Αφηρημένο

Πρόσφατα ανέπτυξε μια μέθοδο για τη δημιουργία μυελοειδή κύτταρα με ικανότητα πολλαπλασιασμού από ανθρώπινα κύτταρα iPS. iPS-ML (iPS κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή /γραμμή μακροφάγων), που παράγεται από την εισαγωγή του πολλαπλασιασμού και αντι-γήρανση παράγοντες iPS κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή κύτταρα, αυξήθηκε συνεχώς κατά τρόπο Μ-CSF-εξαρτώμενη. Ένας μεγάλος αριθμός κυττάρων που εμφανίζουν μακροφάγων που μοιάζουν με ιδιότητες μπορούν να ληφθούν εύκολα με τη χρήση αυτής της τεχνολογίας. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την πιθανή εφαρμογή των iPS-ML στην αντικαρκινική θεραπεία. Έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο ενδοπεριτοναϊκή διαδίδονται γαστρικού καρκίνου με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση NUGC-4 ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα σε ποντίκια SCID. Όταν iPS-ML ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε ποντίκια με προκαθορισμένα περιτοναϊκή NUGC-4 όγκους, iPS-ML μαζικά συσσωρευμένη και διεισδύσει μέσα στους ιστούς του όγκου. iPS-ML που εκφράζουν ΙΡΝ-β (IPS-ML /IFN-β) ανέστειλε σημαντικά την ενδο-περιτοναϊκή ανάπτυξη του NUGC-4 καρκίνου. Επιπλέον, η IPS-ML /ΙΡΝ-β ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκίνου του παγκρέατος MIAPaCa-2 σε ένα παρόμοιο μοντέλο. iPS-ML είναι επομένως μια πολλά υποσχόμενη παράγοντας θεραπεία για ενδοπεριτοναϊκή διαδίδονται καρκίνους, για τις οποίες δεν τυπική θεραπεία είναι προς το παρόν διαθέσιμη

Παράθεση:. Koba C, Haruta M, Matsunaga Υ, Matsumura K, Haga Ε, Sasaki Υ, et al. (2013) Θεραπευτική επίδραση των Ανθρωπίνων iPS-Cell-Προέρχεται μυελοειδή κύτταρα που εκφράζουν IFN-β κατά περιτοναϊκώς Καρκίνου διαδίδονται Μοντέλα ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 8 (6): e67567. doi: 10.1371 /journal.pone.0067567

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 30η Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 21η Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Koba et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από αρ. 23650609 επιχορηγήσεις-in-Aid και 24300334 έως ΥΝ και 23659158 με δ.δ. από το MEXT, την Ιαπωνία? επιχορήγηση για Y.N. από την Princess Τακαμάτσου Καρκίνο Ταμείο Έρευνας? Έρευνα Grant να δ.δ. για δυσίατος Νοσημάτων του Υπουργείου Υγείας και Πρόνοιας, Ιαπωνία? και μια επιχορήγηση για να s.s. από την Επιστήμη και την Τεχνολογία Οργανισμός Ιαπωνία (JST). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα μακροφάγα παίζουν ουσιαστικό ρόλο για τη διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. Κατοικούν σε όλους τους ιστούς του σώματος και ασχολούνται με διάφορες λειτουργίες, όπως η εξάλειψη εισβολή παθογόνων, την αναδιαμόρφωση των ιστών, και την εκκαθάριση των νεκρών κυττάρων. Επιπλέον, διήθηση μακροφάγων παρατηρείται συχνά σε διάφορους καρκίνους [1]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι αυτά τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) προωθούν κυρίως την εξέλιξη του καρκίνου μέσω της επιτάχυνσης της τοπικής εισβολή και τη μετάσταση των καρκίνων [2]. Σε αντίθεση, άλλες μελέτες αποδεικνύουν ογκοκτόνο επίδραση των μακροφάγων [3], [4]. Με βάση τα αντικαρκινικά αποτελέσματα των μακροφάγων παρατηρήθηκε σε προ-κλινικές μελέτες, η εφαρμογή των μακροφάγων στη θεραπεία του καρκίνου έχει δοκιμάσει? για παράδειγμα, η μεταφορά των μακροφάγων προ-ενεργοποιημένα με IFN-γ δοκιμάστηκε ως πιθανός παράγοντας θεραπείας για τους ασθενείς με καρκίνο [5] – [9]. Ωστόσο, δεν υπάρχει σαφής θεραπευτικό όφελος κατά του καρκίνου έχει παρατηρηθεί μέχρι τώρα στο μακροφάγων θεραπεία.

Για να διαπιστωθεί η θεραπεία μακροφάγων ως μια πιο αποτελεσματική θεραπεία κατά του καρκίνου, τη βελτίωση της μεθόδου για την παροχή μακροφάγα είναι απαραίτητη. Στις κλινικές μελέτες, οι μακροφάγοι που χρησιμοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς παρήχθησαν από δότη μονοκύτταρα περιφερικού αίματος που απομονώθηκαν με λευκαφαίρεση. Ωστόσο, μονοκύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από το να μην μπορεί εύκολα να πολλαπλασιάζονται. Ο αριθμός των μακροφάγων που δημιουργούνται με τέτοιες μεθόδους, συνεπώς, περιορισμένη (το πολύ 10

9 έως 10

10), και μπορεί να είναι ανεπαρκής για την επίτευξη κλινικά αποτελέσματα. Αν επαρκείς αριθμούς (για παράδειγμα, περισσότερο από 10

10) των μακροφάγων με την ισχυρή ιδιότητα αντικαρκινικό μπορεί να χορηγηθεί κατ’επανάληψη, θα μπορούσαμε να συνειδητοποιήσουμε αποτελεσματική αντι-καρκινική θεραπεία με μακροφάγα.

