Αφηρημένο

Artonin E είναι ένα πρενυλιωμένων φλαβονοειδών που απομονώνονται από το φλοιό του κορμού του

Artocarpus elasticus

Reinw (. Moraceae). Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τις αποπτωτικών μηχανισμών που προκαλείται από artonin Ε σε ένα μεταστατικό ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σειρά SKOV-3

in vitro

. ΜΤΤ δοκιμασία, κλωνογονική δοκιμασία, ακριδίνη πορτοκαλί και ιωδιούχο προπίδιο διπλή χρώση, του κυτταρικού κύκλου και αναλύσεις αννεξίνης V πραγματοποιήθηκαν προκειμένου για τη διερεύνηση του τρόπου artonin E-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε διαφορετικά χρονικά σημεία. DNA τμήση, ενεργοποίηση κασπασών-3, -8, -9 και, πολυ-παραμετρική κυτταροτοξικότητα-3analysis με υψηλή περιεκτικότητα διαλογή, μέτρηση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου γενιάς, και κηλίδα Western χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των οδών που εμπλέκονται στην απόπτωση. αποτελέσματα ΜΤΤ έδειξαν ότι artonin Ε ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων SKOV-3, με IC

50 τιμές 6,5 ± 0,5 μg /mL μετά τη θεραπεία 72 ώρες, και έδειξε μικρότερη τοξικότητα προς ένα φυσιολογικό ανθρώπινο κύτταρο ωοθήκης lineT1074, με IC

50 αξίας 32,5 ± 0,5 μg /mL. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι artonin E επαγόμενη απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση S. Αυτή η ένωση προώθησε επίσης την ενεργοποίηση των κασπασών-3, -8 και -9. Περαιτέρω έρευνα σχετικά με την εξάντληση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

αποκάλυψε ότι artonin θεραπεία Ε επαγόμενη απόπτωση μέσω ρύθμισης της έκφρασης των προ-επιβίωσης και προ-αποπτωτικών Bcl-2 μελών της οικογένειας. Τα επίπεδα έκφρασης της survivin και πρωτεϊνών HSP70 επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε SKOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με artonin Ε Προτείνουμε ότι artonin Ε προκάλεσε μια αντι-πολλαπλασιαστική δράση που οδήγησε στη φάση S διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης μέσω απορύθμιση της μιτοχονδριακής οδών, ιδιαίτερα ο επαγγελματίας – και τα μονοπάτια σηματοδότησης αντι-απόπτωση

Παράθεση: Rahman MA, Ramli F, Karimian Η Dehghan F, Nordin Ν, Mohd Ali H, et al.. (2016) Artonin Ε επάγει την απόπτωση μέσω μιτοχονδριακού Δυσρύθμιστο σε SKOV-3 κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 11 (3): e0151466. doi: 10.1371 /journal.pone.0151466

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 5 του Φεβρουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 29, Φεβ του 2016? Δημοσιεύθηκε: 28 του Μαρτίου του 2016

Copyright: © 2016 Rahman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η τα δεδομένα που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς επιθυμούν να ευχαριστήσω το Πανεπιστήμιο της Μαλαισίας για την παροχή των ερευνητικών επιχορηγήσεων στο πλαίσιο του σχεδίου UMRG (RG077- 12BIO), Ινστιτούτο διαχείρισης Ερευνών και παρακολούθησης Ερευνών Grant (PG162-2014B) , και το Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης της Μαλαισίας υπό την επίδραση Research Grant High (UM-Mohe UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09) για την οικονομική τους υποστήριξη για τη διεξαγωγή αυτής της έρευνας.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα :. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών θεωρείται η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια [1]. Σε παγκόσμιο επίπεδο, οι περισσότερες από 230.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών αναφέρονται κάθε χρόνο, με περίπου 140.153 θανάτους ετησίως [2]. Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι τα ποσοστά εμφάνισης του καρκίνου των ωοθηκών είναι υψηλότερα στις δυτικές και αναπτυσσόμενες βιομηχανικές χώρες. Το 2012, σχεδόν 22.280 νέες περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών διαγνώστηκαν στις Ηνωμένες Πολιτείες, με περίπου 15.520 θανάτους αναμένεται [3]. Στη Μαλαισία, κυρίως στη χερσόνησο της Μαλαισίας, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των γυναικών, που αποτελούν το 5% του συνόλου των θηλυκών περιπτώσεων καρκίνου [4].

