Abstract

Μικρές κωδικοποίησης μη-πρωτεΐνης RNA, microRNA (MIR), οι οποίες ρυθμίζουν τα επίπεδα αγγελιαφόρου RNA, έχουν πρόσφατα αναγνωρισθεί, και μπορεί να παίζουν σημαντικούς ρόλους στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών. Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε σε miR-31 και διερευνήθηκε πιθανή εμπλοκή της στη πνεύμονα καρκινογένεση. Η έκφραση του miR-31 μεταβλήθηκε σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα είτε μέσω της ενίσχυσης ή απώλεια του τόπου του γονιδίου του ξενιστή. Η ισχυρή έκφραση του miR-31 σε μεγάλες καρκινώματα αποδόθηκε στην ενίσχυση του γονιδίου. Εν τω μεταξύ, η απώλεια της έκφρασης miR-31 παρατηρήθηκε συχνότερα σε επιθετικές αδενοκαρκινώματα. Έτσι, miR-31 μπορεί να παίζει ένα πλειοτροπική ρόλο στην ανάπτυξη των καρκίνων του πνεύμονα μεταξύ των διαφόρων ιστολογικών τύπων. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει τη δυνατότητα του μηχανισμού αιτιολογικό της τροποποιημένης έκφρασης του miR-31 και να προτείνει ενδεχομένως την πολύπλευρη σημασία της στις διάφορες ιστολογικές μορφές καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Okudela Κ, Tateishi Υ, Umeda S, Mitsui Η Suzuki Τ, Saito Y, et al. (2014) Τα αλληλόμορφα Ανισορροπία στο miR-31 Host γονιδιακό τόπο στον καρκίνο του πνεύμονα – εν δυνάμει ρόλο της στην καρκινογένεση. PLoS ONE 9 (6): e100581. doi: 10.1371 /journal.pone.0100581

Επιμέλεια: Salvatore Παπά, Ινστιτούτο ηπατολογίας – Birkbeck, Πανεπιστήμιο του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 23 Ιανουαρίου 2014? Αποδεκτές: 26η Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 του Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Okudela et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και (Τόκιο της Ιαπωνίας), ιαπωνική και με επιχορήγηση από την Γιοκοχάμα Ιατρικό (Yokohama, Ιαπωνία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο κοινές αιτίες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στον ανεπτυγμένο κόσμο [1], [2]. Ακόμη και αν ο πρωτογενής όγκος έχει εκτομή επιτυχώς, η επανάληψη παρατηρείται σε ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών [1], [2]. Αν και μερικοί όγκοι του πνεύμονα είναι ευαίσθητα στο συμβατικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων ή ορισμένων μοριακών παραγόντων στόχευσης, πολλοί δεν είναι [3], [4]. Έτσι, η περαιτέρω κατανόηση του μοριακού μηχανισμού υποκείμενο πνεύμονα καρκινογένεση είναι σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Μικρές μη-πρωτεΐνη που κωδικοποιεί RNA, microRNA, οι οποίες ρυθμίζουν τα επίπεδα του αγγελιαφόρου RNA, έχουν πρόσφατα ταυτοποιηθεί, και έχει έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών. Διάφορα microRNA (MIR), συμπεριλαμβανομένων των ας-7, miR-21, miR-30D, miR-31, miR-155, και miR-205, έχουν προταθεί για να εμπλέκονται στην καρκινογένεση των διαφόρων τύπων κακοηθειών [5]. Μεταξύ αυτών, miR-31 αναφέρθηκε ότι εκφράζεται εντονότερα σε ιστό όγκου από ότι σε μη-νεοπλασματικής ιστό, και προτάθηκε να έχει ογκογόνο ρόλο στην καρκινογένεση του πνεύμονα [6] – [12]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη κατέδειξε την προγνωστική αξία του miR-31, επειδή η υψηλότερη έκφραση του miR-31 σχετιζόταν με φτωχότερη έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [13]. Εν τω μεταξύ, μια διαφορά στην miR-31 έκφρασης μεταξύ των ιστολογικών τύπων καρκίνων του πνεύμονα και το δυναμικό μηχανισμό ενός αλλοιωμένη έκφραση του miR-31, δεν έχουν διευκρινιστεί.

