Αφηρημένο

Τα microRNAs είναι ενδογενείς νουκλεοτιδικές RNAs μικρής αλυσίδας που ρυθμίζουν τη λειτουργία του γονιδίου με άμεση δέσμευση των mRNA στόχου. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την επίδραση του microRNA-206 (MIR-206) για την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. miR-206 επιβεβαιώθηκε το πρώτο που πρέπει να ρυθμίζεται προς τα κάτω στο γαστρικό δείγματα καρκίνου. Αντιστρόφως, προς τα πάνω ρύθμιση της c-Met επιβεβαιώθηκε σε δείγματα ιστού του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου, με το επίπεδο του αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση miR-206. Εισαγωγή miR-206 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό επάγοντας G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου, καθώς επίσης και τη μετανάστευση και την εισβολή. Επιπλέον, σημαντικό πολλαπλασιασμό και /ή μετανάστευση σχετικά μόρια όπως c-Met, CDK4, ρ-Rb, ρ-Akt και ρ-ERK επιβεβαιώθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω με ανάλυση κηλίδος Western. Στόχευση του c-Met επίσης επηρεάζονται άμεσα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων AGS, τη μετανάστευση και την εισβολή.

In vivo

, miR-206 που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται, επίσης, καθυστέρηση της ανάπτυξης σε σύγκριση με ανεπηρέαστη καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι miR-206 κατέστειλε την έκφραση του c-Met σε γαστρικό καρκίνο και θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ισχυρός καταστολέας όγκων σε c-Met που υπερεκφράζουν όγκους. Αναστολή της miR-206 λειτουργία θα μπορούσε να συμβάλει στην ανώμαλο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση, που οδηγεί σε γαστρικό ανάπτυξης καρκίνου

Παράθεση:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang Η, Chen Κ, Li G, et al. (2015) microRNA-206: Αποτελεσματική αναστολή της γαστρικής Καρκίνου Πρόοδος μέσω της οδού c-Met. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10.1371 /journal.pone.0128751

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 4 Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 1η Μαΐου 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 του Ιούλη 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant 81100671 (DY), Zhejiang Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant Y2110609 ( DY), και Wenzhou Επιστήμη & amp? Τεχνολογίας του Προεδρείου Grant Y20080096 (DY). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο στον κόσμο [1]. νοσηρότητα και τη θνησιμότητα της είναι ιδιαίτερα έντονη στις χώρες της Ασίας οφείλεται σε μια ποικιλία επιρροών [1]. Από την παρουσίασή του συνδέεται συχνά με προχωρημένη νόσο, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για πρόοδο στην ανίχνευση της και, τελικά, τη διαχείρισή του. Προς το παρόν, η κατανόηση των microRNAs (miRNAs) για τον επηρεασμό σχηματισμού του γαστρικού καρκίνου που εμφανίζονται με ταχύ ρυθμό.

Από την πρώτη περιγραφή των miRNA στο νηματώδη

C

.

elegans

πίσω στο 1993, ο αντίκτυπος αυτών των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs έχει ξεπεράσει πολλούς κλάδους της μοριακής βιολογίας [2]. MiRNAs είναι εξαιρετικά ιστού συγκεκριμένες βιοδείκτες με τη δυνατότητα να αλλάξει και να μετατρέψει κάτοικος των ιστών. Επειδή υπερέκφραση και υπο-έκφραση έχουν και οι δύο σχετίζονται με ογκογένεση [3], τους ρόλους τους ως ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια και οι δύο καλά εδραιωμένη [4, 5]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων αρκετών ετών, ο αντίκτυπός τους στην ανάπτυξη και την ανίχνευση των όγκων συμπαγών οργάνων, συμπεριλαμβανομένων του γαστρικού καρκίνου είναι σιγά-σιγά διευκρινιστεί. Υπάρχουν ήδη αρκετές miRNAs που προσδιορίζονται στο γαστρικό καρκίνο αντι-αποπτωτικό μηχανισμό όπως miR-21 και miR-148a [6, 7]. Άλλες οδοί επηρεάζονται από miRNAs περιλαμβάνουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου που αποτελείται από miR-222/221, miR-106b /93/25 και miR-24 [6, 7].

Ένα από τα άλλα υποσχόμενη νέα miRNAs για συμπαγών οργάνων όγκων περιλαμβάνει miR-206 [8]. Αυτό το συγκεκριμένο miRNA ανήκει σε μια ομάδα «myomiRs» που εμπλέκεται στο σκελετικό μυ ανάπτυξη [9]. Αφού έχουν συσχετισθεί με πολλές άλλες ασθένειες συμπεριλαμβανομένων των καρδιακών παθήσεων, χρόνιας αποφρακτικής πνευμονικής νόσου και της νόσου του Alzheimer, ο ρόλος του στην ογκογένεση έλαβε έλεγχο πιο πρόσφατα συμπεριλαμβανομένων ραβδομυοσάρκωμα, καρκίνος του πνεύμονα, ορθοκολικό καρκίνο, σβάννωμα, και γαστρικού καρκίνου [8, 9]. Παρά το γεγονός ότι είναι αυξημένα σε μερικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών και του Waldenstrom μακροσφαιριναιμία, miR-206 είναι ως επί το πλείστον καταστέλλεται σε όγκους συμπαγών οργάνων [9]. miR-206 έχει προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών γαστρικό εν μέρει από την καταστολή της κυκλίνης D2 [10]. Σε αυτή την έρευνα, θα συγκεντρώνεται στο ρόλο του miR-206 στο γαστρικό ογκογένεση του καρκίνου μέσω της οδού c-Met, η οποία παραδοσιακά σημαίνοντα οδό σηματοδότησης για ογκογένεση σε μία ποικιλία όγκων [11]. c-Met έχει προβλεφθεί και αποδειχθεί ότι είναι το γονίδιο στόχος πολλαπλών miRNAs συμπεριλαμβανομένων των miR-206 [9, 12].

Αποτελέσματα

Κατάργηση του miR-206 οδήγησε σε αυξημένη c-Met έκφραση σε γαστρικό καρκίνο

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR για την ανίχνευση της έκφρασης του miR-206 σε 40 γαστρικό δείγματα καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς. επίπεδα miR-206 στα περισσότερα δείγματα ιστού των γαστρικών όγκων (34/40) βρέθηκαν να είναι σημαντικά χαμηλότερες από τους φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1Α). έκφραση miR-206 είναι αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο του c-Met παρατηρήθηκε σε δείγματα όγκου (Σχήμα 1Β). Τα περισσότερα δείγματα όγκου, με μειωμένη έκφραση miR-206, έδειξε υψηλό ποσοστό (& gt? 50%) της χρώσης c-Met. Αντιστρόφως, οι όγκοι με φυσιολογική έκφραση του miR-206 έδειξε πολύ αδύναμη ή αρνητική έκφραση του c-Met.

(Α) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR που δείχνει την έκφραση του miR-206 σε φυσιολογικούς ιστούς (που ορίζεται στο 1 ) και η σχετική ποσότητα του miR-206 στους όγκους, όπως πλάσια μείωση. Ν: φυσιολογικούς ιστούς? Τ: όγκων. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) έκφραση miR-206 σε κύτταρα ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με c-Met. Ο εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική χρώση των τριών γαστρικού δειγμάτων όγκου και αντίστοιχα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς τους παρουσιάστηκε. Δείγμα αριθμούς 2, 6, και 23 είναι πανομοιότυπες με εκείνες σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Καρκινικά κύτταρα με & gt? 50% θετική χρώση θεωρήθηκαν για να έχουν ισχυρή έκφραση c-Met.

Η

miR-206 που προκαλείται από G1 σύλληψη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναστέλλεται, τη μετανάστευση και την εισβολή του AGS γαστρικών καρκινικών κυττάρων

Όπως miR -206 έκφραση μειώθηκε στο γαστρικό καρκίνο δείγματα, επιδιώξαμε να καθοριστεί αν η εισαγωγή του miR-206 είχαν οποιαδήποτε βιολογική επίδραση στα κύτταρα AGS. κύτταρα AGS επιμολυσμένα με το μόριο miR-206 έδειξε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο με βάση τη δοκιμασία MTS (Σχ 2Α). ανάλυση FACS των κυττάρων έδειξαν G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου (S1 Εικ). Ο αριθμός των αποικιών μειώθηκε επίσης με την επιμόλυνση του miR-206 (S2 Εικ).

(Α) δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS διεξήχθη την ημέρα 3, όπως υποδεικνύεται. (Β) AGS κύτταρα αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες Transwell και Matrigel. Ο αριθμός των κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων ενθέτου καλλιέργειας (αριστερά) ή είχαν εισβάλει μέσα από τους πόρους Matrigel ένθετο (δεξιά) ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας πέντε ανεξάρτητες οπτικά πεδία. *: Διαφορές στην κυτταρική μετανάστευση ή την εισβολή των miR-206 και του αρνητικού ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικές,

P

& lt? 0.01.

Η

miR-206 μπορεί να αναστείλει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων AGS (Σχήμα 2Β και S3 σχήμα). Μια δραματική μείωση της μετανάστευσης προς τα κάτω θαλάμους παρατηρήθηκε σε miR-206 επιμολυσμένα κύτταρα AGS (86 ± 15 έναντι 165 ± 16 σε AGS κύτταρα,

P

& lt? 0.01, n = 3). Επιπλέον, κύτταρα διαμολυσμένα με miR-206 έδειξε ότι τον επαγόμενο από HGF διεισδυτικότητα επίσης παρεμποδίζεται σημαντικά μετά miR-206 διαμόλυνση (57 ± 12 έναντι 116 ± 14 σε AGS κύτταρα,

P

& lt? 0,01, η = 3).

miR-206 μειωτικά την έκφραση c-Met και οι πρωτεΐνες συνδέονται με τον κύκλο άλλο κύτταρο

Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως c-Met ως άμεσο στόχο του miR-206 [9]. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε ότι η έκφραση του c-Met μειώθηκε κατά miR-206 επιμόλυνση σε AGS κύτταρα (Σχήμα 3). Παράλληλα, έκτοπη miR-206 και κάτω ρυθμίζεται η έκφραση της CDK4, π-Rb, π-Akt και p-ERK.

miR-206 ρυθμίζει προς τα κάτω και την έκφραση της p-Akt και p-ERK1 /2, αλλά όχι ολική Akt ή ERK1 /2.

η

η μειωτική ρύθμιση της c-Met ανέστειλε γαστρικού πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή

Στη συνέχεια, c-Met ειδικό siRNA χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για να μειωθεί η έκφραση του c-Met σε κύτταρα AGS (S4 σχήμα). δοκιμασίες MTS διεξήχθησαν για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. κύτταρα AGS επιμολυσμένα με c-Met siRNA επέδειξαν μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων συγκριτικά με τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου (Σχ 4Α? 25,10 ± 3,81% μείωση). Τόσο επαγόμενο από HGF μετανάστευση και εισβολή μειώθηκαν κατά τη σύγκριση c-Met siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με τον αρνητικό μάρτυρα επιμολυσμένα κύτταρα. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4Β και S5 Σχ, μείωση στη μετανάστευση (88 ± 10 έναντι 155 ± 15, Ρ & lt? 0,01, η = 3) και εισβολή (72 ± 7 έναντι 126 ± 12, Ρ & lt? 0,01, η = 3) ήταν και οι δύο στατιστικά σημαντικές.

(Α) δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS διεξάγεται επί 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση. (Β) Η επίδραση των c-Met siRNA για AGS κύτταρα ποσοτικά με τη χρήση του πολιτισμού ή Matrigel ένθετα.

Η

Εισαγωγή του miR-206 κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

Η

επόμενο διερευνηθεί αν η υπερέκφραση του miR-206 θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Μετά από 8 εβδομάδες, τα κατά μέσο όρο οι όγκοι του όγκου ήταν σημαντικά χαμηλότερα από κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό εκφράζουν miR-206, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 5).

(Α) Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες γυμνών ποντικών 8 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. (Β) Μέσος όγκος των όγκων ήταν στατιστικά σημαντική. *: N = 5 το καθένα,

P

& lt? 0.01.

Η

Συζήτηση

καρκίνο του στομάχου έχει παραμείνει μια σημαντική επιβάρυνση της υγειονομικής περίθαλψης σε παγκόσμιο επίπεδο παρά τα χρόνια της έρευνας [1]. Σύμφωνα με τον ΠΟΥ, γαστρικό καρκίνος παραμένει μια από τις κορυφαίες καρκίνο αιτιολογίες με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας [1]. Όπως και με άλλους όγκους συμπαγών οργάνων, είναι όλο και πιο σαφές ότι η καλύτερη κατανόηση της ογκογένεσης όγκου είναι απαραίτητο να βελτιωθεί η πρόγνωση των ασθενών αυτών. Όντας διαδεδομένη στις ασιατικές χώρες, τα στοιχεία που προέρχονται για το ρόλο των miRNAs στην ανάπτυξη ή την καταστολή των γαστρικών καρκίνων [6].

miRNAs έχουν διττή λειτουργία από την άποψη της ανάπτυξης του καρκίνου του γαστρικού [6, 13]. Μερικά miRNAs είναι καταστολείς των όγκων και άλλοι είναι oncomiRs [6]. Ueda et al. Βρήκαμε 22 miRNAs απορυθμίζεται και 13 μειωτικά στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο του στομάχου [13]. Στόχους που είναι υπό διερεύνηση στην περίπτωση του καρκίνου του στομάχου περιλαμβάνουν ρυθμιστές του p16, μέσω miR-24, και p21 μέσω του miR-222/221 και miR-106b /93/25 [6]. Άλλοι, όπως miR-21, μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε έως και 92% των δειγμάτων γαστρικού καρκίνου ιστού [14]. Οι υποψήφιοι που προσδιορίζονται στο γαστρικό καρκίνο που χρησιμεύει ως καταστολείς όγκων περιλαμβάνουν miR-181β, miR-101 και miR-486 [6]. Για παράδειγμα, miR-101 πιστεύεται ότι στοχεύουν ΕΖΗ2, Cox-2, Mcl-1 και Fos [15]. miR-486 πιστεύεται ότι επηρεάζουν OLFM4, ενδεχομένως επηρεάζουν την απόπτωση κατάντη [16].

Αφού διαπιστώθηκε ότι η πλειοψηφία των miRNAs χρησιμεύσει ως καταστολείς των όγκων, ερευνήσαμε το μονοπάτι c-Met σε καρκίνο του στομάχου. Κατά τη μελέτη της οδού c-Met για rhadbomyosarcoma βρήκαμε τη σημασία αυτής της οδού στο σάρκωμα [9]. c-Met είναι γνωστό ότι απορυθμίζεται σε γαστρικό καρκίνο [11, 17-19]. Η met πρωτο-ογκογονιδίου κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη γνωστή ως υποδοχέας παράγοντα ανάπτυξης ηπατοκυττάρων (HGF), η οποία κατέχει δραστικότητα κινάσης τυροσίνης [18]. Εμείς συνήθως βρίσκουν εκφράζονται μόνο σε βλαστικά κύτταρα, αλλά επίσης έχουν δει δυσρύθμιση του στην ογκογένεση [18]. Σε αυτή τη μελέτη, ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει ότι η c-Met είναι σημαντικά εμπλέκονται σε καρκίνο του στομάχου και του ρόλου της ως στόχος miR-206 είναι ζωτικής σημασίας στην ογκογένεση.

εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι απορυθμίζεται σε γαστρικό καρκίνο. Με βάση τις προηγούμενες εκθέσεις, κυκλίνη D2 είναι αυξημένη σε γαστρικό καρκίνο όταν miR-206 επηρεάζεται [10]. miR-206 έχει δειχθεί ότι είναι ένας ισχυρός προγνωστικός δείκτης [10]. προς τα κάτω ρύθμιση του συνδέεται με μικρότερη συνολική επιβίωση. Αποκατάσταση miR-206 οδηγεί σε G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου, επιβεβαιώνοντας το ρόλο της ως καταστολέας όγκου. Το έργο μας έδειξε επίσης απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου με CDK4 και φωσφορυλιωμένη-Rb να επηρεαστεί. CDK4 είναι μέλος της κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση της οικογένειας με δραστικότητα κινάσης πρωτεΐνης ser /thr. Οδηγεί σε εξέλιξη φάση G1. Επιπλέον, η κινάση οδηγεί στην φωσφορυλίωση της Rb, η οποία είναι ένας καταστολέας όγκων που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Αν και έχουν παρόμοια ευρήματα επιβεβαιώθηκαν σε γαστρικό, καρκίνους ωοθηκών και του μαστού, ο ρόλος του miR-206 φαίνεται να έχουν το αντίθετο αποτέλεσμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου [6, 20]. Μια αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ miR-206 και KLF4 σε μια ομάδα ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου [20]. KLF4, η οποία έχει ογκογόνο ιδιότητες σε άλλους καρκίνους όπως του μαστού, του δέρματος και των πνευμόνων, λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [20]. προαγωγός του είναι υπερ-μεθυλιώνεται με αυξημένα επίπεδα miR-206 που οδηγεί σε αρνητική ρύθμιση των KLF4 [20]. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι το miR-206 μπορεί να μην λειτουργούν παρόμοια σε όλα τα επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία αναιρεί το ένα μέγεθος ταιριάζει σε όλους προσέγγιση σε χημειοθεραπευτικά.

Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε έναν μηχανισμό για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης c-Met μέσω miR-206 σε καρκίνο του στομάχου. c-Met υπερέκφραση εξής miR-206 προς τα κάτω ρύθμιση φαίνεται να είναι η κοινή αιτιολογία για την παθογένεση του καρκίνου του στομάχου στην πλειονότητα των δειγμάτων που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Συνοπτικά, αποδείξαμε ότι miR-206 διαμορφώνει αρνητικά το μονοπάτι σηματοδότησης c-Met συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Οι μελέτες μας ελπίζουμε ότι θα έχουν σημαντικές κλινικές συνέπειες στη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. miR-206 είναι υποψήφιος τόσο για ανοσοϊστοχημική ανίχνευση μικρών όγκων και των πιθανών στόχων για τα βιολογικά θεραπευτικά μέσα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Η ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, AGS, που αγοράστηκε από την ATCC (Manassas, VA), αναπτύχθηκε σε Ham F-12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. (FBS? Hyclone, Logan, UT)

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις και την έγκριση του Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής (Αριθμός άδειας: WZMCOPT-043011). Σαράντα γαστρικά δείγματα όγκων και φυσιολογικό δότη γαστρικό ιστοί ελήφθησαν από τη δεύτερη συνδεδεμένες νοσοκομείο του Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Wenzhou, Κίνα). Η συλλογή των δειγμάτων εγκρίθηκε από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Επιτροπής Δεοντολογίας Wenzhou σχετικά με την έρευνα σε ανθρώπους, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε περίπτωση. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με τη δήλωση του Ελσίνκι και τις εθνικές νομοθεσίες.

Ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από δείγματα ανθρώπινου γαστρικού όγκου και φυσιολογικούς μάρτυρες με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). 10 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση cDNA από το Taqman microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), και το επίπεδο έκφρασης miR-206 ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία Taqman microRNA (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση του Applied Biosystems VIIa 7 PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του c-Met

Τμήματα σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένα σε παραφίνη ανθρώπινου γαστρικού δειγμάτων όγκου (5 μm) έγιναν και στη συνέχεια απο-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και αιθανόλη. Τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με c-Met αντίσωμα σε 1: 300 αραίωση (CST, Beverly, ΜΑ). Ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα /ανίχνευσης DAB EnVision HRP (Dako, Glostrup, Δανία).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

AGS κύτταρα επιστρώθηκαν σε 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων ( συμπρωταγωνιστής, High Wycombe, UK) για κάθε επιμόλυνση. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με αντιδραστήριο (Lipofectamine RNAiMAX? Invitrogen), εις τριπλούν. Για κάθε φρεάτιο, 50 ηΜ miR-206 μιμείται μόριο (Ambion, Austin, ΤΧ), ή ένα αρνητικό μάρτυρα (Ambion) διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκε. Μετά από 72 ώρες καλλιέργειας, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με MTS δοκιμασίας (CellTiter 96 Υδατικό? Promega, Madison, WI).

δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell

24 ώρες μετά την επιμόλυνση, AGS κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκε μία φορά με διάλυμα D-Hanks (Invitrogen). Για τη μέτρηση της κυτταρικής μετανάστευσης ή εισβολή, 8-μm μέγεθος πόρου καλλιέργεια ή ένθετα Matrigel (Transwell? Costar) τοποθετήθηκαν στα φρεάτια των πλακών καλλιέργειας 24 φρεατίων. Στο κάτω θάλαμο, 400 μL F-12 που περιέχει 10% FBS και προστέθηκαν 20 ng /ml HGF. Στη συνέχεια, 5×10

4 κύτταρα προστέθηκαν στον άνω θάλαμο. Μετά από 20 ώρες επώασης, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο (Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) χρησιμοποιώντας έναν 20χ αντικειμενικό.

