Αφηρημένο

Η πλειοψηφία των νέων εγκρίσεων φαρμάκων για τον καρκίνο βασίζονται στις υπάρχουσες θεραπευτικούς στόχους. Μία προσέγγιση για την ταυτοποίηση νέων στόχων είναι να εκτελέσει υψηλής απόδοσης παρεμβολή RNA (RNAi) οθόνες κυτταρική βιωσιμότητα. Εμείς περιγράφουμε μία νέα προσέγγιση η οποία συνδυάζει RNAi διαλογή σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές με τη γονιδιακή έκφραση και γονιδιακό προφίλ για την ταυτοποίηση νέων στόχων καρκίνου. Πραγματοποιήσαμε παράλληλες οθόνες RNAi σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου για τον εντοπισμό γονιδίων τα οποία είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές αλλά όχι σε άλλα, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια αποτελούν βασικούς παράγοντες της κυτταρικής επιβίωσης σε συγκεκριμένα καρκινικά κύτταρα. Η προσέγγιση αυτή επιβεβαιώθηκε με την ταυτοποίηση του

PIK3CA

, αποσιώπηση της οποίας ήταν επιλεκτικά θανατηφόρος για την κυτταρική σειρά MCF7, που φιλοξενεί μια ενεργοποίηση ογκογόνο

PIK3CA

μετάλλαξη. Συνδυάσαμε λειτουργική προσέγγιση RNAi μας με γονιδιακή έκφραση και γονιδιωματική ανάλυση, που επιτρέπει την αναγνώριση αρκετών νέων κινασών, συμπεριλαμβανομένων των

WEE1

, τα οποία είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα μόνο σε κυτταρικές σειρές που έχουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης αυτής της κινάσης. Επιπλέον, εντοπίσαμε ένα υποσύνολο των όγκων του μαστού που πολύ εκφράζουν WEE1 γεγονός που υποδηλώνει ότι WEE1 θα μπορούσε να είναι ένα μυθιστόρημα θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του μαστού. Εν κατακλείδι, η στρατηγική αυτή αποτελεί μια νέα και αποτελεσματική στρατηγική για τον εντοπισμό των λειτουργικά σημαντικών θεραπευτικών στόχων στον καρκίνο

Παράθεση:. Iorns E, Λόρδος CJ, Γρηγοριάδης Α, McDonald S, Fenwick Κ, MacKay A, et al . (2009) Ολοκληρωμένη Λειτουργική, Gene Expression και Γονιδιωματική ανάλυση για την ταυτοποίηση των Πολεμά τον Καρκίνο. PLoS ONE 4 (4): e5120. doi: 10.1371 /journal.pone.0005120

Επιμέλεια: Toru Ouchi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 του Ιανουαρίου του 2009? Αποδεκτές: 6 Μάρ 2009? Δημοσιεύθηκε: 9 Απρίλη 2009

Copyright: © 2009 Iorns et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ευχαριστούμε Θεαματική τον Καρκίνο του μαστού και η Επιτροπή Παιδείας της Νέας Ζηλανδίας Τριτοβάθμια για τη χρηματοδότηση αυτής της μελέτης. Πρέπει επίσης να αναγνωρίσουμε NHS χρηματοδότηση του Κέντρου Ερευνών NIHR Βιοϊατρικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κεντρική στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο είναι η ταυτοποίηση των γονιδίων που είναι κρίσιμης σημασίας για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου αλλά τα οποία είναι σε μεγάλο βαθμό περιττές σε φυσιολογικά κύτταρα [1]. Συσχετίζοντας μοριακές αλλαγές με ογκογένεση έχει παράσχει μία διαδρομή στην ταυτοποίηση των πιθανών φαρμακευτικών στόχων και παρέχει τη λογική πίσω από τις προσπάθειες για τον χαρακτηρισμό γενετική παραλλαγή και γονιδιακή έκφραση σε όγκους. Ωστόσο, η συνακόλουθη φύση αυτών των δεδομένων σημαίνει ότι συχνά δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί αν οι παρατηρήσεις είναι αιτιολογικοί ή απλώς ένα αποτέλεσμα της κατάστασης της ασθένειας. [2]

παρεμβολή RNA (RNAi) είναι ένα φυσικό μηχανισμό ότι ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Σε κύτταρα θηλαστικών, μικρής παρεμβαλλόμενα RNA (siRNAs) διαμεσολαβούν την αποικοδόμηση των συμπληρωματικών αγγελιοφόρου RNA (mRNA) μεταγραφές σε μία αλληλουχία-εξαρτώμενο τρόπο [3]. Αυτή η αλληλουχία-εξειδίκευση της RNAi μπορεί να χρησιμοποιηθεί πειραματικά για να σιγήσει συγκεκριμένα γονίδια με την επιμόλυνση των siRNAs σε κύτταρα θηλαστικών. Η τεχνολογία αυτή έχει επεκταθεί σε RNAi βιβλιοθήκες περιλαμβάνει αντιδραστήρια τα οποία στοχεύουν σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων μετεγγραφής, επιτρέποντας τον ρόλο των πολλαπλών γονιδίων σε ένα κυτταρικό διαδικασία που πρέπει να αξιολογηθούν σε μια αμερόληπτη τρόπο [4], [5]. Οι οθόνες RNAi έχουν χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση γονιδίων σημαντικών για καρκινικά κύτταρα φαινοτύπους, συμπεριλαμβανομένης της βιωσιμότητας των κυττάρων [6], [7].