πολυδύναμα βλαστοκύτταρα, όπως κύτταρα εμβρυϊκών βλαστικών (ES) ή κύτταρα πολυδύναμα αρχέγονα (iPS), μπορεί να μεταδοθεί επ ‘αόριστον και διαθέτουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διάφορους τύπους σωματικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του αίματος. Καταστροφή ενός ανθρώπινου εμβρύου είναι αναγκαίο να παραχθούν ανθρώπινα κύτταρα ES. κύτταρα iPS, από την άλλη πλευρά, μπορεί να παραχθεί εισάγοντας μια σειρά καθορισμένους παράγοντες σε σωματικά κύτταρα που προέρχονται από οποιονδήποτε δότη [10] – [13]. Έτσι, η τεχνολογία των κυττάρων iPS μπορούν να ξεπεράσουν ηθικά ζητήματα, καθώς και το ζήτημα ιστοσυμβατότητας μεταξύ των θεραπευτικών κυττάρων δότη και του λήπτη, καθώς και τη μελλοντική εφαρμογή των κυττάρων iPS σε κλινική ιατρική αναμένεται [14], [15].

Αρκετές ομάδες, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έχουν μέχρι στιγμής καθιερωμένες μεθόδους για την παραγωγή των μακροφάγων από ποντίκι ή ανθρώπινων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων [16] – [24]. Ωστόσο, τα κύτταρα ανθρώπινων πολυδύναμων stemα αποδώσει χαμηλότερο αριθμό των μακροφάγων από βλαστοκυττάρων πολυδύναμων ποντικού. Μέχρι στιγμής καθιερωμένες μεθόδους παράγουν ανθρώπινα αριθμούς μακροφάγων που είναι λιγότερο από 100 φορές τον αριθμό των μη διαφοροποιημένων κυττάρων iPS που χρησιμοποιούνται ως τα υλικά έναρξης? Επιπλέον, δημιουργώντας μακροφάγα με συμβατικές μεθόδους διαρκεί περισσότερο από ένα μήνα. Έτσι, οι συμβατικές μέθοδοι είναι πολύ επίπονη και δαπανηρή για να εφαρμοστεί σε πρακτική ιατρική.

Πρόσφατα, έχουμε δημιουργήσει μια μέθοδο για την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των μυελοειδών κυττάρων-κυττάρων που προέρχονται από iPS (IPS-MC) με φακοϊό-μεσολαβούμενη μεταγωγή των γονιδίων που μπορούν να προωθήσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή αναστέλλουν κυτταρική γήρανση, όπως cmyc συν BMI1, ΕΖΗ2 ή MDM2, να δημιουργήσει ένα iPS κυττάρων που προέρχεται από κυτταρική σειρά μυελοειδούς /μακροφάγων (iPS-ML) [25]. iPS-ML μπορούν να πολλαπλασιάζονται σε ένα τρόπο M-CSF-εξαρτώμενων για τουλάχιστον μερικούς μήνες ενώ διατηρεί την δυνατότητα να διαφοροποιούνται σε δενδριτικά κύτταρα (iPS-ML-DC) με έναν ισχυρό ικανότητα κυττάρων Τ-διέγερσης.

η τρέχουσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη δυνατότητα χρήσης iPS-ML ως κύτταρα τελεστές αντι-καρκίνου. Ερευνήσαμε αν ή όχι γενετικώς τροποποιημένο iPS-ML που εκφράζουν αντι-ΗΕΚ2 αντίσωμα ή ιντερφερόνη (IFN) θα μπορούσε να ασκήσει θεραπευτικό αποτέλεσμα έναντι περιτοναϊκά διαδίδονται γαστρικών και παγκρεατικών καρκίνων σε μοντέλα ξενομοσχεύματος.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και τα αντιδραστήρια

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το διοικητικό συμβούλιο επανεξέτασης δεοντολογίας της Κουμαμότο Πανεπιστήμιο Graduate School of Medical Sciences. Μια ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, NUGC-4, και ένα ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, MIAPaCa-2, δόθηκαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB, Osaka, Japan). Μέθοδοι για την παραγωγή, τη συντήρηση, και η γενετική τροποποίηση των ανθρώπινων κυττάρων iPS έχουν περιγραφεί προηγουμένως [21].

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα ακόλουθα mAbs συζευγμένα με FITC ή ΡΕ αγοράστηκαν από Βϋ Pharmingen (San Diego, CA), Beckman Coulter (Brea, CA), Miltenyi Biotec (Bergish-Gladbach, Γερμανία), Sigma (St. Louis, ΜΟ), ή eBioscience (San Diego, CA): αντι-CD45 (κλώνος HI30, IgG1 ποντικού), αντι-CD33 (WM53, IgG1 ποντικού), αντι-CD36 (FA6.152, IgG1 ποντικού), αντι-CD11b (ICRF44, IgG1 ποντικού), αντι-CD14 (61D3, IgG1 ποντικού), αντι-CD4 ( 11830, IgG2a ποντικού), αντι-CD97 (VIM3b, IgG1 ποντικού), αντι-CD13 (WM15, IgG1 ποντικού), αντι-CD87 (62,022, IgG1 ποντικού), αντι-CD115 (2-3A3-1B10, IgG2a αρουραίου), αντι-CD116 (4H1, IgG1 ποντικού), anti-TLR2 (Τ2.5, IgG1 ποντικού), anti-TLR4 (HTA125, IgG2a ποντικού), αντι-HER2 /neu (Neu 24.7, IgG1 ποντικού), και αντι-cmyc ( 9Ε10, IgG1 ποντικού). Ισότυπου-μάρτυρες, IgG2a ποντικού (G155-178) και IgG1 ποντικού (MOPC-21), χρησιμοποιήθηκαν. Τα δείγματα των κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιδραστήριο FcR-blocking (Miltenyi Biotec) για 10 λεπτά, χρωματίστηκαν με τα συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα mAbs για 30 λεπτά, και πλύθηκαν 3 φορές με PBS /FCS (2%). δείγματα κυττάρων βάφονται αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACScan (Becton Dickinson) κυτταρόμετρο ροής.

