Αφηρημένο

Ιστορικό

Η βιολογική βάση για τον καρκίνο αγνώστου πρωτοπαθούς (CUP) στο μοριακό επίπεδο παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, χωρίς αποδείξεις για το εάν υπάρχει μια κοινή βιολογική οντότητα. Εδώ, θα αξιολογηθεί η δυνατότητα προσδιορισμού μιας κοινής διαγνωστικό βιοδείκτη για CUP χρησιμοποιώντας μια ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών.

Μέθοδοι

δείγματα mRNA όγκων από 60 ασθενείς με CUP αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Affymetrix U133A Plus 2.0 GeneChip και ομαλοποιήθηκαν με ASINH (υπερβολικό τόξο ημιτόνου) μετασχηματισμού για να κατασκευάσει ένα μέσο προφίλ γονιδιακής έκφρασης ειδικά για CUP. Ένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης ειδικά για την ομάδα μη-CUP κατασκευάστηκε με τη χρήση διαθέσιμων στο κοινό των πρώτων συνόλων δεδομένων μικροσυστοιχιών. Τα t-τεστ εκτελέστηκαν για να συγκρίνουν το κύπελλο με μη-CUP ομάδες και τα κορυφαία 59 CUP συγκεκριμένα γονίδια με τη μεγαλύτερη αλλαγή φορές επιλέχθηκαν (

σ

-τιμή & lt? 0.001).

Αποτελέσματα

Μεταξύ των 44 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στην ομάδα CUP, εντοπίστηκαν 6 γονίδια για ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Δύο από αυτά τα γονίδια (

RPS7

και

RPL11

) είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην οδό Mdm2-p53. Εντοπίσαμε επίσης αρκετά γονίδια που σχετίζονται με μετάσταση και την απόπτωση, γεγονός που υποδηλώνει μια βιολογική ιδιότητα του CUP.

Συμπεράσματα

Τα προϊόντα πρωτεΐνης του επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια που εντοπίζονται στην παρούσα μελέτη μπορεί να είναι κλινικά χρήσιμη ως μοναδικό βιοδείκτες για CUP

Παράθεση:. Δρ Νόρι Κουραχάσι I, Fujita Υ, Arao Τ, Kurata Τ, Κο Υ, Sakai K, et al. (2013) Μια μικροσυστοιχιών-Based Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης για τον εντοπισμό Διαγνωστικό βιοδείκτες για άγνωστους πρωτοπαθή καρκίνο. PLoS ONE 8 (5): e63249. doi: 10.1371 /journal.pone.0063249

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 27 του Νοεμβρίου του 2012? Δεκτές: 1 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2013

Copyright: © 2013 Δρ Νόρι Κουραχάσι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση-in-βοήθειας για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι ασθενείς με καρκίνο αγνώστου πρωτοπαθούς (CUP) που υπάρχει με μεταστατική νόσο για την οποία δεν μπορεί να βρεθεί η κύρια περιοχή, παρά την εκτεταμένη τυπική έρευνα. Η πρόγνωση των ασθενών με CUP είναι συνήθως κακή για εκείνους που λαμβάνουν εμπειρική θεραπείες. Η μέση περίοδος επιβίωσης είναι 3-9 μήνες ακόμη και όταν τα νεότερα σχήματα θεραπείας συνδυασμού χορηγείται [1] – [5]. Η επιβίωση των ασθενών με CUP μπορεί να βελτιωθεί, αν μπορεί να προσδιοριστεί η κύρια περιοχή και μια περιοχή-ειδική θεραπεία μπορεί να εφαρμοστεί [6], [7].

Κλινικά, κύπελλα παρουσιάζουν κοινά χαρακτηριστικά, όπως η ταχεία εξέλιξη , πρώιμη διάδοση και μια σιωπηλή πρωτοπαθούς όγκου, με τα σημάδια και τα συμπτώματα που σχετίζονται με τη μεταστατική ιστοσελίδα (ες) [8]. Η πρωτογενής όγκος μπορεί είτε να έχουν μια αργή πρότυπο ανάπτυξης ή μπορεί να γίνει Περίπλοκο και μη ανιχνεύσιμα. Ύπαρξη τέτοιων κοινών ιδιοτήτων μας ωθεί να υποθέσουμε ότι μπορεί να υπάρχουν δυνατότητες βιολογικών δεικτών που διαλεύκανση CUP στο σύνολό της. Ανάλυση έκφρασης γονιδίων είναι ένα από τα μέσα με τα οποία για την αναγνώριση γονιδίων χαρακτηριστικές CUP.

Αρκετές μελέτες χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες έκφρασης γονιδίου έχουν καταδείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης χιλιάδων γονιδίων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα «μοριακό δακτυλικό αποτύπωμα» για να ταξινομήσει ένα πλήθος τύπων όγκων [9] – [15]. Είμαστε σήμερα συμμετέχουν σε μια πολυκεντρική κλινική μελέτη για την πρόβλεψη της πρωτοβάθμιας ιστοσελίδα του CUP με βάση την ανάλυση των προτύπων γονιδιακής έκφρασης. Η ανάλυση ερμηνεύει την έκφραση των γονιδίων ~22,000 σε κάθε δείγμα, εφαρμόζοντας την εξομάλυνση και την ταξινόμηση των αλγορίθμων στα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από ένα μικροσυστοιχιών. Η ομοιότητα του προτύπου έκφρασης του γονιδίου κάθε δείγμα όγκου είναι τότε σε σύγκριση με τα πρότυπα για όγκους από 24 γνωστές πρωτογενείς θέσεις που καλύπτονται από τη δοκιμή. Η μελέτη αυτή επέτρεψε την ταυτοποίηση των γονιδίων που παρουσίασαν ένα μοναδικό μοτίβο έκφρασης σε CUP. Εδώ, σας παρουσιάζουμε διάφορα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μετάσταση-και την απόπτωση που σχετίζονται με αυτόν τον τρόπο προσδιοριζόμενες που μπορεί βιολογικά χαρακτηρίζουν CUP.