Η παρούσα μελέτη ανέλυσε την έκφραση του miR-31 και η κατάσταση του γονιδίου υποδοχής τόπου της στις διάφορες ιστολογικές μορφές του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Μια απαθανάτισε την ανθρώπινη αεραγωγών επιθηλιακών κυττάρων (16HBE14o , ιό πιθήκου 40 (SV40)-μεταμορφωμένων ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα) που περιγράφεται από Cozens aL et al. (1994) [14] παρασχέθηκε ευγενώς από τον Grunert DC (California Pacific Medical Center Research Institute). Μια υπο-κλώνο κυττάρων 16HBE14o, που περιγράφεται ως ΝΗΒΕ-T στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε. Αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές επιθηλιακών αεραγωγών (HPL1D και HPL1A, ανθρώπινο μικρό επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών SV40-μετασχηματισμένα) καθορίστηκαν με Masuda Α et al. (1997) [15]. Ανθρώπινα πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές (Α549, Η322Μ, Η358, Η522, H820, H2087, Η23, EKVX, H226, H827, H1819, Η441, H4006, HOP62, Η1299 και Η460) και μία ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή (ΗΕΚ293Τ) ήσαν αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα LC2AD κυτταρική γραμμή, Lu130, Lu135, Lu139 και Lu140, αγοράστηκε από την Riken Τράπεζας Κυττάρων (Tsukuba, Japan). Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, PC9 και Hara, ήταν από Immuno-Biological Laboratories Co. (Γκούνμα, Japan). Ο καρκίνος ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα, TKB1, TKB2, TKB4, TKB5, TKB6, TKB7, TKB8, TKB9, TKB12, TKB14, TKB15, TBK17 και TKB20, ελήφθησαν από τον Dr. Hiroshi Καμμά μέσω Δρ Takuya Γιαζάβα (University School Κγοπη Ιατρικής) [16]. πρωτογενών επιθηλιακών κυττάρων αεραγωγών μικρό (SAEC) και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ) αγοράστηκαν από την Sanko Kagaku (Tokyo, Japan).

πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα

Ένα σύνολο 129 πρωτοπαθείς όγκους του πνεύμονα (71 αδενοκαρκινώματα, 38 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, 18 μεγάλου κυττάρου καρκινώματα, 2 μικρά καρκινώματα κυττάρων) απομακρύνθηκαν με ριζική χειρουργική εκτομή σε Kanagawa Καρδιαγγειακά και αναπνευστικό κέντρο Hospital (Yokohama, Ιαπωνία). Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι [17], και εγκρίθηκε από τις επιτροπές δεοντολογίας των Yokohama City University και Kanagawa Νομαρχιακή καρδιαγγειακό και αναπνευστικό κέντρο νοσοκομείο [18]. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα που παρέχουν υλικά.

RNA εξόρυξη

Οι κυτταρικές σειρές πλένονται με κρύο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού και στη συνέχεια καταψύχθηκαν. τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και εξετάστηκαν μικροσκοπικά. Οιδηματώδης και μη νεοπλασματικές μέρη αποκόπηκαν με λεπίδα ξυραφιού. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ miRNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA).

Ποσοτική RT-PCR

Για την ανίχνευση miRNA, πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας το ΜΙΚ Kit Χ miRNA First-Strand Synthesis σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Takara, Kyoto, Japan). Το cDNA που παράγεται χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε PCR πραγματικού χρόνου με SYBR πρόμιγμα EXTaq (Takara) και τρέχουν σε Thermal πραγματικού χρόνου σύστημα PCR Cycler DICE (Takara). Το έναυσμα που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση για miR-31 ήταν 5′- AGGCAAGATGCTGGCATAGCT (ώριμο miR-31, MIMAT0000089). Το αντίστροφο έναυσμα ήταν η καθολική MRQ εκκινητής 3 ‘(Takara). Το σετ εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση U6 snRNA αγοράστηκε από την Takara Bio Inc. MiR-31 επίπεδο ομαλοποιήθηκε σε επίπεδα U6 snRNA. Για την ανίχνευση mRNA, cDNA πρώτου κλώνου συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας το SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Το cDNA που παράγεται χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε PCR πραγματικού χρόνου με TaqMan Gene Expression Assay σύστημα (Applied Biosystems, Foster City, CA) και τρέχουν σε Thermal πραγματικού χρόνου σύστημα PCR Cycler DICE (Takara). Οι ανιχνευτές TaqMan και σετ εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση GAPDH [NM_002046.5], ITGA5 [NM_002205.2], MMP16 [NM_005941.4], και RhoA [NM_001664.2], είχε προσαρμοστεί και να αγοραστεί Applied Biosystems. ITGA5, MMP16, και RhoA επίπεδα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH.

ανάλυση PCR του miR-31 locus

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τα καρκινικές κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας το κιτ DNeasy (Qiagen). Η κατάσταση (διαγραφή ή τη διατήρηση) του καυτού τόπου του γονιδίου miR-31 αναλύθηκε με γονιδιακό DNA PCR χρησιμοποιώντας το σύνολο εκκινητών της F 5′-TAACTACATCTTCAAAAGCGGAC και R 5′-TACATAGCAGGACAGGAAGTAA. Η κατάσταση του τόπου του γονιδίου CDKN2A (D9S974) και ενός άλλου μακρινό τόπο της βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 9 (D9S304) επίσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σετ εκκινητών της F 5′-GAGCCTGGTCTGGATCATAA και R 5′-AAGCTTACAGAACCAGACAG, και F 5′-GTGCACCTCTACACCCAGAC και R 5′- TGTGCCCACACACATCTATC, αντίστοιχα.