Έχουμε αποδείξει ότι οθόνες RNAi μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση γονιδίων που είναι διαφορικά απαιτούνται για την βιωσιμότητα του καρκίνου κυτταρικές σειρές και, ως απόδειξη της αρχής αυτής, τον προσδιορισμό του γνωστό ογκογονίδιο

PIK3CA

ως ουσιαστικής σημασίας για τη βιωσιμότητα σε κύτταρα MCF7 με την ενεργοποίηση

PIK3CA

μετάλλαξη. Δείχνουμε ότι ο συνδυασμός λειτουργική ανάλυση RNAi με τη γονιδιακή έκφραση και γονιδιωματική ανάλυση δίνει μια νέα στρατηγική για τον εντοπισμό των βασικών παραγόντων των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων, τα οποία είναι πιθανοί στόχοι νέου φαρμάκου.

Αποτελέσματα

Parallel RNAi οθόνες για να εντοπίσει κινάσες απαραίτητο για την κυτταρική βιωσιμότητα

για την αναγνώριση λειτουργικά σημαντικών γονιδίων που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση ελέγχου RNAi. Χρησιμοποιώντας ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και μια σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA) βιβλιοθήκη στοχεύει 779 κινάσες, πραγματοποιήσαμε πέντε παράλληλες οθόνες η βιωσιμότητά της χρησιμοποιώντας MCF7 (ER θετικός, του αυλού του καρκίνου του μαστού), CAL51 (ER αρνητικά, μικροδορυφόρων ασταθής καρκίνος του μαστού), Α549 (καρκίνος του πνεύμονα), NCI-H226 (καρκίνος του πνεύμονα) και HeLa (καρκίνος τραχήλου) κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1α και Πίνακας S1). Επιλέξαμε να στοχεύουν κινάσες όπως οι πρωτεΐνες αυτές είναι σχετικά επιδεκτικά φαρμακολογική αναστολή και έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντικό οι οδηγοί πολλών διαφορετικών καρκίνων. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με siRNA από τη βιβλιοθήκη. Εδώ χρησιμοποιήσαμε μια βιβλιοθήκη SMARTpool, όπου κάθε φρεάτιο της καλά πλάκα 96 περιείχε μια πισίνα τεσσάρων διαφορετικών siRNAs (α SMARTpool) στοχεύει ένα γονίδιο. Μετά από επτά ημέρες συνεχούς καλλιέργειας, η βιωσιμότητα των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο υπολογίστηκε με χρήση μιας δοκιμασίας φωταύγειας μέτρησης κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ. Για να συγκριθεί η απώλεια των αποτελεσμάτων βιωσιμότητας σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές, μπορούμε κανονικοποιημένα δεδομένα βιωσιμότητας κυττάρων από κάθε κυτταρική γραμμή προς το διάμεσο όλων των ανεπιθύμητων στην εν λόγω κυτταρική γραμμή, που αντιπροσωπεύουν κάθε επίδραση SMARTpool ως όρος Ζ [8], όπου το Ζ = 0 αντιπροσωπεύεται όχι επίδραση στη βιωσιμότητα και Ζ βαθμολογίες κάτω από -3 αντιπροσώπευαν σημαντική απώλεια των επιπτώσεων βιωσιμότητας. Τα αποτελέσματα από τις πέντε οθόνες κυτταρικής βιωσιμότητας προσέγγιση κανονικές κατανομές, επιτρέποντας τη σύγκριση των επιμέρους αποτελεσμάτων siRNA απέναντι κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1β).

α. διαγράμματα διασποράς των βαθμολογιών Ζ από τις οθόνες κυτταρικής βιωσιμότητας διεξάγεται παράλληλα σε MCF7, CAL51, HeLa, Α549 και καρκινικές κυτταρικές σειρές NCI-H226. Μαύρα διαμάντια – ατομική SMARTpools siRNA που στοχεύει 779 γονίδια κινάσης ανά κυτταρική σειρά. Ζ scores≤-3 αντιπροσωπεύουν σημαντική απώλεια των επιπτώσεων βιωσιμότητας. σι. οικόπεδα κατανομή των βαθμολογιών Ζ από τις παράλληλες οθόνες siRNA. Ζ scores≤-3 αντιπροσωπεύουν σημαντική απώλεια των επιπτώσεων βιωσιμότητας. ντο. Οι κινάσες μπορούν να ταξινομηθούν με βάση την επίδραση της αποσιώπησης στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε όλες τις πέντε κυτταρικές γραμμές καρκίνου. siRNAs που δεν είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν πιθανό στόχο ασήμαντους κινάσες (ή το siRNA δεν ήταν λειτουργική). siRNAs που προκαλούν σημαντική απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν πιθανό κινάσες στόχος που είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα στους περισσότερους τύπους όγκων ή εκείνα που είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. siRNAs που προκαλούν μόνο σημαντική θνησιμότητα σε μερικές αλλά όχι σε όλες τις κυτταρικές σειρές που ενδέχεται κινάσες στόχο που μπορεί να μην είναι κρίσιμη για τη βιωσιμότητα όλων των κυττάρων, αλλά αντιπροσωπεύουν όγκου-ειδικά εφέ. ρε. Παράλληλες οθόνες RNAi προσδιορίσει ένα γνωστό ογκογονίδιο,

PIK3CA

. επιδράσεις Κυτταρική βιωσιμότητα του

PIK3CA

στόχευση παρουσιάζονται σε πέντε κυτταρικές σειρές. κύτταρα MCF7 ήταν επιλεκτικά ευαίσθητοι σε στόχευση των

PIK3CA

όπως αποδεικνύεται από βαθμολογία Z του ≤-3. siRNAs που προκαλούν σημαντική θνησιμότητα σε μερικές αλλά όχι σε όλες τις κυτταρικές σειρές είναι πιθανό να στοχεύουν κινάσες που δεν είναι κρίσιμα για τη βιωσιμότητα όλων των κυττάρων, αλλά αντιπροσωπεύουν όγκου-ειδικά εφέ. Σε ορισμένες περιπτώσεις, αυτό μπορεί να εξηγηθεί από την επέλευση ενός ενεργοποιημένου ογκογονιδίου όπως συμβαίνει με τα κύτταρα MCF7, τα οποία φιλοξενούν ένα ενεργοποίησης

PIK3CA

μετάλλαξη.