ηθική Δήλωση Υλικά και Μέθοδοι

Η

Όλοι οι ασθενείς κατόπιν γραπτής εν επιγνώσει συναίνεση. έγκριση της μελέτης λήφθηκε από επιτροπές ανεξάρτητων δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Οζάκα, Σιζουόκα Κέντρο Καρκίνου, Hyogo Κέντρο Καρκίνου, Οσάκα Σίτι Γενικό Νοσοκομείο, το Πανεπιστήμιο Chiba, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου Νοσοκομείο Ανατολή, Πανεπιστήμιο Kobe, Tochigi Κέντρο Καρκίνου, Saitama Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Πανεπιστήμιο Tohoku, και ο Καρκίνος Νοσοκομείο Ινστιτούτου. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Μελέτη

Αυτή η μελέτη προήλθε από τη στιγμή σε εξέλιξη πολυκεντρική, τυχαιοποιημένη, φάσης 2 προοπτική μελέτη για τη θεραπεία των μη επεξεργασμένων CUP με βάση την πρόβλεψη της η κύρια περιοχή χρησιμοποιώντας δεδομένα από ένα τσιπ DNA. Οι ασθενείς είχαν διαγνωστεί ως έχοντες CUP μεταξύ Νοεμβρίου 2008 και Νοεμβρίου 2010, ένα από τα 13 κέντρα της Ιαπωνίας Ογκολογική Ομάδα West (WJOG), ένα ιαπωνικό μη κερδοσκοπική οργάνωση για τη διεξαγωγή των ογκολογικών κλινικών δοκιμών. Οι εργαστηριακές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε 2 κέντρα στην Ιαπωνία (Πανεπιστημίου Κίνκι, Osaka-Sayama και Mitsubishi Chemical Medience Corporation, Τόκιο).

Ασθενείς

Όλες οι επιλέξιμες οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε μια τυπική έρευνα για CUP. Είχαν κατηγοριοποιούνται σε δυσμενή υποσύνολα CUP. επιτρεπόταν διαγνώσεις ιστολογικά ή κυτταρολογικά επιβεβαιωθεί αδενοκαρκίνωμα, κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα ή πλακώδες καρκίνωμα. Σε κάθε ένα από τους ασθενείς, μια πρωταρχική θέση δεν είχε εντοπιστεί μετά από ένα πλήρες ιατρικό ιστορικό, φυσική εξέταση, προφίλ χημεία, αξονική τομογραφία (CT) του θώρακα, την κοιλιά και τη λεκάνη, μαστογραφία σε γυναίκες, οι μετρήσεις του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) επίπεδο στους άνδρες, και μια κατευθυνόμενη κατεργασία των τυχόν συμπτωματική περιοχές. Οι ασθενείς στις ακόλουθες κατηγορίες αποκλείστηκαν: οι γυναίκες με αδενοκαρκίνωμα που περιλαμβάνει μόνο τις μασχαλιαίους λεμφαδένες ή την περιτοναϊκή κοιλότητα, οι ασθενείς με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων που περιλαμβάνουν μόνο τραχηλικούς λεμφαδένες ή βουβωνικοί λεμφαδένες, οι ασθενείς με ανεπαρκώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα συνεπής με γεννητικών κυττάρων όγκου (απομονωμένος δομές μεσαίας γραμμής, πολλαπλές πνευμονικά οζίδια, ή αυξημένα επίπεδα β-ανθρώπινης χοριακής γοναδοτροπίνης ή α-ανθρώπινης χοριακής γοναδοτροπίνης-φετοπρωτεΐνης), οι άνδρες με αυξημένο επίπεδο PSA πλάσματος ή χρώση PSA-θετικά σε έναν όγκο, οι ασθενείς με μια ενιαία, μικρό, ενδεχομένως χειρουργήσιμη όγκου, και οι ασθενείς με νευροενδοκρινείς καρκινώματα.

Συλλογή δείγματος

Φρέσκα κατεψυγμένα δείγματα ελήφθησαν από 60 ασθενείς με CUP χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση. Όλα τα δείγματα δοκιμάστηκαν χωρίς γνώση είτε των κλινικών χαρακτηριστικών ή την επακόλουθη ανταπόκριση στη θεραπεία, εκτός από το φύλο του ασθενούς και τη θέση του βιοψίας (ως επί το πλείστον λεμφαδένες ή ασκιτικού υγρού).