ανάλυση κηλίδος Western

AGS κύτταρα (1×10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε F-12 για 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και υποβλήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό λύσης (35 mM Tris-CI [ρΗ 6,8], 20 g /L δωδεκυλικό θειικό νάτριο [SDS], 100 mM διθειοθρεϊτόλη). Πρωτεϊνικά λύματα (20 μα) διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου 8%, τότε ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες ηθμού νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 5% άπαχο γάλα σε PBS με 0,05% Tween-20 για 2 ώρες και επωάζονται όλη τη νύχτα με αντίσωμα σε 4 ° C. Μετά από μία δεύτερη πλύση με PBS που περιείχε 0,05% Tween-20, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (Millipore, Darmstadt, Germany) και αναπτύχθηκε με μια ενισχυμένη κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αντισώματα για CDK4, ρ-Rb, ΕΚΚ, Akt, ρ-ERK, ρ-Akt, c-Met και GAPDH ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ).

δοκιμασίες siRNA

c-Met-ειδικό siRNA (Ambion) και αρνητικού ελέγχου siRNA (Ambion) χρησιμοποιήθηκαν για να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση c-Met σε AGS κύτταρα. 50 ηΜ c-Met-ειδικό siRNA ή αρνητικό μάρτυρα siRNA διαμολύνθηκε σε AGS κυττάρων με Lipofectamine RNAiMAX. δοκιμασία MTS διεξήχθη 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, ενώ δοκιμασίες Transwell και Matrigel διεξήχθησαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, όπως περιγράφεται παραπάνω.

In vivo

ανάπτυξης όγκου δοκιμασίας

Η προ-microRNA κατασκευές έκφρασης lenti-miR-206 και του φορέα ελέγχου pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP αγοράστηκαν από το Σύστημα Βιοεπιστημών (Mountain View, CA). κύτταρα AGS μολύνθηκαν με φακοϊό έκφραση του miR-206 ή αρνητικός μάρτυρας. Θηλυκά γυμνά ποντίκια, ηλικίας 6 εβδομάδων, εμβολιάσθηκαν με AGS κύτταρα (8×10

6) που εκφράζουν miR-206 ή αρνητικούς ελέγχους σε λαγόνες τους, και στη συνέχεια θυσιάστηκαν μετά από 8 εβδομάδες. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: (

L

x

W

2) x 0.5 (

L

, μήκους?

W

, πλάτος), σύμφωνα με την μέθοδο προηγουμένως αναφερθεί [21]. Όλες οι μελέτες και οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση Επιτροπή Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Τα αποτελέσματα φαίνονται εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από τριπλότυπα σε ένα πείραμα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν εκείνα που λαμβάνονται σε τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων και ομάδων ελέγχου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Μαθητή

t-test

. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή στο

P

& lt? 0.05.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. FACS ανάλυση των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με AGS miR-206.

AGS κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-206 ή NC, βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Δέκα χιλιάδες κύτταρα αξιολογήθηκαν σε κάθε δείγμα. Τα πιο αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα απεικονίζονται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. σχηματισμός αποικίας δοκιμασία.

κύτταρα επιμολυσμένα με AGS miR-206 ή NC σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα. Μετά από 7 ημέρες, σχηματισμό αποικίας προσδιορίστηκε με χρώση με κρυσταλλικό ιώδες. Τα τυπικά αποτελέσματα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. Τα αποτελέσματα του miR-206 επί AGS κύτταρα αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες Transwell και Matrigel.

Ο αριθμός των κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων ενθέτου καλλιέργειας (πάνω) ή είχαν εισβάλει μέσα από τους πόρους ενθέτου Matrigel (κάτω) φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας μια 20X στόχος μικροσκόπιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. . Προς τα κάτω ρύθμιση της c-Met με siRNA

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η καταστολή της έκφρασης του c-Met μετά λιποφεκταμίνη επιμόλυνση κυττάρων AGS είτε με c-Met siRNA ή αρνητικό έλεγχο (NC)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s004

(ΔΕΘ)

S5 Εικ. Οι επιδράσεις των c-Met siRNA επί AGS κύτταρα αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες Transwell και Matrigel.

Ο αριθμός των κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων ενθέτου καλλιέργειας (πάνω) ή είχαν εισβάλει μέσα από τους πόρους ενθέτου Matrigel (κάτω) φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας ένας στόχος μικροσκόπιο 20Χ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s005

(ΔΕΘ)