Αφηρημένο

κυτοκίνης και αυξητικού παράγοντα μονοπάτια που αφορούν STAT3 σηματοδότησης συχνά μόνιμα ενεργοποιημένη σε πολλούς ανθρώπινους πρωτογενείς όγκους, και είναι γνωστή για τη μεταγραφική ρόλο που διαδραματίζουν στον έλεγχο της ανάπτυξης των κυττάρων και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, η έκταση του REACH STAT3 για μεταγραφικό έλεγχο του γονιδιώματος ως σύνολο παραμένει ένα σημαντικό ζήτημα. Έχουμε προβλέψει ότι αυτή η επίμονη σηματοδότηση STAT3 επηρεάζει μια μεγάλη ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, πολλά από τα οποία παραμένουν ακόμα να χαρακτηριστεί. Πήραμε μια ευρεία προσέγγιση για τον εντοπισμό νέων STAT3 γονιδίων που ρυθμίζονται από την εξέταση των μεταβολών στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο από μικροσυστοιχιών, χρησιμοποιώντας κύτταρα που εκφράζουν συστατικά που ενεργοποιούνται STAT3. Χρησιμοποιώντας υπολογιστική ανάλυση, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων που περιέχουν ενεργοποιημένα STAT3 και ταυτοποίηση γονιδίων υποψήφιος στόχος με ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών. Μεταξύ αυτών των γονιδίων εντοπίσαμε Necdin, ένας αρνητικός ρυθμιστής ανάπτυξης, ως νέο γονίδιο στόχο STAT3, του οποίου η έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε επίπεδο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης όταν STAT3 είναι ουσιαστικά δραστική. Αυτή η καταστολή εξαρτάται STAT3, δεδομένου ότι η αναστολή της STAT3 με τη χρήση siRNA αποκαθιστά Necdin έκφρασης. Ένα site STAT3 δέσμευσης DNA ταυτοποιήθηκε στον υποκινητή Necdin και τόσο EMSA και της χρωματίνης ανοσοκαθίζηση επιβεβαιώνουν δέσμευση του STAT3 σε αυτή την περιοχή. Necdin έκφραση έχει προηγουμένως δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ένα μελάνωμα και καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών ανθεκτικών στα φάρμακα. Περαιτέρω ανάλυση της έκφρασης Necdin καταδεικνύεται καταστολή σε STAT3 τρόπο που εξαρτάται σε ανθρώπινο μελάνωμα, του προστάτη και κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η STAT3 συντονίζει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε πολλές μεταβολικές και βιοσυνθετικών οδών, την ενσωμάτωση των σημάτων που οδηγούν σε παγκόσμιες αλλαγές μεταγραφικά και ογκογένεση. STAT3 μπορεί να ασκήσει ογκογόνο δράση του κατά ρύθμισης της μεταγραφής των γονιδίων που εμπλέκονται στην προώθηση της ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού, αλλά και από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των αρνητικών ρυθμιστών των ίδιων κυτταρικών διαδικασιών, όπως Necdin

Παράθεση:. Haviland R , Eschrich S, Bloom G, Ma Υ, Minton S, Jove R, et al. (2011) Necdin, ένας αρνητικός ρυθμιστής ανάπτυξης, είναι ένα μυθιστόρημα STAT3 γονιδίου στόχου κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινα καρκινικά. PLoS ONE 6 (10): e24923. doi: 10.1371 /journal.pone.0024923

Επιμέλεια: Toshi Σιόντα, Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Αύγ του 2010? Αποδεκτές: 24 Αύγ του 2011? Δημοσιεύθηκε: 27 Οκτ, 2011

Copyright: © 2011 Haviland et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ίδρυμα Angela Musette Russo (https://www.russofoundation.com/), H. Lee Moffitt Κέντρο Καρκίνου και Ερευνητικό Ινστιτούτο (https://www.moffitt.org) και το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) Grant R01-CA115674 (https://www.cancer.gov/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

STAT3 είναι ένας λανθάνων κυτταροπλασματική παράγοντα μεταγραφής, που προκαλείται από μια ποικιλία ανάντη σημάτων, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων ανάπτυξης, κυτοκινών και κινάσες τυροσίνης μη-υποδοχέα [1] – [7]. Κατά την ενεργοποίηση με φωσφορυλίωση της τυροσίνης, STAT3 σχηματίζει διμερή, τα οποία μετατοπίζονται στον πυρήνα και ρυθμίζουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες, η δραστικότητα STAT3 ελέγχεται στενά? Ωστόσο, ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης που περιλαμβάνουν STAT3 συχνά ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα σε πολλούς διαφορετικούς ανθρώπινους πρωτοπαθείς όγκους [8] – [15]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι συστατική ενεργοποίηση του STAT3 παρέχει καρκινικών κυττάρων με την ανάπτυξη και την επιβίωση πλεονεκτήματα [16] και ενισχύει την αγγειογένεση όγκων [17] και τη μετάσταση [18]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η ενεργοποίηση STAT3 συμβάλλει στην ογκοάνοση φοροδιαφυγής [19], [20]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι παρεκκλίνουσα σηματοδότηση STAT3 επηρεάζει ένα ευρύ φάσμα θεμελιωδών κυτταρικών λειτουργιών μέσω πολλαπλών μηχανισμών.