Διαδικασία Δοκιμασίας

RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ Isogene (Nippon Gene, Toyama, Japan). Φασματοφωτομετρία χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί κατά πόσον μια επαρκής συνολική συγκέντρωση RNA και η καθαρότητα ήταν παρούσα. Σε γενικές γραμμές, το πρωτόκολλο για την επεξεργασία του RNA, ενίσχυση και σήμανση θραυσμάτων, υβριδοποίηση υλικό στη μικροσυστοιχία, και σάρωση ήταν παρόμοιο με το πρότυπο πρωτόκολλο Affymetrix για ανάλυση έκφρασης GeneChip®. Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 χρησιμοποιήθηκε σε ένα όργανο Affymetrix 3000 ή 3000Dx GeneChip (ρευστονικής σταθμό και scanner) για τη λειτουργία Gene-Chip που λειτουργούν λογισμικό για τη δημιουργία των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (αρχεία .CEL).

Βάση δεδομένων Υποβολή μικροσυστοιχιών δεδομένων

Η μικροσυστοιχία στοιχεία κατατέθηκαν στο Omnibus βάση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (GEO): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Ο αριθμός προσχώρηση GEO για την πλατφόρμα είναι GSE42392, δείγματα GSM1038716-GSM 1038775.

Δεδομένα

Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας asinh (υπερβολικό τόξο ημιτόνου) μετασχηματισμού, η οποία είναι μια τροποποιημένη έκδοση εξομάλυνσης Huber με τη σταθεροποίηση της διακύμανσης [16], [17], καθώς επίσης και ένα μέρος της γενικευμένης μετασχηματισμού log (glog) [18]. Διοργανική και array-to-array προκαταλήψεις διορθώθηκαν με αφαίρεση συγκεκριμένων αποτελεσμάτων τους που εκτιμάται από το μικτό μοντέλο [19]. Η εξίσωση για το μετασχηματισμό είναι ASINH IGK /Ι.Κ, όπου Ι αντιπροσωπεύει την αξία έκφραση, ζ παριστά το γονίδιο, k αντιπροσωπεύει την συστοιχία, και η τελεία υποδεικνύει την μέση τιμή. Τα προκύπτοντα μετασχηματισμένα ASINH αξιών, που αντιπροσωπεύει τη σχετική έκφραση του κάθε γονιδίου, χρησιμοποιήθηκαν σε περαιτέρω αναλύσεις.

Οι πρώτες ομάδες δεδομένων μικροσυστοιχίας για 2.364 καρκίνους διαφόρων πρωτογενών τύπων και 10 φυσιολογικούς λεμφαδένες αποκτήθηκαν από την Gene Expression Omnibus (GEO) (Πίνακας 1). Αυτά τα σύνολα δεδομένων ομαλοποιήθηκαν και χρησιμοποιούνται για την κατασκευή προφίλ γονιδιακής έκφρασης συγκεκριμένες για κάθε τύπο καρκίνου (n = 24), καθώς και ένα συνολικό προφίλ για τον καρκίνο με γνωστά πρωτογενή (CKP). Η κανονική σύνολο δεδομένων λεμφαδένων χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά. Η ποιότητα των δεδομένων των δειγμάτων CUP παρακολουθήθηκε για να εξασφαλιστεί ότι η ανάλυση των δεδομένων των δειγμάτων CUP ήταν συγκρίσιμη με εκείνη των δειγμάτων που συλλέγονται από CKP GEO. Μόνο τα δείγματα των οποίων GAPDH, ένα γονίδιο ελέγχου καθαριότητας, κατά 5′-τερματική περιοχή (AFFX-HUMGAPDH /M33197_5_at) έδειξε μια ελάχιστη έκφραση & gt? 500, και με την αναλογία έντασης έκφρασης (GAPDH στο 3′-περιοχή /5′- περιοχής) & lt?. 3 επιλέχθηκαν

Η

Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης ειδικά για CUP κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας 30 δείγματα CUP ως δεδομένα εκπαίδευσης και άλλα 30 δείγματα και τα δεδομένα δοκιμών (μονές και ζυγές περιπτώσεις, αντίστοιχα) . Από τα 22.215 γονίδια που μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας και τα δύο δείγματα CUP (η εργασία αυτή) και τα δείγματα CKP (δημόσια πρόσβαση), επιλέχθηκαν συνολικά 5.645 γονιδίων με παρούσα πρόσκληση για κάθε δείγμα για περαιτέρω ανάλυση. Για τον εντοπισμό CUP συγκεκριμένα γονίδια, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης ειδικά για CUP (σύνολα δεδομένων εκπαίδευσης) και φυσιολογικό λεμφαδένα συγκρίθηκαν με τη χρήση t-τεστ. Ένα ιστόγραμμα του

p-τιμές

φαίνεται στο Σχήμα 1. Η

σ

-τιμές για τα περισσότερα από τα γονίδια ήταν λιγότερο από 0.001? όταν θα επιλέξει τις 100 κορυφαίες γονίδια, σύμφωνα με

σ

-τιμές τους, το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) ήταν 4,56 × 10

-12 [20]. Για να επικυρώσετε το αν τα γονίδια που εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας τα σύνολα δεδομένων εκπαίδευσης CUP ήταν σημαντικά ειδικά για CUP, η γραμμική διακριτική ανάλυση (LDA) τη χρήση αυτών των γονιδίων έγινε για τα σύνολα δεδομένων δοκιμής CUP και η ακρίβεια εκτιμήθηκε όπως περιγράφεται [21]. Θερμικούς χάρτες και ένα δενδρόγραμμα σύμπλεγμα στη συνέχεια κατασκευάστηκαν με τη μέθοδο του Ward [22].

