Αφηρημένο

Η ιντερλευκίνη (IL) -6 έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Η κυτοκίνη ασκεί pro-ογκογόνο δράση μέσω της ενεργοποίησης των διαφόρων οδών σηματοδότησης ιδίως μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT3) και εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (ERK) 1/2. Ως εκ τούτου, η στόχευση IL-6 γίνεται ολοένα και πιο ελκυστική ως επιλογή θεραπείας στον καρκίνο των ωοθηκών. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση του μινοκυκλίνη για IL-6 και μονοπατιών σηματοδότησης του στον καρκίνο των ωοθηκών.

In vitro

, μινοκυκλίνη βρέθηκε να καταστέλλουν σημαντικά τόσο τη συστατική και IL-1β ή 4-hydroxyestradiol (4-ΟΗ-Ε2) διηγερμένου IL-6 έκφραση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών? OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3. Επιπλέον, μινοκυκλίνη ρυθμισμένα προς τα κάτω δύο κύριων συστατικών του συστήματος υποδοχέα της IL-6 (IL-6Rα και gp130) και αποκλείστηκαν την ενεργοποίηση /2 οδών STAT3 και ERK1 οδηγεί στην καταστολή του τελικού προϊόντος MCL-1. Σε θηλυκούς γυμνούς ποντικούς που φέρουν ενδοπεριτοναϊκή OVCAR-3 όγκους, οξεία χορήγηση (4 και 24 ώρες) μινοκυκλίνης (30 mg /kg) οδήγησε σε καταστολή της IL-6. Ακόμα και μόνο δόση μινοκυκλίνης ήταν αποτελεσματικό σε σημαντικά μείωση του πλάσματος και του όγκου της IL-6 επίπεδα. Σύμφωνα με αυτό, καρκινική έκφραση του ρ-STAT3, ρ-ERK1 /2 και MCL-1 μειώθηκαν σε ποντικούς μινοκυκλίνη φάρμακο. Αξιολόγηση της λειτουργικής εμπλοκή της μινοκυκλίνης σε μεταστατική δραστηριότητα αποκάλυψε την ικανότητα μινοκυκλίνης να αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και την προσκόλληση που συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (ΜΜΡ) -2 και 9. Έτσι, τα δεδομένα υποδεικνύουν έναν δυνητικό ρόλο για μινοκυκλίνη σε καταστολή της IL-6 έκφραση και δραστικότητα. Οι επιδράσεις αυτές μπορεί να αποδειχθεί ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για τις επερχόμενες κλινικές δοκιμές μινοκυκλίνη στον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Ataie-Kachoie P, Μόρις DL, Pourgholami ΜΗ (2013) Minocycline Καταστέλλει ιντερλευκίνης-6, του συστήματος υποδοχέα της και τα μονοπάτια σηματοδότησης και μειώνει τη μετανάστευση, την εισβολή και την πρόσφυση Χωρητικότητα του καρκίνου των ωοθηκών Cells: In Vitro και in vivo μελέτες. PLoS ONE 8 (4): e60817. doi: 10.1371 /journal.pone.0060817

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 28 Νοέμβρη 2012? Αποδεκτές: 3 Μαρτίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 του Απρίλη, 2013