Μέχρι σήμερα, πάνω-ρυθμισμένη έκφραση πολλών γονιδίων στόχων STAT3 έχει ταυτοποιηθεί, περιλαμβανομένων των VEGF [17], Bcl-2 , Bcl-xL [21], p21, Κυκλίνη D1 [22] και σουρβιβίνη [23]. Αυτά τα γονίδια-στόχους STAT3 γενικά έχουν ταυτοποιηθεί σε ατομική βάση, ενώ λίγες μελέτες έχουν προσπαθήσει να προσδιορίσουν μεγάλους αριθμούς STAT3 ρυθμιζόμενων γονιδίων [24] – [28]. Πήραμε μια ευρεία προσέγγιση για τον εντοπισμό νέων STAT3 ρυθμίζονται τα γονίδια που εμπλέκονται στην ογκογένεση εξετάζοντας τις αλλαγές στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο από μικροσυστοιχιών, χρησιμοποιώντας κύτταρα που εκφράζουν μόνιμα ενεργή STAT3. Συνδυάζοντας αυτή την προσέγγιση με την υπολογιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων που εκφράζουν ενεργοποιημένη STAT3 και να εξετάσει το ρόλο της STAT3 τόσο θετική και αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.

Pathway και λειτουργική αναλύσεων δείχνουν ότι STAT3 έχει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση, και θετικά και αρνητικά, μία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών πέραν της μεταγραφής. STAT3 συντονίζει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε πολλές μεταβολικές και βιοσυνθετικών οδών, την ενσωμάτωση των σημάτων που οδηγούν σε παγκόσμιες αλλαγές μεταγραφικά και ογκογένεση. Αυτά περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση, κυτταροσκελετικές αναδιαμόρφωση, νουκλεοτίδιο, λιπίδιο και το μεταβολισμό των πρωτεϊνών, όπως επίσης και την μεταγωγή σήματος.

Μέσω υπολογιστική ανάλυση των δεδομένων μας, εντοπίσαμε Necdin, ένας αρνητικός ρυθμιστής ανάπτυξης, ως νέο δυναμικό STAT3 γονιδίου στόχου. Necdin είναι ένας ισχυρός καταστολέας της ανάπτυξης που εκφράζεται κυρίως σε μετα-μιτωτικούς νευρώνες [29] – [32]. Necdin έκφραση έχει δειχθεί ότι είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκινώματος και πρωτογενείς όγκους [33], υποδηλώνοντας ότι η καταστολή της έκφρασης Necdin μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ογκογένεση. Έχουμε διαπιστώσει ότι η έκφραση του mRNA Necdin συσχετίζεται αντίστροφα με δραστικότητα STAT3 σε κύτταρα που εκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργή STAT3 και ότι STAT3 ρυθμίζει άμεσα την έκφραση του Necdin στο επίπεδο υποκινητή. Επιπλέον, η έκφραση Necdin σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου συσχετίζεται αντίστροφα με την ενεργοποίηση του ενδογενούς STAT3. Τα ευρήματά μας παρέχουν περαιτέρω στοιχεία για τον ρόλο της Necdin ως φυσιολογικό στόχο της STAT3, αποδεικνύοντας ότι υπολογιστική ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό πιθανών γονιδίων στόχων STAT3 για περαιτέρω έρευνα.

Αποτελέσματα

Προσδιορισμός των ενδεχόμενων γονίδια STAT3 στόχο χρησιμοποιώντας μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων

Για τον εντοπισμό δυνητικών νέων γονιδίων STAT3-ρυθμίζονται, εξετάσαμε τα παγκόσμια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές που φέρουν επίμονα ενεργή STAT3. προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε τέτοια κύτταρα είναι πιθανό να είναι αντιπροσωπευτική της γενετικό προφίλ ενός καρκινικού κυττάρου με παρεκκλίνουσα έκφραση STAT3, σε σύγκριση με την επαγωγή δραστικότητας STAT3 παροδικά χρησιμοποιώντας εξωγενή διέγερση, όπως IL-6 ή παροδική επιμόλυνση [25].

RNA συλλέχθηκε από τα φυσιολογικά κύτταρα Balb /c-3Τ3 με χαμηλά επίπεδα ενδογενούς δραστικότητας STAT3, για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. RNA εκχυλίστηκε επίσης από κύτταρα Balb /c-3Τ3 σταθερά διαμολυσμένα με είτε v-Src, είναι γνωστό ότι επάγουν επίμονη ενεργοποίηση STAT3 [34], [35], ή το ουσιαστικά δραστική μετάλλαξη, STAT3-C [36]. Τριπλά δείγματα συλλέχθηκαν, καθεμία από τρεις διαδοχικές διόδους, και κάθε δείγμα RNA υβριδίστηκε σε ένα ενιαίο Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChip. Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) [37] χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ των γονικών κυττάρων Balb /c-3Τ3 και τα κύτταρα σταθερώς επιμολυσμένα με είτε v-Src ή STAT3-C. Δεχτήκαμε όλα τα γονίδια που προσδιορίζονται από SAM όπως διαφορικά ρυθμίζονται κατά τουλάχιστον 1,5 φορές [38].