η in situ υβριδισμού για

miRNA

η in situ υβριδοποίηση

διεξήχθη σύμφωνα με μία μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],19]. Εν συντομία, το κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA)-τροποποιημένα ανιχνευτές ανίχνευσης για miR-31 και U6 snRNA, και κωδικοποιημένα αρνητικού ανιχνευτή ελέγχου (Exiqon, Vedbaek, Denmark) σημάνθηκαν με διγοξιγενίνη (DIG) χρησιμοποιώντας το κιτ DIG Oligonucleotide ουράς (Roche, Βασιλεία , Ελβετία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη ακετυλιώθηκαν και υβριδοποιήθηκαν με DIG-σημασμένων ανιχνευτών ανίχνευσης, και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη με θραύσματα αντι-DIG Fab (Roche). Το σήμα υβριδοποίησης έγινε ορατή χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα εμφανιστή χρώματος (Roche).

φθορισμού

in situ

υβριδισμός (FISH) για το γονιδιακό τόπο

Η φορμαλδεΰδη-σταθερών και εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές ιστών χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση. Οι τομές βρασμένο σε κατεργασμένο με κιτρικά ρυθμιστικό (0.01 Μ, ρΗ 6.0) για την απελευθέρωση κλειστών χρωμοσωμικές δομές [20]. Αυτά τα τμήματα υβριδοποιήθηκαν με ένα Cy3-σημασμένο ανιχνευτή που καλύπτει το miR-31 locus (BAC κλώνος: RP11-354P17) και ΡΙΤΟ-σημασμένο ανιχνευτή για τον τόπο κεντρομερίδιο επί του χρωμοσώματος 9 (Vysis INC, Downer Groves, IL.). Το σήμα από το miR-31 locus και κεντρομεριδίου 9 μετρήθηκε για περισσότερα από 50 κύτταρα σε κάθε όγκου, και υπολογίστηκε ο αριθμός αντιγράφων του miR-31 locus σε σχέση με εκείνη του κεντρομερούς 9.

Η θεραπεία με 5 -azacytidine και τριχοστατίνη Α

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 10 μΜ 5-αζακυτιδίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ) για 72 ώρες με την ανταλλαγή του μέσου κάθε μέρα ή με 300 ng /ml τριχοστατίνη Α ( Wako, Osaka, Japan) επί 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με 5-αζακυτιδίνη για 48 ώρες και στη συνέχεια με έναν συνδυασμό 5-αζακυτιδίνη και τριχοστατίνη Α για ένα επιπλέον χρόνο 24 ωρών.

μεθυλίωσης-ειδική PCR

Γενωμικό DNA υποβλήθηκε σε ένα όξινο θειικό θεραπεία μετατροπή χρησιμοποιώντας το MethylEasy DNA κιτ τροποποίηση διθειικό (Ανθρώπινη Γενετική υπογραφές, Macquarie Park, Αυστραλία). Μεθυλίωσης-ειδική PCR που στοχεύουν τις δύο θέσεις CpG στον τόπο υποκινητή του miR-31 γονίδιο ξενιστή (LOC554202), η οποία είχε προηγουμένως αποδειχθεί [21], πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται αλλού [21].

όξινου θειικού DNA Sequencing

μία θέση GpC στον τόπο προαγωγέα του γονιδίου ξενιστή miR31 (LOC554202), η οποία είχε προηγουμένως αποδειχθεί [21], ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας όξινο θειικό επεξεργασμένου γενωμικό DNA ως μήτρα, σύμφωνα με το μέθοδο που περιγράφεται αλλού [21]. Το PCR προϊόν υποκλωνοποιήθηκε εντός του μπλε πλασμιδιακό φορέα ρΤ7 (Novagen, Darmstadt, Γερμανία), και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ένα κύκλο αντίδραση χρωστικής-τερματιστή με τον εκκινητή καθολική υποκινητή Τ7 χρησιμοποιώντας το κιτ Big Dye Terminator Έκδοση 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Στατιστική Ανάλυση

οι διαφορές στα μέσα του σχετικού αριθμού αντιγράφων του miR-31 locus μεταξύ των ομάδων που κατατάσσονται σύμφωνα με διάφορες παθολογικές παράμετροι αναλύθηκαν με μονόδρομη ΑΝΟνΑ . Οι διαφορές στα μέσα του miR-31 επίπεδα στην ανασταλτική πείραμα αναλύθηκαν με t-test ένα ασύζευκτο Student. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS (SPSS για Windows, έκδοση 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA).

Άλλα

Οι πειραματικές διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση ανοσοϊστοχημεία για Ki-67 και να αναλύσει ογκογόνο μεταλλάξεις στα γονίδια KRAS και EGFR περιγράφονται αλλού [22].

Αποτελέσματα

MiR-31 και η έκφραση των γνωστών στόχων του σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

ΜΙΚ 31 έκφραση φάνηκε να είναι ισχυρή, σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές, αλλά ήταν εντελώς απούσα σε άλλες ορισμένες κυτταρικές σειρές (Σχ. 1). Εξετάστηκε επίσης η έκφραση της αφήνω-7i. Ας-7i εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές και τα επίπεδα του διέφεραν από εκείνα των miR-31 (Σχήμα S1). Χρησίμευε ως μάρτυρας για την αξιολόγηση της ποιότητας των υλικών και εξασφάλισε ότι σημαντικές αλλαγές συνέβησαν στην έκφραση του miR-31. Επιπλέον, ένα προκαταρκτικό πείραμα έδειξε ότι η αποκατάσταση της miR-31 κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη ενός καρκίνου κυτταρική γραμμή (LC2AD) που σχεδόν χάσει την ικανότητά του να εκφράσει miR-31 (Σχήμα S2). Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να διερευνήσει περαιτέρω το δυναμικό σημασία του αλλοιωμένη έκφραση του miR-31 στην πνευμονική καρκινογένεση.