Η

Αποτελέσματα

γονιδιακής έκφρασης Προφίλ CUP και Γνωστή Πρωτοβάθμια καρκίνοι

Ένα σύνολο 237 γονίδια βρέθηκαν να είναι είτε πάνω ρυθμισμένα ή προς τα κάτω ρυθμισμένα κατά περισσότερο από 2 φορές μεταξύ της κανονικής λεμφαδένα και 30 δείγματα CUP (σύνολα δεδομένων εκπαίδευσης). Από αυτούς, 59 γονίδια με περισσότερο από 2,5 φορές αλλαγή (44 επάνω ρυθμισμένη και 15 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια) παρατίθενται στον Πίνακα 2. Έχουμε ορίσει τα σύνολα γονίδιο που αποτελείται από αυτά τα συνδεδεμένα CUP γονιδίων με & gt? 2 φορές και & gt? 2,5 φορές πάνω ρύθμιση ή προς τα κάτω ρύθμιση, όπως Μ

CUP (2.0) και Μ

CUP (2.5), αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας αυτά τα σύνολα ανιχνευτή σε Μ

CUP (2.5), γραμμική διακριτική ανάλυση (LDA) πραγματοποιήθηκε για τα σύνολα δεδομένων εκπαίδευσης CUP μαζί με 2.364 καρκίνους διαφόρων γνωστών τύπων και 10 φυσιολογικούς λεμφαδένες. Όπως ήταν αναμενόμενο, όλα τα 2.404 δείγματα σωστά διακρίσεις. Όταν αξιολογήθηκαν τα υπόλοιπα 30 δείγματα CUP (σύνολα δεδομένων δοκιμής) χρησιμοποιώντας LDA που διαμορφώθηκε με τα σύνολα δεδομένων εκπαίδευσης, 26 από τα δείγματα 30 CUP αποδόθηκαν σωστά για να «CUP», ενώ μόνο οι 4 δείγματα είχαν προβλεφθεί ως «το άλλο καρκίνο» . Έτσι, η ακρίβεια της CUP ελέγχθηκε για να είναι 86,7%, υποδεικνύοντας ότι τα 59 γονίδια που επιλέχθηκαν ήταν στατιστικά σημαντική, όπως έχει βιολογικές ιδιότητες του CUP.

Η

Το Σχήμα 2 δείχνει την εποπτευόμενη ομαδοποίηση όλων των δειγμάτων 60 CUP πραγματοποιείται μαζί με 2.364 καρκίνους διαφόρων γνωστών τύπων και 10 φυσιολογικούς λεμφαδένες χρησιμοποιώντας τα 59 γονίδια. Τα δείγματα CUP χωρίστηκαν σε 2 ομάδες με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (ΛΑΚ) συγκεντρωμένα στο μεταξύ (δεξιά μεγαλύτερο μέρος του χάρτη θερμότητας). Η μεγαλύτερη ομάδα αποτελείτο από 42 δείγματα, ενώ η μικρότερη αποτελούνταν από 15 δείγματα. Μόνο 3 δείγματα CUP δεν περιλαμβάνονταν σε καμία από αυτές τις ομάδες και αντ ‘αυτού περιελήφθησαν στις συστάδες για κανονική λέμφωμα, όγκοι του εγκεφάλου, και ο καρκίνος των ωοθηκών, αντίστοιχα. Αυτά ήταν μεταξύ των 4 δείγματα που είχαν προβλεφθεί ως «το άλλο καρκίνο» στο LDA. Η

VAPA

γονίδιο, το οποίο υπερεκφράζεται στα περισσότερα από τα δείγματα καρκίνου, αλλά όχι στο Κύπελλο ή ΛΑΚ, αποκάλυψε μια έντονη αντίθεση ανάμεσα CUP /ΛΑΚ και άλλα δείγματα, τα οποία μπορεί να έχουν επηρεάσει την ανάλυση ομαδοποίησης. Όταν εκ νέου αναλύθηκαν τα δεδομένα μετά την αφαίρεση του

VAPA

γονίδιο, η ομαδοποίηση για CUP παρέμεινε αμετάβλητη, αλλά η μικρότερη ομάδα με 15 δείγματα δεν ήταν πλέον σε σύμπλεγμα με ΛΑΚ (Σχήμα S1). Τα προφίλ έκφρασης μέση γονιδίου (Geps) για το Κύπελλο, η κανονική λέμφωμα, και 24 γνωστά είδη καρκίνου συγκρίθηκαν για να δημιουργήσετε ένα δενδρόγραμμα που εκπροσωπούν τους ποσοτικοποιημένους σχέσεις μεταξύ CUP και τα γνωστά είδη καρκίνου, η οποία έδειξε και πάλι την ομαδοποίηση των CUP μαζί με ΛΑΚ (Εικόνα S2 ).