Επικάλυψη των δύο μικροσυστοιχιών Σύνολα δεδομένων

ανάλυση μικροσυστοιχιών και μετέπειτα SAM δημιουργούνται δύο λίστες των διαφορικά εκφρασμένων γονίδια: μία λίστα ταυτοποιημένα γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ ελέγχου κύτταρα Balb /c-3Τ3 και κύτταρα επιμολυσμένα με v-Src, και ο δεύτερος κατάλογος περιείχαν γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ ελέγχου κύτταρα Balb /c-3Τ3 και κύτταρα επιμολυσμένα με STAT3-C. Γονίδια που είναι κοινές στα δύο λίστες είναι πιο πιθανό να ρυθμίζεται άμεσα από STAT3. Τα γονίδια αυτά προσδιορίζονται από διασταύρωση των στοιχείων των δεδομένων στους δύο καταλόγους χρησιμοποιώντας τη λειτουργία του Microsoft Excel VLOOKUP

Αν και v-Src μετασχηματισμένα κύτταρα έχουν μόνιμα ενεργή STAT3, Src διεγείρει επίσης άλλες STAT3 ανεξάρτητες πορείες [39]. – [42]. Σε αντίθεση, τα γονίδια-στόχους ενεργοποιούνται από STAT3-C περιορίζονται σε άμεση δέσμευση της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης σε συναινετικές θέσεις STAT3 στο DNA. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιώντας κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με είτε v-Src ή STAT3-C μας επέτρεψε να ελέγχουν για κλωνική παραλλαγές, καθώς και αποκλίσεις στις οδούς, ανάλογα με το μηχανισμό της ενεργοποίησης STAT3 σηματοδότησης. Η χρήση πολλαπλών μικροσυστοιχιών αναπαράγεται στην προσέγγισή περαιτέρω αυξήσεις εμπιστοσύνη μας στα αποτελέσματα. Αυτό μας επέτρεψε να προσδιορίσει ένα σύνολο κοινών γονιδίων ως στόχοι της STAT3. Τα δεδομένα περαιτέρω επικυρώνονται από την αναγνώριση αρκετών προηγουμένως χαρακτηριζόμενη STAT3-ρυθμιζόμενα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων CCND1, ρ21 [22], VEGFA [17], και Mcl-1 [43]. Η πιο σημαντική υπερεκφράζεται (επαγόμενη) και υπό-εκφράζεται γονίδια (καταστέλλονται) που παρατίθενται στον Πίνακα 1 και Πίνακα 2, αντίστοιχα. Μια πιο εκτεταμένη λίστα, συμπεριλαμβανομένων των top 50 σημαντικά υπερ-εκφράζεται και υπο-εκφράζονται γονίδια που περιλαμβάνονται στους πίνακες S1 και S2.

Η

Μέχρι σήμερα, η πλειοψηφία των μελετών έχουν εξετάσει υποθετικό STAT3 γονίδια στόχους τα οποία ρυθμίζονται up-ή υπερεκφράζεται όταν STAT3 είναι ενεργή. STAT3 έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν την μεταγραφή πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στην ογκογένεση [8], η επιβίωση των κυττάρων [16], την εξέλιξη του όγκου [23] και τη μετάσταση [18]. STAT3 έχει επίσης προηγουμένως αποδειχθεί ότι καταστέλλει τη μεταγραφή ενός χούφτα γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των p53 [44] και της συνθάσης του νιτρικού οξειδίου [45] Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι STAT3 είναι ικανό να καταστέλλει την έκφραση ενός πολύ μεγαλύτερου αριθμού γονιδίων. Αυτή η νέα ανακάλυψη έχει τη δυνατότητα να επηρεάσει ριζικά την βιολογία των κυττάρων που φιλοξενούν ουσιαστικώς δραστικής STAT3.

Ένα τέτοιο γονίδιο που φαίνεται να καταστέλλεται από STAT3 είναι ο αρνητικός ρυθμιστής της ανάπτυξης Necdin. Πέντε Affymetrix probesets αντιστοιχούν σε NDN κατατάσσεται στη λίστα των top 12 πιο σημαντικά καταπιεσμένη probesets (Πίνακας 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι Necdin καταστέλλεται σημαντικά όταν STAT3 είναι ενεργά. Αυτό αποδεικνύει ότι η υπολογιστική ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό πιθανών γονιδίων στόχων STAT3 για περαιτέρω έρευνα.

Διαδρομή ανάλυση αποκαλύπτει γνωστές και νέες λειτουργίες της STAT3

μικροσυστοιχίες αξιολογήσει ταυτόχρονες αλλαγές στα επίπεδα μεταγραφής σε σε ατομική βάση, με αποτέλεσμα μια μακρά λίστα των γονιδίων τα οποία έχουν μεταβληθεί σημαντικά τα επίπεδα μεταγραφής σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο, αυτές οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση δεν συμβαίνουν ως ανεξάρτητες εκδηλώσεις μέσα στο κύτταρο, αλλά ελέγχονται με συντονισμένο τρόπο και συχνά αλληλοσυνδέονται. Διαδρομή ανάλυση είναι μια αμερόληπτη μέθοδος για να καθοριστεί εάν διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων, και οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν, εμπλουτίζονται ιδίως οδούς, δίνοντας εικόνα για την βιολογική σημασία των αλλαγών που παρατηρούνται.

υποβληθεί ο κατάλογος των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων κοινά μεταξύ v-Src και STAT3-C κύτταρα που εκφράζουν την MetaCore ™ Ανάλυση Σουίτα (GeneGO) και σε σύγκριση με αυτούς να είναι γνωστή βιολογικών οδών στη βάση δεδομένων μετα-™. Χρησιμοποιώντας αυτή την ανάλυση ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει γνωστές οδούς STAT3, συμπεριλαμβανομένης της JAK /STAT οδού και της αγγειοτενσίνης μονοπάτι /STAT. Αυτό παρέχει υποστήριξη για τη χρήση αυτών των αναλύσεων για την ταυτοποίηση νέων οδών που μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από STAT3.

Η κυτταρική πρόσφυση και κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση ήταν μεταξύ των πλέον σημαντικά εμπλουτισμένη οδούς που εντοπίστηκαν από τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (Πίνακας 3). Ο ρόλος της STAT3 σε κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση έχει προηγουμένως αναφερθεί [46]. Λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που προσδιορίζονται στην κυτταροσκελετική διεργασίες αναδιαμόρφωση, δείχνει ότι STAT3 ρυθμίζει γονίδια που εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση πρωτεΐνης, σηματοδοτώντας (οδοί ΜΑΡΚΚ και Ras), καθώς επίσης και απόκριση στην υποξία και την κυτταρική μετανάστευση.