Zymosan δοκιμασία φαγοκυττάρωσης

εναιωρήματα κυττάρων σε DMEM /10% FCS προστέθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 48 φρεατίων (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μλ) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες για να επιτραπεί στα κύτταρα να προσκολληθούν στα πλακίδια. ΡΙΤΟ-επισημασμένο σωματίδια zymosan Α (Molecular Probes) προστέθηκαν στα φρεάτια (2 × 10

6 σωματίδια /φρεάτιο σε 200 μΙ). Μετά από επώαση για την αναφερόμενη περίοδο, τα κύτταρα μικροσκοπικά παρατηρήθηκαν (Axio Παρατηρητής Ζ1, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) και συλλέχθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη /EDTA για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACScan.

Κατασκευή φορέων έκφρασης

Ενα πλασμίδιο που περιέχει cDNA κλώνος για ένα θραύσμα μεταβλητής περιοχής μονής αλυσίδας (scFv) ειδικό για την ανθρώπινη HER2 /neu ήταν ένα δώρο του Lieberman (Addgene πλασμίδιο # 10794) [26]. Η αλληλουχία scFv συνδεόταν με PCR με νουκλεοτιδικές αλληλουχίες για μια ετικέτα cmyc (EQKLISEEDL) και ένα Ο-τερματικό θραύσμα του ποντικού ΡογΚΙ. Το θραύσμα DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη κλωνοποιήθηκε πρώτα σε pENTR-D-Τορο (Life Technologies) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα φορέα έκφρασης θηλαστικών pCAG-IRES-Puro, η οποία οδηγείται από τον υποκινητή CAG και περιλαμβάνει μια εσωτερική ριβοσωμική θέση εισόδου (IRES) -puromycin

Ν

ακετυλο-τρανσφεράσης κασέτα γονιδίου. cDNAs για ανθρώπινη IFN-α, ΙΡΝ-β, ΙΡΝ-γ, TNF-α, TRAIL, και FAS-συνδετήρα δόθηκαν από NITE Biological Resource Center (Kazusa, Ιαπωνία), Kazusa DNA Research Center (Kazusa, Japan), ή RIKEN BRC (Tsukuba, Ιαπωνία). Ένας φορέας λεντοϊού, CSII-EF, και κατασκευάσματα συσκευασίας παρήχθησαν από τους H. Miyoshi (RIKEN BRC) και οι συνεργάτες του [27]. Τα θραύσματα cDNA εισήχθησαν μέσα στο πλασμίδιο CSII-EF μαζί με IRES-φωσφοτρανσφεράση υγρομυκίνης να δημιουργήσει βραδέος κατασκευάσματα έκφρασης. Η ανασυνδυασμένη φακοϊού παρήχθη και καθαρίστηκε με μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [21].

Δημιουργία iPS-ML που εκφράζει scFv

Ένα πλασμίδιο φορέα (pCAG-IRES-Puro) που κωδικοποιεί αντι-HER2 scFv ήταν εισάγεται σε ανθρώπινα κύτταρα iPS με ηλεκτροδιάτρηση και επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας πουρομυκίνη (5 μg /mL). Σταθερά επιμολυσμένα κλώνοι απομονώθηκαν από μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [21]. Στη συνέχεια, οι κλώνοι των κυττάρων iPS που φέρουν το scFv κατασκεύασμα αντι-HER2 τοποθετήθηκαν σε καλλιέργεια διαφοροποίηση για να δημιουργήσει iPS-MC /αντι-HER2. Τα iPS-MC εκφράζουν scFv ειδικά για HER2 μετήχθησαν με φακοϊό φορείς για cmyc συν BMI1, ή cmyc συν ΕΖΗ2, για να δημιουργήσει iPS-ML. Η μέθοδος για τη δημιουργία και τη διατήρηση iPS-ML έχει αναφερθεί προηγουμένως [25].

Η γενετική τροποποίηση των iPS-ML /scFv να εκφράσουν πρόσθετους παράγοντες

iPS-ML μετήχθησαν με φακοϊό φορέα που κωδικοποιεί ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, ΙΡΝ-γ, TNF-α, FAS-συνδετήρα, ή TRAIL. Για την επιλογή κυττάρων που εκφράζουν σταθερά τα διαγονίδια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο που περιέχει υγρομυκίνη (0.5~2 mg /mL). Για να ποσοτικοποιηθεί η παραγωγή κυτοκινών διαγονιδίου που προέρχεται και FAS-συνδετήρα, καλλιεργήθηκαν τα επιμολυσμένα iPS-ML (1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μλ) σε πλάκες 96-φρεατίων επίπεδου πυθμένα καλλιέργειας για 24 ώρες, και η συγκέντρωση των κυτοκινών και FAS-συνδετήρα στο υπερκείμενο καλλιέργειας μετρήθηκε με τη χρήση κιτ ELISA που αγοράζονται από την Endogen ή R & amp? D Systems. έκφραση TRAIL εξετάστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Ανάλυση του καρκίνου ευαισθησίας των κυττάρων προς κυτοκίνες

NUGC-4 ή κύτταρα MIAPaCa-2 καλλιεργήθηκαν (4 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 1 mL) σε πλάκες καλλιέργειας 24 φρεατίων παρουσία ή απουσία 10 ng /mL ανασυνδυασμένης ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, ΙΡΝ-γ, ή ΤΝΡ-α για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ανακτήθηκαν και χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο Annexin-V (Biovision, Mountain View, CA) και αναλύθηκαν σε FACScan κυτταρόμετρο ροής. Λουσιφεράσης που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μλ) σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων (Β & amp? W Isoplate, Wallac) παρουσία 10 ng /mL ανασυνδυασμένης ΙΡΝ-α, ΙΡΝ -β, ΙΡΝ-γ, ή ΤΝΡ-α. Τρεις ημέρες αργότερα, λουσιφεράση διάλυμα υποστρώματος (SteadyLite Plus, Perkin-Elmer) προστέθηκε (50 μL /φρεάτιο), και η φωταύγεια μετρήθηκε σε αναγνώστη μικρο-πλάκας (TriStar, BertholdTech, Bad Wildbad, Germany).