τα γονίδια υποδεικνύονται στα δεξιά. Η έγχρωμη γραμμή πάνω από το heatmap αντιπροσωπεύει τα διάφορα είδη καρκίνου, και το κλειδί μύθος είναι στα αριστερά. Στο θερμικός χάρτης, το κόκκινο αντιπροσωπεύει up-ρυθμιζόμενα γονίδια και πράσινο αντιπροσωπεύει κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια, σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης σε φυσιολογικό λεμφαδένες, με την κλίμακα που φαίνεται στην άνω αριστερή γωνία. Η έκφραση του γονιδίου προφίλ σύνολα δεδομένων για την κανονική λεμφαδένες και 24 γνωστά είδη καρκίνου, εκτός από CUP ελήφθησαν από πηγές διαθέσιμες στο κοινό, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Επιλογή κύπελλο που σχετίζονται Γονίδια

Παρά το γεγονός ότι οι λειτουργίες ήταν διαφορετικές ή άγνωστες για τους 44 up-ρυθμιζόμενα γονίδια στο M

CUP (2.5) σύνολα δεδομένων (Πίνακας 2), βρήκαμε ότι 14 γονίδια (

S100A4

,

PRG1

,

S100A6

,

GSTP1

,

EIF5A

,

LGALS1

,

S100A11

,

PRKDC

,

VIM

,

CST3

,

TIMP1

,

YWHAZ

,

Nedd8

,

STK17A

) θα μπορούσε να χαρακτηριστεί μετά από μια αναζήτηση χρησιμοποιώντας τις λέξεις-κλειδιά «μετάσταση» και «απόπτωση». Μερικά από αυτά τα γονίδια που σχετίζονται με την επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), μια λειτουργία που έχει αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ως ένα βασικό βήμα στη μετάσταση του καρκίνου [23].

Στο M

CUP ( 2.5) του συνόλου δεδομένων, 15 γονίδια κάτω-ρυθμίζονται. Αυτών των γονιδίων, εστιάσαμε στο

CD24

,

KRAS

και

DICER1

. Οι γνωστές λειτουργίες των προαναφερθέντων επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια θα συζητηθεί με λεπτομέρεια παρακάτω.

σχετική έκφραση πάνω ρυθμισμένα ριβοσωμικές πρωτεΐνες

Στο M

CUP (2.5) του συνόλου δεδομένων, εντοπίσαμε επίσης 6 ριβοσωμικές πρωτεΐνες (

RPL18A

,

RPS7

,

RPL11

,

RPS10

,

RPL36

,

και RPLP2

). Βρήκαμε 11 περισσότερα γονίδια για ριβοσωμικές πρωτεΐνες (

RPL24

,

RPL35

,

RPL35A

,

RPS20

,

RPL13A

,

RPL28

,

RPS26

,

RPS14

,

RPL27A

,

RPL 19

,

και RPL29

) στο Μ

CUP (2.0) του συνόλου δεδομένων. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες συναρμολογούνται σε μικρές και μεγάλες ριβοσωματικών υπομονάδων. Τα μικρά 40 S και μεγάλες υπομονάδες ριβοσωματικές 60 S περιέχει περίπου 32 και 47 ριβοσωμικές πρωτεΐνες (γνωστή ως RPS και πρωτεΐνες RPL), αντίστοιχα [24]. Η αυξημένη έκφραση του ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχει συσχετισθεί με αυξημένο πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη? σε ορισμένες περιπτώσεις, ωστόσο, η αυξημένη έκφραση έχει επίσης δειχθεί να καταστέλλουν την ογκογένεση [25], [26].

Για να εξεταστεί αν τα γονίδια ριβοσωμικής πρωτεΐνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτες για τη διάκριση CUP από άλλους τύπους καρκίνου, η μέση Geps για ένα σύνολο 77 ριβοσωμικής γονίδια πρωτεϊνών συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ομαδοποίησης για CUP, η κανονική λέμφωμα, και 24 γνωστών τύπων καρκίνου (Σχήμα 3). Οι ριβοσωμικές γονίδια πρωτεΐνης που ήταν πάνω ρυθμισμένα στο Κύπελλο ήταν επίσης πάνω ρυθμισμένα στη ΛΑΚ.

Τα ριβοσωμικά γονίδια πρωτεϊνών που αναφέρονται στα δεξιά. Στο θερμικός χάρτης, μοβ αντιπροσωπεύει up-ρυθμιζόμενα γονίδια και πράσινο αντιπροσωπεύει κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια, σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης σε φυσιολογικό λεμφαδένες, με την κλίμακα που φαίνεται στο άνω αριστερό. Τα γονίδια που υπερεκφράζεται αποκλειστικά στο Κύπελλο και το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα τόνισε.

Η

Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA των 4 γονίδια πρωτεϊνών ριβοσωματικών που ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε CUP (

RPS7

,

RPL11

,

RPS10

, και

RPL36

) συγκρίθηκαν με τα επίπεδα σε φυσιολογικό λέμφωμα και 24 γνωστών τύπων καρκίνου (Σχήμα 4). Τα 42 δείγματα που περιείχαν CUP σταθερά μεγάλες ποσότητες από αυτά τα mRNAs ανήκε στο μεγαλύτερο σύμπλεγμα CUP, ενώ το υπόλοιπο 15 δείγμα που έδειξαν σχετικά μικρότερες ποσότητες αυτών των mRNAs ανήκε στην μικρότερη συστάδα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Όπως αναμενόταν, η αυξημένη εκφράσεις από αυτά τα mRNAs παρατηρήθηκαν επίσης σε LAC, αλλά όχι σε άλλους τύπους καρκίνου (Σχήμα 4).

τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του (Α) RPS7, (Β) RPL11, (Γ) RPS10, και (D ) RPL36 συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μεμονωμένα δείγματα CUP (n = 60), τα μέσα επίπεδα έκφρασης των γνωστών τύπων καρκίνου, και ένα φυσιολογικά δείγματα λεμφαδένα (n = 25). Οι τιμές asinh-μεταμορφωθεί για κάθε γονίδιο χρησιμοποιήθηκαν για τους υπολογισμούς.

Η

Συζήτηση

Συσσωρευμένα σύνολα δεδομένων από μικροσυστοιχίες έκφρασης των γονιδίων αναλύθηκαν για διάφορους τύπους όγκων επέτρεψαν τη δημιουργία του οργάνου – και τα προφίλ έκφρασης όγκου-ειδικά που βελτιώνουν την ακριβή πρόβλεψη της πρωτοβάθμιας ιστοσελίδα του CUP [9], [10], [14], [15]. Η μελέτη μας επίσημη φάσης 2 για να επιβεβαιώσει τη σκοπιμότητα της πρόβλεψης CUP χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο μας βρίσκεται σήμερα σε εξέλιξη και θα παρέχει γονίδια που παρουσιάζουν μοναδικά πρότυπο έκφρασης στο Κύπελλο. Ένα συναρπαστικό θεωρία για να εξηγήσει CUP είναι ότι ο πρωταρχικός καρκίνος είναι μικροσκοπικό και μπορεί να εξαφανιστεί λόγω της σημειώνονται απόπτωση μετά τη σπορά μεταστάσεις που είναι σε θέση να πολλαπλασιάζονται σε περισσότερες σημαντικές όγκους σε διαφορετικούς ιστούς [27]. Ως υψηλό δυναμικό μετάστασης και την ευπάθεια σε απόπτωση θα μπορούσε να εξηγήσει τις ιδιότητες του CUP καλά, ψάξαμε πρώτα για τα γονίδια που σχετίζονται με την μετάσταση και την απόπτωση μεταξύ όλων των γονιδίων που ήταν πάνω ρυθμισμένα κατά περισσότερο από 2,5 φορές στα δείγματα CUP (Μ

CUP (2.5) σύνολο δεδομένων).

Από τις 14 έως και ρυθμιζόμενα γονίδια που βρέθηκαν (

S100A4, PRG1, S100A6, GSTP1, EIF5A, LGALS1, S100A11, PRKDC, VIM, CST3, TIMP1

,

YWHAZ

,

Nedd8

,

STK17A

), τρία (

S100A4

,

S100A6

,

S100A11

) ανήκουν σε μια ομάδα πρωτεϊνών S100 που εμπλέκονται στο Ca

2 + δίκτυο σηματοδότησης και ρυθμίζουν μια ποικιλία ενδοκυτταρικών δραστηριότητες συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης και την κινητικότητα [28]. Οι εκφράσεις αυτών των γονιδίων παρατηρείται σε αρκετές επιθηλιακούς όγκους και έχουν συνδεθεί με τη μετάσταση [29], [30].

S100A4

, μαζί με το

VIM

, έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ως δείκτης EMT [31]. Η υπερέκφραση του

EIF5A

προκαλεί την EMT, προωθώντας έτσι τη μετάσταση των όγκων του παχέος εντέρου και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [32]. Serglycin, ένα προϊόν του γονιδίου του

PRG1

, είναι μια πρωτεογλυκάνη που έχει λειτουργικά αναγνωριστεί ως σημαντικός ρυθμιστής της μετάστασης σε ρινοφαρυγγικού καρκινώματος (NPC) [33]. Η αυξημένη έκφραση του Serglycin σε κύτταρα NPC μπορεί να μεσολαβήσει το επίπεδο της βιμεντίνης (

VIM

) έκφραση, η οποία δεν είναι μόνο ένας δείκτης της ΕΜΤ, αλλά έχει επίσης ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης [31] , [34]. Lewis κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα σε ποντικούς δείχνουν μετάσταση στον πνεύμονα όταν τα κύτταρα εκφράζουν γαλεκτίνη-1 (Gal-1), μία μεγάλη πρωτεΐνη υδατάνθρακα πρόσδεσης που κωδικοποιούνται από

LGALS1

, προτείνοντας νέες στρατηγικές στόχευσης για Gal-1 σε καρκίνο [35].

Τόσο μεταστατικά κύτταρα και κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο διαθέτουν παρόμοια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης των μορίων επιβίωσης σχετίζονται, υποδηλώνοντας ότι μεταστατικός καρκίνος μπορεί να είναι δύσκολο να αντιμετωπιστούν λόγω της αντίστασης σε αντικαρκινικά φάρμακα. DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ), ένα προϊόν του γονιδίου του