Σχεδόν το 75% των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών παρουσιάζουν νόσο μετάσταση πέραν η ωοθήκη λόγω της θέσης του καρκίνου [5, 6]. Δεν δοκιμές διαλογής είναι διαθέσιμες σήμερα για την έγκαιρη ανίχνευση των καρκίνων των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, μετά από κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία ήταν η κύρια προσέγγιση της θεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών. Οι περισσότερες από τις τρέχουσες θεραπευτικές διαδικασίες για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών βασίζονται σε λευκόχρυσο προέρχονται φαρμάκων σε συνδυασμό με πακλιταξέλη [7, 8]. Σισπλατίνη και η καρβοπλατίνη είναι οι πιο ισχυροί πλατίνα προερχόμενο φάρμακα χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Αν και η χημειοθεραπεία και η χειρουργική επέμβαση κυτταρομειωτικής είναι προσβάσιμα για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, αυτές οι προσεγγίσεις είναι πολύ αναποτελεσματικό και άκρως τοξικό με χαμηλά ποσοστά επιβίωσης. Επιπλέον, η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα που συμβαίνει την πάροδο του χρόνου καθιστά τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών πιο προκλητική. Τοξικότητα και την αντίσταση στην τρέχουσα χημειοθεραπευτικά φάρμακα έχουν ενθαρρύνει τους ερευνητές να διερευνήσουν νέων υποψήφιων φαρμάκων από φυσικά προϊόντα, εστιάζοντας στην απόπτωση ως φυσιολογική διαδικασία που προσφέρει ένα ισχυρό, μη-εμπρηστικών προσέγγιση να εκδιώξει έβλαψε τα κύτταρα από τους ιστούς, κατά συνέπεια, την εξασφάλιση της ομοιόστασης των ιστών [9]. Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν εξελιχθεί πολλαπλές οδούς για να αντισταθεί στην επαγωγή της απόπτωσης, εκμεταλλευόμενη τα φυσικά προϊόντα που μπορεί να έχουν την ικανότητα να καταστέλλουν, να σκοτώσει, μπλοκ, και να αντιστραφεί η διαδικασία ογκογένεσης μπορεί να παράσχει νέες ευκαιρίες για την ανάπτυξη φαρμάκων για τον καρκίνο, ιδιαίτερα στην θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών [ ,,,0],10].

το γένος

Artocarpus

(Moraceae) περιλαμβάνει σχεδόν 55 είδη, τα οποία είναι ευρέως κατανεμημένη σε όλη τροπικές και υποτροπικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένων Μαλαισία, την Ινδονησία, τη Νέα Γουινέα, και το Νότιο Ειρηνικό [11 ]. Ορισμένα είδη αυτού του γένους παρέχουν ουσιαστική, νόστιμο φαγητό, όπως

Artocarpus chempeden

(chempedak),

Μια

.

heterophyllus

(καρποί), και

Μια

.

altilis

είναι (αρτόδεντρο) Πολλά μέλη αναγνωρίζονται να έχουν ιατρική αξία στη θεραπεία ενός αριθμού ασθενειών, συμπεριλαμβανομένης της ελονοσίας, φλεγμονή, έλκος, και διάρροια [12, 13]. Ειδικότερα,

Artocarpus elasticus

Reinw. Ex Blume είναι μια σημαντική πηγή flavorful τρόφιμα, ξυλεία, και παραδοσιακή λαϊκή ιατρική για πολλές ασθένειες.

Artonin Ε είναι ένα γνωστό πρενυλιωμένων φλαβονοειδών. Αυτή η ένωση βρίσκεται σε αρκετά

Artocarpus

φυτά, όπως

Μια

.

elasticus

,

Μια

.

nobilis

[14],

Μια

.

gomezianus

[15], και

Μια

.

communis

[16]. Προηγούμενες μελέτες σχετικά με τη δράση του artonin E έναντι επιλεγμένων καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των MCF-7 (αδενοκαρκίνωμα μαστού), HCT-8 (ileocecal), MDA-MB-231 (αδενοκαρκίνωμα μαστού), ΚΒ (ανθρώπινο καρκίνωμα του στόματος επιδερμοειδές), κύτταρα Vero γραμμή, και Ρ388 (λευχαιμία) κυτταρικές γραμμές, εμφανίζεται ενδιαφέροντα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα [11, 17, 18]. Αυτή η ένωση επίσης έδειξε ισχυρές ιδιότητες ριζών κατά της ρίζας DPPH [19] και αποδείχθηκε ότι είναι ένας ισχυρός αναστολέας αραχιδονικό 5-λιποξυγενάσης με IC

50 αξία του 0.36μM [20]. Επιπλέον, artonin Ε ενισχύει anoikis (αποκόλληση επαγόμενη απόπτωση) των κυττάρων Η460 (καρκίνος του πνεύμονα) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [21]. Αυτή η ένωση ευαισθητοποιημένα επίσης τα κύτταρα με προς τα κάτω ρύθμιση της αντι-αποπτωτική myeoloid λευχαιμία κυττάρου-αλληλουχία-1 (MCL1) πρωτεΐνη [21]. Πιο πρόσφατα, artonin E παρουσίασαν ελπιδοφόρα αντι-μετανάστευσης και αντι-εισβολής ιδιότητες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Η460 [15]. Στο καλύτερο της γνώσης μας, ο μηχανισμός της artonin Ε ως αντικαρκινικός παράγων και επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών δεν έχει διευκρινιστεί. Έτσι, η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να εξετάσει τις προκαλούν απόπτωση ιδιότητες των artonin Ε σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και των πιθανών μηχανισμών που εμπλέκονται.

Υλικά και Μέθοδοι

Το φυτικό υλικό

τα βλαστικά φλοιούς των

Μια

.

elasticus

συλλέχθηκαν από Ulu Λανγκάτ, Selangor, Μαλαισία το 2010. Η συλλογή του φυτικού υλικού δεν απαιτεί την άδεια της κάθε τοπικής αρχής, επειδή η μονάδα δεν είναι είδος υπό εξαφάνιση. Τα δείγματα που προσδιορίζονται από τον Δρ Rusea Μετάβαση από το Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Putra Μαλαισία. Ένα δείγμα κουπόνι (S94408) κατατέθηκε στο ερμπαρίου τμήμα [22].

