Abstract

Ανώμαλη microRNA (miRNA) έκφραση έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων, και τέτοια απορύθμιση μπορεί να προκύψει από παρεκκλίνουσα μεθυλίωση DNA. Ενώ ένας μικρός αριθμός miRNAs είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA, έχουμε δεδομένο ότι τέτοιες επιγενετική ρύθμιση είναι πιο διαδεδομένη. Με το συνδυασμό MBD-απομονωθεί Genome Sequencing (MIGS) για την αξιολόγηση προτύπων μεθυλίωσης του DNA του γονιδιώματος-ευρεία και ανάλυση μικροσυστοιχιών για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των miRNAs, εμείς συστηματικά αναζήτηση για τις υποψήφιες miRNAs ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε 64 miRNAs να μεθυλιωμένο γερά στα κύτταρα HCT116? Δεκαοκτώ από αυτούς που βρίσκονται στην αποτύπωση περιοχές ή που έχουν ήδη αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA. Για τις υπόλοιπες 46 miRNAs, τα επίπεδα έκφρασης των 18 ήταν συνεπής με την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA τους. Τέλος, 8 miRNAs ήταν πάνω ρυθμισμένα με κατεργασία 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και προσδιορίζονται ότι είναι νέα miRNAs ρυθμίζονται από μεθυλίωσης DNA. Επιπλέον, δείξαμε τη λειτουργική σημασία αυτών των επιγενετικώς σιγήσει miRNAs με εκτοπικά εκφράζοντας επιλογή των υποψηφίων, η οποία οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης και της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων. Εκτός από την αναφορά αυτών των ευρημάτων, η μελέτη μας παρέχει επίσης μια αξιόπιστη, συστηματική στρατηγική για τον εντοπισμό DNA miRNAs μεθυλίωση-ρυθμίζονται με το συνδυασμό προφίλ μεθυλίωσης του DNA και τα δεδομένα έκφρασης

Παράθεση:. Yan H, Choi Aj, Lee BH, Τινγκ AH (2011) Ταυτοποίηση και λειτουργική ανάλυση επιγενετικώς κατασιγασμένου Τα microRNAs στα κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (6): e20628. doi: 10.1371 /journal.pone.0020628

Επιμέλεια: Axel Imhof, Ludwig-Maximilians-Universität München, Γερμανία

Ελήφθη: 24η Ιανουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 6 Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 16, Ιουν, 2011

Copyright: © 2011 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης. RNAs που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και παίζουν κεντρικούς ρόλους σε κανονικές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και απόπτωσης [1]. Τόσο ανώμαλη έκφραση και αποσιώπηση miRNAs έχουν παρατηρηθεί σε ανθρώπινους καρκίνους, υποδεικνύοντας πιθανές λειτουργίες ογκογόνο και ογκοκατασταλτικό για αυτά τα miRNAs [2], [3]. Η βιογένεση των miRNAs περιλαμβάνει τη μεταγραφή μιας μακράς πρωτογενούς μεταγραφής (PRI-miRNA) από την RNA πολυμεράση II [4], η διάσπαση σε ένα ενδιάμεσο προϊόν (προ-miRNA) με Drosha [5], και την τελική επεξεργασία στην ώριμη miRNA με Dicer [ ,,,0],6]. Κάθε βήμα της διαδικασίας ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό, και απορρύθμισης σε οποιοδήποτε επίπεδο μπορεί να οδηγήσει σε ακατάλληλη λειτουργίες miRNA. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη μελέτη μας είναι miRNA μεταγραφική ρύθμιση από μεθυλίωση του DNA. Γενικά, το DNA προαγωγέα γονίδιο μεθυλίωσης συσχετίζεται αρνητικά για την έκφραση του γονιδίου και μπορεί να ευθύνεται για παρεκκλίνουσα γονιδιακή σίγηση ογκοκατασταλτικό σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [7]. Παρόμοια με αυτά τα POLR2A μεταγράφεται κωδικοποίησης γονίδια πρωτεϊνών, miRNA μεταγραφής μπορεί επίσης να σιγήσει προαγωγέα DNA μεθυλίωση.

επιγενετικώς σιγήσει miRNAs έχουν ανακαλυφθεί σε καρκίνους βασίζεται σε διαφορική έκφραση μεταξύ των φυσιολογικών ιστών και όγκων ή μεταξύ της βάσης αναφοράς και DNA απομεθυλιωθεί καρκίνο κύτταρα. Για παράδειγμα, Bandres

et al.

Προσδιορίζονται πρώτα 23 miRNAs που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πρωτογενείς ορθοκολικούς καρκίνους σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό επιθήλιο παχέως εντέρου και στη συνέχεια ανακάλυψαν ότι miR-129-2, miR-9-1, και miR -137 οι σιγήσει από μεθυλίωση του DNA στον καρκίνο [8]. Toyota

et al.

Θεραπεία του καρκίνου του παχέος HCT116 κυττάρων με το παράγοντα απομεθυλίωσης, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) και σύγκριση προφίλ έκφρασης miRNA μεταξύ του επεξεργασμένου και των μη επεξεργασμένων κυττάρων για τον εντοπισμό αποσιώπηση του miR-34b /c από το DNA προαγωγός υπερμεθυλίωση [9]. Επιπλέον, Lujambio

et al.