PRKDC

, είναι μία από τις πρωτεΐνες πάνω ρυθμισμένα σε διάφορα μεταστατικών και ανθεκτικών σε φάρμακα καρκινικών κυττάρων [36]. Επειδή παρατηρήθηκε η αυξητική ρύθμιση του ΟΝΑ-ΡΚ στους ασθενείς CUP σε ομάδα μας, οι οποίοι δεν είχαν ποτέ υποβληθεί σε αγωγή με χημειοθεραπεία, ΟΝΑ-ΡΚ μπορεί να υποδεικνύει ουσιαστική αντίσταση, παρά επίκτητη αντοχή, στη χημειοθεραπεία. GSTP1 Επίσης αξιώθηκε σε διάφορους τύπους καρκίνου για την ενίσχυση της μεταστατικού δυναμικού και την ανάπτυξη αντίστασης στα φάρμακα που επάγουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), όπως πακλιταξέλη και σισπλατίνη [37], [38]. Άλλα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε CUP αποκαλύπτουν επίσης έναν σημαντικό ρόλο στην χημειοαντίσταση και μπορεί να συνδέεται με το μεταστατικό δυναμικό. Ο καρκίνος του μαστού κύτταρα που υπερεκφράζουν ΤΙΜΡ-1, ένα πολύ γνωστό αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας, εμφανίζουν μία μειωμένη ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικού paclitaxel φάρμακα και epirubicin μέσω της ενεργοποίησης του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ [39]. Το νοκ-κάτω την έκφραση της 14-3-3 ζ, ένα προϊόν του γονιδίου του

YWHAZ

, ευαισθητοποιεί καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυττάρων στη χημειοθεραπεία [40]. Ένα μικρό μόριο αναστολέας της Nedd8 ένζυμο ενεργοποίησης (ΝΑΕ) μπορεί να είναι δραστικές εναντίον των όγκων που είναι ανθεκτικοί σε άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [41].

Σε αντίθεση με τις μέχρι τώρα περιγράφονται γονίδια, κυστατίνη C (

CST-3

) και λειτουργία STK17A ως άμεση προ-αποπτωτικών παραγόντων με ανταγωνισμό σηματοδότηση ΤΟΡ-β και με διαμόρφωση ROS, αντίστοιχα. Κυστατίνης Ο έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα ΤΟΡ-β τύπου II, εμποδίζοντας έτσι μετέπειτα επαγωγή ΕΜΤ [42] δέσμευσης ΤΟΡ-β και. TGF-β έχει γίνει δεκτή ως κύριος εμπνευστής της EMT? Ωστόσο, NF-κΒ βρέθηκε πρόσφατα για την προώθηση της ΕΜΤ σε μερικά κύτταρα τα οποία δεν ανταποκρίνονται στη ΤΟΡ-β επειδή στερούνται λειτουργικών Smad4, που αντιπροσωπεύει μία εναλλακτική οδό που οδηγεί στην EMT ότι μπορεί να αντικαταστήσει ΤΟΡ-β σηματοδότηση [43]. NF-κΒ σηματοδότηση μπορεί κυρίως να προκαλέσει EMT στο Κύπελλο. Τόσο ΤΙΜΡ-1, που μπορούν να ενεργοποιήσουν ΝΡ-κΒ, και βιμεντίνη, η οποία ενεργοποιείται με ΝΡ-κΒ, ήταν μεταξύ των γονιδίων (πρωτεΐνες) που ρυθμίζεται προς τα πάνω στο φλιτζάνι, όπως περιγράφεται παραπάνω, καθιστώντας αυτή η υπόθεση πιο πιθανό [39], [43]. STK17A είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο [44]. Από STK17A είναι γνωστή ως θετικός ρυθμιστής της αποπτωτικής οδού και το επίπεδο έκφρασής του σε ορθοκολικό καρκίνωμα είναι ενισχυμένη σε βλάβες με μετάσταση λεμφαδένα, η αποπτωτική διεργασία μπορεί να εμπλέκεται στον κόμβο μετάσταση των καρκινωμάτων, συμπεριλαμβανομένων CUP [45].

από τις 15 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια στο M

CUP (2.5) του συνόλου δεδομένων,

CD24

,

KRAS

και

DICER1

παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. CD24 είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη, μαζί με CD44, για τον εντοπισμό ογκογενή κύτταρα σε καρκινώματα του μαστού. CD44

+ /CD24

– /low κύτταρα καρκίνου του μαστού έχουν την ικανότητα να κάνουν μετάσταση, δεδομένου ότι ο εμπλουτισμός αυτών των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν παρατηρείται σημαντικά σε ασθενείς με θετικούς λεμφαδένες [46]. Ένα υποσύνολο των KRAS μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν «KRAS εθισμό» και έχει διαφοροποιημένο επιθηλιακό φαινότυπο. Η επαγωγή της ΕΜΤ έχει δειχθεί να μετατρέψει kras εξαρτώμενη καρκινικά κύτταρα να kras ανεξάρτητη κύτταρα, τα οποία δεν απαιτούν την συνεχιζόμενη έκφραση του KRAS [47].

Dicer1

λειτουργεί ως haploinsufficient ογκοκατασταλτικό γονίδιο [48]. Η συχνή απώλεια ενός αλληλόμορφου του

Dicer1

έχει παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους όγκων που προκαλεί μια συνολική μείωση των επιπέδων μικρο RNA σταθερής κατάστασης που θα μπορούσε να είναι λειτουργικά κατασταλτική στην ογκογένεση και τη μετάσταση του κυπέλλου.