εκχύλιση φυτών

Το αποξηραμένο φλοιό του

A

.

elasticus

(1,5 kg) κονιοποιήθηκε και ακολούθως εκχυλίζονται σε θερμοκρασία δωματίου με τη χρήση εξανίου, EtOAc, και μεθανόλη ως διαλύτες. Οι υπερβολικές διαλύτες συμπυκνώθηκαν με χρησιμοποίηση περιστροφικού εξατμιστήρα για να αποδώσει 1,55 g, 40,22 g, 30,52 και γρ σκούρου καφέ ημιστερεού εκχύλισμα, αντιστοίχως. Το ακατέργαστο εκχύλισμα EtOAc (38,22 g) επικαλύφθηκε με πυριτική πηκτή και υποβλήθηκε σε κλασμάτωση χρησιμοποιώντας κενό υγρή χρωματογραφία. Η στήλη εκλούστηκε με μίγματα από εξάνιο, εξάνιο /χλωροφόρμιο

3, ΟΗΟΙ

3 /EtOAc, EtOAc /MeOH, και MeOH για να δώσει 60 κλάσματα 200 ml έκαστο. Παρόμοια κλάσματα συνενώθηκαν με βάση το προφίλ TLC. Η κρυστάλλωση των κλασμάτων 26-36 απέδωσε 2,3 g (0,06%) κίτρινης σκόνης. Η ένωση στη συνέχεια ανακρυσταλλώθηκε σε εξάνιο και ακετόνη για να δώσει artonin Ε με σημείο τήξεως (σ.τ.) 232-233 ° C [23] και m.p.of 231-232 ° C, αντίστοιχα. Το εκχύλισμα μεθανόλης κλασματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας chromatoghraphy στήλη κενού (παρόμοια με κενό χρωματογραφία στήλης) για να παράγει μια άλλη παρτίδα των artonin E προϊόντος (0,6 g, ένα κίτρινο στερεό).

Απομόνωση artonin E

Artonin Ε απομονώθηκε ως κίτρινη σκόνη (3 g), σ.τ. 232-233 ° C [23] Σ.Τ. 231-232 ° C, από μεθανόλη και τα εκχυλίσματα οξικό αιθυλεστέρα φλοιό του

A

.

elasticus

. Οι απομονώσεις υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό και την περαιτέρω ανάλυση, και έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα: IR

ν

max cm

-1 του 3417 (ΟΗ), 2979 (κορεσμένο CH), 1644 (C = O), 1462, και 1354? UV λ

max nm, (log ε) του 351 (0.35), 268 (1.29), 209 (1.01)?

1H-NMR (400 MHz, ακετόνη

-d

6

) του δ 13.19 (

s

, 1Η, ΟΗ-5), 6,82 (

s

, 1Η, Η-6 ‘), 6.57 (

d

,

J

= 11 Hz, 1Η, Η-14), 6.54 (

s

, 1Η, Η-3 ‘), 5,62 (

d

,

J

= 10,1 Hz, 1Η, Η-15), 5.08 (

t

,

J

= 6,3 Hz, 2Η, Η-10), 3.1 (

d

,

J = 7.36Hz

, 2Η, Η-9), 1,52 (

s

, 3Η, Η-13), 1.41 (

s

, 3Η, Η-12), 1.39 (

s

, 3Η, Η-17), και 1.39 (

s

, 3Η, Η-18)? APT-NMR (100 MHz, ακετόνη

-d

6

) του δ 182.4 (C = O), 161.8 (C-2), 161.4 (C-7), 159.1 (C-5), 152,4 (C-8a), 148,9 (C-2 ‘), 148,6 (C-4’), 138,2 (C-5 ‘), 131,5 (C-11), 127,2 (C-15 ), 121,6 (C-10), 120,8 (C-3), 116.2 (C-6 ‘), 114,6 (C-14), 110,5 (C-1’), 104.7 (C-4a), 103.8 (C- 3 ‘), 100.7 (C-6), 98,8 (C-8), 77,9 (C-16), 29,1 (C-18), 29,1 (C-17), 27,4 (C-13), 23,7 (C- 9), και 16,8 (C-12)? EIMS

m /z

(% ένταση) 436 (Μ

+, 45), 421 (100), 393 (24), 203 (66), 182 (22), και 69 (15 ). Με βάση την προαναφερθείσα σωματική και φασματικά δεδομένα, η ένωση ταυτοποιήθηκε ως γνωστό flavone ονομάζεται artonin Ε (Σχήμα 1) [23].

Η

καλλιέργειας κυττάρων

Μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών (SKOV- 3) και φυσιολογικές κυτταρικές σειρές ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) αρχικά ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA). SKOV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α και τα κύτταρα CHO καλλιεργήθηκαν σε μέσο F12K. Ένα ανθρώπινο περιοδοντικό σύνδεσμο κυτταρική γραμμή ινοβλαστών αγοράστηκε από την Lonza, USA και διατηρήθηκαν σε βασικό μέσο στρώμα κυττάρων [24]. T1074 (κανονική αθανατοποιημένη ανθρώπινη επιφάνεια των ωοθηκών επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής) είχε αγοραστεί αρχικά από την Applied Βιολογικών Υλικών (ABM

®) του Καναδά και καλλιεργήθηκαν σε Prigrow 1 μέτριο [25, 26].