Σύγκριση του προφίλ έκφρασης των miRNAs των κυττάρων άγριου τύπου HCT116 με εκείνη του απομεθυλιωμένου ισογονιδιακές παραγώγων του, το DNA μεθυλοτρανσφεράση -1 και -3β διπλό νοκ-άουτ (ϋΚΟ) κύτταρα, και βρήκαν 18 miRNAs πάνω ρυθμισμένα σε ϋΚΟ κύτταρα [10]. Στη συνέχεια, επιβεβαίωσαν ότι μεθυλίωση του DNA είναι υπεύθυνη για την αποσιώπηση του miR-124a στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μια αναζήτηση της βιβλιογραφίας χρησιμοποιώντας MEDLINE αποκάλυψε ότι οι 16 miRNAs είναι γνωστό ότι σιγήσει επιγενετικώς από μεθυλίωση του DNA [8], [9 ], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Μεθυλίωσης του DNA αναφέρεται στην ομοιοπολική προσθήκη μιας ομάδας μεθυλίου στην θέση-5 του κυτοσίνες, συνήθως σε ένα πλαίσιο δινουκλεοτίδιο CpG σε διαφοροποιημένα κύτταρα θηλαστικών [18]. Περιοχές του γονιδιώματος με υψηλή πυκνότητα των CpGs ονομάζονται νησιά CpG και είναι συχνά οι θέσεις των ρυθμιστικών μεθυλίωσης του DNA. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το 16% των σχολιασμένη ανθρώπινα miRNAs βρίσκονται μέσα 1000 bp του νησιού CpG [19], μπορούμε να υποθέσουμε ότι η επιγενετική ρύθμιση των miRNAs θα μπορούσε να είναι πιο συχνές από ό, τι αναφερθεί μέχρι στιγμής. Προηγούμενες μελέτες στηρίχθηκε σε διαφορική έκφραση των miRNAs για τον εντοπισμό των υποψηφίων για τις επόμενες επιγενετικές αξιολόγηση. Η προσέγγιση αυτή εισάγει μεροληψία που περιορίζει τον αριθμό των επιγενετικώς ρυθμιζόμενης miRNAs που μπορεί να ανακαλυφθούν. Για παράδειγμα, miRNAs ιστοειδική που ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA μπορεί να είναι ισοδύναμα μεθυλιωμένα σε φυσιολογικούς ιστούς και όγκους, με αποτέλεσμα την έλλειψη της διαφορικής έκφρασης μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων. Επιπλέον, miRNAs με χαμηλά επίπεδα έκφρασης δεν μπορεί να προσδιοριστεί αξιόπιστα, διότι οι διαφορές στην έκφραση μεταξύ της κανονικής και του καρκίνου ή μεταξύ βάσης και απομεθυλιωμένο συνθήκες πιθανότατα θα πέσουν κάτω από τα συμβατικά αποκοπές (μεταξύ 2 και 1,5 φορές). Τέλος, υπολειμματική μεθυλίωση επιμένει στις δύο φαρμακολογικά και γενετικά απομεθυλιωθεί κύτταρα [20]. Όπως η μεθυλίωση μπορεί να είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, ενδεχομένως μέσω επίμονη καταστολή των βασικών miRNAs. Αυτό θα οδηγούσε σε τέτοιες miRNAs δεν έχει προσδιοριστεί μέσω στρατηγικών έκφρασης που βασίζεται.

Για να ξεπεραστεί η προκατάληψη ανακάλυψη που θεσπίστηκε με τη στρατηγική αναγνώριση της έκφρασης που βασίζεται, θα χρησιμοποιηθεί άμεσα τα παγκόσμια πρότυπα μεθυλίωσης DNA για την αναγνώριση miRNAs ρυθμίζεται από μεθυλίωσης του DNA σε HCT116 και ϋΚΟ καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Έχουμε χαρτογραφήθηκαν στο παρελθόν γονιδιώματος σε επίπεδο μεθυλίωσης του DNA σε αυτές τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας περιοχή πρόσδεσης μεθυλο CpG (MBD) -isolated Genome Sequencing (MIGS) [21]. Εμείς εντοπίστηκε για πρώτη φορά miRNAs με εγγύς μεθυλίωσης του DNA ως υποψήφιοι. Στη συνέχεια διασταυρώνονται σε τον κατάλογο των υποψηφίων με τα στοιχεία έκφρασης των miRNAs ως αποδεικτικά στοιχεία. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, εντοπίσαμε με επιτυχία και τα δύο miRNAs μεθυλίωση ρυθμιζόμενων γνωστά και νέα DNA. Εδώ σας παρέχουμε ένα πιο περιεκτικό κατάλογο επιγενετικώς ρυθμίζονται miRNAs σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, αποδεικνύοντας ότι επιγενετική ρύθμιση των miRNAs είναι διαδεδομένη σε αυτές τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, οι λειτουργικές μελέτες επιλέξτε miRNAs παρέχουν βιολογική σημασία για την εν λόγω επιγενετική ρύθμιση στο πλαίσιο του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Υποψήφιος miRNAs ρυθμίζεται από μεθυλίωσης του DNA εντοπίστηκαν από εγγύς γονιδιωματική μεθυλίωση του DNA και τη στήριξη της έκφρασης δεδομένων

Σας χρησιμοποιηθεί προηγουμένως Μιγκ για την κατασκευή του γονιδιώματος σε επίπεδο προφίλ μεθυλίωσης DNA για την HCT116 κυτταρική σειρά και απομεθυλιωμένο ισογονικούς κυτταρική σειρά του, DKO [21]. κύτταρα ϋΚΟ είναι κύτταρα HCT116 διαγράφονται για το DNA μεθυλοτρανσφεράση -1 και -3β και διατηρούν & lt? 5% γενωμικού μεθυλίωσης του DNA [20]. DNA μεθυλιωμένο κλάσματα του γονιδιώματος απομονώθηκαν με επώαση με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες MBD, αλληλουχήθηκαν σε αλληλουχητή Illumina GAII, και χαρτογραφήθηκαν πίσω στο γονιδίωμα αναφοράς για να δημιουργήσει μεμονωμένα προφίλ methylome. Για τον εντοπισμό DNA miRNAs μεθυλίωση-ρυθμίζονται, ψάξαμε για miRNAs με αποδεικτικά στοιχεία της μεθυλίωσης του DNA μέσα σε 500 bp σχολιασμένες θέσεις τους σε HCT116 και τα κύτταρα DKO. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, εντοπίσαμε 64 υποψήφιες miRNAs για μεταγενέστερη ανάλυση (Σχήμα 1).