Η

Εμείς αιτιολογημένη ότι τα siRNA προκαλώντας σημαντικές απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας (Z≤-3) σε όλες τις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν πιθανό αντιπροσωπεύεται κινάσες που είναι απαραίτητες για την βιωσιμότητα στα περισσότερα είδη όγκων ή πιο πιθανό απαραίτητη για τη βιωσιμότητα τόσο των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Ομοίως, siRNAs που δεν είχαν σημαντική επίδραση επί της βιωσιμότητας σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές γραμμές ήταν είτε δεν είναι λειτουργικό ή που στοχεύουν μη ουσιώδη κινασών. Τέλος, η υπόθεση ότι τα siRNA που προκάλεσαν μόνο σημαντικές φονικότητα σε ορισμένες, αλλά όχι όλες τις κυτταρικές σειρές, τα οποία προσδιορίζονται κινάσες που αντιπροσωπεύουν όγκου-ειδικά εφέ δυνητικώς προσδιορισμό νέων θεραπευτικών στόχων (Σχήμα 1γ). Για να προσδιοριστεί η φύση του αποτελέσματος, τα siRNA ταξινομήθηκαν από τη σύγκριση των βαθμολογιών Ζ μεταξύ των κυτταρικών σειρών (Πίνακας 1).

Η

Αναγνώριση

PIK3CA

παρέχει απόδειξη της αρχής για την προσέγγιση

η αρχική μας ανάλυση έδειξε ότι

PIK3CA

αποσιώπηση ήταν πιθανό να αντιπροσωπεύουν μια κυτταρική σειρά συγκεκριμένο αποτέλεσμα. Αποσιώπηση του

PIK3CA

ήταν επιλεκτικά θανατηφόρος για τα κύτταρα MCF7 (βαθμολογία Ζ του -3,80), αλλά όχι HeLa, CAL51, Α549 ούτε H226 (Σχήμα 1δ και Πίνακας 1). Τα κύτταρα MCF7 γνωστό ότι φιλοξενούν μια ενεργοποίησης

PIK3CA

μετάλλαξη (E545K) πάνω στην οποία αυτά τα κύτταρα εξαρτώνται για την επιβίωση [9], [10]. Επιπλέον, πολλαπλασιασμοί και κέρδος-of-λειτουργία μεταλλάξεων του

PIK3CA

έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο των ωοθηκών [11], τον καρκίνο του τραχήλου [12] και του καρκίνου του μαστού [10]. Η εξάρτηση των κυττάρων MCF7 κατά ένα

PIK3CA

ενεργοποίηση μετάλλαξη, μπορεί να είναι ένα ογκογονίδιο αποτέλεσμα εθισμού που μπορούν να αξιοποιηθούν θεραπευτικά [13]. Σε περιπτώσεις γονιδιακής εξάρτησης, τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται φυσιολογικά από τη συνέχιση της λειτουργίας των ενεργοποιημένων ή υπερεκφράζεται ογκογονίδια τα οποία είναι, ως εκ τούτου προφανής υποψήφιος θεραπευτικούς στόχους. Για παράδειγμα, η αποτελεσματικότητα του imatinib (Gleevec) στη θεραπεία της λευχαιμίας που φέρει την σύντηξη BCR-ABL [14] προβλέπει ένα κλινικό παράδειγμα ογκογονιδίου εθισμού και πώς μπορεί να αξιοποιηθεί για θεραπευτικούς σκοπούς. Η ταυτοποίηση των

PIK3CA

επικυρωθεί η προσέγγισή μας για τον εντοπισμό κινάσες που είναι απαραίτητες για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου.

Συσχέτιση της βιωσιμότητας των κυττάρων με την έκφραση του γονιδίου

Αν και κυτταρο-ειδικές επιδράσεις γονίδιο που ταυτοποιείται στην οθόνη RNAi μπορεί να είναι λόγω της ενεργοποίησης μεταλλάξεων, όπως σε

PIK3CA

, είναι πιθανό ότι οι άλλοι θα μπορούσαν να ανακύψουν λόγω της απόκτησης από το αυξημένο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Για να διερευνήσουν αυτό, πραγματοποιήσαμε γονιδίωμα-ευρεία προφίλ γονιδιακής έκφρασης στον πίνακα κυτταρική γραμμή με χρήση ανθρώπινων-6 v2 Illumina BeadChips [15] και σύγκριση αυτή με τα στοιχεία της οθόνης RNAi (Πίνακας S2). Έκφραση προφίλ διεξήχθη εις τριπλούν και κινασών με σημαντικές διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ των κυτταρικών σειρών που προσδιορίζονται από την ανάλυση της διακύμανσης. Για τα γονίδια όπου τουλάχιστον ένα siRNA μειώθηκε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Πίνακας 1), εξετάσαμε την συσχέτιση μεταξύ της κυτταρικής βιωσιμότητας εξής siRNA επιμόλυνση και έκφραση του γονιδίου. Η ανάλυση αυτή εντοπίζονται τέσσερα γονίδια όπου η κυτταρική βιωσιμότητα αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του γονιδίου?

ADCK2

,

NAGK

,

TLR6

και

WEE1

(Σχήμα 2 και Πίνακας 1). Κάθε μία από αυτές τις συσχετίσεις πρότεινε ότι αυξημένη έκφραση του εν λόγω γονιδίου μπορεί να είναι απαραίτητη για την επιβίωση του όγκου και μπορεί επομένως να αντιπροσωπεύουν μια νέα θεραπευτικό στόχο.