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα του artonin Ε και δύο θετικούς μάρτυρες πακλιταξέλη και καρβοπλατίνη εξετάστηκαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα σε πυκνότητα 5 χ 10

3cells /φρεάτιο τοποθετήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και αφέθηκαν για 24 ώρες για να προσκολληθούν. Τα προσκολλημένα κύτταρα εκτέθηκαν σε artonin Ε, πακλιταξέλη, και καρβοπλατίνη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και επωάστηκαν για 24, 48 και 72 ώρες. Ακολούθως, 20 μι από 5 mg /mL διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε μετά από φαρμακευτική αγωγή και το προκύπτον μείγμα επωάστηκε για 4 ώρες για να σχηματίσει μωβ φορμαζάνης. Κατόπιν, 100 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) μεταφέρθηκε σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθεί το πορφυρό φορμαζάνης, και τα αποτελέσματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Tecan άπειρη M 200 PRO, Männedorf, Ελβετία) σε απορρόφηση 570 nm. Οι μισές-μέγιστες συγκεντρώσεις που προκάλεσαν αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (IC

50 τιμές) ελήφθησαν από την καμπύλη ΜΤΤ ανάπτυξη της βιωσιμότητας.

Μορφολογική μελέτη χρησιμοποιώντας ένα κανονικό ανεστραμμένο μικροσκόπιο

Η SKOV-3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων και αφέθηκαν για 24 ώρες για να προσκολληθούν. Το IC

50 artonin Ε στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία (8 μg /mL) με βάση τα αποτελέσματα του προσδιορισμού κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των κυττάρων διάρκεια των πειραμάτων, με εξαίρεση το κλωνογονική δοκιμασία. Τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα κανονικό ανεστραμμένο μικροσκόπιο στα 200 × μεγέθυνση. Οι μορφολογικές αλλαγές εκτιμήθηκαν και συγκρίθηκαν με τα μη επεξεργασμένα βιώσιμων κυττάρων.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Τα κύτταρα SKOV-3 τρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, και συμπληρώνεται με φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα καταμετρήθηκαν και αμέσως σπάρθηκαν (300 κύτταρα /πλάκα) σε ένα 60 mm τρυβλίο Petri, και αφήνεται όλη τη νύχτα να προσκολληθούν. Τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 5, 10, 15, και 20 μg /mL του artonin E για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα επεξεργασμένα μέσα απομακρύνθηκαν και προστέθηκαν φρέσκα μέσα. Τα κύτταρα επωάστηκαν για τρεις εβδομάδες για να σχηματίσουν αποικίες. Επιβίωσαν αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 90% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες.

Η μορφολογική εκτίμηση των αποπτωτικών κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης και ιωδιούχου προπιδίου διπλή χρώση

Η επίδραση της artonin Ε σε επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε SKOV -3 κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ακριδίνη πορτοκαλί (ΑΟ) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση. SKOV-3 κύτταρα απλώθηκαν σε 5 × 10

5cells σε T75cm

2 φιάλη και επωάστηκαν όλη τη νύκτα για να επιτραπεί η σύνδεση. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 8 μg /mL του artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες. Μετά την επώαση, τα κατεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και φυγοκεντρήθηκε στις 1500 rpm για 5 λεπτά. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό PBS και φυγοκεντρείται δύο φορές για να ληφθεί φρέσκο ​​καθαρό σφαιρίδια. Τα φρέσκα σφαιρίδια αναμίχθηκαν με ένα ίσο όγκο διαλύματος φθορίζουσας χρώσης χρωστικής (1: 1), που περιλαμβάνει 10 μg /mL AO και 10 μg /mL ΡΙ (διαλυμένο σε PBS). Το πρόσφατα χρωματισμένο εναιώρημα κυττάρων πέσει πάνω σε ένα γυάλινο πλακίδιο και παρατηρείται κάτω από ένα μικροσκόπιο υπεριώδους φθορισμού (Leica προσαρτημένο με την Q-Flora Software) μέσα σε 30 λεπτά, πριν από το ξεθώριασμα του φθορισμού. Τα μορφολογικά κριτήρια που χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση των υγιών, αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων έχουν ως εξής: (i) βιώσιμα κύτταρα δείχνουν ένα πράσινο πυρήνα με στρογγυλά ανέπαφη δομή? (Ii) πρώιμη απόπτωση εμφανίζει ένα πυκνό καταπράσινο πυρήνα με συμπύκνωση της χρωματίνης? (Iii) τα τέλη απόπτωση παρουσιάζει μια πυκνή περιοχή πορτοκαλί λόγω της συμπύκνωσης της χρωματίνης? και (iv) δευτερεύουσα νέκρωση δείχνει ένα πορτοκαλί /κόκκινο άθικτο πυρήνα [27].