Η

Από τις 64 υποψήφιες miRNAs, 13 έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από DNA μεθυλίωση (Πίνακας S1). Ένα άλλο 5 ανήκουν σε μια μεγάλη συστάδα miRNA που βρίσκεται στο ανθρώπινο DLK1-GTL2 αποτυπώνεται τομέα σε 14q32 και σιγήσει στο πατρικό χρωμόσωμα από μεθυλίωση του DNA [22]. Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στα εναπομείναντα 46 miRNAs που δεν έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από τη μεθυλίωση του DNA για λεπτομερή επικύρωσης. Κατ ‘αρχάς, θα επιλέγονται τυχαία 6 miRNAs για ανάλυση θειώδους αλληλουχίας για την επαλήθευση της κατάστασης μεθυλίωσης του DNA ανιχνεύεται από MIGS (Σχήμα 2 και Σχήμα S1). Τα δεδομένα διθειώδες αλληλούχισης επιβεβαίωσε τα στοιχεία ΜΟΒΚ σε όλα τα 6 τόπους.

Bisulfite αλληλούχισης διεξήχθη για (Α) miR-941, (Β) miR-1237, και (Γ) miR-1247 σε γονικά κύτταρα HCT116 , κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 5 μΜ 5-αζα-dC για 48 ώρες, και τα κύτταρα ϋΚΟ. Η UCSC οθόνη συλλαμβάνει το πρόγραμμα περιήγησης γονιδιώματος δείχνει το σήμα της μεθυλίωσης του DNA σε κάθε δείγμα. Τα ορθογώνια επισημάνετε τις περιοχές που έχουν επικυρωθεί από το όξινο θειώδες αλληλουχίας. Κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει ένα δινουκλεοτίδιο CpG. Μαύρο κύκλοι αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένα κυτοσίνες ενώ λευκό κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένα κυτοσίνες.

Η

Στη συνέχεια, αιτιολογημένη ότι η απώλεια της μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα ϋΚΟ όταν συγκρίνονται με κύτταρα HCT116 πρέπει να οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση των υποψηφίων miRNAs ενώ κατακράτησης μεθυλίωσης του DNA θα πρέπει να συσχετίζονται με επίμονη αποσιώπηση των υποψηφίων miRNAs. Επομένως, εξετάσαμε τα δεδομένα μικροσυστοιχίας έκφρασης για τα 46 υποψηφίους σε HCT116 κύτταρα και ϋΚΟ (Πίνακας S2). Χρησιμοποιώντας 1,5 φορές αλλαγή ως κατώφλι μας, εντοπίσαμε 18 miRNAs ως έχουσα συνεπή δεδομένα έκφρασης με την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA σε HCT116 και τα κύτταρα DKO (Πίνακας S1). Πραγματοποιήσαμε ανάλυση miRNA-συγκεκριμένους ποσοτικούς πραγματικού χρόνου RT-PCR (miR-qRT-PCR) για 6 επιλέξτε miRNAs για την επαλήθευση των στοιχείων της έκφρασης καθορίζεται από το μικροσυστοιχιών (Εικόνα S2). Τα αποτελέσματα miR-qRT-PCR επιβεβαίωσε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών για τις 6 miRNAs, η οποία περιελάμβανε και τις δύο γνωστές και τις υποψήφιες μεθυλίωσης του DNA ρυθμίζεται miRNAs. Ως εκ τούτου, με βάση την εμπειρική γονιδιωματική μεθυλίωση του DNA και τα συνοδευτικά στοιχεία έκφρασης μικροσυστοιχιών, εντοπίσαμε 18 νέα υποψήφια miRNAs που μπορεί να ρυθμίζεται μεταγραφικά από μεθυλίωση του DNA.

Υποψήφιος miRNAs εκ νέου ρητή μετά από θεραπεία 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης

για να επικυρώσετε ότι οι υποψήφιες miRNAs πράγματι ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA, που αντιμετωπίζονται HCT116, RKO, και DLD1 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα με τον παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης (5-αζα-dC) για να προσδιοριστεί εάν τα miRNAs επανα-εκφράζεται μετά από αγωγή 5-αζα-dC. Όπως μεθυλίωσης του DNA ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση στο μεταγραφικό επίπεδο, προσδιορίστηκαν για την έκφραση των πρωτογενών miRNAs (Pri-miRNA) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR [23]. περιλαμβάνονται Pri-miR-193a, -9-3, και -375, τα οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται μεταγραφικά από μεθυλίωση του DNA σε κύτταρα HCT116 [8], ως θετικοί μάρτυρες και Pri-miR-1224, το οποίο διμεθυλιοποιήθηκε αλλά παρέμεινε σιγήσει στο κύτταρα ϋΚΟ σε αυτή τη μελέτη, ως αρνητικός έλεγχος. Δοκιμάσαμε 17 από τα 18 νέων υποψηφίων, διότι κανένας από τους εκκινητές που σχεδιάστηκαν για miR-1234 απέδωσε επιτυχημένα προϊόντα της PCR. Σε κύτταρα HCT116, βρήκαμε 11 από 17 miRNAs να είναι σημαντικά επάνω ρυθμισμένη μετά από αγωγή 5-αζα-dC (Σχήμα 3Α). Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω ανεξάρτητα όλα 11 υποψηφίων σε κύτταρα RKO (Σχήμα 3Β) και 10 από τους 11 υποψηφίους σε κύτταρα DLD1 (Σχήμα 3C). Για να βεβαιωθείτε ότι το up-ρύθμιση αυτών των miRNAs ήταν συνακόλουθη με το DNA απομεθυλίωση μετά από 5-αζα-dC θεραπεία, θα αξιολογηθούν οι αλλαγές στην κατάσταση μεθυλίωσης του DNA στα εγγύς περιοχές του miR-941-1/3, miR-1237 και miR-1247 με όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση (Σχήμα 2). Απομεθυλίωση παρατηρήθηκε σε αυτές τις θέσεις στα κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-dC, υποστηρίζοντας ότι η εκ νέου έκφραση που παρατηρείται οφείλεται στο DNA απομεθυλίωση.

Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR διεξήχθη για την αξιολόγηση υποψήφιων πρωτογενή miRNAs (Pri-miRNAs) επίπεδα στο (Α) HCT116, (Β) RKO, και κύτταρα (C) DLD1 πριν και μετά τη θεραπεία με 5 μΜ 5-αζα-dC για 48 ώρες. miR-1224 συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. miR-193a, miR-375 και miR-9-3 συμπεριλήφθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. * Υποδηλώνει σημαντική αύξηση στην έκφραση Pri-miRNA μετά από θεραπεία 5-αζα-dC (ρ & lt? 0,05). Εκφράσεις των miRNAs ήταν εσωτερικά ομαλοποιηθούν τα επίπεδα έκφρασης του

GAPDH

, και κανονικοποιημένη έκφραση για κάθε miRNA πριν από 5-αζα-dC θεραπείες ορίσθηκε σε 1.

Η

Τέλος, ιντρονικές miRNAs μπορούν να συν-μεταγράφεται από υποκινητές γονιδίων του ξενιστή και ως εκ τούτου, δεν είναι ανεξάρτητα ρυθμίζονται στο μεταγραφικό επίπεδο [24], [25]. Ως εκ τούτου, για να κατανοήσει πλήρως τη σημασία της μεθυλίωσης του DNA που παρατηρήθηκε για 10 υποψήφιες miRNAs μας, εξετάσαμε τις γονιδιωματικής πλαίσια των 10 υποψηφίων πιο στενά (Πίνακας 1). miR-1247, miR-1826, και miR-219-2 βρίσκονται σε διαγονιδιακές περιοχές και, ως εκ τούτου, είναι απίθανο να είναι συν-ρυθμίζεται από ένα υποκινητή του γονιδίου υποδοχής. Τα υπόλοιπα 7 υποψήφιοι που βρίσκονται σε εσώνια της REFSEQ ή EST μεταγραφές και μελετήθηκαν περαιτέρω. Με βάση τα γονιδιώματος σε επίπεδο προφίλ μεθυλίωσης του DNA, κανένα από τα υποθετικών γονιδίων του ξενιστή, με εξαίρεση το μη κωδικοποιητικό RNA

ANKRD30BL

, έχουν σημαντικές μεθυλίωσης του DNA στο υποκινητές τους (Πίνακας 1 και Σχήμα S3), υποδηλώνοντας ότι αυτές υποθετική γονίδια υποδοχής δεν ρυθμίζονται από προαγωγέα DNA μεθυλίωση.

η

Παρ ‘όλα αυτά, εμείς ως αίτημα ότι αν η υποτιθέμενη μεταγραφή του γονιδίου υποδοχής υπαγορεύει την έκφραση των ενσωματωμένων υποψήφια miRNAs, θα πρέπει να ανιχνεύσει αυξημένη έκφραση του γονιδίου υποδοχής μετά από 5- επεξεργασία αζα-dC IN κύτταρα HCT116, RKO, και DLD1. Τέτοιες αυξήσεις στην έκφραση του γονιδίου-ξενιστή θα αντιστοιχούν στις αυξήσεις που παρατηρήθηκαν για τις ενσωματωμένες miRNAs σε αυτά τα ίδια κύτταρα μετά από αγωγή 5-αζα-DC. Αντιστρόφως, εάν τα υποθετικών γονιδίων του ξενιστή δεν αποκρίνονται σε 5-αζα-dC θεραπεία με τον ίδιο τρόπο όπως το ενσωματωμένο miRNAs, τα miRNAs είναι πιθανό μεταγράφονται ανεξάρτητα από τα πιθανά γονίδια ξενιστή. Σε αυτό το τελευταίο σενάριο, μεθυλίωση του DNA ανακαλύψαμε κοντά στα miRNAs θα είναι πιο σημαντική στη ρύθμιση της μεταγραφής τους. Με βάση τα αποτελέσματα qRT-PCR, διαπιστώσαμε ότι το miR-1237, miR-602, miR-941-1, miR-941-3, και miR-663Β είναι μεταγραφικά ανεξάρτητα από τις αντίστοιχες υποθετικό γονίδια που τους φιλοξενούν (Σχήμα 4). Η έκφραση του

ANKRD30BL

, το υποτιθέμενο γονίδιο υποδοχής για miR-663Β, δεν ήταν ανιχνεύσιμη πριν ή μετά τα πειράματα 5-αζα-άΟ και, ως εκ τούτου, δεν απεικονίζονται στο Σχήμα 4. Για miR-24-1 και ΜΙΚ 27β, τα δεδομένα είναι λιγότερο πειστικά, και δεν μπορούσε να αποκλείσει ότι τα δύο αυτά mi-RNAs μπορεί να συν-συντεθεί με το γονίδιο υποδοχής,

C9orf3

[26]. Συνολικά, εντοπίσαμε και επιβεβαιώνονται τουλάχιστον 8 νέα miRNAs που μεταγραφικά ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA.

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR διεξήχθη για να αξιολογηθεί υποτιθέμενο γονιδιακής έκφρασης ξενιστή σε απόκριση σε 5-αζα-dC θεραπείες σε HCT116 (μπλε), RKO (σκούρο ροζ), και DLD1 (κίτρινο). Οι αλλαγές στις ενσωματωμένες έκφραση miRNA επίσης χαράσσεται για side-by-side συγκρίσεις. Όλες οι εκφράσεις εσωτερικά κανονικοποιήθηκαν με τα επίπεδα έκφρασης του

GAPDH

, και κανονικοποιημένη έκφραση για κάθε γονίδιο υποδοχής και miRNA πριν θεραπείες 5-αζα-άΟ ορίσθηκε σε 1.