Η αυξημένη έκφραση αρκετών ριβοσωμικές πρωτεΐνες βρέθηκε στο κύπελλο. Είτε αυτές οι αλλαγές στην έκφραση που σχετίζεται αιτιολογικά με την παραγωγή CUP είναι άγνωστη. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η υπερέκφραση του ριβοσωματικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων RPL5, RPL11, RPL23 και RPS7 έχει δειχθεί ότι καταστέλλουν την ογκογένεση [49], [50]. Αυτές οι πρωτεΐνες ενεργοποιούν ρ53 μέσω σύνδεσης με MDM2 και την αναστολή της MDM2 με τη μεσολάβηση ρ53 ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση σε απάντηση πυρηνισκικός στρες (που ονομάζεται επίσης ριβοσωμική στρες). RPL11 και RPS7 δείχθηκε πρόσφατα να απαιτείται για την ενεργοποίηση της ρ53 που προκαλείται από παράγοντες που προκαλούν βλάβη του DNA [51], υποδηλώνοντας ότι αυτές οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μπορεί να παίξουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ρ53 σε απόκριση προς διαφορετικές πιέσεις. Επιπλέον, neddylation, η διαδικασία με την οποία η ουμπικουϊτίνη-πρωτεΐνης Nedd8 είναι συζευγμένο με το στόχο του, είναι απαραίτητη για το ρόλο RPL11 στην μεσολάβηση της ρ53 σηματοδότηση [49]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα δύο ριβοσωμικές πρωτεΐνες και Nedd8 συμπεριλήφθηκαν στην Μ μας

CUP (2.5) του συνόλου δεδομένων. Η λειτουργία ογκοκατασταλτικό εκτελείται από αυτές τις πρωτεΐνες μπορεί να σχετίζεται με την ευπάθεια σε απόπτωση που CUP (στην αρχική τοποθεσία) παρουσιάζει ως μία από τις ιδιότητές του.

Για λειτουργικές αναλύσεις των ταυτοποιημένων γονιδίων, υπερέκφραση ή νοκ ντάουν πειράματα χρησιμοποιώντας κατάλληλες κυτταρικές σειρές θα ήταν λογικό να ακολουθήσει, αν το ενδιαφέρον γονίδιο προσδίδει αλλαγή στην ανάπτυξη ή στη μεταστατική ικανότητα των κυττάρων. Η μεταστατική διαδικασία μπορεί να αξιολογηθεί

in vitro

παρακολουθώντας εισβολή κυττάρου μέσω Matrigel και την προσκόλληση των κυττάρων στις πλάκες, κλπ ειδικά για Gal-1, ϋΝΑ-ΡΚ και 14-3-3 ζ έχουν αναπτυχθεί συνθετικοί αναστολείς [52] – [54]. Έτσι, θα είναι ενδιαφέρον να διερευνηθεί η επίδραση αυτών των αναστολέων στα κύτταρα που υπερεκφράζουν το αντίστοιχο γονίδιο

in vitro

ή

in vivo

, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε στοχευμένη θεραπεία για CUP.

Προς έκπληξή μας, το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης (GEF) του CUP έμοιαζε πολύ με εκείνη του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (ΛΑΚ), το οποίο μπορεί να αντανακλά απλά το σχετικά υψηλό μεταστατικό δυναμικό της ΛΑΚ. Σε μία μελέτη με τη χρήση

18F-φθορο-2-δεοξυγλυκόζη τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (FDG-PET), η πιο συχνά ανιχνεύεται τοποθεσία του πρωτογενούς όγκου σε ασθενείς με CUP ήταν ο πνεύμονας [55]. Σε CUP, η κύρια καρκίνο και μετάσταση (-ses) του συμπεριφέρονται πολύ διαφορετικά σε σχέση με τον πολλαπλασιασμό, οδηγούν στην υπόθεση ότι τα μοριακά χαρακτηριστικά του CUP δείγματα από τις δύο περιοχές θα διαφέρουν. Είμαστε σε θέση να συγκρίνει αυτές τις διαφορές, διότι η κύρια καρκίνος είναι αδιευκρίνιστες. Μια ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων με τη χρήση πρωτογενών και μεταστατικών καρκινικών ιστών από ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να παρέχει κάποιες ενδείξεις σε αυτή την ερώτηση.

Εν κατακλείδι, εντοπίσαμε αρκετά γονίδια που ήταν επάνω-ρυθμίζονται στο Κύπελλο και ότι μπορεί να συμβάλει στην απόκτηση ενός μεταστατικού φαινοτύπου καθώς και αντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα σε πολλές περιπτώσεις. Ταυτοποιήθηκαν επίσης προ-αποπτωτικών παραγόντων. Οι συνδυαστικές επιπτώσεις των πολλαπλών λειτουργιών των γονιδίων που είναι ιδιαίτερα εκφράζονται σε CUP μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση CUP συμπεριφορές, όπως η απόπτωση και μετάσταση. Ανοσοϊστοχημική ή που βασίζεται σε PCR που βασίζεται σε επικύρωση από τα υποψήφια γονίδια είναι απαραίτητη για να βελτιώσετε τη μοριακή ταξινόμηση του CUP.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Heatmap κατασκευάστηκε όπως στο σχήμα 1, αλλά χωρίς το

VAPA

γονίδιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063249.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Cluster δενδρόγραμμα για κάθε τύπο καρκίνου. ανάλυση ομαδοποίηση έγινε με τη μέθοδο του Ward και 77 γονίδια πρωτεϊνών ριβοσωμικής

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063249.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Takuya Wada για την ανάλυση σάρωσης μικροσυστοιχιών και δεδομένων, Tomoko Kitayama για τεχνική υποστήριξη, και Marco DeVelasco για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από NPO Δυτική Ιαπωνία Ογκολογικής Ομάδας.