Η

εξετάστηκαν επίσης τα γονίδια που ρυθμίζονται από STAT3 στην προσκόλληση των κυττάρων και απέδειξαν ότι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην προσκόλληση κυττάρου-μήτρας και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, σχηματισμός ιδιαίτερα εστιακή πρόσφυση, ήταν ιδιαίτερα εμπλουτισμένο όταν STAT3 είναι ουσιαστικά δραστική, όπως επίσης και αρκετά γονίδια στην προσκόλληση ιντεγκρίνης κύτταρο μονοπάτι. Ως εκ τούτου, δείχνουμε ότι υπολογιστική ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μπορεί να εντοπίσει τόσο γνωστά και νέα μονοπάτια ρυθμίζονται από STAT3.

Λειτουργίες του Induced Γονίδια

Για να προσδιοριστεί η λειτουργική ταξινόμηση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που προσδιορίζονται από SAM, πραγματοποιήσαμε Λειτουργική σχολιασμού χρησιμοποιώντας το εργαλείο στη βάση δεδομένων DAVID Βιοπληροφορικής (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [47], [48]. Ένα ευρύ φάσμα γονιδίων στόχων μεταβλήθηκαν από την ενεργοποίηση STAT3, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που εμπλέκονται στην ρύθμιση πολλαπλές οδούς βιολογικών και κυτταρικών διεργασιών, πρωτεΐνη εντοπισμού και μεταφοράς, καθώς και την ανάπτυξη οργάνων και συστημάτων (Πίνακας 4). Γονίδια εντός αυτών των κατηγοριών (Πίνακας S3. Στήλη «Affymetrix Probeset αναγνωριστικά» επεκτείνεται για να απαριθμηθούν όλες probeset IDs) περιλαμβάνουν πολλά που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και τη συντήρηση των κυττάρων, όπως λιπίδιο, νουκλεοτίδιο και την πρωτεϊνική σύνθεση, τον μεταβολισμό και /ή εντοπισμό (συμπεριλαμβανομένων VLDLR, APOL6, AK5, ΜΤΑΡ, UPP1, POP5, NUPL1, SEC61B, VDP), καθώς και μεταγωγής σήματος, τα οποία απαιτούνται για την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό.

η

STAT3 έχει ένα καλά χαρακτηρισμένο ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής, ωστόσο, δείχνουμε επίσης μέσω λειτουργικών Ανάλυση, ότι STAT3 ελέγχει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε κυτταρικές διεργασίες που απαιτούνται για τη μεταφορά των πρωτεϊνών και ρυθμίζουν υποκυτταρικό εντοπισμό τους. Αυτό υποστηρίζει την υπόθεση μας, που συντονίζει STAT3 πολλαπλές οδούς εντός του κυττάρου και αποκαλύπτει ότι STAT3 έχει ευρείες επιπτώσεις, ελέγχοντας πολλαπλών κυτταρικών οδών που εμπλέκονται στην βασικές βιολογικές διεργασίες. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η STAT3 ενορχηστρώνει μεταγραφή, μετάφραση, μεταφορά και εντοπισμού που οδηγούν σε ευρεία σημαντικές συνέπειες για την ανάπτυξη των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση.

Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες των γονιδίων στόχων STAT3, αποδείξαμε ότι STAT3 ρυθμίζει ένα ευρύ φάσμα γονιδίων τόσο σε θετικό και αρνητικό τρόπο. Τα περισσότερα γονίδια που ρυθμίζονται από STAT3 που έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα εμφανίζουν αυξημένη έκφραση στα κύτταρα όπου είναι ενεργοποιημένη STAT3. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι η STAT3 σηματοδότηση προκαλεί καταστολή πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων Necdin, η οποία θα μπορούσε να επηρεάσει βαθιά τη βιολογία των κυττάρων που φιλοξενούν μόνιμα ενεργή STAT3.

μόνιμα ενεργοποιημένη Έκφραση STAT3 μπλοκ Necdin mRNA

στη συνέχεια, έθεσε ως στόχο να επαληθεύσει την υπολογιστική ανάλυση και να επιβεβαιώσει εάν Necdin είναι στην πραγματικότητα ένα γονίδιο στόχο STAT3. NDN, το γονίδιο που κωδικοποιεί Necdin, ένας αρνητικός ρυθμιστής ανάπτυξης [31], καθώς και μέλος της οικογένειας MAGE των αντιγόνων μελανώματος που σχετίζονται, αναγνωρίστηκε ως ένα υποψήφιο γονίδιο STAT3-ρυθμίζεται. Πέντε Affymetrix probesets αντιστοιχούν σε NDN κατατάσσεται στη λίστα των top 12 πιο σημαντικά καταπιεσμένη probesets (Πίνακας 2). Σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα ελέγχου, ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι η έκφραση NDN καταστάλθηκε με συνέπεια στις κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν v-Src ή STAT3-C, υποδεικνύοντας ότι NDN είναι ένα υποψήφιο γονίδιο STAT3 ρυθμιζόμενη σε δύο από αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ . 1Α). Σχήμα 1Β. επιβεβαιώνει ότι η έκφραση NDN mRNA είναι δραματικά κάτω-ρυθμίζονται σε v-Src και STAT3-C κύτταρα που εκφράζουν, όπως μετράται με ποσοτική Real-Time PCR.