Η

ΜΙΚ 941 και miR-1247 αύξηση καταστολή των κυττάρων και τη μετανάστευση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Εμείς προχώρησε σε δοκιμή των βιολογικών λειτουργιών αυτών επιγενετικώς ρυθμιζόμενης miRNAs να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με τη σημασία της μεθυλίωσης του DNA τους σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Για να καθοριστεί εάν η έκφραση αυτών των επιγενετικώς σιγήσει miRNAs θα επηρεάσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση, έχουμε επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 με miRNA μιμείται του miR-941 (την ώριμη μορφή του miR-941-1 και -3), miR-1237, miR-1247 , και ένα μη-κωδικοποίησης αρνητικός έλεγχος (Neg Allstars.).

Πρώτον, εκτελέσαμε ανάλυση ανάπτυξη καμπύλη (Σχήμα 5Α) και ΜΤΤ δοκιμασία (Σχήμα 5Β) για να αξιολογήσει την ανάπτυξη των κυττάρων και μεταβολική ικανότητα. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-1247 είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην ανάπτυξη HCT116 κυττάρων και μεταβολική δραστηριότητα, όπως μετράται από τις δύο δοκιμασίες, αντίστοιχα. δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU ανεξάρτητα επαλήθευσε ότι η μειωμένη ανάπτυξη και το μεταβολισμό είναι πιθανό μια συνέπεια της μειωμένης πολλαπλασιασμό σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 5C). Παρατηρήσαμε μια παρόμοια μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μεταβολική λειτουργία σε DLD1 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα επιμολυσμένα με miR-1247 μιμούνται (Σχήμα S4A και Β). Αντίθετα, στα κύτταρα DKO, όπου miR-1247 είναι ήδη απομεθυλιωθεί και εκ νέου εξέφρασε, επιμόλυνση με επιπλέον miR-1247 μιμείται δεν είχε επιπτώσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων και το μεταβολισμό (Σχήμα S5A και Β). Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι miR-1247 μπορεί να είναι ογκο-κατασταλτική στον καρκίνο του παχέος εντέρου και ως εκ τούτου επιγενετικές σίγηση του είναι επωφελής για την ανάπτυξη του καρκίνου.

Καμπύλες ανάπτυξης (Α) και (Β) δοκιμασίες ΜΤΤ του mock επιμολυσμένων κυττάρων HCT116 και HCT116 κύτταρα επιμολυσμένα με μη-κωδικοποίησης αρνητικός έλεγχος miRNA (Allstars Neg.), miR-941, miR-1237, ή miR-1247 μιμείται. δοκιμασία ενσωμάτωσης (C) BrdU του mock επιμολυσμένων κυττάρων HCT116 και τα κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με μη-κωδικοποίησης αρνητικός έλεγχος miRNA (Allstars Neg.), miR-941, ή ​​miR-1247. Ένας εκπρόσωπος πεδίο για κάθε πειραματική συνθήκη εμφανίζεται. Το γράφημα ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ποσοστό (%) των BrdU θετικών κυττάρων. (D) Δοκιμασία επούλωση της πληγής για mock επιμολυσμένων κυττάρων HCT116 και κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (Allstars Neg.), MiR-941, miR-1237, ή miR-1247 μιμείται. Οι φωτογραφίες λήφθηκαν αμέσως μετά τον τραυματισμό και 16 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν και ομαλοποιούνται στη mock επιμολυσμένων κυττάρων. δοκιμασίες (Ε) Transwell μετανάστευση για mock επιμολυσμένων κυττάρων HCT116 και κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (Allstars Neg.), miR-941, ή ​​miR-1247 μιμείται. Αντιπροσωπευτικά πεδία μεταστατικών κυττάρων επί της μεμβράνης εμφανίζονται. Το γράφημα ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο αριθμό των κυττάρων στην κάτω πλευρά των μεμβρανών σε κάθε θεραπεία κανονικοποιήθηκε προς ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα.

Η

Επιπλέον, υπολογιστικά προέβλεψε στόχους του miR-941 και miR-1247 συμπεριλαμβάνονται πολλά γονίδια που εμπλέκονται σε κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Για παράδειγμα, ADAM μεταλλοπεπτιδάση τομέα 15 (

ADAM15

) είναι ένα προβλεπόμενο στόχο του miR-1247 και κωδικοποιεί μια γλυκοπρωτεΐνη διαμεμβράνης σημαντική για την κυτταρική προσκόλληση [27]. Εμείς αξιωματική ότι κάτω ρύθμιση αυτών των προβλεπόμενων στόχων από έκτοπη έκφραση του miR-941 και miR-1247 θα επηρεάσει αρνητικά τη μετανάστευση των κυττάρων. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε τα αποτελέσματα της έκτοπη έκφραση του miR-941, miR-1237, και miR-1247 σχετικά με την κινητικότητα των κυττάρων σε κύτταρα HCT116. Στις δοκιμασίες επούλωση της πληγής, κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με miR-941 και miR-1247 μιμείται ήταν σημαντικά μειωμένη στην ικανότητά τους να ανασυστήσουν τραυματίες περιοχές σε σύγκριση με mock, αρνητικός έλεγχος, ή miR 1237-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 5D). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με τη χρήση της δοκιμασίας μετανάστευσης transwell (Σχήμα 5Ε). Τέλος, παρόμοια κατασταλτικές δράσεις για τη μετανάστευση κυττάρων ανεξάρτητα παρατηρηθεί σε κύτταρα DLD1 (Σχήμα S4C) και τα κύτταρα DKO (Σχήμα S5c) επιμολυσμένα με miR-941 και miR-1247 μιμείται. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η επιγενετική αποσιώπηση του miR-941 και miR-1247 μπορεί να διευκολύνει την μετανάστευση καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων και εισβολή.