αννεξίνης V δοκιμασία

Μία δοκιμασία αννεξίνης V διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα BD Pharmingen

TM Annexin V-FITC Η απόπτωση Detection Kit (ApoAlert αννεξίνης V, Clontech, California, USA). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων και αφέθηκαν επί μία νύκτα να προσκολληθούν. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 8 μg /mL του artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες. Τα κατεργασμένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 rpm για 10 λεπτά για απομάκρυνση υπολειμματικού media. Στη συνέχεια, ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1Χ προστέθηκε για να ξεπλύνει τα φρέσκα σφαιριδίων πριν από την επαναιώρηση τους σε 200 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναμίχθηκαν με 5 μL αννεξίνης V και 10 μL PI και επωάστηκαν για 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Τα παρασκευασμένα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACS Canto 11 Becton-Dickson). Στη συνέχεια, 300 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης προστέθηκε σε κάθε δείγμα για να ρυθμίσετε την ένταση της αντίδρασης σε τουλάχιστον 500 μL για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα κύτταρα κατεργασμένα με DMSO (0,1%, ν /ν) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

SKOV-3 κύτταρα σε συγκέντρωση 5 × 10

5 κύτταρα ήταν τοποθετήθηκαν σε ένα T75cm

2 φιάλη και επωάστηκε για μία νύχτα για να επιτραπεί η σύνδεση. Τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 8 μg /mL του artonin Ε σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 rpm για 10 λεπτά. Τα φρέσκα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 500 μL 70% ψυχρής αιθανόλης και επωάζονται στους -20 ° C όλη τη νύκτα. Το υπόλοιπο αιθανόλη απομακρύνθηκε στη συνέχεια και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 20 μι RNase Α (10 μg /mL) και 2 μί PI (2.5 μg /mL). Το προκύπτον μίγμα επωάστηκε για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας FACS Canto 11 Becton-Dickinson κυτταρομετρίας ροής. Για κάθε δείγμα, 10,000 κύτταρα μετρήθηκαν. ModFit LT λογισμικό (Verity Software House, Topsham, ΜΕ) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του ποσοστού των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις.

Ανίχνευση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου γενιάς

2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin διοξική (DCFH-DA) χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η παραγωγή ενδοκυτταρικών αντιδραστικών ειδών οξυγόνου σε SKOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με artonin Ε Τα κύτταρα SKOV-3 σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων μαύρη πλάκα και επωάζονται όλη τη νύκτα να προσκολληθούν. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 8 μg /mL του artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες. ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hank χωρίς ορό χρησιμοποιήθηκε για να πλύνει τα κύτταρα. Στη συνέχεια, 100 μι του διαλύματος DCFH-DA προστέθηκε σε κάθε καθορισμένο καλά, και η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση μιας συσκευής ανάγνωσης μικροπλάκας φθορισμού (Tecan Άπειρο M 200 PRO, Männedorf, Ελβετία) σε 485 nm διέγερση και 520 nm εκπομπή.

πολλαπλών παραμέτρων κυτταροτοξικότητα 3 υψηλής περιεκτικότητας σε έλεγχο

Cellomics Multiparameter κυτταροτοξικότητα 3 κιτ (Thermo Scientific

TM, Pittsburgh, ΡΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει ταυτόχρονη ανίχνευση από τα κρίσιμα αποπτωτικά γεγονότα σε SKOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με artonin Ε συντομία, SKOV-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε μαύρες πλάκες επίπεδου πυθμένα 96 φρεατίων (PerkinElmer Inc., Wellsley, MA, USA) και αφέθηκε όλη τη νύκτα να προσκολληθούν. Τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 8 μg /mL artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα μετά εκτέθηκαν σε 50 μL του διαλύματος χρώσης ζωντανών κυττάρων για 30 λεπτά. Η περίσσεια μέσου και διάλυμα χρώσης ζωντανών κυττάρων ήταν ήπια απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 16% παραφορμαλδεΰδη. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα εκτέθηκαν με ρυθμιστικό διαπερατότητας που ακολουθείται από ρυθμιστικό αποκλεισμού για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πρωτογενής Cytochrome

C

αντισώματα και δευτερογενή DyLight 649 συζευγμένο κατσίκας IgG ποντικού προστέθηκαν και αφέθηκαν να αλληλεπιδράσουν για 1 ώρα η κάθε μία. Χρωστική Hoechst 33342 χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων σε SKOV-3 κύτταρα. Βαμμένα κύτταρα SKOV-3 στις πλάκες 96 φρεατίων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα ArrayScan υψηλής περιεκτικότητας διαλογής (HCS). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές.

Κυτόχρωμα c απελευθερώνοντας δοκιμασία απόπτωσης

Κυτόχρωμα c απελευθερώνοντας κιτ δοκιμασίας απόπτωσης (ab65311) αγοράστηκε από την Abcam

® (Cambridge, UK ). Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, SKOV-3 κύτταρα επάχθηκαν με artonin Ε σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Οι επάγεται και un-προκληθέντα κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 6,00 χ

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 10 mL παγωμένου PBS, φυγοκεντρήθηκαν και συλλέχθηκαν το ίζημα. Τα φρέσκα σφαιρίδια στη συνέχεια επανα-εναιωρήθηκαν με 1,0 mL 1X ρυθμιστικού εκχύλισης κυτοσόλιο μείγμα που περιέχει DTT και αναστολέα πρωτεάσης και επωάζονται σε πάγο για 10 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια Dounce-ομογενοποιείται πριν φυγοκέντρηση στα 7000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκαν και αποθηκεύονται ως κυτοσολικά κλάσματα. Τα υπόλοιπα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 0.1 ml ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης μιτοχονδριακό, στροβιλίζονται για 10 δευτερόλεπτα και αποθηκεύεται ως μιτοχονδριακό κλάσματα. Αμφότερα τα κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα εφαρμόστηκαν για ανάλυση πρωτεϊνών και προχώρησε με την τυποποιημένη διαδικασία στυπώματος Western.