Α. Μικροσυστοιχιών Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης Necdin mRNA. RNA από κύτταρα Balb /c-3T3 σταθερώς εκφράζουν είτε pMvSrc ή pRc-STAT3-C απομονώθηκε, επεξεργασία και υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChips. Με σκοπό τον έλεγχο και για τους δύο βιολογικούς και πειραματική διακύμανση, για κάθε κυτταρική σειρά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν από τρεις διαδοχικές διόδους. Σε κάθε πέρασμα, πέντε πλάκες 10 εκ των εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα ομαδοποιήθηκαν για εξαγωγή RNA και το RNA υβριδοποιήθηκε σε ένα ενιαίο Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChip. Οι συστοιχίες σαρώθηκαν και ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα Affymetrix GeneArray 3000 GeneChip σαρωτή και η εικόνα σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό λειτουργίας GeneChip (GCOS) έκδοση 1.1 για να παράγουν CEL αρχεία που περιέχουν δεδομένα αισθητήρα στάθμης για κάθε GeneChip. Όλα τα πειράματα μικροσυστοιχιών έγιναν εις τριπλούν ανεξάρτητα πειράματα, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται για κάθε ανιχνευτή οριστεί ως μέση μεταβολή φορές σε έκφραση RNA. Τα δεδομένα για δύο διαφορετικούς probesets που παρουσιάζονται. Η ένταση του σήματος των γονικών κυττάρων Balb /c 3Τ3-τέθηκε στο 100%. Β πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR. Δείγματα RNA χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μικροσυστοιχίας μετρήθηκαν για έκφραση Necdin mRNA χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου με το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές και φθορίζοντα επισημασμένο ανιχνευτή (TaqMan® Gene Expression Δοκιμασίες, Applied Biosystems). έκφραση RNA ομαλοποιήθηκε στο 18S rRNA. n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. C. Western. ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά v-Src σπάρθηκαν (2.5 × 10

5) σε 6 cm τρυβλία ιστοκαλλιέργειας σε πλήρες μέσο 24 ώρες πριν την επιμόλυνση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με είτε 125 ηΜ siRNA ελέγχου ή 100 nm ή 125 ηΜ siRNA STAT3. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ολικής πρωτεΐνης συλλέχθηκε και ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης (100 ug) φορτώθηκαν σε 10% γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου, ηλεκτροφόρηση και ανοσοστυπώθηκαν για Necdin (πολυκλωνικά, Abcam ab18554), φωσφορυλιωμένο STAT3 (ρ-STAT3, κυτταρική σηματοδότηση 9131), η συνολική STAT3 (Santa Cruz, sc-482) και αντι-ακτίνης (μονοκλωνικά, πρωτεΐνες Sigma Α-4551).

Η

καταστολή της έκφρασης Necdin mRNA είναι STAT3 Εξαρτημένη

κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 που εκφράζουν σταθερά v-Src εκφράζουν υψηλά επίπεδα του δραστικού STAT3. Αυτά τα κύτταρα v-Src 3Τ3 υπέστησαν αγωγή είτε με έλεγχο siRNA ή δύο διαφορετικές δόσεις του STAT3 ειδικών siRNA. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με siRNA ελέγχου διατηρούν υψηλά επίπεδα STAT3 και έχουν χαμηλά επίπεδα έκφρασης Necdin (Εικ. 1Γ, λωρίδα 1). Όπως ήταν αναμενόμενο, STAT3 siRNA αποτελεσματικά ανέστειλε την έκφραση του συνόλου των STAT3 (Εικ. 1 C, διαδρομές 2 και 3). Σε αυτά τα κύτταρα, η έκφραση της πρωτεΐνης STAT3 ανεστάλη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, και η έκφραση Necdin αποκαταστάθηκε κατά τρόπο σύμφωνο με STAT3 knockdown σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η καταστολή της Necdin εξαρτάται από την ενεργοποιημένη STAT3.

Ενεργός STAT3 συνδέεται με την Necdin Διοργανωτή

in vitro

Η

Για να προσδιορίσετε αν STAT3 ρυθμίζει άμεσα τη μεταγραφή Necdin, εμείς ανέλυσε την αλληλουχία του υποκινητή NDN ποντικού [32] για τις πιθανές θέσεις σύνδεσης STAT3. Οι θέσεις συναίνεση STAT3 ορίστηκε ως παλίνδρομες αλληλουχίες με την κοινή αλληλουχία 5′-ΤΤ (N

4-6) ΑΑ-3 ‘[49]. Η ανάλυσή μας εντοπιστεί αρκετές υποψήφιες STAT3 τοποθεσίες σε όλο το 1500 ζεύγη βάσεων δεσμευτική ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο ανιχνευτές δημιουργήθηκαν για όλες τις πιθανές θέσεις σύνδεσης και δοκιμάστηκαν σε ένα διαγωνισμό EMSA (Εικ. 2Α) για την ικανότητά τους να ανταγωνίζονται για τη δέσμευση της STAT3 έναντι μιας παραλλαγής υψηλής συγγένειας της θέσης σύνδεσης STAT3 στο C-

fos

υποκινητή (hSIE) [50]. Το ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει την υποθετική θέση σύνδεσης στη θέση -558 σε σχέση με τη θέση έναρξης μεταγραφής ταυτοποιήθηκε ως να είναι σε θέση να ανταγωνιστούν πιο αποτελεσματικό με τον ανιχνευτή hSIE (Εικ. 2Α, λωρίδα 9). Επιπλέον, εξετάσαμε την ικανότητα των αυξανόμενων ποσοτήτων μη ραδιενεργού NDN /-558 ολιγονουκλεοτιδίου για να ανταγωνιστεί με το ραδιοεπισημασμένο ανιχνευτή hSIE για πρόσδεση των ενεργοποιημένων STAT3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, μια μεγάλη μοριακή περίσσεια μη επισημασμένου NDN /-558 είναι σε θέση να ανταγωνιστεί με

32Ρ-hSIE για STAT3 δεσμευτική.