Ανάλυση της δραστικότητας κατά του όγκου του iPS-ML

in vitro

Η

NUGC-4 κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) που εκφράζουν λουσιφεράση καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς iPS- ml (2,5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 96-φρεατίων επίπεδου πυθμένα καλλιέργειας (Β & amp? W Isoplate, Perkin-Elmer). Μετά από μια καλλιέργεια 3 ημερών, 50 μί /φρέαρ διαλύματος υποστρώματος λουσιφεράσης προστέθηκε, και η φωταύγεια μετρήθηκε σε αναγνώστη μικρο-πλάκας.

Ανάλυση iPS-ML διείσδυση σε ιστούς καρκίνου σε ποντίκια SCID

πειράματα ποντίκι εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστημίου ζώο Κουμαμότο. Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) εκφράζοντα NUGC-4 κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικών SCID. Μετά από 15 ημέρες, η IPS-ML σημάνθηκαν με ΡΚΗ26 (Sigma), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, και ήταν ενδοπεριτοναϊκώς (ε.π.) ένεση σε ποντικούς (3 χ 10

6 κύτταρα /ποντικό). Οι ποντικοί θανατώθηκαν την επόμενη ημέρα και υποβάλλεται σε ανάλυση φθορισμού για την ανίχνευση μακροσκοπικά τη θέση των NUGC-4 όγκους και iPS-ML σε Nightowl II (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany). NUGC-4 /GFP ανιχνεύθηκε με 475 nm διέγερση και 520 nm φίλτρα εκπομπής και ΡΚΗ26-επισημασμένο iPS-ML ανιχνεύθηκε με 550 nm διέγερση και 600 nm φίλτρα εκπομπής. Για τη μικροσκοπική εξέταση, ο καρκίνος ιστοί στο μείζον επίπλουν αφαιρέθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη /PBS, και ενσωματωμένα σε Tissue-ΤΕΚ ΟΟΤ-ένωσις (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan). Τομές ιστού πάχους 20 μm έγιναν σε κρυοστάτη και αναλύθηκαν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Axio Παρατηρητής Ζ1, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

Ανάλυση της δραστικότητας κατά του όγκου του iPS-ML

in vivo

Η

SCID ποντίκια ήταν ip ένεση με τα καρκινικά κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό). Την ημέρα 3 ή 4, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ανάλυση εικόνας φωταύγεια να εξετάσει εγκατάσταση του όγκου. Στη συνέχεια, οι ποντικοί με καθιερωμένους όγκους χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες θεραπείας και ελέγχου. Οι ποντικοί στην ομάδα θεραπείας ενέθηκαν με iPS-ml σύμφωνα με την υποδεικνυόμενη χρονοδιάγραμμα, και ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων παρακολουθήθηκε σε ποντικούς μέσω ανάλυσης απεικόνισης φωταύγειας. Το μέγεθος της αύξησης του καρκίνου προσδιορίστηκε από τη μεταβολή των συνολικών μετρήσεων φωταύγειας για κάθε ποντικό.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της ανθρώπινης iPS κυττάρων που προέρχονται από πολλαπλασιαζόμενα μυελοειδή κύτταρα

προηγουμένως καθιερώσει μια διαδικασία για τη δημιουργία μυελομονοκυτταρικού κύτταρα με πολλαπλασιαστικά ικανότητα (iPS-ML) από φακοϊό μεσολάβηση μεταγωγή του cmyc συν ΔΜΣ-1 σε ανθρώπινα μυελοειδή κύτταρα προερχόμενο από κύτταρα iPS (iPS-MC) [25]. iPS-ML μεγάλωσε ως επί το πλείστον σε εναιώρημα σε ένα τρόπο M-CSF-εξαρτώμενη. Εξέφρασαν αρκετές διαμορφωτές μακροφάγων, και ήταν ετερογενή στη μορφολογία και στην έκφραση μερικών από τα μόρια κυτταρικής επιφάνειας (Σχ. 1Α, Β).

A. Μια εικόνα αντίθεσης φάσης ζωντανής iPS-ML σε μια πλάκα καλλιέργειας (άνω) και μια εικόνα από iPS-ML βάφονται με May-Giemsa σε μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα (κατώτερο) δείχνονται. B. έκφρασης στην κυτταρική επιφάνεια των μακροφάγων μορίων δείκτη CD11b, CD14, CD4, CD13, CD33, CD36, CD87, CD97, CD115, CD116, TLR2, TLR4 και επί iPS-ML αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα προφίλ χρώση του ειδικού mAb (παχιές γραμμές) και ένα ισότυπο ελέγχου mAb (γκρίζα περιοχή) απεικονίζεται. Γ iPS-ML σε πλάκες καλλιέργειας προστέθηκαν με FITC-επισημασμένο σωματίδια zymosan. Φάση αντίθεσης (άνω) και φθορισμού (κατώτερο) εικόνων μετά από 90 λεπτά επώασης δείχνονται. D. Μετά από 40 λεπτά επώασης υπό την παρουσία ή απουσία zymosans, τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη /ΕϋΤΑ και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής. Τα ποσοστά των κυττάρων με την υψηλή ένταση φθορισμού υποδεικνύει την ενδοκυτταρική ζυμοσάν απεικονίζεται. E. Χρόνος βέβαια για φαγοκυττάρωση εμφανίζεται. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD των διπλών προσδιορισμών.

