCSK2

(p & lt? 0.007),

PCSK5

(p & lt? 0.0002),

PCSK7

(p & lt? 0.002),

PCSK9

( p & lt? 0.00008), και

MBTPS1

(p & lt? 0,00004) μειώθηκε? ενώ

PCSK1

επίπεδο mRNA έδειξε μια τάση να αυξάνεται (Σχήμα 1). Έτσι, η έκφραση του επτά από τις οκτώ γονιδίων PC (εκτός

PCSK6

), του οποίου το mRNA είναι ανιχνεύσιμο στον πνεύμονα, έδειξε μονής κατεύθυνσης αλλαγές στον καρκίνο του πνεύμονα σε δείγματα μας. Αν και η έκφραση των προσωπικών υπολογιστών αναλύθηκε σε πολλές δημοσιεύσεις, αυτό είναι ένα πρωτότυπο εύρημα, καθώς τα επίπεδα mRNA των περισσότερων γονιδίων PC σε καρκινικά εναντίον φυσιολογικούς ιστούς δεν έχουν ποσοτικοποιηθεί προηγουμένως. Ταυτόχρονα, το υψηλό επίπεδο του

φουρίνη

έκφραση σε NSCLC [5], [8] και άλλους τύπους καρκίνου [10], [16], [18] έχει αναφερθεί προηγουμένως.

Ο ρόλος των MMPs στην εξέλιξη του καρκίνου ως ρυθμιστές της μικροπεριβάλλον του όγκου επί του παρόντος λαμβάνει πολλή προσοχή (αναθεωρηθούν [42], [43]). Σε αυτή τη μελέτη αναλύσαμε έκφραση δύο ΜΜΡ γονιδίων διαφορετικών τύπων: и εκκρίνεται ΜΜΡ2 μεμβράνη αγκυρώνεται ΜΜΡ14. Αυτές οι πρωτεάσες είναι οι κύριοι MMPs εμπλέκονται σε καρκίνο εισβολή και πολλαπλασιασμό κυττάρου, αγγειογένεση όγκου και αγγειογένεσης, κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, καθώς και στην ανοσολογική επιτήρηση. Λαμβάνοντας αυτό υπόψη, η απουσία σημαντικών διαφορών μεταξύ των

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ14

επίπεδα έκφρασης στον όγκο και γειτονικούς ιστούς χωρίς ιστολογική παθολογία μπορεί να κοιτάξει εκπληκτικό. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό βρίσκεται σε συμφωνία με άφθονες αποδείξεις για υψηλά επίπεδα έκφρασης τους, τόσο στον καρκίνο και στρωματικά κύτταρα σε NSCLC [38], [39], [44] – [52]. Την ίδια στιγμή, η άμεση σύγκριση των

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ14

έκφρασης στον όγκο του καρκίνου εναντίον παρακείμενων φυσιολογικών ιστών αναφέρθηκε μόνο σε δύο εκδόσεις, και τα συμπεράσματά τους είναι σε αντίθεση. Ο πρώην, παρόμοια με τη μελέτη μας, παρατηρούνται σημαντικές διαφορές για καμία

ΜΜΡ2

ούτε

ΜΜΡ14

[46]. Η τελευταία δημοσίευση έδειξε μια αυξημένη έκφραση του

ΜΜΡ14

σε καρκίνο σε σχέση με δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα [39]. Το πιο πιθανό, αυτή η διαφορά οφείλεται σε διαφορετικούς τύπους δειγμάτων που αναλύθηκαν: πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (ΤΣΡ) επικράτησε στην πρώην μελέτη [46], καθώς και στην εργασία μας, ενώ περισσότερα αδενοκαρκινώματα (ΚΔΚ) αναλύθηκαν στην τελευταία έκθεση [39]

κατά την άποψή μας, το πιο σημαντικό αποτέλεσμα ελήφθη με σύγκριση των προτύπων των αλλαγών στην έκφραση των γονιδίων PC μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών. Cluster ανάλυση χωρίζεται μελετημένων δειγμάτων σε τέσσερις ομάδες (Σχήμα 2), τα οποία δεν συσχετίζονται με τις διαθέσιμες κλινικά χαρακτηριστικά των όγκων. Τρεις από αυτές τις ομάδες (C1, C2, C3 και) καλύπτουν το 80% των δειγμάτων. Κάθε ομάδα είναι μάλλον ομοιογενές και έχει ένα μόνο πλήκτρο γονίδιο:

φουρίνη

στο C1,

PCSK1

στο C2, και

PCSK6

στο C3. Συνήθως, το κλειδί γονιδιακή έκφραση είναι αυξημένη σε καρκίνο? αν και, μπορεί να είναι φυσική ή μειώθηκε ελαφρώς στο πλαίσιο της σημαντικής μείωσης των επιπέδων mRNA του άλλους υπολογιστές (Σχήμα 1). Μη ανιχνεύσιμο

PCSK6

έκφραση στα περισσότερα δείγματα είναι ένα επιπλέον χαρακτήρα του C1, ενώ C3 διαθέτει μη ανιχνεύσιμη έκφραση του

PCSK1

και /ή

φουρίνη

σε περισσότερα από τα μισά δείγματα. C4 είναι πιο ετερογενής. Τα δείγματα σε αυτή την ομάδα αλλαγές μερίδιο παρόμοια έκφραση του

PCSK5

,

PCSK7

,

PCSK9

, και

MBTPS1

καθώς και μη ανιχνεύσιμα mRNAs του

φουρίνη

και

PCSK1

στις περισσότερες περιπτώσεις. Έτσι, οι αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων PC στον καρκίνο του πνεύμονα έχουν περιορισμένο αριθμό σεναρίων, η οποία μπορεί να αντιστοιχεί σε προηγουμένως απαρατήρητα τύπους NSCLC.