α-d. Ζ βαθμολογίες από τις οθόνες siRNA, Ζ scores≤-3 τονίζονται με κόκκινο διακεκομμένη κουτί. e-h. Ομαλοποιημένη επίπεδα έκφρασης υπολογίζονται από Illumina προφίλ έκφρασης. Υψηλή έκφραση συσχετίζεται με την ευαισθησία στην siRNA, επισημαίνεται με μια κόκκινη διακεκομμένη κουτί. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Η σημασία των διαφορών στην έκφραση γονιδίων μεταξύ των κυτταρικών σειρών αξιολογήθηκε με μονόδρομη ANOVA και ρ τιμή που εμφανίζεται για κάθε κυτταρικές γραμμές. i-l. σύγκριση των τιμών Ζ με κανονικοποιημένη επίπεδα έκφρασης. Η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει το Ζ = -3 όριο για σημαντική απώλεια των αποτελεσμάτων βιωσιμότητας (ρ & lt? 0,0015). Για δείξει τα τέσσερα γονίδια, ένα ανυψωμένο επίπεδο έκφρασης είναι σύμφωνο με απώλεια βιωσιμότητας μετά siRNA διαμόλυνση. Βλέπε Πίνακα 1 για Pearson συσχέτιση του Z vs έκφρασης.

Η

Η Toll-όπως υποδοχέα 6, (TLR6) είναι γνωστό για την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα κάππα σηματοδότησης-Β, έναν υποψήφιο θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο [16] , και η ενεργοποίηση της οδού TLR πρόσφατα έχει προταθεί να έχει ένα ρόλο στην ογκογένεση [17]. Η λειτουργία του

ADCK2

(aarF πεδίο περιέχει κινάση 2) ​​είναι λιγότερο καλά εδραιωμένη. NAGK (Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη κινάση) μετατρέπει ενδογενούς Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc), ένα σημαντικό συστατικό των σύνθετων υδατανθράκων, από αποικοδόμηση λυσοσωμική ή θρεπτικές πηγές σε ΟΙοΝΑο 6-φωσφορικό άλας, ως μέρος μιας καταλυτικής οδού διάσωσης. Η λειτουργία του WEE1 συζητείται παρακάτω.

Συσχέτιση της γονιδιακής έκφρασης με γονιδιωματική ανάλυση

Εξετάσαμε αν η σχετικά αυξημένη έκφραση των τεσσάρων γονιδίων που προσδιορίζονται στην οθόνη RNAi μας θα μπορούσε να εξηγηθεί από τις αλλαγές στη γονιδιακή αντίγραφο αριθμό (δηλαδή κέρδη αριθμού αντιγράφων και /ή ενίσχυση του γονιδίου). αριθμός αντιγράφων του γονιδίου εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική γενωμική υβριδισμού ανάλυση που βασίζεται σε μικροδιάταξη (aCGH) και επιστρώθηκαν επί RNAi και των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 3, Σχήμα S1 και Πίνακας S3). Αυτή η συνδυασμένη ανάλυση αποκάλυψε ότι για ορισμένες κυτταρικές σειρές, αυξημένη έκφραση του

ADCK2

,

NAGK

ή

WEE1

συσχετίστηκε με μία αύξηση στον αριθμό αντιγράφων του γονιδίου, πιθανώς την αναγνώριση ενός αιτία από αυξημένα έκφρασης. κύτταρα MCF7 ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε

ADCK2

siRNA και αυτό αντικατοπτρίζεται άνω ρύθμιση της μεταγραφής και την αύξηση του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου σε

ADCK2

. Ομοίως, η αύξηση του αριθμού αντιγράφων γονιδίου ήταν σύμφωνο με αυξημένη έκφραση και την ευαισθησία siRNA για

NAGK

σε κύτταρα Α549. Τέλος, η ευαισθησία των κυττάρων HeLa σε

WEE1

siRNA ήταν σύμφωνο με προς τα πάνω ρύθμιση αυτού του γονιδίου και γονιδιωματικών κέρδους (Σχήμα 3 και Σχήμα S1).

οικόπεδα Scatter που απεικονίζει τη σχέση μεταξύ του αριθμού αντιγράφων γονιδίου και γονιδιακή έκφραση. Κάθετες διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν το όριο για αντιγραφή κέρδη αριθμό (αναλογίες AWS & gt? 0,12).

Η

Περαιτέρω χαρακτηρισμός της WEE1

WEE1 έχει ένα καλά καθορισμένο ρόλο στον έλεγχο του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, με WEE1 δραστηριότητα τον περιορισμό των προ-μιτωτική επιπτώσεις της CDC2 (aka CDK1) [18]. Κατά συνέπεια, η απώλεια της δραστικότητας κινάσης WEE1 και η καταστροφή του είναι μια απαίτηση για την είσοδο στη μίτωση [19], υποδηλώνοντας ότι η δραστικότητα WEE1 μπορεί να περιορίσει πράγματι την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Δεδομένου ότι τα δεδομένα RNAi μας πρότεινε ότι WEE1 είναι, σε ορισμένα πλαίσια, κρίσιμη για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν, διερευνήσαμε το ρόλο αυτής της κινάσης περαιτέρω. Επιβεβαιώσαμε καταρχάς ότι WEE1 πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε κύτταρα HeLa και CAL51 υποστήριξη ανάλυσης RNA μας (Σχήμα 4α). Για να επιβεβαιώσετε τη συσχέτιση της ευαισθησίας σε siRNA και την έκφραση WEE1, WEE1 σίγησε από μια ανεξάρτητη ομάδα των siRNAs σχεδιαστεί για να μειώσει εκτός στόχου αποτελέσματα (Wee1 ONTARGETplus). κυτταρικές σειρές CAL51 και HeLa ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα στην αποσιώπηση του WEE1 από κυτταρικές σειρές που δεν υπερεκφράζουν WEE1 (Σχήμα 4β και σχήμα S2). Μικρά μόρια έχουν αναπτυχθεί για να αναστέλλουν WEE1 με βάση το ότι η αναστολή αυτής της κινάσης μπορεί να οδηγήσει σε κατάργηση της G