Η

Για να αναλυθεί η φαγοκυτταρική ικανότητα των iPS-ML, είμαστε μικροσκοπικά παρατηρήθηκε τον πολιτισμό iPS-ML μετά την προσθήκη FITC-επισημασμένα σωματίδια zymosan. Μετά από 90 λεπτά επώασης, τα σήματα φθορισμού ανιχνεύθηκαν στα περισσότερα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι το μεγαλύτερο μέρος της iPS-ML κατάποση σωματίδια zymosan (Εικ. 1 C). Περίπου το 60% του iPS-ML που περιέχονται zymosan σωματιδίων μετά από 40 λεπτά επώαση με FITC-επισημασμένο zymosan σωματίδια, όπως εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Σχ. 1D). Ένα χρόνο πορεία για φαγοκυττάρωση φαίνεται στο Σχήμα 1Ε.

αντικαρκινική δράση των iPS-ML εκφράζουν αντι-HER2 scFv

in vitro

Η

Ένα αντιγόνο σχετίζονται με τον καρκίνο, HER2 /neu, εκφράζεται από διάφορα είδη ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού και γαστρικών καρκίνων [28]. Αποφασίσαμε να εξετάσει την επίδραση κατά του καρκίνου του iPS-ML που εκφράζουν αντι-ΗΕΚ2 scFv έναντι ενός HER2 που εκφράζει γαστρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή, NUGC-4 (Εικ. 2Α). Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε iPS-ML σταθερώς εκφράζουν αντι-ΗΕΚ2 scFv (IPS-ML /αντι-ΗΕΚ2) (Σχ. 2Β). iPS-ML /αντι-ΗΕΚ2 δημιουργήθηκαν από Ips-MC που προέρχεται από ένα κλώνο κυττάρου iPS εισάγεται με έναν φορέα έκφρασης για την αντι-HER2 scFv με μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [21]. Εμείς σποραδικά εξέτασε και επιβεβαίωσε την έκφραση του scFv από iPS-ML /αντι-HER2.

Α. HER2 έκφρασης /neu για NUGC-4 ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα αναλύθηκε. Τα προφίλ χρώση αντι-HER2 mAb (παχιά γραμμή) και ένα αντίσωμα ελέγχου ταιριαστού ισότυπου (γκρίζα περιοχή) απεικονίζεται. B. έκφρασης στην κυτταρική επιφάνεια των αντι-HER2 scFv επί iPS-ML (IPS-ML /αντι-HER2) ανιχνεύθηκε με χρώση με ένα αντίσωμα αντι-cmyc-tag. Γ λουσιφεράσης που εκφράζουν NUGC-4 κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν μόνο του ή συν-καλλιεργήθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων με iPS-ML (1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο ) με ή χωρίς την έκφραση αντι-HER2 scFv. Ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων NUGC-4 μετρήθηκε με δραστικότητα λουσιφεράσης μετά από 3-ημερών καλλιέργεια. Τα δεδομένα αναφέρονται ως η μέση τιμή + SD των διπλών προσδιορισμών.

Η

Κατά την πρώτη μας αξιολόγησε την επίδραση των iPS-ML /αντι-HER2 κατά NUGC-4 κύτταρα

in vitro

. Firefly λουσιφεράσης εισαχθεί κύτταρα NUGC-4 συν-καλλιεργήθηκαν με iPS-ML, με ή χωρίς την έκφραση αντι-HER2 scFv. Παρατηρήσαμε ότι η IPS-ML ελαττωμένη ζωντανά κύτταρα NUGC-4, και ότι η έκφραση των αντι-HER2 scFv σε iPS-ML ενίσχυσε την ανασταλτική δράση έναντι της ανάπτυξης του NUGC-4 κύτταρα (Σχ. 2C).

Συσσώρευση και της διείσδυσης των ip ένεση iPS-ML σε ιστούς όγκων

Θα θέλαμε να αξιολογήσει κατά πόσον iPS-ML είχε μια θεραπευτική επίδραση στην ενδοπεριτοναϊκή διάδοση του καρκίνου. Διήθηση μακροφάγων παρατηρείται συχνά σε κλινικά δείγματα ιστού καρκίνου [1]. Εξετάσαμε κατά πόσο ή όχι ενδοπεριτοναϊκώς χορηγείται iPS-ML διεισδύσει σε καρκινικούς ιστούς προκαθορισμένα στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών.

Για το σκοπό αυτό, GFP που εκφράζουν NUGC-4 ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, που ιδρύθηκε από την περιτοναϊκή μεταστατική αλλοίωση ενός διάχυτου τύπου γαστρικό ασθενή με καρκίνο, εγχύθηκαν ίρ σε SCID ποντίκια. Μετά από 15 μέρες, iPS-ML επισημαίνονται με κόκκινη φθορίζουσα χρωστική ΡΚΗ26 ένεση. Εμείς ταυτόχρονα εγχέεται ενεργοποιητή ανασυνδυασμένου πλασμινογόνου ιστού (tPA) εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικών, αναμένοντας ότι tPA προώθησε την διείσδυση του iPS-ML σε ιστούς όγκων. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν για την επόμενη ημέρα, και τεμαχίζεται για να καθορίσει τη θέση του με ένεση iPS-ML με ανάλυση φθορισμού

Η μακροσκοπική ανάλυση φθορισμού ανίχνευση GFP (διέγερση /εκπομπής: 475/520 nm). Έδειξαν ότι NUGC-4 Οι όγκοι εντοπισμένη κυρίως στον μείζον επίπλουν (Εικ. 3Α). Εγχέεται iPS-ML ανιχνεύεται από ΡΚΗ26 φθορισμού (διέγερση /εκπομπής: 550/600 nm) επίσης εντοπίζονται κυρίως στο μείζον επίπλουν, αποδεικνύοντας ότι η IPS-ML συσσωρεύσει αποτελεσματικά μέσα στους ιστούς του όγκου. Μια τέτοια σαφής συσσώρευση iPS-ML στο μείζον επίπλουν δεν παρατηρήθηκε όταν iPS-ML εμβολιάστηκαν σε ποντίκια χωρίς εγκατεστημένων όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