Συζήτηση

Τα microRNAs είναι σημαντικά ρυθμιστικά μόρια που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση σε τόσο αναπτυξιακές και ασθένειας διεργασίες. ρύθμισή τους είναι, ως εκ τούτου, ένα κρίσιμο συστατικό για την κατανόηση κάθε βιολογικό πλαίσιο. Γονιδιωματικό DNA μεθυλίωση έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τη μεταγραφή μιας χούφτας miRNAs στον καρκίνο. Αυτές οι προηγούμενες μελέτες που αποσκοπούν στον εντοπισμό DNA miRNAs μεθυλίωση ρυθμίζονται στηρίχθηκε για τον προσυμπτωματικό έλεγχο για διαφορικά εκφρασμένων miRNAs από καρκίνο και φυσιολογικό συγκρίσεις ή την εκ νέου έκφραση των miRNAs στο DNA απομεθυλιούνται συνθήκες. Μια έκφραση που βασίζεται σε προσέγγιση που εισάγει μια ανακάλυψη προκατάληψη εναντίον ισοδύναμα μετουσιωμένο, ως εκ τούτου ισοδύναμα σιγήσει, miRNAs στις ομάδες σύγκρισης. Αυτό το είδος της επιγενετικώς ρυθμιζόμενων miRNA μπορούσε ακόμα να είναι σημαντική για την ανάπτυξη του καρκίνου. Για παράδειγμα, ισοδύναμα σιγήσει miRNAs σε κανονικές και καρκίνος μπορεί να είναι σημαντική για τον καρκίνο σε έναν ιστό-ειδικό τρόπο. Επιπλέον, τα υπολείμματα της μεθυλίωσης του DNA σε επαγόμενες συνθήκες απομεθυλίωση μπορούσε να στηρίξει αποσιώπηση των κρίσιμων miRNAs, με αποτέλεσμα την έλλειψη ανιχνεύσιμων διαφορικής έκφρασης και την αποτυχία να εντοπίσει τέτοια επιγενετικώς ρυθμιζόμενη miRNAs. Τέλος, miRNAs με οριακή διαφορική έκφραση κάτω από τυπικές κατώτατα όρια θα ήταν επίσης να χαθεί, όταν ο έλεγχος βασίζεται αποκλειστικά σε διαφορική έκφραση.

Για να ξεπεραστούν τα παραπάνω προκαταλήψεις και συνολικότερα τον εντοπισμό DNA miRNAs μεθυλίωση-ρυθμίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, που προβλήθηκε για τις υποψήφιες miRNAs με βάση εμπειρικά στοιχεία της γονιδιωματικής μεθυλίωσης του DNA σε HCT116 και DKO καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Εμείς συστηματικά έψαξε το DNA methylome χάρτες που δημιουργούνται από Μιγκ σε αυτά τα κύτταρα για miRNAs βρίσκονται εντός 500bp σημάτων μεθυλίωσης του DNA. Βρήκαμε 64 υποψηφίους, μεταξύ των οποίων 5 γνωστό αποτυπώνεται miRNAs, 13 γνωστοί DNA miRNAs μεθυλίωση-ρυθμίζεται, και 46 νέες υποψηφιότητες. Στη συνέχεια, έχουμε επιβεβαιώσει ότι 8 νέες υποψήφιοι ήταν πράγματι ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA σε HCT116, DKO, RKO, και DLD1 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Μαζί με την ανίχνευση γνωστών DNA-μεθυλίωση ρυθμίζονται miRNAs, η μελέτη μας εντόπισε συνολικά 26 επιγενετικώς ρυθμιζόμενης miRNAs, αποδεικνύοντας ότι η προσέγγισή μας είναι αποτελεσματική και αποδοτική.

Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι μπορεί να εξακολουθεί να λείπει το DNA μεθυλίωση ρυθμιζόμενων miRNAs προέρχονται από μακρά πρωτογενή μεταγραφές. Προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν στις miRNAs με ακολουθίες stem-loop τους ενσωματώνονται σε ή κοντά σε νησίδες CpG, και την τρέχουσα μελέτη μας επικεντρώθηκε σε miRNAs με μεθυλίωση του DNA εγγύς προς τις αλληλουχίες του στελέχους-βρόχου. Αν και αυτές οι παρόμοιες στρατηγικές επιτρέπουν συστηματική διαλογή, αυτά πιθανόν υποτιμούν το συνολικό αριθμό των miRNAs ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA επειδή έναρξης μεταγραφής για τις πρωτογενείς miRNAs μπορεί να είναι πολύ ανοδικά από την αλληλουχία stem-loop. Για παράδειγμα, το πρωτεύον προϊόν μετεγγραφής του miR-21 είναι 3.433 νουκλεοτιδίων μήκους ενώ η ώριμη miR-21 κωδικοποιείται από τα υπολείμματα +2445 να +2516 σε κύτταρα HeLa [28]. . Πρόσφατα, Chim

et al

ανέφεραν ότι miR-34a ρυθμιζόταν από μεθυλίωση προαγωγού CpG νησί του DNA που βρίσκονται & gt? 30 kb ανοδικά από την ώριμη miR-34a [29]. Ως εκ τούτου, περισσότερα miRNAs μπορούν να ρυθμίζονται από προαγωγέα DNA μεθυλίωση, αλλά δεν θα πρέπει να εντοπίζονται εύκολα χρησιμοποιώντας μια συστηματική προσέγγιση που βασίζεται στην τρέχουσα σχολιασμό γονιδιώματος.