Α. EMSA ανταγωνισμό. Ολιγονουκλεοτίδια για τις με νόημα και αντινόημα κλώνους όλων υποθετικές θέσεις STAT3 δέσμευσης στον προαγωγό Necdin ανοπτήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για να ανταγωνίζονται για σύνδεση STAT3 με

32Ρ-σημασμένο hSIE ολιγονουκλεοτίδιο χρησιμοποιώντας 5 ug του πυρηνικού εκχυλίσματος από κύτταρα Balb /c-3T3 σταθερώς επιμολυσμένα με v-Src ως πηγή ενεργοποιημένου STAT3. Μια θέση δέσμευσης STAT3 DNA υποψήφιος στον υποκινητή ποντικού Necdin ταυτοποιήθηκε (θέση -558 σε σχέση με την θέση έναρξης μετάφρασης). Η υψηλή συγγένεια δέσμευσης STAT3 ολιγονουκλεοτίδιο, hSIE χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. * «Supershifting» επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας αντι-STAT3 αντισώματα προστέθηκαν στην αντίδραση να επιβεβαιωθεί η παρουσία του STAT3 στο συγκρότημα. Β EMSA Ανταγωνισμού. 3Τ3 v-Src πυρηνικό εκχύλισμα επωάστηκε είτε με

32Ρ-σημασμένο δίκλωνο hSIE ολιγονουκλεοτιδίου (διαδρομές 1 και 2) ή με μη επισημασμένο, άγριου τύπου NDN /-558 ολιγονουκλεοτιδίου σε 10 έως 10

3-φορές μοριακή περίσσεια (λωρίδες 3-5) πριν από την προσθήκη

32Ρ-επισημασμένο hSIE ολιγονουκλεοτιδίων, για να ανταγωνιστεί με hSIE για δέσμευση STAT3. SS, υπερμετατόπισης με αντι-STAT3 αντισώματα. Γ EMSA. 3Τ3 v-Src πυρηνικό εκχύλισμα επωάστηκε με τις ακόλουθες

32Ρ-επισημασμένο δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια: hSIE (λωρίδες 1 και 2), NDN /-558 (λωρίδες 3 και 4), με και χωρίς αντι-STAT3 αντισώματα. δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης Δ χρωματίνης (μάρκας). κύτταρα Balb /3T3 v-Src εκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργή STAT3 χρησιμοποιήθηκαν για chip. Εν συντομία, μετά διασυνδέσεως ιστόνες στο DNA με φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επεξεργασία με υπερήχους σε διάτμηση του DNA σε μέσο μήκος των 200-1000 bp. Ένα μέρος αυτού του υλικού χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για PCR (Input). Το υπόλοιπο δείγμα επωάστηκε είτε με αντι-IgG ή αντι-STAT3 αντισώματα όλη τη νύκτα και στη συνέχεια ανοσοκαταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη Α-αγαρόζη. Το σύμπλοκο ιστόνης-ΟΝΑ ήταν αντίστροφη εγκάρσια συνδεδεμένη μετά από αρκετά στάδια έκπλυσης, και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές που περιβάλλουν τη θέση STAT3 δέσμευσης υποψηφίου στη θέση -558 στον προαγωγό NDN.

Η

A διπλής έλικας ολιγονουκλεοτίδιο

32Ρ-ραδιοεπισημασμένο DNA που αντιστοιχεί στο /-558 αλληλουχία NDN προσδιορίζονται στον υποκινητή NDN χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια σε μια EMSA για να ανιχνεύσει STAT3 σύνδεσης DNA. Ο ανιχνευτής NDN, καθώς επίσης και ο θετικός ανιχνευτής ελέγχου, hSIE, επωάστηκαν με 5 ug πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα v-Src 3Τ3 και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ιθαγενών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, ενεργοποιημένα STAT3 δεσμεύεται με την αλληλουχία υψηλής συγγένειας στο ολιγονουκλεοτίδιο hSIE (λωρίδα 1), καθώς και με την ακολουθία που προέρχεται από τον υποκινητή NDN (λωρίδα 3). Για να επιβεβαιωθεί ότι STAT3 περιέχεται στο σύμπλοκο πρωτεΐνης δέσμευσης στα ολιγονουκλεοτίδια, το πυρηνικό εκχύλισμα ήταν προ-επωάστηκαν με αντι-STAT3 αντισώματα πριν την προσθήκη του ραδιοεπισημασμένου ανιχνευτή ( «υπερμετατοπισθεί» ζώνες, λωρίδες 2 και 4). NDN /-558 δείχνει μια ασθενέστερη δραστικότητα δέσμευσης STAT3 DNA σε σύγκριση με το τεχνητό υψηλής συγγένειας STAT3 στοιχείο πρόσδεσης hSIE και η προσθήκη του αντι-STAT3 αντίσωμα μερικώς μπλοκ πρόσδεσης του ραδιενεργού ανιχνευτή. Αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει, εάν η θέση αναγνώρισης αντισώματος και ΟΝΑ τομέα δέσμευσης σε STAT3 ήταν σε στενή γειτνίαση, προκαλώντας το αντίσωμα να παρεμποδίσει μερικώς πρόσδεσης του STAT3 με τον ανιχνευτή.