A. GFP-κύτταρα που εκφράζουν NUGC-4 (5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικών SCID. Μετά από 15 μέρες, iPS-ML σημανθεί με φθορίζουσες ΡΚΗ26 ενέθηκαν ε.π. στα ποντίκια (3 χ 10

6 κύτταρα /ποντικό). Οι ποντικοί θανατώθηκαν την επόμενη ημέρα και υποβάλλεται σε ανάλυση απεικόνισης φθορισμού για τον προσδιορισμό της θέσης των όγκων NUGC-4-GFP (διέγερσης /εκπομπής: 475/520 nm) και ΡΚΗ26-iPS-ML (διέγερσης /εκπομπής: 550/600 nm ). B. ιστούς όγκου στο μείζον επίπλουν των ποντικών απομονώθηκαν, και 20-μm πάχους κατεψυγμένες τομές έγιναν. Οι τομές αναλύθηκαν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού, και ένα συγχωνευμένη εικόνα με πράσινο φθορισμό υποδεικνύοντας NUGC-4 κύτταρα /GFP και κόκκινο φθορισμό υποδεικνύοντας ΡΚΗ26-βάφονται iPS ML-δείχνεται. C, D Τομές ιστού έγιναν με μια παρόμοια διαδικασία όπως και για Β, εκτός του ότι tPA δεν χρησιμοποιήθηκε. Ένα υψηλότερο άποψη μεγέθυνση της περιοχής που περιβάλλεται από μια διακεκομμένη τετράγωνο σε C φαίνεται στο D.

Η

Στη συνέχεια απομονώνονται και μικροσκοπικά εξετάσθηκαν τους ιστούς του όγκου. Στην ενότητα ιστού που φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ΡΚΗ26-επισημασμένο iPS-ML διεισδύσει μέσα στη φωλιά του GFP που εκφράζουν NUGC-4 κύτταρα. Παρόμοια πειράματα έγιναν χωρίς ένεση tPA, και υψηλότερες ανάλυση μεγέθυνση των τμημάτων του ιστού δείχνει σαφώς τη διείσδυση του iPS-ML σε καρκινικό ιστό (Σχ. 3C, D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η IPS-ML διεισδύσει αποτελεσματικά μέσα στους ιστούς του καρκίνου, όταν ε.π. ένεση σε ποντικούς που φέρουν καρκίνους είναι εγκατεστημένοι στην περιτοναϊκή κοιλότητα.

αριθ αντικαρκινική δράση του iPS-ML που εκφράζουν αντι-ΗΕΚ2 scFv

in vivo

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα των iPS-ML /αντι-HER2 κατά NUGC-4

in vivo

. Λουσιφεράση κύτταρα που εκφράζουν NUGC-4 εμβολιάστηκαν στην περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικών SCID (5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό). Μετά από 3 ημέρες, ο καρκίνος των κυττάρων εμφύτευση στα ποντίκια εξετάστηκε με ανάλυση βιοφωταύγεια, και ποντίκια που φέρουν καρκινικά κύτταρα χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες θεραπείας ή ελέγχου. Από ημέρες 4 έως 8, οι ποντικοί ομάδα θεραπείας ενέθηκαν καθημερινά με iPS-ML /αντι-ΗΕΚ2 (2 × 10

7 κύτταρα /ποντικό). Την ημέρα 10, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ανάλυση βιοφωταύγεια πάλι για να εξετάσει την εξέλιξη του καρκίνου.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, NUGC-4 όγκοι στα ποντίκια που iPS-ML-αγωγή αυξήθηκαν με ταχύτερους ρυθμούς από ό, τι στην ποντίκια ελέγχου. Αυτοί μάλλον ενισχυμένη NUGC-4 ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε αυτό το

in vivo

μοντέλο, αν και στατιστικά μη σημαντική. Αυτό μπορεί να οφείλεται iPS-ML /αντι-HER2 επλήγησαν από το μικροπεριβάλλον του καρκίνου να αποκτήσει ένα φαινότυπο προ-καρκίνου.

Ευαισθησία της NUGC-4 κυττάρων σε κυτοκίνες και μόρια κυτταρικής σκοτώνοντας

για να κάνετε iPS-ML είναι σε θέση να ξεπεράσει το μικροπεριβάλλον του καρκίνου και να ασκήσουν αντικαρκινικές επιδράσεις

in vivo

, είμαστε αποφασισμένοι να την περαιτέρω τροποποίηση iPS-ML /αντι-HER2 να εκφράσουν επιπλέον μόρια. Οι κυτοκίνες, όπως IFNs, είναι γνωστό ότι επάγουν το θάνατο ή αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [29], [30]. Επιπλέον, αυτές οι κυτοκίνες είναι γνωστό ότι ενισχύουν την αντικαρκινική δράση των μακροφάγων [31] – [33].

Αναλύσαμε την ευαισθησία του NUGC-4 κυττάρων σε ανασυνδυασμένη ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, ΙΡΝ -γ, ή ΤΝΡ-α. Μετά από επώαση 24 ωρών υπό την παρουσία είτε από αυτούς τους παράγοντες (10 ng /mL), αναλύσαμε την απόπτωση με χρώση των κυττάρων με FITC-επισημασμένο αννεξίνης-ν. Παρατηρήσαμε ότι όλα τα ελεγμένα κυτοκίνες που προκαλείται από ορισμένα επίπεδα του NUGC-4 απόπτωση των κυττάρων (Σχ. S2A). Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα να μειωθεί ο αριθμός των ζώντων κυττάρων NUGC-4, λουσιφεράση-κύτταρα που εκφράζουν NUGC-4 καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες παρουσία αυτών των παραγόντων. Σε συμφωνία με τα δεδομένα αννεξίνης-ν-χρώση, όλα τα ελεγμένα κυτοκίνες μείωσε σημαντικά τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων NUGC-4 (Εικ. S2B). Σε αμφότερες τις δοκιμασίες, ΙΡΝ-β και ΙΡΝ-γ παρουσίασαν την πιο βαθιά επίδραση.