Εξετάσαμε περαιτέρω την βιολογική σημασία της επιγενετικής αποσιώπηση του πρόσφατα εντοπίστηκαν DNA μεθυλίωση ρυθμιζόμενων miRNAs. Εστιάσαμε σε δύο σημαντικές πτυχές του καρκίνου ανάπτυξης, της ανάπτυξης και της μετανάστευσης, καθώς και επιλεγμένα miR-941, miR-1237, και miR-1247 για λειτουργικές μελέτες. Η έκτοπη έκφραση του miR-1247 μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση σε HCT116 κύτταρα και DLD1, υποδηλώνοντας ότι miR-1247 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με τις λειτουργίες των διαφόρων προβλεπόμενων στόχων του miR-1247 (https://www.microrna.org). Για παράδειγμα, Citron (CIT), μια κινάση σερίνης /θρεονίνης, είναι παρούσα στο αυλάκι διάσπασης και μέσου σώματος κατά τη διάρκεια της κυτταροκίνηση και είναι απαραίτητη για την κυτταρική αποκοπή [30], [31]. CIT ρυθμίζει επίσης την G2 /M μετάπτωση σε ηπατοκύτταρα αρουραίου [32], και να χτυπήσει κάτω CIT ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [33]. Ένας άλλος πιθανός στόχος για miR-1247 είναι FosB, η οποία διμερίζεται με πρωτεΐνη Jun να ενεργοποιήσει μεταγραφή των πρωτεασών που εμπλέκονται στη μετανάστευση του όγκου και εισβολή [34]. Τέλος, η διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, ADAM15, θα μπορούσε επίσης να απευθύνονται από miR-1247, για να διευκολυνθεί ο καρκίνος του προστάτη μετάσταση [35]. Αυτά τα υπολογιστικά προέβλεψε στόχοι θα πρέπει να επικυρώνονται εμπειρικά στο μέλλον.

Είναι ενδιαφέρον ότι, στα κύτταρα DKO, όπου miR-1247 απομεθυλιώνεται και εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι τα κύτταρα HCT116, επιπλέον έκθεση σε miR-1247 μιμείται δεν να οδηγήσει σε μειώσεις της κυτταρικής ανάπτυξης που προκαλείται αλλά εξασθενημένη μετανάστευσης. Οι διαφορές μεταξύ των φαινοτύπων της έκτοπη miR-1247 έκφραση σε HCT116, τα κύτταρα DLD1 και DKO μπορεί να αντανακλά τις διαφορετικές συγκεντρώσεις στις οποίες είναι διακριτές κυτταρικές λειτουργίες ρυθμίζονται από miR-1247. Εναλλακτικά, αυτό μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των διαφόρων στόχων για miR-1247 σε HCT116 κύτταρα και ϋΚΟ. Αυτές οι δύο δυνατότητες θα απαιτήσει πρόσθετες μελέτες για να διευκρινιστούν.

Ενώ διαφορικά μεθυλιωμένων και εκφράζονται miRNAs είναι σημαντικά για την ανάπτυξη του καρκίνου, προτείναμε ότι υπολειμματική μεθυλίωση του DNA σε απομεθυλιωμένο συνθήκες, όπως σε κύτταρα ϋΚΟ, μπορεί επίσης να είναι κρίσιμη. λειτουργική μελέτη μας miR-941 τεκμηριωμένες αυτή την υπόθεση. Βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-941 ήταν σε θέση να αναστείλει σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση τόσο HCT116 και τα κύτταρα ϋΚΟ και επιπλέον σε κύτταρα DLD1. Αυτό το αποτέλεσμα είναι λογικό λαμβάνοντας υπόψη αρκετές προέβλεψε στόχους υψηλής προτεραιότητας του miR-941 είναι σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων. Για παράδειγμα, μήτρα μεταλλοπεπτιδάση 24 (MMP24) είναι μια προβλεπόμενη στόχος για miR-941, και διευκολύνει την αναδιαμόρφωση ιστών και μετανάστευση των κυττάρων σε ενδομήτριο από ασθενείς ενδομητρίωση [36]. Παρόμοιου τύπου του DNA miRNAs μεθυλίωσης ρυθμιζόμενων θα πρέπει να χαθεί από την προηγούμενη έκφραση προσέγγιση, αλλά θα μπορούσε να συλληφθεί εύκολα από το σχεδιασμό της μελέτης μας. Έξι από τα 8 νέα επιγενετικώς ρυθμιζόμενη miRNAs που προσδιορίζονται στη μελέτη μας διατήρησε εγγύς μεθυλίωση του DNA σε κύτταρα DKO, όπου & lt?. 5% μεθυλίωση γονιδιακό DNA αφήνεται σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HCT116 της

Εν ολίγοις, η προσέγγισή μας για να Ανακαλύψτε μεθυλίωσης του DNA ρυθμίζεται miRNAs απέδωσε μια σειρά από προηγουμένως ανεξερεύνητο υποψηφίων. Δείξαμε μέσω έκτοπη έκφραση και λειτουργικές δοκιμασίες ότι τουλάχιστον δύο από αυτά τα miRNAs μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική στην πρόοδο του όγκου. Η μέθοδός μας είναι ένα χρήσιμο συμπλήρωμα στην παραδοσιακή προσέγγιση της χρησιμοποιώντας ένα σύστημα έκφρασης που βασίζεται στην ταυτοποίηση νέων miRNAs σιγήσει από μεθυλίωση του DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και φαρμάκων θεραπείας

Ο ορθοκολικός καρκίνος κυτταρικές σειρές HCT116, DLD1, RKO και ϋΚΟ κύτταρα [25] καλλιεργήθηκαν σε 5Α μέσα ενημέρωσης του McCoy (Invitrogen, San Diego, CA) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco, Grand Island, ΝΥ) στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση, και κυτταρικά ιζήματα ξεπλένονται δύο φορές με PBS (Gibco, Grand Island, ΝΥ). Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, San Diego, CA) η εκχύλιση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA επίσης σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (Roche, Indianapolis, ΙΝ) για την απομάκρυνση ιχνοποσοτήτων υπολειμματικού γονιδιωματικού DNA. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από κυτταρικά σφαιρίδια με επώαση των σφαιριδίων σε διαλύματα που περιέχουν 0,5 mg /ml πρωτεϊνάση Κ, 2% SDS, και 20 mM Tris-HCl όλη τη νύκτα σε 55

oC με ανακίνηση και ακολούθησε εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο και καταβύθιση με αιθανόλη. Για 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) θεραπείες, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα ανά 100 mm δίσκο 24 ώρες πριν από την προσθήκη του 5-αζα-dC (Sigma, St Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5 μΜ 5-αζα-DC για 48 ώρες πριν από τη συγκομιδή.