Η πρόσδεση της STAT3 με την NDN Promoter

in vivo

η

για να καθοριστεί εάν STAT3 θα μπορούσε να δεσμεύσει τον προαγωγό Necdin σε άθικτα κύτταρα, δοκιμασίες ανοσοκαταβύθισης χρωματίνη (μάρκας) διεξήχθησαν σε κύτταρα 3Τ3 v-Src χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για STAT3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, η PCR απέδωσε DNA Necdin υποκινητή ανοσοκατακρημνίστηκαν με ένα αντι-STAT3 αντίσωμα στην περιοχή του υποτιθέμενου STAT3-θέση δέσμευσης -558, αλλά όχι σε μία θέση ελέγχου επί του υποκινητή NDN. Η εξειδίκευση αυτής της αλληλεπίδρασης δέσμευσης αποδεικνύεται από την έλλειψη σήματος που παράγεται όταν ένα αντίσωμα ελέγχου χρησιμοποιείται (IgG αντι-κουνελιού). Αυτά τα δεδομένα παρέχουν αποδείξεις ότι STAT3 μπορεί να δεσμεύει άμεσα τον προαγωγό Necdin σε ανέπαφα κύτταρα 3Τ3 v-Src.

Δεδομένου ότι τόσο οι δοκιμασίες EMSA και το chip δείχνουν ότι STAT3 έχει την ικανότητα να προσδένονται στον προαγωγέα NDN τόσο

σε vitro

και

in vivo

, αυτό παρέχει περαιτέρω απόδειξη ότι ο έλεγχος της έκφρασης NDN με STAT3 συμβαίνει μέσω άμεσης πρόσδεσης εκδήλωση στο υποκινητή και ότι γονιδιακή ρύθμιση λαμβάνει χώρα κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής.

Necdin έκφραση καταστέλλεται στο ανθρώπινο μελάνωμα κύτταρα

επόμενο εξέτασε κατά πόσον τα κάτω ρύθμιση των Necdin συνέβη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με ενεργό STAT3. Έκφραση Necdin έχει προηγουμένως δειχθεί ότι καταστέλλεται σε κύτταρα μελανώματος [51] έτσι εξετάσαμε αν αυτό είχε μια συσχέτιση με δραστικότητα STAT3.

φωσφορυλίωση STAT3, STAT3 δέσμευσης DNA δραστικότητα και τα συνολικά επίπεδα STAT3 έχει δειχθεί ότι αυξάνουν σε κύτταρα Α375 μελανώματος σε μία πυκνότητα τρόπο που εξαρτάται εν απουσία συνδέτη [52]. Α375 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε αύξηση της πυκνότητας και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 72 ώρες. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν από τον EMSA. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι το DNA-σύνδεσης του STAT3 αυξάνει με την κυτταρική πυκνότητα, όπως αναμένεται. Στη συνέχεια αναλύθηκαν ολική πρωτεΐνη με κηλίδα Western για έκφραση Necdin. Η Εικόνα 3Β δείχνει ότι η έκφραση του συνολικού STAT3 και φωσφορυλίωση STAT3 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε μια πυκνότητα-εξαρτώμενο τρόπο. Αντιστρόφως, καθώς αυξάνεται STAT3 ενεργοποίηση, η έκφραση Necdin ρυθμίζεται προς τα κάτω στο επίπεδο πρωτεΐνης

Α375 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε διαφορετικές πυκνότητες (σχήμα 3Α και 3Β:.. 1, 2.5, 5 ή 7,5 × 10

5 κύτταρα? Εικ 3Γ:. 10

5 και 10

6 κύτταρα) σε πλάκες 10 cm και αναπτύχθηκαν για 72 ώρες. Πυρηνικά εκχυλίσματα και συνολικής πρωτεΐνης συλλέχθηκαν. Α EMSA. Πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα Α375 επωάστηκαν με STAT3 ειδικά hSIE

32Ρ-σημασμένο δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο. Β Western blot. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματα συλλέχθηκαν από κύτταρα Α375 καλλιεργήθηκαν με διαφορετικές πυκνότητες και ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης (100 ug) φορτώθηκαν σε 10% γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου, ηλεκτροφόρηση και ανοσοστυπώθηκαν για Necdin, φωσφορυλιωμένο STAT3 (ρ-STAT3) και των ολικών πρωτεϊνών STAT3 . C. Western blot. Α375 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε δύο διαφορετικές πυκνότητες (10

5 και 10

6 κύτταρα) και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Πλάκες σπάρθηκαν σε 10

6 κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με DMSO ή CPA-7 (20 umol /L) και όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη συλλέχθηκε και αναλύθηκε με στύπωμα Western. Για πυκνομετρία, εικόνες ψηφιακά σαρωθεί και η οπτική πυκνότητα των ζωνών ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο. Η αναλογία των pSTAT3 προς το σύνολο των STAT3 υπολογίστηκε για μεμονωμένες λωρίδες.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η καταστολή της έκφρασης Necdin είναι STAT3-εξαρτώμενη, τα κύτταρα Α375 καλλιεργήθηκαν σε υψηλή πυκνότητα, και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα πριν είναι αγωγή είτε με DMSO ή τον αναστολέα STAT3-CPA-7 (20 umol /L) για 24 ώρες [53]. Η ανάλυση στυπώματος Western δείχνει ότι όταν τα κύτταρα Α375 επιστρώνονται σε χαμηλή πυκνότητα (10

5 κυττάρων), η έκφραση Necdin είναι υψηλή, ενώ ενεργοποιούνται τα επίπεδα είναι χαμηλά STAT3 (Σχ. 3C, λωρίδα 1). Κύτταρα απλώθηκαν σε υψηλή πυκνότητα (10

6 κύτταρα), (Σχ. 3C, λωρίδα 3) δείχνουν υψηλότερα επίπεδα ρ-STAT3 και μειωμένη έκφραση Necdin. Η επεξεργασία των κυττάρων Α375 υψηλής πυκνότητας με CPA-7 για 24 ώρες ανέστειλε την ενεργοποίηση STAT3 (Σχ. 3C, διαδρομή 2), και τα επίπεδα Necdin σε αυτά τα κύτταρα που αποκαθίστανται σε υψηλά επίπεδα, συγκρίσιμα με κύτταρα επιστρώνονται σε χαμηλή πυκνότητα.