Copyright: © 2013 Ataie-Kachoie et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια ιδιαίτερα θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια για την οποία γενική πρόγνωση παραμένει φτωχή κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών [1]. Για να εξηγήσει τις υποκείμενες μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη αυτής της θανατηφόρου κακοήθειας διάφορες θεωρίες έχουν προταθεί μέχρι σήμερα [1]. Πειστικά στοιχεία υποστηρίζουν την εμπλοκή του φλεγμονώδους στρωματικών μικροπεριβάλλον, που προκαλείται από υπερ-έκφραση κυτοκινών και χημειοκινών στην προώθηση ογκογένεση και τον καρκίνο εξέλιξης [2] ωοθηκών. Συγκεκριμένα, IL-6 που παράγεται από τον όγκο ή /και ενεργοποιημένα ανοσοκύτταρα έχει υποτεθεί ότι είναι ένα βασικό λειτουργικό κυτοκίνη που μεταβάλλει τα καρκινικά κύτταρα συμπεριφορές μέσω πολύπλοκων μηχανισμών [3]. IL-6 εκφράζεται από πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια και έχει ανιχνευθεί βαθιά υψηλότερο σε ιστό όγκου [4], το πλάσμα και κακοήθη ασκίτη των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [5]. IL-6 έκφραση στο μικροπεριβάλλον του όγκου των ωοθηκών μπορεί να επηρεάσει το ανοσοποιητικό τους μηχανισμούς άμυνας ξενιστή, καθώς και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την αγγειογένεση [6]. Προκαλεί επίσης μετάσταση μέσω πάνω ρύθμιση της χωρητικότητας καρκινικών κυττάρων προσκόλληση και εισβολή [7]. Επιπλέον, η IL-6 επηρεάζει την κατάσταση της κλινικής νόσου και την πρόγνωση, απονέμοντας αντίσταση σε συμβατικές θεραπείες [8], διεγείροντας κακοήθους σχηματισμού ασκίτη [9], και επάγουν συμπτώματα όπως ανορεξία, μεταβάλλεται το μεταβολισμό της ενέργειας, κόπωση και αναιμία [10]. Πρόσφατα στοιχεία δεδομένα ότι ο αποκλεισμός της IL-6 μπορεί να προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για τη βελτίωση της διαχείρισης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Η αναστολή της IL-6 σηματοδότηση έχει αποδειχθεί ότι ελαττώνει την ανάπτυξη του όγκου και τα αποπτωτικά και μεταστατικές εκδηλώσεις σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Θα είχε επίσης ως αποτέλεσμα παρατεταμένες περιόδους σταθεροποίηση της νόσου, αντιστροφή της χημειοαντίσταση και ενισχύονται ανοσίας του ξενιστή σε ασθενείς με χημειοθεραπεία υποτροπιάζοντα καρκίνο των ωοθηκών [3].

IL-6 μεταδίδει σήματα της μέσω αλληλεπίδρασης με ένα σύμπλοκο υποδοχέα που αποτελείται από το συνδέτη που δεσμεύουν γλυκοπρωτεΐνη που ονομάζεται IL-6R και της μεταγωγής σήματος gp130 συστατικό. Υπάρχουν δύο τύποι IL-6R, δηλαδή, η κυτταρική μεμβράνη υποδοχέα IL-6 (IL-6Rα) με χαμηλή συγγένεια που σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με την gp130 μετά τη σύνδεση με την IL-6 για να αρχίσει το ενδοκυτταρικό σήμα (κλασική σηματοδότηση), και ένα διαλυτό IL-6 υποδοχέα (sIL-6R), που συνδέεται με IL-6 και στη συνέχεια με την αλυσίδα του υποδοχέα β μεμβράνη – gp130 που οδηγεί στην μεταγωγή σήματος (trans-σηματοδότηση) [11]. Η μεταγωγή σήματος της IL-6 περιλαμβάνει ενεργοποίηση αρκετών ογκογόνο οδούς. Ειδικότερα STAT3 φωσφορυλιώνεται και ενεργοποιείται σε απόκριση στην IL-6. Μετά τη φωσφορυλίωση, STAT3 σχηματίζει ένα διμερές το οποίο στη συνέχεια μετατοπίζεται προς τον πυρήνα για να ρυθμίζουν την έκφραση αρκετών γονιδίων που οδηγεί στην επαγωγή μιας σειράς γεγονότων συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης του όγκου, την επιβίωση και τη μετάσταση. Εκτός από την STAT3, ενεργοποιημένα από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες (ΜΑΡΚ) καταρράκτη ενεργοποιείται επίσης σε απόκριση στην IL-6 που οδηγεί σε υπερφωσφορυλίωση της μίας σειράς πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων ERK1 /2, η οποία με τη σειρά τους διαμεσολαβούν ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής, με ποικίλα αποτελέσματα επί κυττάρων όγκου, συμπεριλαμβανομένων η επαγωγή της επιβίωσης, τη μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής [12].