MBD-απομονωθεί Γονιδιώματος δεδομένα αλληλουχίας ανάλυση

Γονιδίωμα-ευρύ μεθυλίωσης του DNA στοιχεία για HCT116 και DKO κύτταρα που συγκεντρώθηκαν προηγουμένως εκτελώντας MBD-απομονωθεί Genome Sequencing (MIGS) [21]. Η πρώτη αλληλουχίας διαβάζει μπορείτε να το κατεβάσετε από το NCBI Σύντομη Διαβάστε Αρχείο (SRA # SRP001414). Ο ελάχιστος αριθμός των αλληλούχισης διαβάζει υποδεικνύοντας σήματα μεθυλίωση σημαντικές DNA προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Σχολιασμένη miRNAs (Hg18, NCBI Build 36.1) που βρίσκεται σε απόσταση 500 bp σημαντικών μεθυλίωσης του DNA ταυτοποιήθηκαν ως υποψήφιοι για τις επόμενες αναλύσεις.

miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών

προφίλ έκφρασης των miRNAs μικροσυστοιχιών με βάση έγινε με τη χρήση του Illumina έκφραση ανθρώπινου microRNA προφίλ πίνακα V2 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ανθρώπινο v2 πίνακα miRNA περιέχει 1.146 αναλύσεις για την ανίχνευση του 97% περίπου των miRNAs που περιγράφονται στη βάση δεδομένων miRBase (Sanger miRBase, v9.1, απελευθέρωση Φεβρουάριος 2007). Η επεξεργασία δεδομένων διεξήχθη σε GenomeStudio v2009.1 (Illumina, San Diego, CA). Τριπλά πειράματα πραγματοποιήθηκαν για κάθε κυτταρική γραμμή. Τα δεδομένα από κάθε πείραμα κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου που περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Για την HCT116 έναντι DKO σύγκρισης,

t

δοκιμή του Welch έγινε με ένα

σ

-τιμή αποκοπής 0.05 και πολλαπλές διόρθωση δοκιμές με ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR). Τα δεδομένα array microRNA (GEO # GSE26819) μπορεί να προσεγγιστεί από την έκφραση γονιδίων ιστοσελίδα Omnibus.

Bisulfite αλληλουχίας

1 μg γονιδιακού DNA από κάθε δείγμα όξινο θειώδες μετατρέπεται χρησιμοποιώντας το κιτ EpiTect (Qiagen , GmbH, Hilden) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συνθήκες PCR και αλληλουχίες εκκινητή που παρέχονται στον Πίνακα S3. Οι PCR αμπλικόνια καθαρίστηκαν επί πηκτής και υποκλωνοποιήθηκε εντός φορέα ρΟΚΙΙ-ΤΟΡΟ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τουλάχιστον οκτώ κλώνους επιλέχθηκαν τυχαία και η αλληλουχία σε αναλυτή ABI3730xl DNA για να εξακριβώσει τα μοτίβα μεθυλίωσης του κάθε τόπου.

Ανίχνευση ώριμης και πρωτογενών miRNAs έκφραση με ποσοτική RT-PCR

Η έκφραση των ώριμων miRNAs προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, GmbH, Hilden) και ομαλοποιήθηκε με την έκφραση ενδογενούς snoRNA U6 χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο [38]. Εν συντομία, 100 RNA ng ϋΝάση από κάθε δείγμα προστέθηκε σε 10 μΐ του 2 × SYBR πράσινο μάστερ μιξ PCR, 0,2 μΙ RT-mix, 200 ηΜ του κάθε εκκινητή, και RNase-free νερό σε ένα σύνολο 20 μλ. Για πρωτογενή έκφραση των miRNAs, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εξομάλυνση. Η έκφραση του κάθε πρωτογενούς miRNA σε σχέση με GAPDH προσδιορίστηκε επίσης με τη χρήση του 2

-ΔΔCt μέθοδο. Οι αλληλουχίες εκκινητών για την ανίχνευση ώριμη και πρωτογενών miRNAs σχεδιάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [39] και παρατίθενται στον Πίνακα S3. Η μέση τιμή των τριπλών πειραμάτων ήταν γράφημα με τυπικές αποκλίσεις παρουσιάζονται ως ράβδοι σφάλματος.

Ανίχνευση των υποθετικών γονιδιακής έκφρασης υποδοχής από ποσοτική RT-PCR

Η έκφραση των υποθετικών γονιδίων υποδοχής προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας QuantiTect SYBR Green RT -PCR κιτ (Qiagen, GmbH, Hilden) και ομαλοποιήθηκε σε GAPDH εσωτερικά. Η σχετική έκφραση μετά από αγωγή 5-αζα-άΟ υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Το RNA εκχυλίζεται με τον ίδιο τρόπο όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Οι αλληλουχίες εκκινητών που καταγράφονται στον Πίνακα S3. Η μέση τιμή των τριπλών πειραμάτων ήταν γράφημα με τυπικές αποκλίσεις παρουσιάζονται ως ράβδοι σφάλματος.

έκτοπη έκφραση miRNAs

Η υπερέκφραση του miR-941, miR-1237, και miR-1247 σε HCT116, DKO και DLD1 κυττάρων επιτεύχθηκε με την επιμόλυνση των κυττάρων με 20 nM miRNA δίπολα που μιμήθηκε την ώριμη miR-941 (MSY0004984, Qiagen), miR-1237 (MSY0005592, Qiagen), και miR-1247 (MSY0005899, Qiagen). Η Allstars Αρνητικό siRNA ελέγχου (1027281, Qiagen) συμπεριλήφθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.