ενεργοποίηση κασπασών-3, -8, -9 και δοκιμασία

Θερμιδομετρικά δοκιμασία της ενεργοποίησης των κασπασών -3, -8, -9 και διεξήχθη χρησιμοποιώντας Ε & amp? κιτ σύστημα D, USA. Εν συντομία, σε μια T75cm

2 φιάλη του 90% συρρέοντα κύτταρα SKOV-3 διεγέρθηκαν με artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες. Τα διεγερμένα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης και φυγοκεντρούνται στις 1800 rpm για 10 λεπτά. Τα φρέσκα σφαιρίδια πλύθηκαν με ψυχρό PBS και αμέσως λύονται με ρυθμιστικό λύσης πρωτεΐνη. Το προϊόν λύσης κυττάρου στη συνέχεια διατηρήθηκε σε πάγο για 10 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g για 15 λεπτά, και μεταφέρονται σε ένα νέο σωλήνα. Το φρέσκο ​​προϊόν λύσης κυττάρου (50 μL), το οποίο περιείχε 100-200 μg πρωτεΐνης, προστέθηκε σε ένα τρυβλίο 96 φρεατίων εις τριπλούν. Πενήντα μικρολίτρα ρυθμιστικού αντίδρασης και 5 μL της κασπάσης στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κάθε καθορισμένο καλά πριν επώαση της πλάκας σε ένα CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 2 ώρες. Μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Tecan άπειρη M 200 PRO, Männedorf, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση σε μήκος κύματος 405 nm.

DNA κατακερματισμό δοκιμασία

SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με artonin Ε σε διαφορετικά χρονικά σημεία, και συλλέχθηκαν με την προσθήκη τρυψίνης για την προώθηση της αποκόλλησης. Τα αποκολλημένα κύτταρα περιδινίστηκαν και πλένονται δύο φορές με ψυχρό PBS. Το DNA από τα κύτταρα στο εναιώρημα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την αυτοκτονία Track

κιτ TM DNA απομόνωση σκάλα (Calbiochem, EMD Bioscience, Germany). Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με ανάμιξη 55 μΙ ΤΕ (Τρις και EDTA) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και 20 μί ενζύμου Α (ΚΝάσης Α). Το προκύπτον μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C για 1 ώρα. Ακολούθως, 25 μι ενζύμου Β (πρωτεϊνάση Κ) προστέθηκε και το λύμα διατηρήθηκε σε υδατόλουτρο στους 50 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την επώαση, 2 μΙ Pellet Paint, 60 μλ 3Μ οξικού νατρίου και 662 μι 2-προπανόλης προστέθηκαν στο λύμα, και το διάλυμα αναμίχθηκε για λίγο με αναστροφή και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 2 λεπτά. Το DNA μετά καταβυθίστηκε με φυγοκέντρηση των δειγμάτων στα 16.000 χ

g

για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα σφαιρίδια φρέσκο ​​ξεπλύθηκαν δύο φορές με 70% και 100% παγωμένης αιθανόλης. Τα σφαιρίδια ξηράνθηκαν στον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου για λίγα λεπτά για να απορρίψει την αιθανόλη και επαναιωρήθηκε με 50 μι ρυθμιστικού διαλύματος επαναιώρησης DNA. Τα παρασκευασμένα δείγματα σκάλα DNA φορτώθηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης 1,5% που έχει συσταθεί και λειτουργεί σε 50 βολτ σταθερή για 3 ώρες. Μόλις ολοκληρώθηκε ηλεκτροφόρηση, το πήκτωμα αμέσως βάφονται με SybrGreen ™ και το συγκρότημα που ελήφθη οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα τεκμηρίωσης UV Gel (Biospectrum 410, UVP).

κηλίδος Western

SKOV-3 κύτταρα απλώθηκαν σε μία φιάλη καλλιέργειας 75 εκατοστών

2 και εκτέθηκαν σε artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες. ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0? 120 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40? και 1 mM PMSF) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση της συνολικής πρωτεΐνης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα BCA κιτ αντιδραστηρίου δοκιμασίας πρωτεΐνης (Bio-Rad, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (40 μg) εκχύλισμα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνη polyvinylidenedifluoride (Bio-Rad). Τα στυπώματα στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% άπαχο γάλα σε TBS-Tween ρυθμιστικό 7 (0.12 Μ Τπδ-βάση, 1.5 Μ NaCl, και 0.1% Tween 20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C, τα στυπώματα πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας pico ή φεμτο χημειοφωταύγειας (ECL σύστημα) και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης UV. Τα επόμενα πρωτεύοντα αντισώματα, τα οποία περιλαμβάνουν εκείνα για β-ακτίνη (1: 10.000), Βαχ (1: 10.000), Bcl-2 (1: 10.000), HSP-70 (1: 10.000), survivin (1: 10.000), κασπάσης -3 (1: 10.000), κασπάσης -8 (1: 10.000), κασπάσης -9 (1? 10000) και κυτόχρωμα c (1: 200). αγοράστηκαν από Abcam, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο

Η στατιστική ανάλυση

Μέση datafrom τουλάχιστον τρεις μετρήσεις για κάθε δείγμα που ελέγχθηκε ήταν κανονικοποιούνται με τα μη επεξεργασμένα αποτελέσματα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS-16,0 πακέτο και GraphPad Prism 5.0. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD και

p & lt?.. 0

05

θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Artonin E αναστέλλει επιλεκτικά την ανάπτυξη του καρκίνου κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα

in vitro

η

Τα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα του artonin Ε σε διάφορες κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ, όπως φαίνεται στον πίνακα 1. το πείραμα αυτό καθορίστηκε με βάση την ικανότητα του η NADP (H) ένζυμο εξαρτώμενο κυτταρικό οξειδοαναγωγάσης να μειωθεί η κίτρινη χρωστική τετραζολίου σε αδιάλυτο μωβ φορμαζάνης, η οποία αντανακλά την αναλογία των βιώσιμων κυττάρων που υπάρχουν. Μεταξύ των κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, τα χαμηλότερα IC

50 τιμές παρατηρήθηκαν για SKOV-3 κύτταρα μετά την αγωγή 24 ώρες. Το IC

50 τιμές του SKOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με artonin Ε μειώθηκε αισθητά μετά από 48 και 72 ώρες θεραπείας, αντίστοιχα, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Αντίθετα, κανονικά ανθρώπινα κύτταρα των ωοθηκών (T1074), φυσιολογικά ανθρώπινα περιοδοντικό σύνδεσμο ινοβλάστες , και φυσιολογικά CHO κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με artonin Ε ήταν λιγότερο τοξικά. Τα IC

50 τιμές του SKOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με artonin Ε ήταν ελαφρώς χαμηλότερη από εκείνη που έλαβαν θεραπεία με καρβοπλατίνη, η οποία είναι ένα πολύ γνωστό χημειοθεραπευτικό φάρμακο (Πίνακας 2). Η πακλιταξέλη και η καρβοπλατίνη χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Και τα δύο από αυτά τα φάρμακα μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε SKOV-3 κύτταρα σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Πίνακας 2).

Η

Artonin E μειώνει την επιβίωση των κυττάρων

Οι μορφολογικές αλλαγές σε SKOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με artonin Ε παρατηρήθηκαν υπό κανονικές ανεστραμμένη μικροσκοπία (Σχήμα 2). Τα διαχωρισμένα μορφολογική δομή των κατεργασμένων κυττάρων ήταν εμφανής μετά από έκθεση 24 ώρες για να artonin Ε φλύκταινες μεμβράνης κυττάρων παρατηρήθηκαν με μια απότομη μείωση του αριθμού των κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι είχε λάβει χώρα αναστολή της ανάπτυξης. Ο σχηματισμός των αποπτωτικών σωμάτων παρατηρήθηκαν μετά από ένα μεγαλύτερο χρόνο έκθεσης. Αντίθετα, τα φυσιολογικά κύτταρα SKOV-3 παρέμειναν υγιή με ένα άθικτο δομή.

(Α) μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Κύτταρα μετά τη θεραπεία 24 ώρες. (Γ) Κύτταρα μετά τη θεραπεία 48 ώρες. (D) Κύτταρα μετά τη θεραπεία 72 ώρες. IC: δομή άθικτο κύτταρο? DC: διαχωριστεί δομή των κυττάρων? MB: διόγκωση μεμβράνη? και AB:. αποπτωτικά σώμα

Η

Artonin E αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών σε SKOV-3 κύτταρα

Κλωνογόνος δοκιμασία εκτελέστηκε για να εξεταστεί η μακροπρόθεσμη επίδραση της SKOV-3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με artonin Ε . Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 3 δείχνουν ότι artonin E αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε 5 μg /mL του artonin Ε, σχεδόν το ήμισυ των αποικιών μειώθηκαν, μειώνοντας απότομα σε συγκέντρωση 10 μg /mL. Δεν σχηματίστηκαν αποικίες μετά τα κύτταρα είχαν υποβληθεί σε αγωγή με 15 και 20 μg /mL του artonin Ε, υποδηλώνοντας έτσι ότι αυτή η ένωση έχει μια αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε SKOV-3 κύτταρα.

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του artonin Ε για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν για τρεις εβδομάδες για να σχηματίσουν αποικίες. Οι αποικίες που σχηματίζονται μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες.

Η

Η ποσοτικοποίηση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας διπλή χρώση AO-ΡΙ

χρησιμοποιήθηκε ανάλυση

ΑΟ-PI να εξετάσει τις αλλαγές στον τομέα της πυρηνικής μορφολογία σε κύτταρα κατεργασμένα SKOV-3. Τα αποπτωτικά κύτταρα αξιολογήθηκαν με βάση την πυρηνική συμπύκνωση και τον κατακερματισμό. Σε αυτή τη μελέτη, 200 κύτταρα από κάθε πείραμα βαθμολογήθηκαν και ποσοτικοποιούνται τυχαία. Αποτελέσματα αποκαλύπτουν (Σχήμα 4) που artonin Ε προκάλεσε μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την απόπτωση ήδη 24 ώρες μετά την αγωγή. Το σήμα κατατεθέν της πρόωρης απόπτωσης παρατηρήθηκε με AO παρεμβάλλεται εντός του κατακερματισμένου DNA. Σε αυτό το χρονικό σημείο, διόγκωση μεμβράνης και περιθωριοποίηση του πυρήνα ήταν σαφώς δει. Περαιτέρω 48 ώρες από την έκθεση έδειξε ότι τα κατεργασμένα κύτταρα είχαν υποστεί απόπτωση αργά με την παρατηρούμενη διόγκωση και κόκκινο /πορτοκαλί χρώμα. Δευτερογενής νέκρωση με το χαρακτηριστικό φωτεινό κόκκινο χρώμα παρατηρήθηκε 72 ώρες μετά την αγωγή, λόγω της ΡΙ σύνδεση με το DNA των νεκρών κυττάρων. Αντίθετα, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν μια πράσινη ανέπαφη πυρηνική δομή. Μια στατιστικά σημαντική