η μινοκυκλίνη (7-διμεθυλαμινο-6-desoxytertracycline) είναι μια καλά ανεκτή και ασφαλής αντιβιοτικό από την οικογένεια τετρακυκλίνη δεύτερης γενιάς. Εκτός από ευρέος φάσματος αντιβιοτική δράση του, μινοκυκλίνη έχει επίσης αναγνωριστεί ως αντιφλεγμονώδη παράγοντα. Χρησιμοποιείται κλινικά στη θεραπεία των ασθενειών με φλεγμονώδη φόντο, όπως η ακμή [13] και πομφολυγώδες πεμφιγοειδές [14]. Επιπλέον, μινοκυκλίνη έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στη θεραπεία των αυτοάνοσων νοσημάτων όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα [15] και το σκληρόδερμα [16]. Οι ισχυρές αντι-φλεγμονώδεις και κυττάρων διαμορφωτική δραστηριότητες μινοκυκλίνης πιστεύεται ότι προκαλούνται μέσω αναστολής των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκων α [17] και η IL-1β [18]? και η καταστολή των MMPs [19]. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, είναι στοιχεία που δείχνουν καταστολή της IL-6 με μινοκυκλίνη σε μονοκύτταρα [20] και το κεντρικό νευρικό σύστημα ή κάτοικος ενδοδιηθητικά κύτταρα [21]. Αυτή η ανασταλτική δράση έχει επίσης αναφερθεί στην IL-6 αύξηση που παρατηρήθηκε το νευροπαθητικό πόνο [22]. Τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποιώντας διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος και ζωικά μοντέλα έχει δείξει επίσης ότι η μινοκυκλίνη και μια σειρά από άλλες τετρακυκλίνες και χημικώς τροποποιημένα παράγωγά τους μπορεί να αναστείλουν την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση καταστέλλοντας μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας και από μία άμεση επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα αποτελέσματα κατά του όγκου αυτών των παραγόντων έχουν μέχρι σήμερα τεκμηριωθεί σε προ-κλινικά μοντέλα της λευχαιμίας [23], το μελάνωμα [24], νεφρικών, προστάτη [25] και του καρκίνου του μαστού [26]. Κατά μήκος αυτής της γραμμής, έχουμε κοινοποιηθεί πρόσφατα τα προκαταρκτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η μινοκυκλίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των ανθρώπινων ξενομοσχευμάτων καρκίνου των ωοθηκών [27], [28], καθώς και καταστέλλει τον καρκίνο των ωοθηκών προκαλείται από κακοήθη σχηματισμό ασκίτη [28]. Η αναγνώριση αυτών των ιδιοτήτων σε συνδυασμό με το ευνοϊκό φαρμακολογικό και φυσικοχημικές προφίλ μινοκυκλίνης συμπεριλαμβανομένων των υψηλών λιπόφιλων ιδιοκτησίας, πλήρης απορρόφηση από του στόματος [29], μια μακρά ημιζωή, κλινικά επιθυμητά φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά [30] και ένα προφίλ καλή ασφάλεια (μέσος ανεκτή δόση από το στόμα 400 mg /ημέρα) [31] μας οδήγησε να σχεδιάσει το τρέχουσα μελέτη στο προφίλ αυτό το φάρμακο σε σχέση με τις επιπτώσεις της επί της IL-6 και IL-6 μονοπατιών σηματοδότησης στον καρκίνο των ωοθηκών. Εδώ, παρουσιάζουμε μας