Δείγματα αρίθμηση αντιστοιχεί με το Σχ. 1. Η αναλογία

Τ /Ν τιμές στον χάρτη ζέστη ήταν σειρά κανονικοποιημένη και παρουσιάζεται σε γραμμική κλίμακα. Gray κύτταρα δείχνουν δείγματα με μη ανιχνεύσιμο mRNA σε φυσιολογικά και καρκινικούς ιστούς. μήκος Branch αντικατοπτρίζει την απόσταση μεταξύ των κόμβων δενδρόγραμμα. Οι συστάδες βρίσκονται επισημαίνονται ως C1, C2, C3 και C4.

Η

Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι τα ένζυμα που κωδικοποιούνται από τα γονίδια-κλειδιά των ομάδων αποκάλυψε ανήκουν σε διαφορετικούς τύπους υπολογιστών [53]. Φουρίνη, PCSK1, και PCSK6 έχουν διαφορετικά είδη Ο-τερματικές επεκτάσεις. Αυτοί οι υπολογιστές έχουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης: PCSK1 εντοπίζεται σε νευρικά και ενδοκρινικά κύτταρα, PCSK6 συμβαίνει σε μεγάλο βαθμό, και φουρίνη είναι πανταχού παρούσα. Τέλος, εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα έκκρισης: PCSK1 ακολουθεί την οργανωμένη εκκριτικό μονοπάτι, ενώ φουρίνη και PCSK6 τα συστατικά που εκκρίνονται. Στο πλαίσιο αυτό, μπορεί κανείς να προτείνει διάφορα σενάρια μεταβολής στην έκφραση των γονιδίων PC προκαλέσουν διάφορες αλλαγές στο φάσμα των ενεργοποιημένων υποστρωμάτων.

Οι μέχρι σήμερα διαθέσιμες μπορούν να παρέχουν συμβουλές μόνο για την προέλευση των αποκάλυψε ομάδων δεδομένων . Για παράδειγμα, C2 με ενεργό

PCSK1

μπορεί να αντιστοιχεί σε NSCLCs με τα σημάδια της νευροενδοκρινείς διαφοροποίησης [54] – [65], η οποία μπορεί να δείξει την προέλευση αυτών των όγκων. Ο σχηματισμός του C1 (

φουρίνης

) και C3 (

PCSK6

) μπορεί να προκαλείται από τον παράγοντα μεταγραφής E2F1, η οποία ρυθμίζει προς τα πάνω ειδικώς

PCSK6

αλλά όχι

φουρίνης

ή

PCSK5

[66]. Ωστόσο, τα στοιχεία αυτά δεν παρέχουν καμία αξιόπιστη εξήγηση των μηχανισμών που διέπουν τις τυπικές σενάρια αλλαγών στη μεταγραφή των προσωπικών υπολογιστών στον καρκίνο του πνεύμονα. Ακόμα, τουλάχιστον δύο ριζικά διαφορετικές εκτιμήσεις μπορεί να προχωρήσει. Από τη μία πλευρά, τα παρατηρούμενα αποτελέσματα μπορούν να προκύψουν από τις διαφορές που υπήρχαν πριν από την κακοήθη μετασχηματισμό, π.χ., οι διαφορές μεταξύ των ατόμων γονότυπο ή διαφορές τύπου κυττάρου εντός ενός ατόμου. Από την άλλη πλευρά, μπορεί να οφείλεται σε μεταβολές οι προέκυψαν κατά τη διάρκεια του σχηματισμού του καρκίνου, ιδίως, οι τοπικές διαταραχές στην έκφραση μεμονωμένων γονιδίων PC ή ποικιλιών της παγκόσμιας απορρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Επιπλέον, οι παρατηρούμενες γεγονότα μπορούν να προκύψουν από την επίδραση διαφόρων παραγόντων ταυτόχρονα.

Συνολικά, η ανάλυση των προτύπων των αλλαγών στην έκφραση των γονιδίων PC σε άτομα μας επέτρεψε να αποκαλύψει διάφορους τύπους NSCLC και να αποδείξει ότι οι αλλαγές έκφρασης έχουν περιορισμένο αριθμό σεναρίων, η οποία μπορεί να αντανακλά διαφορετικές οδούς ανάπτυξης όγκου και κρυπτικά χαρακτηριστικά των όγκων. Η διαπίστωση αυτή δικαιολογεί περαιτέρω έρευνα, και επιτρέπει να εξετάσουν τα mRNAs των γονιδίων PC ως δυνητικά σημαντικό καρκινικών δεικτών.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Χαρακτηριστικά των δειγμάτων και δεδομένων γονιδιακής έκφρασης.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055752.s001

(XLS)

Ευχαριστίες

Σας ενημερώνουμε ότι καθ Evgeny Δ Sverdlov για την πολύτιμη συμβολή στη σύλληψη της μελέτης και για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου.