Αφηρημένο

Εφεσ υποδοχείς είναι η μεγαλύτερη οικογένεια των κινασών τυροσίνης υποδοχέα. Μαζί με τους συνδέτες τους, οι εφρίνες, πληρούν πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες. Παρεκκλίνουσα έκφραση Ephs /εφρινών οδηγεί σε αυξημένη υποδοχέα Eph να ephrin συνδέτη αναλογίες είναι ένας κρίσιμος παράγοντας στην ογκογένεση, υποδεικνύοντας ότι σφιχτή ρύθμιση της Εφεσ και της έκφρασης ephrin είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική κυτταρική συμπεριφορά. Οι 3′-αμετάφραστες περιοχές (3’UTRs) των μεταγραφών διαδραματίζουν σημαντικό ακόμη ευρέως underappreciated ρόλο στον έλεγχο της έκφρασης πρωτεΐνης. Με βάση την παραδοχή ότι παράλογα μεγάλων οικογενειών γονιδίων θα μπορούσαν να εμφανίζουν ένα διατηρημένο οργάνωση των ρυθμιστικών στοιχείων σε 3’UTRs τους εφαρμόσαμε μια νέα προσέγγιση βιοπληροφορική /μοριακής βιολογίας με τις 3’UTR αλληλουχίες Eph /μεταγραφές ephrin. Εμείς εντοπίστηκαν συστάδες των μοτίβων που αποτελείται από κυτταροπλασματικά στοιχεία πολυαδενυλίωσης (CPEs), AU-πλούσια στοιχεία (Άρη) και θέσεις πρόσδεσης HuR. Αυτά τα συμπλέγματα δεσμεύουν πολλαπλές RNA σταθεροποίησης και αποσταθεροποιητικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων HuR. Παραδόξως, παρά ευρέως αποδεκτό το ρόλο της ως mRNA-σταθεροποιητική πρωτεΐνη, δείχνουμε περαιτέρω ότι η σύνδεση του HuR σε αυτά τα συμπλέγματα αποσταθεροποιεί πράγματι μεταγραφές Eph /εφρίνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Κατά συνέπεια, knockdown του HuR διαμορφώνει σε μεγάλο βαθμό την έκφραση των πολλαπλών Ephs /εφρινών τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Μαζί μελέτες μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του Ωρ, όπως διαπιστώθηκε σε πολλές προοδευτικές όγκους θα μπορούσε να είναι αιτιολογικός για disarranged υποδοχέα Eph σε αναλογίες συνδέτη ephrin οδηγεί σε υψηλότερο βαθμό διεισδυτικότητας ιστού

Παράθεση:. Χειμώνας J, Roepcke S, S Krause , Müller ΕΚ, Otto Α, Vingron M, et al. (2008) Συγκριτική Ανάλυση 3’ΙΙΤΡ επιτρέπει την αναγνώριση της Ρυθμιστικής Συνεργατικών Σχηματισμών που οδηγούν Εφεσ /ephrin Έκφραση σε γραμμές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 3 (7): Ε2780. doi: 10.1371 /journal.pone.0002780

Επιμέλεια: Θωμάς Preiss, Victor Chang Καρδιακές Research Institute, Αυστραλία

Ελήφθη: 23 του Απριλίου 2008? Αποδεκτές: 25 Ιούνη 2008? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιουλίου, 2008

Copyright: © 2008 Winter et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Deutsche Volkswagenstiftung και την Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 577, έργο A6 σε SS)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

3 ‘μη μεταφρασμένης περιοχές (3’UTRs) των mRNA παίζουν σημαντικό ρόλο στην μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, για παράδειγμα με ρύθμιση του mRNA εντοπισμός [1], [2], [3], τη σταθερότητα [4], και τη μετάφραση [ ,,,0],5], [6]. Εκτός από το να έχουν θέσεις σύνδεσης για τις ανακαλύφθηκε πρόσφατα microRNAs, 3’UTRs μπορούν λιμάνι μοτίβα που αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένες πρωτεΐνες ΚΝΑ-δεσμευτική. Τα μοτίβα αυτά είναι συνήθως στοιχεία μικρής αλληλουχία των οποίων η δραστηριότητα μπορεί να επηρεαστεί από δευτεροταγή δομή τους [7]. Ως εκ τούτου, η ταυτοποίησή τους από αλγόριθμους υπολογιστή είναι δύσκολη και συνήθως παράγει πολλά ψευδώς θετικά

Για την αναγνώριση 3’ΙΙΤΡ μοτίβα χρησιμοποιήσαμε μια νέα προσέγγιση που βασίζεται σε δύο παραδοχές:. Πρώτη, όχι μόνο περιοχές κωδικοποίησης, αλλά και στοιχεία μέσα οι 3’UTRs που είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του γονιδίου θα μπορούσε να διατηρηθεί μεταξύ των παράλογα μεγάλες οικογένειες γονιδίων? δεύτερο, mRNAs που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν λειτουργικά ή πληρούν περιττές λειτουργίες μπορεί να εμφανίζουν μια συντηρημένη οργάνωση των ρυθμιστικών στοιχείων σε 3’UTRs τους. Για να διερευνήσουν αυτό, επιλέξαμε τις οικογένειες των ephrin συνδετήρων και υποδοχέων Εφεσ. Η οικογένεια υποδοχέων Eph είναι η μεγαλύτερη υποοικογένεια υποδοχέων-κινασών τυροσίνης. Οι υποδοχείς Eph διαιρούνται σε δύο υποκατηγορίες με βάση την ειδικοτήτων συνδετήρα τους. Σε γενικές γραμμές, Eph κατηγορίας Α (EphA) υποδοχείς προσδένονται σε συνδετήρες εφρίνης Α γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης σταθεροποιημένες (ephrinA) (με την εξαίρεση της EphA4), ενώ Eph κατηγορίας Β (EphB) υποδοχείς προσδένονται σε συνδετήρες διαμεμβρανική περιοχή που περιέχει εφρίνης Β (ephrinB) [ ,,,0],8]. Ωστόσο, πιο πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι αλληλεπιδράσεις μπορεί να συμβεί σε όλες τις κατηγορίες [9]. Μετά την πρόσδεση σε συγγενείς συνδέτες εφρίνης τους, Εφεσ υποδοχείς αυτοφωσφορυλιωθεί και ενεργοποιούν κατάντη καταρράκτες σηματοδότησης (προς τα εμπρός σηματοδότηση). Παρά το γεγονός ότι δεν διαθέτουν οι ίδιοι καταλυτική δράση, και οι δύο κατηγορίες ephrin συνδέτες μπορεί να ενεργοποιήσει μονοπάτια μεταγωγής σήματος μετά την αλληλεπίδραση με τους υποδοχείς Εφεσ (reverse σηματοδότηση) [10].

Σε κυτταρικό επίπεδο, σηματοδότηση μέσω των υποδοχέων Eph και εφρινών οδηγεί είτε να αυξηθεί πρόσφυσης (έλξης) ή μειωμένη πρόσφυση (απώθηση) των αλληλεπιδρώντων κυττάρων. Αυτές οι αποκρίσεις είναι σημαντικά στη μεσολάβηση ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης, κελί διαχωρισμού, κυτταρική προσκόλληση, η κυτταρική μορφογένεση και η κυτταρική κινητικότητα [11]. Αρκετές από αυτές τις διαδικασίες είναι εκτός ελέγχου κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, υπογραμμίζοντας έναν πιθανό κρίσιμο ρόλο για Eph σηματοδότηση /εφρίνης στην ανάπτυξη πολλών ανθρώπινων καρκίνων. Σύμφωνα με την εν λόγω παθοφυσιολογία, αρκετές Ephs και εφρίνες, συμπεριλαμβανομένων EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphB2, EphB3, και εφρίνης-Α1, υπερεκφράζονται σε μία ποικιλία όγκων, και παρουσιάζουν ως επί το πλείστον τις ιδιότητες προαγωγής όγκων [11], [12 ].

πρότυπα έκφρασης των Ephs και εφρινών είναι πολύπλοκες, και η σωστή έκφραση τους είναι απαραίτητη για τη σωστή λειτουργία του πολλές από τις διαδικασίες που αναφέρονται παραπάνω. Ως εκ τούτου, ένα τελειοποιηθεί ρύθμιση της Εφεσ έκφρασης /ephrin τόσο σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο φαίνεται να είναι απαραίτητη. Στο μεταγραφικό επίπεδο, έχουν Eph υποδοχέων και συνδετήρων εφρίνης ενοχοποιηθεί ως κατάντη στόχοι πολλών διαφορετικών παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών ομοπεδίου [13] και της οικογένειας πρωτεϊνών ρ53 [14], [15], [16], [17]. Πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με μεταγραφικούς κανονισμού. Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις εμπλοκής της 3’UTR:. Αυξορρύθμιση του υποδοχέα EphA2 σε άξονες που διέρχονται από τη μέση γραμμή διαμεσολαβείται από μία άκρως συντηρημένη αλληλουχία στην 3’UTR της μετεγγραφής του που περιέχει μια κυτταροπλασματική στοιχείο πολυαδενυλίωσης (CPE) [18]

Εδώ έχουμε συλλέξει συστηματικά τα 3’UTR ακολουθίες των υποδοχέων του ποντικιού Εφεσ και συνδέτες εφρίνης και να ελέγχονται για

cis-δράσης

μοτίβα ακολουθία. Έχουμε εντοπίσει τρεις διαφορετικούς τύπους μοτίβα σε αρκετές από τις 3’UTRs Εφ /ephrin: CPEs, AU-πλούσια στοιχεία (Άρη), και HuR θέσεις πρόσδεσης. Ενώ μερικά από αυτά τα μοτίβα βρέθηκαν να διανεμηθεί προφανώς τυχαία στις αντίστοιχες 3’UTRs, άλλοι βρέθηκαν να διατάσσονται σε ομάδες οι οποίες είναι άκρως συντηρημένες μεταξύ διαφορετικών ειδών σπονδυλωτών. Επιπλέον, έχουμε προσδιορίσει διάφορους RNA-δεσμευτικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων HuR, που αλληλεπιδρούν με αυτά τα συμπλέγματα, και δείχνουμε ότι EfnA2, EphA2, και EphA4 είναι άμεσοι στόχοι μετα-μεταγραφική HuR σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι HuR δεν ενεργεί ως σταθεροποιητικός παράγοντας κατά την έκφραση αυτών των Eph /εφρινών, αλλά ότι αποσταθεροποιεί τα αντίστοιχα μηνύματα.

Αποτελέσματα

3 ‘μη μεταφρασμένης περιοχές της μετεγγραφής του ποντίκι Εφ υποδοχείς και συνδέτες εφρίνης

Για να αποκτήσετε μια πλήρη συλλογή από πλήρους μήκους 3’UTR αλληλουχίες των mRNA των υποδοχέων Eph και συνδέτες εφρίνης, εξάγαμε πρώτα όλες τις ακολουθίες Εφεσ /ephrin διαθέσιμο το ποντίκι από τη βάση δεδομένων GenBank του NCBI. Μόνο πολυαδενυλιωμένα μεταγραφές θεωρήθηκαν πλήρους μήκους, και μόνο τέτοια περικοπή παραλλαγές που περιέχουν και (i) μία αλληλουχία εξαμερούς συναινετική κοντά στη θέση διάσπασης και (ii) ένα πολυ (Α) ουρά συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Ατελής μεταγραφές επεκτάθηκαν προς την πολυ (Α) ουρά με την ευθυγράμμιση 3’complete δεδομένων EST με τη χρήση του προγράμματος λογισμικού CAP3 (για αριθμούς προσχώρησης βλέπε πίνακα S1). C-τερματική κολοβωμένη ισομορφές δεν συμπεριελήφθησαν στη μελέτη.

ότι περιοχές κωδικοποίησης και τα όρια εξονίου /ιντρονίου [19] είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ των διαφόρων μελών της οικογενείας του γονιδίου Eph υποδοχέων και συνδέτη εφρίνης, οι 3’UTRs των μεταγραφών παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία μήκους και αλληλουχία: εκείνες των συνδετήρων εφρίνης ποικίλουν από 552 bp (EfnA4) έως 3171 bp (EfnB2) και αυτών των υποδοχέων Eph από 198 bp (EphB6) έως 3310 bp (EphA4) (Σχ. 1, Πίνακας S1). Επιπλέον, δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε σημαντική εξοικονόμηση σε επίπεδο αλληλουχίας, είτε μεταξύ των 3’UTRs των μεταγραφές υποδοχέα Eph ή εκείνες της εφρίνης συνδέτες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Σχέδιο των 3’UTRs της Εφεσ /εφρινών. Υποτιθέμενο

cis

Οι-δράσης μοτίβα ακολουθία τονίζεται σε διάφορα χρώματα, διατήρηση μεταξύ ανθρώπου /ποντικού, ανθρώπου /ποντίκι /Xenopus εμφανίζεται με αστερίσκους /ανοικτούς κύκλους.

Η

ορθόλογες διατήρησης μεταξύ των ανθρώπινων και το ποντίκι κυμαινόταν από 60% έως 80%, το οποίο είναι συγκρίσιμο με το γονιδίωμα-ευρεία μέση τιμή των 69% [20].

Εναλλακτικές θέσεις πολυαδενυλίωσης βρέθηκαν στα 3’UTRs της EfnA4, EfnB2, EphA3, και EphA7 (Εικ. 1).

Οι 3 ‘αμετάφραστη περιοχές των μεταγραφών των υποδοχέων Eph και συνδέτες εφρίνης περιέχουν εξαιρετικά διατηρημένη

cis-δράσης

ακολουθία μοτίβα

Όπως περιγράφεται παραπάνω, οι αλληλουχίες των Eph 3’UTRs /εφρίνης είναι πολύ κακώς συντηρημένες μεταξύ παράλογα. Ωστόσο, μετα-μεταγραφική ρύθμιση συχνά βασίζεται σε σύντομο

cis-δράσης

μοτίβων αλληλουχίας, και τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν λειτουργικώς και /ή τα γονίδια που ανήκουν στην ίδια οικογένεια γονιδίων θα μπορούσε να αναμένεται να περιέχουν συντηρημένα μοτίβα 3’UTR. Για την ανίχνευση αυτών των στοιχείων θα σαρωθεί τις 3’UTRs των μεταγραφών Εφ /ephrin ποντίκι για γνωστά

cis-δράσης

μοτίβα ακολουθία (βλ https://genereg.molgen.mpg.de/cgi-bin/regEchse/regEchse.pl: τα μοτίβα που έχουν περιληφθεί στην αναζήτηση παρατίθενται στην ενότητα «επιλέξτε γνωστό μοτίβο? θέσεις δέσμευσης HuR ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Transterm https://uther.otago.ac.nz/Transterm.html). Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτό οδήγησε στην ταυτοποίηση τρεις εξέχοντες μοτίβα-CPEs, Άρη και δεσμευτική HuR sites-σε πολλές από τις 3’UTRs Εφ /εφρίνης (Εικ. 1). CPEs είναι μεταφραστική μονάδες ελέγχου που πρέπει να κατοικούν σε άμεση γειτνίαση με τη θέση πολυ (Α) να είναι λειτουργική [21]. Ως εκ τούτου, στο Σχήμα 1, μόνο οι CPEs που πληρούν αυτό το κριτήριο [0-250 απόσταση bp από πολυ (Α) εξαμερές] απεικονίζονται. HuR αλληλεπιδρά με πολλαπλές επαναλήψεις AUUUA [22] και U-πλούσια τμήματα με υψηλή συγγένεια. Πιο πρόσφατα προσπάθειες έχουν αναλάβει να καθορίσει πιο συγκεκριμένα μια ιστοσελίδα HuR δεσμευτική [23], [24]. Σε μια σειρά πειραμάτων δέσμευσης Meisner et al. συναγόμενη ότι η θέση σύνδεσης είναι η HuR NNUUNNUUU 9-μερές. Είναι αξιοσημείωτο ότι αυτό το μοτίβο βρέθηκε να είναι παρούσα σε όλες τις επικυρωμένες στόχους HuR, και ένα μονό σημείο μετάλλαξης εντός του μοτίβου είναι επαρκής για να καταστρέψει εντελώς δεσμευτική HuR. Σε αυτή τη μελέτη η αναζήτηση για θέσεις δέσμευσης HuR βασίστηκε σε αυτό το μοτίβο. Τόσο Άρη και θέσεις πρόσδεσης HuR βρέθηκαν σε όλα τα μέρη των 3’UTRs. Μερικά από τα μοτίβα βρέθηκαν ως απομονώθηκαν, μη-επικαλυπτόμενα στοιχεία. Σε άλλες περιπτώσεις, CPEs βρέθηκαν να συμπίπτουν με τον Άρη ή θέσεις δέσμευσης HuR, ή του Άρη με θέσεις δέσμευσης HuR. Αξίζει να σημειωθεί ότι και οι τρεις τύποι μοτίβων, μερικά σε πολλαπλά αντίτυπα, βρέθηκαν μαζί σε συστάδες (Εικ. 1, Πίνακας S2). Αυτές οι συστάδες δείχνουν δύο διακριτά μοτίβα εντοπισμού: βρίσκεται οπουδήποτε στην 3’UTR χωρίς προφανή προτίμηση για μια ειδική περιοχή (π.χ. EphA3, βλέπε Σχ. 1) ή ειδικά παρατάσσονται στην 3’terminal περιοχή της 3’UTR σε άμεση γειτνίαση με η θέση πολυαδενυλίωσης (π.χ. EphA2, βλέπε Εικ. 1).

σε ορθόλογες 3’UTRs,

cis-δράσης

στοιχεία ακολουθία με σημαντικές ρυθμιστικές λειτουργίες αναμένεται να συντηρείται μέσω της εξέλιξης [24] . Για 18 από τις 3’UTRs Eph /εφρίνης 21 ποντικού διερευνήθηκε σε αυτή τη μελέτη, οι αλληλουχίες από ανθρώπινο ορθόλογα ήταν διαθέσιμα, και το 44%, 74% και 72% των CPEs, άρια και HuR θέσεις σύνδεσης, αντίστοιχα, βρέθηκαν να είναι συντηρημένη μεταξύ των δύο ειδών (Σχ. 1 και 2). Πιο προφανές, σχεδόν όλα από τα μοτίβα παρατάσσονται σε συστάδες είναι συντηρημένες. Εκτός από τα θηλαστικά, ορθόλογες αλληλουχίες των 3’UTRs της EfnB2 και EphA2 από το χαμηλότερο σπονδυλωτών

Xenopus laevis

είναι διαθέσιμα. Και πάλι, ειδικά εκείνα τα μοτίβα που παρατάσσονται σε συστάδες και βρίσκεται κοντά στον τόπο της πολυ (Α) βρέθηκαν να διατηρείται σε αυτού του είδους (Εικ. 1 και 2).

Multialignments αντιπροσωπευτικά παραδείγματα του συμπλέγματος μοτίβα όπως διαπιστώθηκε στα 3’terminal μέρη του EfnA1, EfnA4, EphA2 και EphA4 3’UTRs. Οι θέσεις των CPEs, AREs, θέσεις δέσμευσης HuR καθώς και η συναίνεση εξαμερές του σήματος πολυαδενυλίωσης υποδεικνύονται κάτω από τις ευθυγραμμίσεις.

Η

Πιστοποίηση πρωτεϊνών που δεσμεύονται με ακολουθία μοτίβων στα 3’UTRs /ephrin Eph

Με βάση τα ακόλουθα κριτήρια, επελέγησαν οι 3’terminal τμήματα των EfnA1, EphA2, και EphA4 3’UTRs για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Κατ ‘αρχάς, το καθένα περιέχει συμπλέγματος μοτίβα ακολουθία που αποτελείται από CPEs και θέσεις πρόσδεσης HuR. EphA2 και EphA4, επιπλέον, να περιέχει AREs σε αυτές τις ομάδες. Ως εκ τούτου, οι 3’terminal μέρη αυτών των 3’UTRs φαινόταν να είναι καλοί υποψήφιοι για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τα συμπλέγματα μοτίβο. Δεύτερον, και οι τρεις συστάδες μοτίβο παρουσιάζουν έναν υψηλό βαθμό διατήρησης ορθολόγων σε άνθρωπο (Εικ. 1). Επιπλέον, το σύμπλεγμα EphA2 είναι ιδιαίτερα συντηρημένη σε

Xenopus laevis

(για EfnA1 και EphA4, καμία πληροφορία αλληλουχίας ήταν διαθέσιμα για αυτό το είδος). Τρίτον, η 3’terminal περιοχή της EphA2 3’UTR έχει ήδη δείξει τις σημαντικές ρυθμιστικές λειτουργίες [18].

Για να δοκιμαστεί η δέσμευση των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με αυτές τις συστάδες μοτίβο, ραδιενεργά σημασμένο μεταγραφές που περιλαμβάνει το 3 ‘τερματική περιοχές του EfnA1, EphA2, και EphA4 3’UTRs (Εικ. 3α) επωάστηκαν με κυτταρόλυμα από τον εγκέφαλο και UV διασταυρωμένο ποντικού. εγκέφαλο ποντικού χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα επειδή αρκετές γνωστές είναι- και πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με CPE είναι εντόνως εκφρασμένα σε αυτό το όργανο. Συγκροτήματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση μέσω γελών ακρυλαμίδης SDS, και τα ξηραμένα πηκτώματα εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ. Είναι ενδιαφέρον, η μέθοδος αυτή δεν είναι μόνο προσδιόρισε διάφορες πρωτεΐνες που είχαν συνδεθεί με τις συστάδες μοτίβο των τριών 3’terminal περιοχές, αλλά επίσης αποκάλυψε μία επικαλυπτόμενη μορφή ζωνών (Σχήμα 3β.): Πρωτεΐνες 30-45, 50, και 75 kD συνδέεται με και οι τρεις αλληλουχίες, αν και η συγγένεια προς τις 3’terminal περιοχές της EphA2 και EphA4 3’UTRs φάνηκε πολύ υψηλότερη από ό, τι προς εκείνη του EfnA1 3’UTR. Πρωτεΐνες του -60 και 70 kD ήταν αποκλειστικά ανιχνεύσιμα στα EphA2 και EphA4 λωρίδες (Εικ. 3b). Ταυτότητες των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν προσδιορίστηκαν σε μία δοκιμασία αναπτυσσόμενο ΠΝΑ-πρωτεΐνης με επακόλουθη ανάλυση του εκλουσμένου κλάσματος με φασματομετρία μάζας. Σημασμένο με βιοτίνη

στο

–

vitro

-transcribed μεταγραφές που αντιστοιχούν στην 3’terminal περιοχή της EphA2 3’UTR επωάστηκαν με λύμα από εγκέφαλο ποντικού και τράβηξε προς τα κάτω με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια. Οι μεταγραφές σε αντιπληροφοριακό προσανατολισμό προς την επιλεγείσα περιοχή χρησιμοποιήθηκαν σε ένα πείραμα αρνητικό έλεγχο. Συγκροτήματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE, χρωματισμένο με κολλοειδή Coomassie, ζώνες και εμπλουτίζεται ειδικά στο δείγμα λαμβάνεται με τις μεταγραφές αίσθηση αναλύθηκαν με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI) φασματομετρία μάζας. Είναι ενδιαφέρον ότι, εκτός από αρκετές πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην μεταγραφή και mRNA έκφραση παράγοντας ματίσματος-μυελίνης 2 (MyEF-2)? ετερογενής πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης M (hnRNP Μ)? πολύ ανάντη δεσμευτική πρωτεΐνη 1 (πρωτεΐνη FUSE-δεσμευτική 1, FBP)? παράγοντα ματίσματος, προλίνη και γλουταμίνη πλούσια (PSF) -Είμαστε προσδιορίζονται AUF1 και KSRP, δύο είναι δεσμευτικές πρωτεΐνες (ARE-BP) που είναι γνωστοί ρυθμιστές της σταθερότητας του mRNA (Σχ. 3γ, Πίνακας 1). Για να επιβεβαιώσετε την αλληλεπίδραση επαναλάβαμε τη δοκιμασία κυλιόμενο RNA-πρωτεΐνης. Αυτή τη φορά, ωστόσο, σύμπλοκα ΚΝΑ-πρωτεΐνης μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα. Όπως ήταν αναμενόμενο, KSRP δεσμεύεται με τον ανιχνευτή RNA που αντιστοιχεί στην περιοχή τερματικό EphA2 3’UTR αλλά όχι στον αντινοηματικό αρνητικό μάρτυρα (Σχ. 3d). Είναι ενδιαφέρον ότι, όσον αφορά AUF1, θα μπορούσαμε μόνο να ανιχνεύσει την δέσμευση των p45 και p42 ισομορφές, αλλά όχι τα p40 και P37 ισομορφές. Εκτός από ARE και CPE-μοτίβα, η 3’terminal μέρος της EphA2 3’UTR φιλοξενεί μια θέση πρόσδεσης HuR της συναίνεσης NNUUNNUUU. Ωστόσο, HuR δεν ταυτοποιήθηκε ως πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης στην ανάλυση φασματομετρίας μάζας. Για να ελεγχθεί απ ‘ευθείας για τη σύνδεση του HuR επωάσαμε την μεμβράνη κηλίδος Western με ένα αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι ενδογενών πρωτεϊνών HuR. Όπως ήταν αναμενόμενο, HuR βρέθηκε να αλληλεπιδρούν ειδικά με την 3’terminal περιοχή της EphA2 3’UTR.

(Α) Διάγραμμα των 3’UTRs του EfnA1, EphA2 και EphA4 όπως απεικονίζεται στο Σχ. 1. Probes χρησιμοποιούνται για δοκιμασίες UV-διασταυρωμένης σύνδεσης και RNA-πρωτεΐνη κυλιόμενο υποδεικνύεται (Β) υν-διασταυρωμένης σύνδεσης με πρωτεΐνη κυτταρολύματος από εγκέφαλο ποντικού και ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτές που αντιστοιχούν σε σύμπλεγμα μοτίβα που υπάρχουν στα τμήματα των 3’terminal EfnA1, EphA2 και EphA4 3 «UTRs. (C) 10% SDS-πήκτωμα βαμμένο με κολλοειδές Coomassie που δείχνει τις πρωτεΐνες που εκλούονται από σφαιρίδια στρεπταβιδίνης συζευγμένη με ένα βιοτινυλιωμένο ιχνηλάτη που αντιστοιχεί στο 3’terminal μέρος της EphA2 3’UTR (αριστερά λωρίδα) ή με την αντίστοιχη αλληλουχία αντινόημα (δεξιά λωρίδα ). Διαφορικές ζώνες αποκόπηκαν και αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας. Οι ταυτότητες πρωτεΐνη δίνονται. (D) αναλύσεις Western blot RNA-πρωτεΐνης pulldowns με πρωτεΐνη κυτταρολύματος από εγκέφαλο ποντικού και βιοτινυλιωμένο ανιχνευτές που αντιστοιχούν στο 3’terminal μέρος της EphA2 3’UTR (αριστερή λωρίδα) ή με την αντίστοιχη αλληλουχία αντινόημα (δεξιά λωρίδα). KSRP, AUF1, HuR και hnRNP A0 ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. (Ε) στυπώματος Western αναλύσεις pulldowns RNA-πρωτεΐνης με πρωτεΐνη κυτταρολύματος από εγκέφαλο ποντικού και βιοτινυλιωμένο ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα τμήματα της 3’terminal Eph 3’UTRs /εφρίνης ή προς την αλληλουχία αντινόημα EphA2. HuR και AUF1 ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα.

Η

Με βάση ομοιότητες μέγεθος των 30-45 kD, η δοκιμασία υν-σταυροσύνδεσης προτεινόμενη δέσμευση των ίδιων πρωτεϊνών στα 3’terminal μέρη του EfnA1, EphA2, και EphA4 3’UTRs (Εικ. 3b). Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι η έκφραση αρκετών από τους υποδοχείς Eph και εφρινών ρυθμίζεται από έναν κοινόχρηστο μηχανισμό. Για να αποδείξει ότι οι ίδιες πρωτεΐνες που συνδέονται με τα clusters μοτίβο εντοπίστηκαν σε αρκετές 3’UTRs /ephrin Εφεσίους, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις κυλιόμενο επιπλέον RNA-πρωτεΐνης με

στο

–

vitro

-transcribed και βιοτινυλιωμένο 3 ‘ τερματικών τμημάτων όλων των 3’UTRs /ephrin Εφεσ που περιέχουν Άρη, CPEs ή /και θέσεις δέσμευσης HuR (Πίνακας 2). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε το 3 ‘τερματικό μέρος μιας Eph 3’UTR που δεν περιέχει ένα τέτοιο μοτίβο (EphA1? Το μόνο μοτίβο που προσδιορίζονται στην 3’UTR της παρούσας μεταγραφής είναι μια θέση σύνδεσης HuR βρίσκεται έξω από το 3’ τερματικό μέρος ). Και πάλι, τα σύμπλοκα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, και αυτά επωάστηκαν με αντισώματα ανίχνευσης της 32 kD HuR πρωτεΐνη και το τέσσερα ισόμορφα AUF1, P37, p40, Ρ42, Ρ45 και, αντίστοιχα. Προς έκπληξή μας διαπιστώσαμε ότι τόσο HuR και AUF1 p42 /p45 συνδέεται με κάποια, αλλά όχι όλα τα μεταγραφές (Σχήμα 3ε.), Και τα δεσμευτικά πρότυπα των δύο πρωτεϊνών ήταν μόνο επικαλυπτόμενες εν μέρει: τόσο HuR και AUF1 αλληλεπιδρά με το τερματικό του 3 ‘ περιοχές του EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, και EphA6 3’UTRs, αλλά μόνο AUF1 συνδέεται προς το 3 ‘τερματικές περιοχές του EfnA1, EphA3, και EphB1 3’UTRs (Σχ. 3e). Δεν δεσμεύουν είτε AUF1 ή HuR παρατηρήθηκε με τερματική περιοχή 3 ‘του EphA1, η οποία δεν περιέχει ένα μοτίβο.

Η

Μια πιο προσεκτική ματιά στην σύνθεση των διαφορετικών 3’ΙΙΤΡ μέρη τερματικό αποκάλυψε ότι AUF1 είχε βέβαιο ότι όλοι περιέχουν μεταγραφές εκτός EphA7, αλλά και για τέσσερις μεταγραφές που δεν περιέχουν μια ARE (EfnA1, EfnB2, EphA6, EphB1). Για την πρόσδεση του HuR, παρουσία της θέσης πρόσδεσης συναινετική HuR ήταν απαραίτητη αλλά όχι επαρκής: δεν μπορούσε να ανιχνεύσει σύνδεση του HuR με οποιαδήποτε από τις μεταγραφές που στερείται αυτήν την περιοχή? Ωστόσο, από τις οκτώ μεταγραφές που περιέχουν αυτό το site, HuR δεσμεύεται να EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4 και EphA6 αλλά όχι να EfnA1, EfnB3 και EphB1.

Επειδή HuR συνδέεται με μονόκλωνο RNA, ήταν πρότεινε ότι η θέση σύνδεσης HuR μπορεί να χρειαστεί να αναλάβει μια συγκεκριμένη διαμόρφωση να υποβληθούν σε υψηλής συγγένειας HuR δέσμευσης [24]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε το πρόγραμμα Mfold να προβλέψει δευτερογενείς δομές στους ιχνηθέτες 3’UTR που είχαμε που χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμασία αναπτυσσόμενο RNA-πρωτεΐνης. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της Meisner et al. (2004), βρήκαμε ότι HuR είχαν αλληλεπιδράσει μόνο με τις μεταγραφές στα οποία είχαν προβλεφθεί οι θέσεις δέσμευσης HuR να βρίσκεται σε μονόκλωνη βρόχους (Εικ. 4α). Οι θέσεις σύνδεσης HuR των υπόλοιπων μεταγραφές ήταν όλα (τουλάχιστον εν μέρει) που βρίσκεται στην διπλόκλωνων περιοχών (Εικ. 4b) και, ως εκ τούτου, ενδεχομένως απρόσιτες για HuR.

Ορατή οι δευτερογενείς δομές των ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται σε UV -crosslinking και RNA-πρωτεΐνης πειράματα κυλιόμενο που αντιστοιχούν στα τμήματα της 3’terminal 3’UTRs Eph /εφρίνης όπως προβλέπεται από Mfold. (Α) ανιχνευτών με HuR χώρους που βρίσκονται σε μονόκλωνες περιοχές (αστερίσκοι), που έδειξε δέσμευση του HuR υψηλής συγγένειας. (Β) Probes όπου προβλέπεται να φιλοξενούνται σε περιοχές δίκλωνο θέσεις πρόσδεσης HuR.

Η

Η δευτεροταγής δομή ενός σχετικά μικρή μερική μεταγραφής μπορεί να διαφέρουν σε μεγάλο βαθμό από τη δομή του όλου 3’UTR και επομένως μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν τη διαμόρφωση

in vivo

. Να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την προσβασιμότητα των θέσεων δέσμευσης HuR έτρεφε στα 3’UTRs /ephrin Εφεσ χρησιμοποιήσαμε τον αλγόριθμο Mfold να προβλέψει τις δευτερογενείς δομές του συνόλου 3’UTRs. Είναι ενδιαφέρον ότι, εκτός από EfnB3 και EphA1, όλα 3’UTRs /εφρίνης ποντικού Eph περιέχουν τουλάχιστον μία θέση δέσμευσης HuR προβλέπεται να είναι μέρος ενός μονόκλωνου περιοχή εντός ή εκτός των περιγραφόμενων συστάδων μοτίβο, υποδηλώνοντας έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο του HuR σε η ρύθμιση της έκφρασης Eph /εφρίνης (Εικ. S1).

HuR ρυθμίζει την έκφραση του Eph /εφρινών σε κυτταρικές σειρές καρκίνου

Ανώμαλη έκφραση του Eph /εφρινών έχει αναφερθεί σε διάφορους καρκίνους, και σχετίζεται με κακή πρόγνωση και προχωρημένα στάδια της κακοήθειας [11], [25]. Ενώ πολύ προσπάθεια έχει τεθεί στη διαλεύκανση της μεταγραφικής ρύθμισης του Εφ /εφρινών σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και καρκινικών ιστών, μετα-μεταγραφική ρύθμιση έχει παραμεληθεί. Εβδομήντα δύο τοις εκατό των θέσεων δέσμευσης HuR του 3’UTRs Eph /εφρίνης ποντίκι είναι συντηρημένα σε άνθρωπο (βλέπε παραπάνω). Για να ελεγχθεί αν τα ευρήματά μας σε κύτταρα ποντικού εφαρμόζονται επίσης σε ανθρώπινα κύτταρα που ανοσοκαταβυθίστηκε HuR από την τραχηλική κυτταρική γραμμή καρκινώματος HeLa και ο αστροκύτωμα /γλοιοβλάστωμα κυτταρική σειρά U373MG (Εικ. 5α) χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-HuR, και εκτελέστηκε RT-PCR για την ανοσοκαθιζάνουν με εκκινητές ειδικούς για EfnA2, EphA2, και EphA4, τα οποία είναι τρία mRNAs που είναι γνωστό ότι εκφράζεται υψηλά σε διάφορους τύπους καρκίνου [11]. Ως αρνητικός έλεγχος πραγματοποιήσαμε την ίδια διαδικασία με μη ειδική ανοσοσφαιρίνες αντί του αντι-HuR αντίσωμα (Σχ. 5α και β), και ως αρνητικό μάρτυρα για RT-PCR πραγματοποιήσαμε το στάδιο cDNA σύνθεσης χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο IgG, υπήρχε σαφής εμπλουτισμός των EfnA2, EphA2, και τα μηνύματα EphA4 στα ανοσοϊζήματα από αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 5b) υποδεικνύοντας ότι HuR είχε δεσμεύονται στα mRNAs Eph /εφρίνης

in vivo

. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το μήνυμα GAPDH-μη στόχους θα μπορούσε επίσης να ενισχυθεί, αν και λιγότερο αποτελεσματικά και στον ίδιο βαθμό και στις δύο ομάδες ΠΕ? η διαπίστωση αυτή έχει περιγραφεί πριν [23], και επαλήθευσε τη χρήση ίσες ποσότητες των υλικών εισόδου.

(Α) Ανοσοκαταβύθιση ενδογενούς HuR. κυτταρολύματα HeLa ή U373 ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-HuR αντίσωμα ή με μη ειδική IgGs. Τα ανοσοϊζήματα φορτώθηκαν σε 10% SDS-Pages και αναλύθηκαν με στυπώματος Western με αντι-αντίσωμα HuR? HC, βαριά αλυσίδα? LC, ελαφριά αλυσίδα (Β) RT-PCR μετά από RNA εκχύλιση από τα προϊόντα ανοσοκαταβύθισης HuR και IgG με εκκινητές ειδικούς για EfnA2, EphA2, EphA4 και GAPDH.

Η

Σε μία περαιτέρω σειρά πειραμάτων δοκιμάσαμε αν HuR ρυθμίζει μετα-μεταγραφικά την έκφραση /ephrin Εφεσ. Εμείς χτυπηθεί κάτω HuR σε κύτταρα HeLa και U373MG χρήση δύο διαφορετικών HuR-ειδικά ολιγονουκλεοτίδια siRNA (Σχ. 6α και τα δεδομένα δεν εμφανίζονται) και ανιχνεύεται EfnA2, EphA2, και EphA4 mRNAs με πραγματικού χρόνου RT-PCR 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. HuR έχει αναφερθεί ως ένα mRNA σταθεροποιητική πρωτεΐνη, υποδηλώνοντας ότι knock-down της θα οδηγήσει σε μείωση της έκφρασης του mRNA /ephrin Εφ. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη το ποσό της EphA2 mRNA ελαττώθηκε μετά knock-down του Ωρ, προς έκπληξή μας, τα επίπεδα EfnA2 και EphA4 mRNA αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. 6α). Για να ελέγξετε αν οι αλλαγές που παρατηρούνται στο επίπεδο RNA αντικατοπτρίζουν την κατάσταση στο επίπεδο της πρωτεΐνης που φορτώθηκαν ίσες ποσότητες των προϊόντων λύσης πρωτεΐνης από κύτταρα HeLa και U373 μετά HuR knock-down και πραγματοποιείται ανάλυση Western blot με αντισώματα ανίχνευση EphA2 και EphA4 (Εικ. 6β) . Σε επιβεβαίωση των Real-Time PCR πειράματα βρήκαμε ότι η έκφραση της EphA2 πρωτεΐνης μειώθηκε δραματικά κατά 10 φορές σε HeLa και 5 φορές σε κύτταρα U373 μετά knock-down του Ωρ, ενώ η έκφραση του EphA4 αυξήθηκε κατά 1,2 φορές και 2-φορές, αντίστοιχα (Εικ. 6β). Έλεγχος siRNA ολιγονουκλεοτίδια δεν είχαν σημαντική επίδραση στην EphA2 ή EphA4 έκφραση πρωτεΐνης σε σύγκριση με ένα ψευδο-επιμολυσμένα ελέγχου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η εμπορικά διαθέσιμη EphA4 αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα ανιχνεύει τρεις διαφορετικές ζώνες σε κύτταρα HeLa (Εικ. 6b), το σύνολο των οποίων ρυθμίζεται αυξητικά μετά HuR knock-down. Δύο από αυτές τις ζώνες μπορεί να αντιστοιχούν σε δύο διαφορετικές ισομορφές EphA4 με διαφορά μεγέθους των 37 αμινοξέων που παρατίθενται στον Browser Γονιδιώματος. Η τρίτη ζώνη μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα HeLa-ειδική ισομορφή που δεν έχει ακόμη ανιχνευθεί σε οποιαδήποτε από τις συμβατικές βάσεις δεδομένων.

HuR χτυπήθηκε κάτω με ένα ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο HuR RNAi σε κύτταρα HeLa και U373 (Α) έκφραση του mRNA του EfnA2, EphA2 και EphA4 72 ώρες μετά την επιμόλυνση ενός ειδικού ολίγο HuR RNAi συγκρίθηκε με την επιμόλυνση ενός μη φίμωση ολίγο ελέγχου, όπως μετράται από Real Time RT-PCR. Οι αναλογίες μεταξύ των επιπέδων έκφρασης μετά HuR νοκ ντάουν και επιμόλυνσης των oligonucleotodides ελέγχου μη φίμωση δείξει. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. (Β) στυπώματος Western αναλύσεις της πρωτεΐνης έκφρασης της EphA2, EphA4 (τρεις ισομορφές, βλέπε βέλη), HuR και GAPDH 72 ώρες μετά την knockdown του HuR (άνω πάνελ, λωρίδα 3) με ειδικά αντισώματα σε σύγκριση με ένα ψευδο-ελέγχου (λωρίδα 1) καθώς και ένα μη-σίγησης ελέγχου siRNA (λωρίδα 2). Ποσοτικοποίηση των ζωνών (έναντι GAPDH) διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Image Quant λογισμικό 5.2 (κάτω πίνακας). Πλάσια αύξηση ή μείωση της έκφρασης απεικονίζονται.

Η

Για να γίνει διάκριση μεταξύ των έμμεσων επιδράσεων μεταγραφικής και άμεση σταθεροποίηση του mRNA που προκαλείται από το knock-down του HuR, έχουμε μπλοκάρει τη μεταγραφή με ακτινομυκίνη D 48 ώρες μετά την επιμόλυνση του HuR siRNA ολίγος ή ολίγο ελέγχου, και μετρούνται τα mRNA ημίσειας ζωής της EfnA2, EphA2, και EphA4 με Real-Time RT-PCR. Παραδόξως, βρήκαμε ότι knock-down της HuR αύξησε τις ημίσειας ζωής όλων των mRNAs Εφ /ephrin δοκιμαστεί. Αυτό υποδηλώνει ότι HuR αποσταθεροποιεί αυτά mRNAs (Εικ. 7α), και ότι η μείωση μήνυμα EphA2 ανιχνεύονται μετά knock-down του HuR μπορεί να προκληθεί από δευτερογενείς αναστολή της μεταγραφής EphA2.

(Α) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση ενός ειδικού ολιγονουκλεοτιδίου HuR RNAi ή ένα ολιγονουκλεοτίδιο ελέγχου των ημιζωές EfnA2, EphA2 και EphA4 mRNAs αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας 5 μg /ml ακτινομυκίνη D? mRNA ημιζωές μετρήθηκαν με Real Time RT-PCR, η έκφραση mRNA κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. (Β) 3’terminal μέρη του EfnA2, EphA2 και EphA4 3’UTRs κλωνοποιήθηκαν σε φορέα προαγωγέα pGL3 και επιμολύνθηκε σε κύτταρα HeLa. 30 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας μετρήθηκε. Για ομαλοποίηση ένα πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla (PRL) συν-επιμολύνθηκε. (C) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση ενός ειδικού ολιγονουκλεοτιδίου κύτταρα HeLa HuR RNAi επιμολύνθηκαν με κατασκευές pGL3 προαγωγό όπως περιγράφεται στο (Β), και 48 ώρες αργότερα δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας μετρήθηκε, και ομαλοποιήθηκε ως προς την συν-επιμολυσμένα pRL πλασμίδιο.

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις που προκαλούνται από

cis

-δράσης ακολουθίες έτρεφε στα 3’terminal μέρη του EfnA2, EphA2, και EphA4 3’UTRs, pGL3P πλασμίδια ανταποκριτές που φέρουν αυτές οι αλληλουχίες (περιλαμβανομένων των θέσεων δεσμεύσεως HuR) καθοδικά του cDNA της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa. Για κανονικοποίηση, ο φορέας που περιέχει pRL ο

Renilla

cDNA λουσιφεράσης ήταν συν-επιμολυνθεί. κατασκευές pGL3P περιέχει το EfnA2, EphA2 ή EphA4 3’terminal ακολουθίες που παράγονται σημαντικά μικρότερη λουσιφεράσης πυγολαμπίδας δράση από το φορέα pGL3P χωρίς 3’ΙΙΤΡ ένθετα, επιβεβαιώνοντας μια αποσταθεροποιητική λειτουργία των 3’terminal μέρη αυτών 3’UTRs (Σχ. 7β). Μετά knock-down της HuR με ένα συγκεκριμένο ολίγο RNAi αυτό αποσταθεροποιητική επίδραση θα μπορούσε να διασωθεί εν μέρει, γεγονός που υποδηλώνει περαιτέρω αποσταθεροποιητικές λειτουργία για την πρωτεΐνη HuR (Εικ. 7c). Knock-down του HuR με ολίγο RNAi στοχεύει σε ένα διαφορετικό περιοχή του mRNA HuR έδειξε συγκρίσιμα αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Off-στόχου αποτελέσματα αποκλείστηκαν από την επιμόλυνση ενός φορέα pGL3P χωρίς θέσεις πρόσδεσης HuR.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση βιοπληροφορική /μοριακής βιολογίας για τον έλεγχο των 3’UTRs των μεταγραφών της Εφεσ υποδοχείς και συνδέτες εφρίνης για την υποτιθέμενη

cis-δράσης

μοτίβα ακολουθία και να χαρακτηρίσουν τη βιολογική τους λειτουργία.

Θα δείξουμε ότι αρκετές από τις 3’UTRs Εφ /ephrin, αν και παρουσιάζουν σημαντική απόκλιση μεταξύ παράλογα σε αφορά το μήκος και την ακολουθία, περιέχουν εξελικτικά συντηρημένη συστάδες μοτίβο αποτελείται από επικαλυπτόμενα CPEs, Άρη, και θέσεις πρόσδεσης HuR. Εντοπίσαμε HuR και πολλές άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον έλεγχο της σταθερότητας του mRNA ως εταίροι αλληλεπίδραση αυτών των συστάδων. Εναλλαγή από ποντικούς για ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, λάβαμε επίσης απόδειξη ότι η έκφραση του Eph /εφρινών είναι μετα-μεταγραφικά ρυθμίζεται μέσω της αλληλεπίδρασης των συντηρημένων συμπλεγμάτων αλληλουχία και HuR, γεγονός που υποδηλώνει μια σύνδεση μεταξύ απορρύθμιση της έκφρασης /εφρίνης Eph στον καρκίνο και υπερέκφραση του HuR.

Οι 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχές των μεταγραφών των Εφ υποδοχείς ποντικιού και ephrin συνδέτες

Ένα χαρακτηριστικό των μελών των οικογενειών /ephrin Εφεσ είναι επέκταση τους αριθμούς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, λόγω των πολλαπλών επικαλύψεων γεγονότα [19]. Οι αντίστοιχες περιοχές κωδικοποίησης και τα όρια εξονίου /ιντρονίου είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ ορθόλογα και παράλογα, η οποία αντικατοπτρίζεται από τις περιττές λειτουργίες που μπορεί να επιτελέσει Eph /εφρινών και από την ικανότητα των υποδοχέων Eph να αλληλεπιδρούν με πολλαπλές εφρινών. Επιπλέον, οι 3’UTRs του Eph ορθόλογα /εφρίνης είναι εντόνως διατηρημένες μεταξύ ανθρώπου και ποντικού (έως 80%), γεγονός που υποδεικνύει ισχυρή πίεση επιλογής και ίσως διατήρηση των διακριτών προφίλ έκφρασης. Σε αντίθεση, τα 3’UTRs του /εφρίνης παράλογα Eph παρουσιάζουν υψηλό βαθμό δομικής απόκλισης, η οποία μπορεί να ενεργοποιηθεί Ephs /εφρινών να αποκτήσουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης (κυτταρικό ή υποκυτταρικό), όπως έχει προταθεί για άλλα συντηρημένα παράλογα [26]. 95 ° C για 10 λεπτά?