MiR-31 επίπεδα κανονικοποιήθηκαν με τα επίπεδα U6 snRNA. Τεχνική επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι σφάλματος) εμφανίζονται. AEC, επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (μη καρκινικά κύτταρα)? ADC, αδενοκαρκίνωμα? SQC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC, μεγάλων κυττάρων καρκίνωμα? SCC, μικροκυτταρικό καρκίνωμα.

Η

Κατάσταση του γονιδίου τόπου miR-31 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Οι καταστάσεις του τόπου miR-31 γονίδιο, CDKN2A τόπου, και το παρακείμενο locus (D9S304), διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση PCR. Μεταξύ των κυτταρικών γραμμών σαράντα ένα εξετάστηκαν, έξι κυτταρικές γραμμές (14,6%, 6/41 κυτταρικές γραμμές? H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, και TKB9) έχασε το miR-31 γονιδιακό τόπο υποδοχής (Σχήμα 2, Πίνακας 1. ), ενώ δώδεκα γραμμές (29,3%, 12/41 κυτταρικές σειρές?. TKB14, H4006, Α549, LC2AD, TKB4, Η460, H322, TKB1, TKB2, TKB5, TKB8, TKB9) έχασε τον τόπο CDKN2A (Σχήμα 2, Πίνακας 1 ). Όλα τα έξι γραμμές που έχασε το miR-31 locus έχασε επίσης τον τόπο CDKN2A (Σχ. 2, Πίνακας 1). Το γειτονικό τόπο (D9S304) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για ανάλυση PCR (Εικ. 2).

Τα αποτελέσματα από την ανάλυση PCR δείχνονται. AEC, επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (μη καρκινικά κύτταρα)? ADC, αδενοκαρκίνωμα? SQC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC, μεγάλων κυττάρων καρκίνωμα? SCC, μικροκυτταρικό καρκίνωμα.

Η

Επιγενετική τροποποίηση του υποκινητή του miR-31 και η έκφρασή της

MiR-31 έκφραση ήταν απούσα σε όλες τις έξι κυτταρικές σειρές χάσει το miR -31 γονιδιακό τόπο υποδοχής (Εικ. 2, Πίνακας 1). Εν τω μεταξύ, οι πέντε κυτταρικές γραμμές (Η441, LC2AD, Lu140, TKB15, και TKB17), που διατήρησε το γονίδιο τόπο miR-31 (Εικ. 2, Πίνακας 1) έχασε επίσης miR-31 έκφραση ή μειώνεται σημαντικά το επίπεδο του (Σχ. 2, Πίνακας 1), η οποία έδειξε την πιθανή εμπλοκή των επιγενετικών τροποποίηση μειορύθμιση της. Έτσι, οι κυτταρικές σειρές που έχασαν την έκφραση miR-31, αλλά διατήρησε γονιδιακό τόπο του εξετάσθηκαν για να διερευνηθούν οι επιδράσεις των αναστολέων για μεθυλτρανσφεράσης DNA και αποακετυλάσης ιστόνης για την έκφραση του miR-31. Είτε και /ή ο συνδυασμός και των δύο αναστολέων δεν επαναλήψιμα αποκαταστήσει έκφραση miR-31 σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 3Α). Η μεθυλίωση-ειδική PCR ανάλυση σε δύο τοποθεσίες στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου ξενιστή miR-31 αποκάλυψε ότι οι δύο θέσεις μεθυλιώθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν (Εικ. 3Β). Όξινου θειικού ανάλυση αλληλουχίας DNA στη θέση CpG της περιοχής προαγωγού αποκάλυψε επίσης ότι είχε περιστασιακά μεθυλιώθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν (SAEC, ΝΗΒΕ-T, H820, Η441, LC2AD, Lu140, TKB15, και TKB17) (Σχ. 3C). Τα επίπεδα μεθυλίωσης φαίνεται να μην είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ των κυττάρων διατηρεί την έκφραση του miR-31 (SAEC, ΝΗΒΕ-T, και H820) και εκείνων που χάνουν το (Η441, LC2AD, Lu140, TKB15 και TKB17) (Σχ. 3C) . Η κατάσταση μεθυλίωσης των υποθετικών περιοχών προαγωγού του γονιδίου ξενιστή miR-31 δεν συνδέθηκε με την ιδιότητα ανάκτηση miR-31 επίπεδα μετά τις θεραπείες με τους αναστολείς (Σχ. 3Α και 3Γ). Έτσι, η μεθυλίωση του DNA στην υποθετική περιοχή που εξετάζονται εδώ, δεν θα μπορούσε να αποδοθεί στην ρύθμιση προς τα κάτω του miR-31.