Δημιουργία iPS-ML /αντι-ΗΕΚ2 που εκφράζουν επιπλέον μόρια

δημιουργείται φακοϊό φορείς έκφρασης για τα IFNs και TNF-α, και να εισαχθούν σε iPS-ML /αντι-HER2. Επιπλέον, παρουσιάσαμε φακοϊού φορείς έκφρασης για «παράγοντες επαγωγής απόπτωσης», FAS-συνδετήρα ή TRAIL. Ήμασταν σε θέση να παράγει επιμολυσμένα iPS-ML που παράγονται κυτοκίνες σε περισσότερα από 3 ng /24 ώρες /10

6 κύτταρα, εκτός από την IFN-γ (Σχ. S3A). Θα μπορούσε να δημιουργήσει μορφομετατροπέα iPS-ML που παράγει μόνο ένα χαμηλό επίπεδο της ΙΡΝ-γ, πιθανώς λόγω της τοξικότητας των ΙΡΝ-γ στην IPS-ML. έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια του TRAIL στα επιμολυσμένα iPS-ML επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Εικ. S3b).

Είμαστε συν-καλλιεργήθηκαν τα iPS-ML /αντι-HER2 που εκφράζουν επιπλέον μόρια κατά του καρκίνου με λουσιφεράσης- εκφράζουν NUGC-4 κύτταρα και αναλύθηκαν ο αριθμός των ζωντανών NUGC-4 κύτταρα με βάση την δραστικότητα της λουσιφεράσης μετά από 3 ημέρες (Εικ. 4). iPS-ML /αντι-HER2 που εκφράζουν ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, ή TRAIL εμφάνισαν πιο έντονη επίδραση για τη μείωση NUGC-4 κύτταρα από iPS-ML /αντι-HER2, και εκείνοι που εκφράζουν ΙΡΝ-β ήταν η πιο ισχυρή. iPS-ML /αντι-HER2 που εκφράζουν ΙΡΝ-γ ή ΤΝΡ-α εμφάνισε μια επίδραση παρόμοια με iPS-ML /αντι-HER2. Η έλλειψη σημαντική ενίσχυση της αντι-NUGC-4 αποτέλεσμα με μεταγωγή ΙΡΝ-γ μπορεί να οφείλεται στο ότι η ποσότητα της ΙΡΝ-γ που παράγεται από την IPS-ML /αντι-HER2 /ΙΡΝ-γ ήταν χαμηλότερο από το επίπεδο για να ασκήσει αντι -cancer αποτέλεσμα. Σε αυτό το πείραμα, η αναγκαστική έκφραση FAS-συνδετήρα αποδυναμωθεί απροσδόκητα την αντι-NUGC-4 επίδραση των iPS-ML /αντι-HER2.

λουσιφεράσης που εκφράζουν NUGC-4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) με iPS-ML /αντι-HER2 που εκφράζουν ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, ΙΡΝ-γ, TNF-α, FAS-συνδετήρα, ή TRAIL (2.5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων NUGC-4 μετρήθηκε με ανάλυση φωταύγειας μετά από 3-ημερών καλλιέργεια. Τα δεδομένα αναφέρονται ως η μέση + SD προσδιορισμών εις τριπλούν.

Η

Θεραπευτική δράση του iPS-ML /IFN-β επί περιτοναϊκώς διαδίδονται NUGC-4 γαστρικών καρκινικών κυττάρων σε SCID ποντίκια

Με βάση τα αποτελέσματα του

in vitro

πειράματα, εξετάσαμε το

in vivo

αντι-NUGC-4 επίδραση των iPS-ML /αντι-ΗΕΚ2 που εκφράζουν είτε IFN-α, ΙΡΝ-β, ή TRAIL. Η θεραπεία με ούτε iPS-ML /αντι-HER2 /IFN-α ούτε iPS-ML /αντι-ΗΕΚ2 /TRAIL έδειξε σαφή ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vivo

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από την άλλη πλευρά, η IPS-ML που εκφράζουν ΙΡΝ-β παρουσίασε σημαντική επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου, όπως περιγράφεται παρακάτω.

Στα πειράματα που δείχνονται στο Σχήμα 5, η αύξηση του NUGC-4 όγκων παρακολουθήθηκε με βιοφωταύγεια ανάλυση κατά τις ημέρες 4, 10 και 17 μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων. Ποντικοί που φέρουν NUGC-4 όγκους την ημέρα 4 χωρίστηκαν σε ομάδα (ελέγχου) θεραπεία ή καθόλου θεραπεία. Ποντικοί από τις ομάδες θεραπείας ενέθηκαν ε.π. με iPS-ML /ΙΡΝ-β ή iPS-ML /αντι-HER2 /IFN-βfrom ημέρα 4 (2 χ 10

7 κύτταρα /ένεση /ποντικό, 3 ενέσεις ανά εβδομάδα). Το Σχήμα 5Α δείχνει τα δεδομένα εικόνας της ανάλυσης φωταύγειας των ποντικών. Η Εικόνα 5Β δείχνει την αναδίπλωση αλλαγή δραστηριότητας φωταύγειας από την ημέρα 4 των ομάδων ελέγχου και θεραπείας, αποδεικνύοντας ότι η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη με αγωγή με iPS-ML /ΙΡΝ-β ή iPS-ML /αντι-HER2 /IFN-β. iPS-ML /ΙΡΝ-β και iPS -ML /αντι-HER2 /ΙΡΝ-β ήταν ισοδυνάμως αποτελεσματικές, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση των αντι-HER2 είναι περιττή για αντικαρκινική δράση των iPS-ML που παράγουν IFN-β.