IL-6 καταστέλλει Necdin έκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη

IL-6 δρα ως αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας για τον καρκίνο του προστάτη [54] και έχει συνδεθεί με την εξέλιξη των όγκων [55]. Οι IL-6 τα σήματα που μεταδίδονται μέσω της οδού JAK-STAT από υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων στα γονίδια στόχους στον πυρήνα, που περιλαμβάνει φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση STAT3 [56]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε εάν η ενεργοποίηση του STAT3 μέσω IL-6 διέγερση οδήγησε σε καταστολή της Necdin έκφραση στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη DU145 και PC3. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές φιλοξενούν χαμηλά επίπεδα συστατικώς δραστικής STAT3 [57], [58], η οποία μπορεί να προκληθεί περαιτέρω με διέγερση με IL-6. Τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 3 ώρες πριν από τη θεραπεία με IL-6 (10 nmol /L) για 12 ή 24 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη παρασκευάσθηκε και αναλύθηκε με στύπωμα Western. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η IL-6 διέγερση είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα STAT3 μέσα στα κύτταρα και όπως αποδείχθηκε αντιστοιχούν προς τα κάτω ρύθμιση έκφρασης Necdin κατά IL-6 διέγερση, σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Αυτό επιβεβαιώνει ότι η IL-6 είναι ικανή να καταστέλλει την έκφραση Necdin μέσω STAT3 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

A. κηλίδα Western. Η ολική πρωτεΐνη από DU145 και PC3 κύτταρα επεξεργασμένα με IL-6 (10 nmol /L) για 12 ή 24 ώρες αναλύθηκε με στύπωμα Western. B. Η ολική πρωτεΐνη συλλέχθηκε από MDA-MB-468, MDA-MB-231 και MCF-7 κύτταρα και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western. C. Τα κύτταρα MCF-7 σπάρθηκαν και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα προτού παροδικά επιμολυσμένα με τον έλεγχο (GFP), pMvSrc ή pRc /CMV-STAT3-C πλασμίδια χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη PLUS. Η συνολική πρωτεΐνη συλλέχθηκε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western. Για πυκνότητας, εικόνες ψηφιακά σάρωση και οπτική πυκνότητα των ζωνών μετρήθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο.

Η

Necdin έκφραση συσχετίζεται με STAT3 δραστηριότητα στον ανθρώπινο καρκίνο του μαστού κύτταρα

από EGFR και Src μονοπάτια σηματοδότησης συμβάλλουν στην ενεργοποίηση STAT3 σε καρκίνους του μαστού [15], [34], αξιολογήσαμε Necdin επίπεδα έκφρασης σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού με διαφορετικά επίπεδα ενδογενούς δραστικότητας STAT3. Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι η ρ-STAT3 επίπεδα πρωτεΐνης ήταν υψηλή σε MDA-MB-468 κύτταρα, ελαφρώς χαμηλότερο σε MDA-MB-231 και πολύ χαμηλή σε κύτταρα MCF-7. έκφραση Necdin πρωτεΐνη αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα ρ-STAT3, που εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε MDA-MB-468 και τα κύτταρα 231 MDA-MB-αλλά παρουσίασαν πολύ υψηλότερη έκφραση σε κύτταρα MCF-7.

Για να δοκιμαστεί η υπόθεση ότι συστατικώς ενεργοποιημένη STAT3 έχει αιτιώδη ρόλο στην καταστολή της έκφρασης Necdin σε καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε κατά πόσο παροδική ενεργοποίηση σηματοδότησης STAT3 θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω Necdin έκφρασης. κύτταρα MCF7 εκφράζουν υψηλά επίπεδα Necdin (Σχήμα 4C, λωρίδα 1 & amp?. 4), ωστόσο, όταν παροδικά επιμολυσμένα με v-Src ή STAT3-C για 48 ώρες, η έκφραση πρωτεΐνης Necdin αναστέλλεται. Αυτό αποδεικνύει ότι ακόμη και μια παροδική 2-πλάσια αύξηση στην ενεργοποίηση STAT3 σε αυτά τα κύτταρα είναι επαρκής για να καταστείλει αποτελεσματικά την έκφραση του Necdin. (Σχήμα 4C, λωρίδα 3 & amp?. 6)

Συζήτηση

Η μεταγραφική προφίλ ενός κυττάρου που εκφράζει συστατικώς δραστικό STAT3 προβλέπεται να είναι πολύ διαφορετικά σε σύγκριση με ένα κύτταρο όπου STAT3 είναι υπό αυστηρή ρύθμιση. Η αρχική μας υπόθεση ήταν ότι η STAT3 προωθεί εκτεταμένες αλλαγές στην παγκόσμια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης, συμπεριλαμβανομένων των άμεσων και έμμεσων στόχων. Πήραμε μια ευρεία προσέγγιση μελετώντας τις αλλαγές της παγκόσμιας γονιδιακή έκφραση χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών σε κύτταρα που εκφράζουν συστατικά που ενεργοποιούνται STAT3.