Κύτταρα κατεργασμένα με έκδοχο ελέγχου (CTL), 5-αζακυτιδίνη (ΑΖΑ), τριχοστατίνη Α (TRC), ή ένας συνδυασμός ΑΖΑ και TSA (Ω /TR) εξετάστηκαν για την αποκατάσταση της miR-31 έκφραση χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Το σχετικό επίπεδο του miR-31 κανονικοποιήθηκε ως προς εκείνες του U6 snRNA υπολογίστηκε. Δύο ανεξάρτητα πειράματα εκτελέστηκαν. Τεχνική επαναλήψεις της ανάλυσης PCR πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι σφάλματος) εμφανίζονται (Α). Οι δύο θέσεις (S1 και S2) από τον υποθετικό προαγωγό του miR-31 ήταν ενισχυμένο με PCR με εκκινητές ειδικούς για είτε μεθυλιωμένα (Μ) ή μη μεθυλιωμένο (UM) DNA χρησιμοποιώντας νάτριο όξινο θειικό τροποποιημένου γενωμικού DNA ως μήτρα, σύμφωνα με τη μέθοδο περιγράφεται σε μια προηγούμενη μελέτη [21]. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα παρουσιάζονται (Β). Η περιοχή του miR-31 προαγωγό που περιέχουν θέσεις CpG ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας νάτριο όξινο θειικό τροποποιημένου γενωμικού DNA ως μήτρα, σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται σε μια προηγούμενη μελέτη [21]. Οκτώ υποκλώνοι των προϊόντων της PCR αναλύθηκαν για την κατάσταση μεθυλίωσης τους χρησιμοποιώντας αλληλούχιση DNA. Άνοιγμα (○) και συμπληρώθηκε (•) κύκλοι υποδεικνύεται μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη και μεθυλιωμένα στις υποδεικνυόμενες θέσεις CpG, αντίστοιχα (C). AEC, επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (μη καρκινικά κύτταρα)? ADC, αδενοκαρκίνωμα? SQC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC, μεγάλο καρκίνωμα? SCC, καρκίνωμα μικρών κυττάρων.

Η

Η έκφραση του miR-31 σε πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα

Ποσοτική RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι ορισμένοι οιδηματώδης και μη ογκογόνους ιστούς εκφράζονται miR-31 σε ανιχνεύσιμα επίπεδα (Σχ. 4Α). Αυτά τα επίπεδα ποικίλει, αλλά ήταν σημαντικά υψηλή σε ορισμένες από τις όγκων που έχουν εξετασθεί (Σχ. 4Α). Αυτές φαίνεται να είναι ελαφρώς υψηλότερη σε μεγάλες καρκινώματα και ελαφρά χαμηλότερο σε αδενοκαρκινώματα (Σχ. 4Α). Μεταξύ των αδενοκαρκινώματα που εξετάστηκαν, η έκφραση του miR-31 ήταν χαμηλότερη σε πτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα (Σχ. 4Β και 4C), καθώς και στο στερεό υπότυπο (Εικ. 4D). Σοβαρή βλάβη του ιστού που συνοδεύεται από την αναγεννητική αντιδράσεις παρατηρήθηκε σε μη ογκογόνους ιστούς που εκφράζουν miR-31 (δεν φαίνεται).

MiR-31 επίπεδα αξιολογήθηκαν σε πρωτογενείς όγκους του πνεύμονα και του αντίστοιχου πνεύμονα μη οιδηματώδης ιστός. Οι αριθμοί αντιγράφου του miR-31 και U6 snRNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Τεχνική επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι σφάλματος) του miR-31 επίπεδα κανονικοποιήθηκαν προς εκείνες των U6 snRNA φαίνονται τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από όλους τους όγκους (Α) και εκείνων του ADC (Β). Σημαντικές διαφορές στη μέση miR-31 επίπεδα σε αδενοκαρκινώματα μεταξύ των διαφόρων ιστολογικών βαθμών (9 καλά διαφοροποιημένο καρκίνωμα (WEL)? 3 μετρίως διαφοροποιημένων καρκινωμάτων (MOD)? 8 φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα (POR)) και υποτύπους (καρκίνωμα 8 βρογχιολοκυψελιδικό (BAC) ? 3 καρκίνωμα κυψελωτά (ACN)? 8 στερεό καρκίνωμα (ΣΟΛ) (ένα θηλώδες καρκίνωμα (= καλά διαφοροποιήσει καρκίνωμα) εξαιρέθηκε από τη στατιστική ανάλυση) αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι σφάλματος). οι ιστολογικές βαθμούς (C) και υποτύπους (D) παρουσιάζονται.

η

In situ

ανάλυση υβριδισμού για miR-31 σε τομές ιστών επιβεβαίωσε ότι το miR-31 εκφράστηκε σε νεοπλασματικά κύτταρα και επίσης αποκάλυψε ότι ακόμη και ποικίλη μεταξύ νεοπλασματικών κυττάρων, ακόμη και με τον ίδιο όγκο (Εικ. 5). Αναγεννητική επιθηλιακά κύτταρα, διάμεσα κύτταρα και φλεγμονώδη κύτταρα εξέφρασαν επίσης miR-31 σε διάφορα επίπεδα (Σχ. 5).