(ρ & lt?. 0

05)

διαφορά στην επαγωγή της απόπτωσης στα επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5) παρατηρήθηκε. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αύξηση στον κυτταρικό θάνατο (δευτερεύουσα νέκρωση)

(ρ & lt?. 0

05)

μετά από παρατεταμένη χρόνο έκθεσης, δηλαδή, 72 ώρες μετά την κατεργασία (Σχήμα 5) . Αυτά τα αποτελέσματα επέδειξαν εξαρτώμενη από τον χρόνο χαρακτηριστική δημιουργούνται μορφολογικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την απόπτωση μετά artonin κατεργασία Ε στην SKOV-3 κύτταρα.

Τα κατεργασμένα κύτταρα εξετέθησαν σε 8 μg /mL του artonin Ε για 24, 48, και 72 ώρες . (Α) Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Κύτταρα μετά τη θεραπεία 24 ώρες. (Γ) Κύτταρα μετά τη θεραπεία 48 ώρες. (D) Κύτταρα μετά τη θεραπεία 72 ώρες. VI: βιώσιμα κύτταρα? BL: διόγκωση των κυτταρικών μεμβρανών? LA: lateapoptosis? . Και SN: δευτεροβάθμια νέκρωση

Η

(ΕΑ: πρώιμη απόπτωση? LA: αργά απόπτωση? Και SN: δευτεροβάθμια νέκρωση). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρεις επαναλήψεις. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από τον έλεγχο κάθε φάσης (

p & lt?

0.05).

Η

Artonin Ε επάγει την απόπτωση σε SKOV-3 κύτταρα

Η απόπτωση έχει δύο διακριτές μορφολογικές και βιοχημικές χαρακτηρισμούς. Αλλαγές στη μορφολογική αποπτωτικά κύτταρα, όπως η απώλεια της ασυμμετρίας πλάσμα μεμβράνης και προσκόλληση, διόγκωση μεμβράνης πλάσματος, η συμπύκνωση του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, συνοδεύονται πάντα από αρκετές βιοχημικές τροποποιήσεις [28]. Τα αποτελέσματά μας μέχρι στιγμής αποδειχθεί τα τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης σε artonin E αγωγή SKOV-3 κύτταρα. Διπλό κυτταρομετρία ροής V /ΡΙ χρώση Annexin χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει τις βιοχημικές αλλαγές σε artonin αγωγή SKOV-3 κύτταρα. Μία από προηγούμενες βιοχημικές αλλαγές σε εκδηλώσεις απόπτωση είναι μια διαφορετική κινητική της φωσφατιδυλσερίνης (PS) έκθεση στην εξωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος. Annexin V, ένα Ca

2 + -εξαρτώμενη πρωτεΐνη φωσφολιπιδίων πρόσδεσης ήταν γνωστό ότι αλληλεπιδρούν ειδικά και ισχυρά με PS και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση της απόπτωσης με στόχο την απώλεια της ασυμμετρίας της πλασματικής μεμβράνης [29]. Η χρώση από τον μέσο /ΡΙ- υποδεικνύει βιώσιμων κυττάρων λόγω PI δεν διαπερατή μεμβράνη σε ακέραιο κύτταρο, ενώ χρώση AV + /ΡΙ- αντιπροσωπεύει τις αρχές του αποπτωτικά κύτταρα, λόγω της απώλειας του ασυμμετρίας μεμβράνης πλάσματος και ισχυρή συγγένεια του AV-FITC με PS. Αντ ‘αυτού, η AV + /ΡΙ + αντιπροσωπεύει τέλη αποπτωτικών και από τον μέσο /ΡΙ + αντιπροσωπεύει νεκρωτική φάση η οποία οφείλεται στην μείωση της μεμβράνης του πλάσματος και της ακεραιότητας της πυρηνικής μεμβράνης που επιτρέπει στα PI να περάσει μέσα από τις μεμβράνες και παρεμβάλλει σε νουκλεϊκών οξέων. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6, πάνω από το 40% των κυττάρων σε πρώιμα και όψιμα στάδια της απόπτωσης μετά από 24 και 48 ώρες μετά τη θεραπεία, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας εξαρτώμενες από το χρόνο σημαντική

(ρ & lt?. 0

05 )

αύξηση σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, η θεραπεία με artonin Ε έδειξε επίσης χρονο-εξαρτώμενη μείωση στην βιώσιμων κυττάρων με ταυτόχρονη αύξηση νεκρωτικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, οι τρέχουσες αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης σε SKOV 3-κύτταρα επεξεργασμένα συνδέονται στενά.

[Α] Ελέγχου (χωρίς θεραπεία), [B] 24 ώρες θεραπείας, [C] 48 ώρες θεραπείας, και [D ] 72 ώρες θεραπείας. [Ε] Ιστόγραμμα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρεις επαναλήψεις.