2 /M σημείο ελέγχου. Πολλά καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν ένα ελαττωματικό G

1 σημείο ελέγχου με αποτέλεσμα την εξάρτηση από την G

2 /M σημείο ελέγχου κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του κυττάρου και, ως εκ τούτου, η αναστολή της G

2 /M σημείο ελέγχου μπορεί να είναι θανατηφόρος σε αυτό πλαίσιο [20]. Χρησιμοποιήσαμε ένα μικρό μόριο αναστολέα WEE1 (PHCD [21]) για να επιβεβαιώσει την επιλεκτική ευαισθησία των κυτταρικών σειρών CAL51 και HeLa στην αναστολή WEE1 (Σχήμα 4γ). Εξετάσαμε επίσης πρόσθετες κυτταρικές σειρές για την έκφραση WEE1 και ευαισθησία σε WEE1 στόχευση, με καρκινώματος προστάτη PC3 γραμμές και DU145, και το μη ογκογόνο κυτταρική σειρά επιθηλιακών μαστού ΜΟΡ10Α. Καμία από αυτές τις κυτταρικές σειρές εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του WEE1 (Σχήμα 4α), και, όπως ήταν αναμενόμενο, καμία δεν ήταν ευαίσθητη σε WEE1 στόχευσης (Σχήμα 4β και 4γ).

α. Ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης που παρασκευάζονται από HeLa, CAL51, MCF7, Α549, ΝΟΙ-Η226, PC3, DU145 και τα κύτταρα ΜΟΡ10Α. Ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει WEE1 χρησιμοποιήθηκε με β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. έκφραση WEE1 αυξάνεται σημαντικά σε κύτταρα HeLa και CAL51 σύγκριση με MCF7, Α549, ΝΟΙ-Η226, PC3, DU145 και ΜΟΡ10Α κύτταρα. σι. Αριστερό πλαίσιο: Δοκιμασία Η βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα επιμολυσμένα με WEE1 ONTARGETplus SMARTpool, ή ONTARGETplus siControl. WEE1 αποσιώπηση ήταν επιλεκτικά θανατηφόρα για WEE1 υπερεκφράζουν κύτταρα HeLa και CAL51. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM από τριπλές επιμολύνσεις. Δεξιό πλαίσιο: ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης παρασκευάστηκαν από κύτταρα επιμολυσμένα με CAL51 WEE1 ONTARGETplus SMARTpool ή ONTARGETplus siControl. Ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει WEE1 χρησιμοποιήθηκε με β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. WEE1 ONTARGETplus SMARTpool μείωσε σημαντικά την έκφραση πρωτεΐνης σε σύγκριση με WEE1 siControl επιμολυσμένων κυττάρων. ντο. δοκιμασία βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα που κατεργάζονται με αναστολέα WEE1. αναστολή WEE1 ήταν επιλεκτικά θανατηφόρα για WEE1 υπερεκφράζουν κύτταρα HeLa και CAL51. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM από τριπλές θεραπείες κύτταρο. ρε. Αριστερό πλαίσιο: ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης παρασκευάστηκαν από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολέα WEE1 5 μΜ για 0, 6, 24 και 48 ώρες. Ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει PARP χρησιμοποιήθηκε με β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Μετά από 24 ώρες WEE1 επαγόμενη αναστολή διάσπασης PARP (Clvd PARP) σε WEE1 υπερεκφράζουν κύτταρα HeLa και CAL51 αλλά δεν προκάλεσε διάσπαση PARP σε MCF7 και NCI-H226 κύτταρα τα οποία εκφράζουν WEE1 σε φυσιολογικά επίπεδα. Δεξιό πλαίσιο χέρι: Κασπάση 3,7 δραστηριότητα σε κύτταρα κατεργασμένα με αναστολέα WEE1 5 μΜ για 24 ώρες. αναστολή WEE1 επαγόμενη κασπάσης 3,7 ενεργοποίηση σε WEE1 υπερεκφράζουν κύτταρα HeLa και CAL51 αλλά δεν προκάλεσε κασπάσης 3,7 ενεργοποίηση σε MCF7 και NCI-H226 κύτταρα τα οποία εκφράζουν WEE1 σε φυσιολογικά επίπεδα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM από τριπλές θεραπείες κύτταρο. μι. Αριστερό πλαίσιο: ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης παρασκευάστηκαν από κύτταρα επιμολυσμένα με WEE1 ONTARGETplus SMARTpool ή ONTARGETplus siControl. Ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει PARP χρησιμοποιήθηκε με β-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Αποσιώπηση του WEE1 επαγόμενη διάσπαση PARP σε WEE1 υπερεκφράζουν κύτταρα HeLa και CAL51 αλλά δεν προκάλεσε διάσπαση PARP σε MCF7 και NCI-H226 κύτταρα τα οποία εκφράζουν WEE1 σε φυσιολογικά επίπεδα. Δεξιό πίνακα: κασπάσης 3,7 δραστηριότητα σε κύτταρα επιμολυσμένα με WEE1 ONTARGETplus SMARTpool ή ONTARGETplus siControl. Αποσιώπηση του WEE1 επαγόμενης κασπάσης 3,7 ενεργοποίηση σε WEE1 υπερεκφράζουν κύτταρα HeLa και CAL51 αλλά δεν προκάλεσε κασπάσης 3,7 ενεργοποίηση σε MCF7 και NCI-H226 κύτταρα τα οποία εκφράζουν WEE1 σε φυσιολογικά επίπεδα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SEM από τριπλές επιμολύνσεις.