Ένας ανιχνευτής που αποτελείται από το ανακατωμένο τυχαίας αλληλουχίας χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος (κάτω πάνελ). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες από οιδηματώδης (αριστερά δύο πάνελ) και μη-νεοπλασματικές ιστού (δεξιά δύο πίνακες), η οποία εκφράζεται miR-31 (κέντρο δύο πάνελ) ή όχι (πλευρική δύο πάνελ), παρουσιάζονται.

Η

Κατάσταση του miR-31 γονιδιακό τόπο υποδοχής σε πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα

FISH ανάλυση αποκάλυψε ότι το miR-31 γονιδιακός τόπος υποδοχής χάθηκε στα νεοπλασματικά κύτταρα ορισμένων όγκων, όπως την καταμέτρηση σήμα από το miR-31 locus ήταν χαμηλότερη από εκείνη από την κεντρομερές του χρωμοσώματος 9 (Σχ. 6Α). Το γονίδιο δοσολογία του miR-31 locus Εκτιμάται με το λόγο του miR-31 /κεντρομεριδίων σε αδενοκαρκινώματα και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων ήταν ελαφρώς χαμηλότερη από ότι σε μη-καρκινικές βρογχικά επιθήλια (Εικ. 6Β). Ωστόσο, σε μερικούς όγκους μεγάλων κυττάρων καρκινωμάτων ο τόπος miR-31 ενισχύθηκε (Εικ. 6C). Η δοσολογία γονίδιο ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μεγάλες καρκινώματα σε σύγκριση με μη καρκινική επιθήλια και άλλων ιστολογικών τύπων (Σχ. 6C, Πίνακας 2). Όλες οι όγκοι με ενίσχυση της θέσεως του γονιδίου, που διαθεσιμώς εξετάστηκαν, εξέφρασαν ένα υψηλό επίπεδο της μεταγραφής miR-31. Αντίθετα, μεταξύ των αδενοκαρκινώματα, η δοσολογία γονίδιο έτεινε περαιτέρω να είναι χαμηλότερη σε πιο επιθετικούς όγκους (ανεπαρκώς διαφοροποιημένο όγκους ή όγκους στερεό υποτύπου) (Πίνακας 2).

Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από οιδηματώδης και μη ογκογόνους ιστούς παρουσιάζονται

, και πράσινη και κόκκινη σήματα υποδεικνύουν την miR-31 locus και κεντρομεριδίου θέση του χρωμοσώματος 9, αντίστοιχα (Α). Η μέτρηση του σήματος από το miR-31 θέση κανονικοποιούνται στο ότι από τον τόπο κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος 9 προσδιορίστηκε ως το σκορ FISH. Οι βαθμολογίες FISH μετρήθηκαν παρουσιάζονται (Β). Οι μέσες βαθμολογίες σε μη νεοπλασματικής βρογχικό επιθήλιο και στους διάφορους ιστολογικών τύπων των καρκίνων του πνεύμονα που παρουσιάζεται (C). Οι διαφορές στην μέση βαθμολογία αναλύθηκαν με μονόδρομη δοκιμασία ANOVAs. Οι τιμές P ανέφερε. BEC, βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (μη καρκινικά κύτταρα)? ADC, αδενοκαρκίνωμα? SQC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC, μεγάλο καρκίνωμα.

Η

Συζήτηση

Μια αρχική μελέτη για τους καρκίνους του μαστού πρότεινε ότι το miR-31 θα μπορούσε να είναι ένα ογκοκατασταλτικό, το οποίο ανέστειλε την επεμβατική και μεταστατική εξάπλωση της νεοπλασματικά κύτταρα [23]. Άλλες μελέτες έχουν υποστηρίξει αυτή την αρχική διαπίστωση και αποκάλυψε τις πιθανές μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον τρόπο miR-31 αποφεύγει την εισβολή και τη μετάσταση [24]. MiR-31 απεδείχθη επίσης να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικούς καρκίνους και προτάθηκε να λειτουργεί ως καταστολέας όγκου [25]. Σε αντίθεση, miR-31 βρέθηκε να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένη σε ορθοκολικό καρκίνους, και προτάθηκε να προωθήσει την επεμβατική και μεταστατική εξάπλωση νεοπλασματικών κυττάρων [26], [27]. Έτσι, ο πιθανός ρόλος του miR-31 στην καρκινογένεση μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου. Στον καρκίνο του πνεύμονα, η έκφραση του miR-31 έχει γενικά αναφερθεί ότι είναι υψηλότερη σε ιστό όγκου σε σχέση με το αντίστοιχο μη-οιδηματώδης ιστός [6] – [12]. Τα αποτελέσματά μας από ποσοτική ανάλυση RT-PCR, στην οποία διάφορα καρκινώματα πνεύμονα πρωτογενούς έδειξαν να εκφράζουν έντονα miR-31, φάνηκε να είναι συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα [6], [7], [9] – [12]. ανάλυση FISH αποκάλυψε ότι η ενίσχυση στον γονιδιακό τόπο υποδοχής θα μπορούσε να είναι ένας από τους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την ισχυρή έκφραση του miR-31. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε μια προγνωστική αξία της miR-31, καθώς η υψηλότερη έκφραση του miR-31 σχετιζόταν με φτωχότερη έκβαση σε καρκίνους του πνεύμονα [13], και επίσης προτείνει ογκογόνο ρόλο του μέσα από