λουσιφεράσης-κύτταρα που εκφράζουν NUGC-4 εγχύθηκαν ίρ σε SCID ποντίκια (5 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι). Την ημέρα 4, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ανάλυση απεικόνισης φωταύγειας. Τα ποντίκια ενέθηκαν τις ημέρες 4, 6, 8, 11, 13, και 15 με iPS-ML /ΙΡΝ-β ή iPS-ML /ΙΡΝ-β /αντι-ΗΕΚ2 (2 × 10

7 κύτταρα /ποντικό για κάθε ένεση, η = 5 για κάθε ομάδα). Ως μάρτυρας, 8 ποντικοί αφέθηκαν χωρίς θεραπεία. Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ανάλυση βιοφωταύγεια τις ημέρες 10 και 17. Α Οι εικόνες φωταύγειας δείχνεται. B. Για κάθε ποντίκι, το σήμα φωταύγειας υπολογίστηκε ως σχετική αξία, όπου το φωτόνιο μετρά την ημέρα 4 ορίστηκε ως 1. Η μέση τιμή ± SD της πολλαπλής μεταβολής από την ημέρα 4 στις ομάδες ελέγχου και θεραπείας φαίνονται.

Σχήμα S4 δείχνει τα αποτελέσματα παρόμοιων πειραμάτων για να εξετάσει συγκριτικά τα αποτελέσματα των iPS-ML, η iPS-ML /ΙΡΝ-β, η iPS-ML /αντι-HER2, και ανασυνδυασμένη ΙΡΝ-β έναντι NUGC-4 καρκίνο

in vivo

. Σε συνεπής με τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 5, η αγωγή με iPS-ML /IFN-β κατέστειλε σημαντικά την εξέλιξη του καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, αμφότερα τα iPS-ML και iPS-ML /αντι-HER2 μάλλον προώθησε την ανάπτυξη του καρκίνου, αν και στατιστικά μη σημαντική. Ένεση 400 ng αλλά όχι 200 ​​ng /ποντικό /ένεση ανασυνδυασμένου ΙΡΝ-β για το ίδιο χρονοδιάγραμμα η ένεση iPS-ML παρουσίασε κάποια ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου, αν και το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντικό.

Συλλογικά , απλό iPS-ML δεν εμφανίζουν αντικαρκινική δράση

in vivo

. Η γενετική τροποποίηση για να παράγει ΙΡΝ-β που ανατίθενται σημαντική αντικαρκινική δράση στην IPS-ML. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση των αντι-HER2 scFv δεν είχε τέτοιο αποτέλεσμα.

Θεραπευτική δράση του iPS-ML /ΙΡΝ-β έναντι του καρκίνου του παγκρέατος σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος

Στη συνέχεια εξετάσαμε το επίδραση των iPS-ML θεραπεία /IFN-β από καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Η προσθήκη της ανασυνδυασμένης ΙΡΝ-β να MIAPaCa-2 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που προκαλείται από απόπτωση και μείωσε τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων σε

in vitro

πειράματα (Σχ. S5).

Εξετάσαμε την επίδραση της iPS-ML /IFN-β από κύτταρα MIAPaCa-2

in vivo

. Θα μπορούσε να δημιουργήσει μια περιτοναϊκή μοντέλο καρκίνου με ε.π. ένεση των κυττάρων MIAPaCa-2 που εκφράζουν λουσιφεράση σε ποντίκια SCID. Στα πειράματα που δείχνονται στο Σχήμα 6, 6 ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ένεση iPS-ML /ΙΡΝ-β 3 φορές την εβδομάδα για 2 εβδομάδες από την ημέρα 4? Τα αποτελέσματα από τα 8 ποντίκια ελέγχου χωρίς αγωγή παρουσιάζονται επίσης. Παρατηρήσαμε ότι η IPS-ML θεραπεία /ΙΡΝ-β ανέστειλε σημαντικά MIAPaCa-2 ανάπτυξης του όγκου συγκριτικά με τα ποντίκια ελέγχου. Η μείωση στη μέση φωταύγεια μετρούν από την ημέρα 10 έως την ημέρα 17 του ελέγχου (χωρίς θεραπεία) ομάδας θα πρέπει να οφείλεται στην αύξηση του ασκίτη που προκαλείται από τον καρκίνο, επειδή παρατηρήσαμε προοδευτική διεύρυνση της κοιλιάς στα ποντίκια της ομάδας αυτής. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 6 δείχνουν ότι η θεραπεία με iPS-ML /IFN-β είναι αποτελεσματικός έναντι του καρκίνου του παγκρέατος.

κύτταρα λουσιφεράσης που εκφράζουν MIAPaCa-2 εμβολιάστηκαν ί.ρ. σε ποντίκια SCID (5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό), και οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ανάλυση απεικόνισης φωταύγεια την ημέρα 3. Τα ποντίκια μεταμοσχευμένα με καρκινικά κύτταρα χωρίστηκαν τυχαία σε θεραπεία (n = 6) και ελέγχου (n = 8 ) ομάδες. Οι ποντικοί στην ομάδα θεραπείας ενέθηκαν με iPS-ML /IFN-β (2 × 10

7 κύτταρα /ποντικό για κάθε ένεση) τις ημέρες 4, 6, 8, 11, 13, και 15. Ολοι οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ανάλυση βιοφωταύγεια τις ημέρες 10 και 17. Οι εικόνες φωταύγειας φαίνονται στον A. για κάθε ποντικό, η αλλαγή του σήματος φωταύγειας ανά ποντικό υπολογίσθηκε σε σχετική τιμή, όταν η καταμέτρηση φωτόνιο την ημέρα 3 ορίστηκε ως 1. η μέση τιμή ± SD της πτυχής αλλαγή στις ομάδες ελέγχου και θεραπείας δείχνονται στο Β

η

Συζήτηση

διήθηση μακροφάγων παρατηρείται συχνά σε κλινικά δείγματα των στερεών καρκίνων, και αυτές οι μακροφάγα ονομάζονται ΤΑΜ. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η ε.π. εγχέεται iPS-ML αποτελεσματικά συσσωρευτεί και διεισδύσει σε προκαθορισμένα καρκινικούς ιστούς στην περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικών SCID (Εικ. 3).