Η

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας παρέχουν στοιχεία που να δείχνουν ότι οι κυτταρικές σειρές που εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης WEE1 είναι ευαίσθητοι στην αναστολή WEE1. Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός της ευαισθησίας σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, εξετάσαμε τα επίπεδα απόπτωσης μετά την αναστολή WEE1. Χημική αναστολή της WEE1 προκάλεσε απόπτωση μόνο σε κυτταρικές σειρές με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης WEE1 (Σχήμα 4δ), μια παρατήρηση επιβεβαιώθηκε επίσης από την χρήση του WEE1 siRNA (Σχήμα 4Ε).

κλινική σημασία WEE1

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι WEE1 υπερέκφραση μπορεί να είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, ανακρίθηκε την έκφραση της WEE1 σε διαθέσιμες στο κοινό σύνολα δεδομένων περιγράφεται λεπτομερώς το προφίλ έκφρασης των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού και όγκους [22], [23]. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση WEE1 συσχετίζεται με

WEE1

αριθμού αντιγράφων γονιδίου (Spearman p = 0,039) και δείχνει μια τάση (t test ρ = 0,06, Mann-Whitney test ρ = 0,07) για υψηλότερη έκφραση σε κυτταρικές σειρές με ένα φαινότυπο αυλού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση τα δεδομένα αυτά, εξετάσαμε WEE1 έκφρασης με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Έκφραση WEE1 αξιολογείται από IHC σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη σφαιρίδια κυτταρική γραμμή συσχετίζεται με την έκφραση μετράται με κηλίδωση Western, παρέχοντας απόδειξη της ειδικότητας του αντισώματος WEE1 (Σχήμα 5α). Στη συνέχεια εξετάστηκε ένα καλά σχολιασμένα σειρά των όγκων του μαστού [24], [25] και βρέθηκε ότι το 35% παρουσίασαν επίπεδα έκφρασης WEE1 παρόμοια με εκείνα των κυττάρων CAL51, τα οποία είναι ευαίσθητα σε αναστολή WEE1 (Σχήμα 5β). Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης WEE1 ήταν κατά προτίμηση βρίσκονται σε καρκίνους του μαστού με φαινότυπο του αυλού, όπως ορίζεται από Nielsen et al. [26], σύμφωνα με την ανάλυση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού. Στο πλαίσιο της προηγούμενης δεδομένα μας εμπλέκουν WEE1 ως στόχος καρκίνου, αυτές οι ανοσοϊστοχημικές δεδομένα υποδεικνύουν ότι η χρήση των αναστολέων WEE1 μπορεί να είναι κατάλληλη σε ένα σημαντικό υποσύνολο των ασθενών με καρκίνο του μαστού.

α. WEE1 ανοσοϊστοχημική χρώση σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και καρκίνου του μαστού επεμβατικές. Σημειώστε τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης WEE1 σε H226 κύτταρα και ένα βασικό-όπως ο καρκίνος του μαστού και τα υψηλά επίπεδα έκφρασης σε κύτταρα WEE1 CAL51 και του αυλού και καρκίνων του μαστού HER2. (Χρώση Harris Αιματοξυλίνη /DAB? Αρχική μεγέθυνση χ 200). σι. Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης WEE1 προτίμηση εκφράζεται σε καρκίνους του μαστού αυλού. Περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με το σύστημα βαθμολόγησης Allred [36], όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Για κάθε όγκο πληκτρολογήστε το ποσοστό των όγκων με έκφραση υψηλού WEE1 δείχνεται. Υψηλή έκφραση WEE1 έδειξε στατιστικά σημαντική άμεση συσχέτιση με την έκφραση των υποδοχέων οιστρογόνων και προγεστερόνης και κυκλίνη D1, και μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση με το μέγεθος του όγκου, η ιστολογική βαθμός και η έκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), κυτοκερατίνης (Ck) 14, Ck 5 /6, Ck 17, MIB-1 δείκτη επισήμανσης και caveolins 1 και 2. Δεν συσχετίσεις μεταξύ WEE1 ανοσοϊστοχημική έκφραση και την παρουσία του λεμφο-αγγειακή εισβολή, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, η έκφραση του HER2 ή ενίσχυση γονιδίου, η έκφραση p53, και

CCND1

και

MYC

ενίσχυση γονιδίου βρέθηκε [24], [37] (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλες οι περιπτώσεις ταξινομήθηκαν σε αυλού, HER2 και βασικού μοιάζει ομάδες ανάλογα με την ανοσοϊστοχημική πίνακα περιγράφεται από Nielsen et al. [26].

Η

Συζήτηση

Η πλειοψηφία των νέων εγκρίσεων φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου βασίζονται στις υπάρχουσες στόχους. Αντί αντικατοπτρίζει την απουσία των στόχων, αυτό είναι ίσως ενδεικτικό του κόστους και του χρόνου που απαιτείται για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Παράλληλες διαλογή RNAi μπορεί να επιτρέψει μια απλή, υψηλής απόδοσης, προσέγγιση στη λειτουργική ταυτοποίηση των στόχων, και άλλοι έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί σε παράλληλη διαλογή RNAi για τον εντοπισμό πιθανών οδηγούς ογκογένεσης και υποψήφιων στόχων [27]. ταυτοποίηση μας