in vitro πειράματα

[ ,,,0],13]. Σε συνδυασμό με τα ευρήματα αυτά, miR-31 προτάθηκε να προωθήσει την καρκινογένεση, ιδιαίτερα των μεγάλων κυττάρων καρκινωμάτων. Σε αντίθεση, miR-31 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη ή εντελώς απούσα σε μερικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, τα επίπεδα του διέφερε σε πρωτογενείς όγκους του πνεύμονα. Ορισμένοι όγκοι εκφράζονται miR-31 σε χαμηλότερα επίπεδα από την αντίστοιχη μη οιδηματώδης ιστός, ενώ άλλοι όγκοι δεν το εκφράζουν καθόλου. Μεταξύ των αδενοκαρκινώματα που εξετάστηκαν, η δοσολογία γονίδιο ήταν ελαφρώς χαμηλότερη σε περισσότερο επιθετικούς όγκους (ανεπαρκώς διαφοροποιημένο ή στερεά υποτύπου όγκους). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι miR-31 μπορεί να παίζει έναν κατασταλτικό ρόλο στην καρκινογένεση του αδενοκαρκινώματα. Έτσι, miR-31 μπορεί να παίζει ένα πλειοτροπική ρόλο στην ανάπτυξη των καρκίνων του πνεύμονα διαφορετικού ιστολογικών τύπων. Η έκφραση κάποιων γνωστών στόχων του miR-31, όπως ITGA5, MMP16, και RhoA [28], προκαταρκτικά εξετάστηκε σε miR-31-επιμολυσμένα κύτταρα και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Σχήμα S3). Ωστόσο, η αναγκαστική έκφραση του miR-31 δεν μειώνουν τα επίπεδα του mRNA των μορίων αυτών. Στη μητρική κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, δεν παρατηρήθηκε συσχετισμός μεταξύ του επιπέδου αυτών των μορίων και miR-31 επίπεδα μεταξύ των διαφόρων ιστολογικών τύπων (Σχήμα S3). Στόχοι του miR-31 μπορεί να ποικίλλει σε διάφορες καταστάσεις, και σύνθετες στιχομυθία μεταξύ των στόχων μπορεί να βρίσκεται κρυμμένο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Περαιτέρω μελέτες που διερευνούν διεξοδικά κατάντη στόχους δικαιολογείται, προκειμένου να αποσαφηνιστεί το δυναμικό μοριακός μηχανισμός που διέπουν τον τρόπο miR-31 προάγει την καρκινογένεση των διαφόρων ιστολογικών τύπων καρκίνου του πνεύμονα.

Μη ογκογόνους ιστούς που εμφανίζουν σοβαρή βλάβη και φλεγμονή εκφράζεται έντονα miR-31.

In situ

ανάλυση υβριδοποίησης επιβεβαίωσε επίσης την ισχυρή έκφραση του miR-31 στην αναγέννηση μη νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα και μεσεγχυματικά κύτταρα. Έτσι, miR-31 μπορεί να προκληθεί με ερεθίσματα την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων σε απόκριση σε βλάβη ιστού και μπορεί να ελέγχει την αναγεννητική αντιδράσεις. Η αλλαγμένη έκφραση του miR-31, είτε ρυθμίζεται προς τα κάτω ή προς τα πάνω ρύθμιση, μπορεί να οδηγήσει σε διάσπαση στην κυτταρική ομοιόσταση και μπορούν επίσης να συμμετέχουν σε νεοπλασματικό μετασχηματισμό.

Μια ανάλυση της κατάστασης του τόπου του γονιδίου απέδειξε ότι η ομόζυγη διαγραφή του γονιδίου τόπου miR-31 ήταν μία από τις αιτίες για την απώλεια της έκφρασης του σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, ορισμένες κυτταρικές γραμμές που διατήρησε το γονίδιο τόπο miR-31 επίσης εξασθενημένα σοβαρά την έκφρασή του. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι η υπερμεθυλίωση του DNA ή ιστόνης στον τόπο υποκινητή του γονιδίου ξενιστή miR-31 ήταν η αιτία για τη σοβαρή αρνητική ρύθμιση του miR-31 σε καρκίνους του μαστού [21] ή ενήλικας Τ κυττάρων λευχαιμίας [29]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας από το πείραμα με τη χρήση αναστολέων για μεθυλοτρανσφεράσης DNA και αποακετυλασών των ιστονών δεν υποστηρίζουν τη συμμετοχή των επιγενετικών τροποποίηση στην εξασθένιση της έκφρασης miR-31. Μεθυλίωσης-ειδική PCR και όξινο αλληλουχίας αναλύσεις, επίσης, απέτυχε να αποδείξει αιτιώδεις σχέσεις μεταξύ DNA υπερμεθυλίωση του υποκινητή και τέτοια σοβαρή εξασθένηση. Ένας πιθανός μηχανισμός πλην επιγενετικές τροποποίηση είναι πιθανόν να εμπλέκεται στην μειορύθμιση της έκφρασης miR-31. Η υποθετική θέση προαγωγέα του γονιδίου ξενιστή miR-31 περιέχει πολλαπλά στοιχεία ενισχυτή CCAAT [30]. πρωτεΐνη CCAAT πρόσδεσης στοιχείο (C /EBP) -β βρέθηκε να επάγει miR-31 έκφραση σε επιθήλια των αεραγωγών σε απόκριση σε ορισμένα εξωτερικά ερεθίσματα [30]. Ο /ΕΒΡ-α αποδείχθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σοβαρά σε καρκίνους του πνεύμονα [31] – [34], και μπορεί να είναι η αιτία για την διαταραγμένη έκφραση του miR-31. Μια έρευνα σχετικά με την πιθανή εμπλοκή της οικογένειας Ο /ΕΒΡ στην εξασθένηση του miR-31 έκφρασης σε καρκίνο του πνεύμονα είναι δικαιολογημένη. Εν τω μεταξύ, μη-καρκινικές αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές επιθηλιακών αεραγωγών μετασχηματίζεται από τον SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο (ΝΗΒΕ-T, HPL1D, και HPL1A), στην οποία οι αδρανοποιημένο, βρέθηκαν ρ53 και RB μεσολάβηση μονοπάτια για να εκφράσουν miR-31 σε αισθητά χαμηλότερα επίπεδα από μικρά κύτταρα επιθηλιακά αεραγωγών (SAEC) και βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ). Αυτό ιικό αντιγόνο μπορεί άμεσα και έμμεσα τροποποιούν την έκφραση του miR-31.

Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι μια αλλοιωμένη έκφραση του miR-31 οφείλεται είτε σε ενίσχυση ή απώλεια του γονιδίου ξενιστή τόπου του μπορεί συμμετέχουν στην καρκινογένεση του πνεύμονα. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να περιγράψει το δυναμικό μηχανισμό αιτιολογικό στηρίζεται η αλλοιωμένη έκφραση του miR-31 σε καρκίνους του πνεύμονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Οι αριθμοί αντίγραφο ας-7ί και U6 snRNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Ας-7i επίπεδα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα U6 snRNA. AEC, επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (μη καρκινικά κύτταρα)? ADC, αδενοκαρκίνωμα? SQC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC, μεγάλων κυττάρων καρκίνωμα? . SCC, μικροκυτταρικό καρκίνωμα

doi: 10.1371 /journal.pone.0100581.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Βιολογικές επιδράσεις της αποκατάστασης του miR-31 σε καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική σειρά (LC2AD) παρουσιάζεται. Ο φορέας προ-ρετροϊού pLHCX (BD Clontech) που φέρει θραύσματα DNA που περιλαμβάνει την περιοχή κωδικοποίησης miR-31 (MIMAT0000089) συνοδευτικά περίπου ένα περιθώριο 100 ζεύγη βάσεων και στις δύο κατευθύνσεις, ελήφθη. Οι φορείς ρετροϊού (κενό φορέα (ψεύτικο), η αίσθηση κλώνος του miR-31 (SS), και ο αντινοηματικός κλώνος του miR-31 (AS)) μολύνθηκαν ως την ίδια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Μετά από μια σύντομη επιλογή με Υγρομυκίνη Β (BD Clontech), τα επιζώντα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν, και 2.0 χ 10

4 επανα-σπείρονται επάνω σε ένα δίσκο των 10 εκατοστών. Μετά από 15 ημέρες, τα κύτταρα ήταν μεθανόλη-σταθερών και Giemsa χρώση (Α). Τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι σφάλματος) των αριθμών αποικιών από τριπλότυπα πειράματα που παρουσιάζονται (Β). Τα κύτταρα που επιλέγονται αναπτύσσονται και πέρασε αρκετές φορές. Οι σωρευμένες διπλασιασμούς πληθυσμού παρουσιάζονται (C). Τα κύτταρα συγκομίζονται αμέσως μετά τη διαδικασία επιλογής εξετάστηκαν για την έκφραση του miR-31 και U6 snRNA με ποσοτική RT-PCR. Το επίπεδο του miR-31 κανονικοποιούνται με εκείνη του U6 snRNA παρουσιάζεται (D)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0100581.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Οι αριθμοί αντιγράφου του ITGA5, RhoA, ΜΜΡ-16, και GAPDH mRNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. ITGA5 (Α), οι RhoA (Β), και ΜΜΡ-16 επίπεδα (C) κανονικοποιημένη σε επίπεδα GAPDH απεικονίζεται. AEC, επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (μη καρκινικά κύτταρα)? TRAS, LC2AD καρκίνου του πνεύμονα κυτταρική σειρά – επιμολύνσεων βάση (κενό φορέα (ψεύτικο), η αίσθηση κλώνος του miR-31 (SS), και ο αντινοηματικός κλώνος του miR-31 (AS))? ADC, αδενοκαρκίνωμα? SQC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LCC, μεγάλων κυττάρων καρκίνωμα? SCC, μικροκυτταρικό καρκίνωμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0100581.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε ιδιαίτερα τον Emi HONDA και Misa OTARA (Kanagawa Νομαρχιακή καρδιαγγειακή και αναπνευστική Κέντρο Νοσοκομείο, Yokohama, Ιαπωνία) για τη βοήθειά τους.