PIK3CA

, ένα γνωστό ογκογονίδιο και θεραπευτικός στόχος, χρησιμοποιώντας παράλληλα οθόνες RNAi παρέχει ισχυρές ενδείξεις για την προσέγγιση αυτή. Επιπλέον, οι βελτιώσεις στην τεχνολογία RNAi μπορεί να κάνει παράλληλες RNAi διαλογή μιας πολύ πιο απλή και οικονομικά αποδοτική διαδικασία [28], [29]. Παράλληλες οθόνες RNAi, όταν συνδυάζεται με το σύντροφό προσεγγίσεις, όπως η δημιουργία προφίλ έκφρασης, γονιδιακό προφίλ και υψηλή απόδοση ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση έχουν τη δυνατότητα να εντοπίσει πιθανούς στόχους που αξίζουν περαιτέρω έρευνα. Στην περίπτωση των WEE1, ένας συνδυασμός RNAi διαλογής, μεταγραφή προφίλ, γονιδιωματική προφίλ και ιστολογική ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός υποσυνόλου ασθενή (αυλού του καρκίνου του μαστού), όπου η αναστολή αυτής της κινάσης θα μπορούσε να διερευνηθεί ως ένα δυνητικό θεραπευτική στρατηγική. Ενσωματώνοντας την προσέγγιση αυτή στην συμβατική διαδικασία αναγνώρισης στόχου φάρμακο έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την ανάπτυξη νέων θεραπειών.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, οι ενώσεις, τα πλασμίδια και siRNA

MCF7, CAL51, HeLa, Α549, ΝΟΙ-Η226, PC3, DU145 και ΜΟΡ10Α κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC (USA) και διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. αναστολέας WEE1 (681.637) λήφθηκε από Calbiochem (UK). MCF7 και HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με SMARTpool siRNAs χρησιμοποιώντας Dharmafect 3 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης? Α549 και NCI-H226 κύτταρα επιμολύνθηκαν με SMARTpool siRNAs χρησιμοποιώντας Dharmafect 1 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Dharmacon). κύτταρα CAL51 επιμολύνθηκαν με SMARTpool siRNAs χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Oligofectamine σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με SMARTpool siRNAs χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Η βιβλιοθήκη κινάση siRNA (siARRAY – στόχευση 779 γνωστές και υποθετικές γονίδια ανθρώπινης κινάσης πρωτεΐνης) ελήφθη σε δέκα πλάκες των 96 φρεατίων από Dharmacon (USA). Κάθε φρεάτιο σε αυτή τη βιβλιοθήκη περιείχε ένα SMARTpool από τέσσερις διακριτές ειδών siRNA που στοχεύει διαφορετικές αλληλουχίες της μεταγραφής στόχου. Κάθε πλάκα συμπληρώθηκε με siCONTROL (δέκα πηγάδια, Dharmacon (ΗΠΑ)). Η WEE1 ONTARGETplus SMARTpool και ONTARGETplus siControl ελήφθησαν από Dharmacon (ΗΠΑ)

χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα

Τα αντισώματα που στοχεύουν στα ακόλουθα επιτόπια:. WEE1 (4936, Cell Signaling, UK), PARP (9542, Cell Signaling, UK) και β-τουμπουλίνης (T4026, Sigma, UK). Όλα τα δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western συζεύχθηκαν HRP.

μέθοδος οθόνη siRNA

κύτταρα τοποθετούνται σε πλάκες 96 φρεατίων μορφομετατράπηκαν 24 ώρες αργότερα με siRNA (τελική συγκέντρωση 100 ηΜ), όπως ανά κατασκευαστή οδηγίες. Κάθε πλάκα siRNA συμπληρώθηκε με 10 φρεάτια siControl. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και χωρίζεται σε τρεις πανομοιότυπες πλάκες ρεπλίκα. Media αναπληρώθηκε μετά από 48 ώρες και 96 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από επτά ημέρες χρησιμοποιώντας CellTiter Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία (Promega, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα από κάθε κυτταρική γραμμή υπέστη επεξεργασία ως εξής: η ένδειξη φωταύγειας για κάθε φρεάτιο σε μια πλάκα ήταν log

2 μεταμορφώνεται και εκφράζεται σε σχέση με τη μέση τιμή φωταύγειας του όλες τις κοιλότητες πάνω στην ίδια πλάκα (πλάκα κεντράρισμα). Αυτά τα δεδομένα στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν σύμφωνα με τη μέση του συνόλου των δεδομένων της οθόνης, χρησιμοποιώντας την διάμεση απόλυτη απόκλιση (MAD) για να εκτιμηθεί η πραγματική μεταβολή εντός κάθε οθόνη [30]. Αυτή η ομαλοποίηση αντιπροσώπευε την επίδραση κάθε SMARTpool σε κάθε κυτταρική σειρά, ως όρος Ζ [30] και επέτρεψε τα αποτελέσματα της κάθε SMARTpool στη βιωσιμότητα πρέπει να συγκριθεί σε όλον τον πίνακα κυτταρική γραμμή. AZ score≤-3 λήφθηκε ως όριο σημασία για μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, που εκπροσωπούν τρεις ΟΙΥ από τη μέση και την προσέγγιση σε τρεις τυπικές αποκλίσεις.

Απομαγνητοφώνηση προφίλ

Το RNA που εξάγεται από κυτταρικές σειρές με ΤπζοΙ και φαινόλης /χλωροφορμίου εκχύλιση που ακολουθείται από καθίζηση με ισοπροπανόλη. Για REACH κυτταρική γραμμή, εκτελέστηκαν εις τριπλούν εκχυλίσεις και προφίλ. Βιοτίνη σημασμένο cRNA παρήχθη με τη βοήθεια ενός γραμμικού κιτ ενίσχυσης (IL1791? Ambion, Austin, ΤΧ, https://www.ambion.com) χρησιμοποιώντας 250 ng του ελεγχόμενης ποιότητας ολικό RNA ως είσοδο. υβριδοποιήσεις Chip, το πλύσιμο, Cy3-στρεπταβιδίνης (Amersham Biosciences) χρώση, και σάρωση εκτελέστηκαν σε ένα Illumina BeadStation 500 (San Diego, https://www.illumina.com) πλατφόρμα χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια και πρωτόκολλα που παρέχονται παρακάτω από τον κατασκευαστή. δείγματα cRNA υβριδοποιήθηκαν σε Illumina ανθρώπου-6 v2 BeadChips, που καλύπτουν περίπου 47.000 μεταγραφές REFSEQ. Η τυχαία κατανομή των μεγάλων πληθυσμών σφαιριδίων ολιγονουκλεοτιδίου επικαλυμμένων σε όλη τις διαθέσιμες θέσεις μέσα στο ανθρώπινο-6 v2 τσιπ επιτρέπει, κατά μέσο όρο, οι μετρήσεις 30 ένταση ανά REFSEQ, αποδίδοντας ποσοτικές εκτιμήσεις της γονιδιακής έκφρασης [15]. Όλα τα βασικά ανάλυση των δεδομένων έκφρασης διεξήχθη με τη χρήση του λογισμικού του κατασκευαστή BeadStudio 3.1. προφίλ έκφρασης Illumina διεξήχθησαν εις τριπλούν, τα ακατέργαστα δεδομένα ήταν τότε διακύμανση σταθεροποίησης μετασχηματισμένων και στιβαρή σφήνα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο lumi στο λογισμικό Bioconductor [31], [32]. Οι τιμές έκφρασης για κάθε δείγμα ήταν διάμεσος Σφραγίζονται και η μέση τιμή έκφρασης καθοριστεί κατά τις τρεις επαναλήψεις. Γονίδια με σημαντική διαφορά στην έκφραση μεταξύ των κυτταρικών σειρών ταυτοποιήθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Αυτό το προφίλ δεδομένων μεταγραφή είναι τώρα διαθέσιμες στο κοινό (ένταξη ArrayExpress: E-TABM-610)

Συσχέτιση της βαθμολογίας siRNA Z με τη γονιδιακή έκφραση

Η συσχέτιση μεταξύ βαθμολογίας siRNA Z και της έκφρασης κανονικοποιούνται γονιδίου ήταν. εξετάζονται για τα γονίδια όπου siRNA προκάλεσε σημαντική απώλεια βιωσιμότητας (Ζ & lt? -3). Ζ σκορ ήταν σε σύγκριση με την έκφραση ομαλοποιημένη γονίδιο χρησιμοποιώντας Pearson συντελεστής συσχέτισης. Ένα γονίδιο λήφθηκε ως συσχετίζεται σημαντικά αν ο συντελεστής συσχέτισης Pearson ήταν σημαντικά διαφορετική από την μηδενική υπόθεση, η συσχέτιση ήταν αντίστροφη, και η μεταβολή στην έκφραση του γονιδίου μεταξύ κυττάρων γραμμές ήταν σημαντικά διαφορετικές όπως αξιολογείται με μονόδρομη ANOVA.

Array CGH μέθοδος ανάλυσης

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το QIAamp Blood DNA Mini Kit (51104, Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μικροσυστοιχιών με βάση ανάλυση CGH πραγματοποιήθηκε σε μια πορεία 32K πλακάκια BAC πλατφόρμα σειρά in-house όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33], [34]. Για αριθμό αντιγράφων συσχετισμούς, ο μέσος όρος της προσαρμοστικής βάρος εξομαλύνονται (AWS) αναλογίες BACs που περιέχουν το γονίδιο ενδιαφέροντος χρησιμοποιήθηκε για αριθμό αντιγράφων συσχετίσεις, και τον αριθμό αντιτύπου αποδίδεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Εν συντομία, AWS εξομαλύνεται δείκτης τιμών & lt log2? -0.12 Ταξινομήθηκαν ως απώλειες, εκείνοι & gt? 0,12 ως κέρδη, και εκείνων που στο μεταξύ ως αμετάβλητη. Ενισχύσεις ορίστηκαν ως εξομαλύνεται δείκτης τιμών & gt log2? 0.4 [35]. επεξεργασία και ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκαν στην Ε 2.0.1 (https://www.r-project.org/) και BioConductor 1.5 (https://www.bioconductor.org/), κάνοντας εκτεταμένη χρήση των τροποποιημένων εκδόσεων του πακέτα aCGH, Marray και AWS ειδικότερα.

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας για τη μέτρηση WEE1 siRNA ευαισθησία

τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων μορφομετατράπηκαν 24 ώρες αργότερα με WEE1 ONTARGETplus SMARTpool ή ONTARGETplus siControl (τελική συγκέντρωση 100 ηΜ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και χωρίζεται σε τρεις πανομοιότυπες πλάκες ρεπλίκα. Media αναπληρώθηκε μετά από 48 ώρες και 96 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από επτά ημέρες χρησιμοποιώντας CellTiter Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία (Promega, USA) και εκφράζεται σε σχέση με μέση φωταύγεια στα φρεάτια επιμολυσμένα με siControl.

Κυττάρων δοκιμασία για τη μέτρηση της βιωσιμότητας ευαισθησία φαρμάκου

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και εκτίθενται σε διάφορες δόσεις του αναστολέα WEE1 (Calbiochem, Cat. Νο 681637, 4- (2-φαινυλ) -9-υδροξυπυρρολο [3, 4-c] καρβαζολο-1,3- (2Η, 6Η) -διόνη (PHCD)) [21]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με Δοκιμασία Βιωσιμότητας CellTiter Glo Luminescent κυττάρων (Promega, USA) 48 ώρες αργότερα και κλάσματος επιβίωσης για κάθε δόση του φαρμάκου αξιολογείται διαιρώντας την τιμή φωταύγειας του φαρμάκου αντιμετωπίζεται από την τιμή φωταύγειας του οχήματος.

Western ένα.