in vitro

αποτελέσματα που δείχνουν την ικανότητα του μινοκυκλίνης να μειώσει τόσο τη συστατική και διεγείρεται (είτε από την IL-1 βήτα ή 4-ΟΗ-Ε2) IL-6 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι η μινοκυκλίνη καταστέλλει σύστημα υποδοχέα IL-6 (IL-6R και gp130), τα μονοπάτια σηματοδότησης (STAT3 και ERK1 /2) και προς τα κάτω στόχος MCL-1 στα κύτταρα αυτά. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι η μινοκυκλίνη παρεμβαίνει με τις μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που συνδέεται με την καταστολή της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Αυτό ακολουθείται από μας

in vivo

-με βάση έρευνα αποκαλύπτει για πρώτη φορά τα αποτελέσματα των μινοκυκλίνη για τη μείωση τόσο του πλάσματος και των όγκων της IL-6 έκφραση μαζί με ρύθμιση προς τα κάτω των καρκινικών π-STAT3, π-ERK1 /2 και MCL-1 σε ένα πειραματικό μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών σε ποντίκια.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα έργα των ζώων έχουν διεξαχθεί σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλία Φροντίδα ζώων και Επιτροπής Δεοντολογίας (ACEC) κατευθυντήριες γραμμές. Όλες οι διαδικασίες που πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια ήταν αυστηρά σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από ACEC (αριθμός έγκρισης: 9 /23Β). Και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία

Χημικά και αντισώματα

Εκτός εάν άλλως αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα χημικά και τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (Αυστραλιανή θυγατρική, Sydney, Αυστραλία). Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε όλη αυτή τη μελέτη: πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού ειδικά για την IL-6Rα, gp130, Tyr

705-ρ-STAT3, STAT3, Mcl-1, π-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (ρ-ERK1 /2) , ρ44 /42 ΜΑΡΚ (ΕΚΚ1 /2) (Cell Signaling Technology, Sydney, Αυστραλία), ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 (Santa Cruz, Sydney, Australia) και μονοκλωνικά ποντικού αντι-β-ακτίνης (R &? D Systems, Inc ., Σύδνεϋ, Αυστραλία). Δευτερογενή αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντι ανοσοσφαιρίνη ποντικού G συζευγμένο με χρένο peroxidise (Santa Cruz Biotechnology, Σίδνεϊ, Αυστραλία)

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών.? OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3 κύτταρα, λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με 2 mM L-γλουταμίνη, 2 g /L διττανθρακικό νάτριο, 4,5 g /L γλυκόζη, 10 mM HEPES, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Invitrogen, Sydney, Australia) συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορού (FBS) και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (50 U /ml) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2.

In vivo πειράματα

Θηλυκά nude αθυμικοί Balb C ηυ /ηυ ποντίκια (ηλικίας 6 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Βιολογικών Πόρων (Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Νέας Νότιας Ουαλίας). Τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν σε στρωτή ροή ντουλάπια κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από το Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας Φροντίδα Ζώων και Επιτροπής Δεοντολογίας (ACEC). Όλες οι διαδικασίες που πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια ήταν αυστηρά σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από ACEC (αριθμός έγκρισης: 9 /23Β) και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Εν συντομία, 10 × 10

6 λογαριθμικής φάσης καλλιέργεια OVCAR-3 κύτταρα αιωρούνται σε 0,5 ml αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ί.ρ.) σε κάθε ποντικό. Την ημέρα 28 μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε μία από τις ομάδες θεραπείας ή ελέγχου. Η μινοκυκλίνη διαλύθηκε σε στείρο κανονικό αλατόνερο (0.6 mg /ml). Τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με μία απλή δόση μινοκυκλίνης (30 mg /kg). ομάδα ελέγχου έλαβε αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού αντί. Στο τέλος της περιόδου αγωγής (4 ή 24 ώρες), συλλέχθηκε αίμα μέσω καρδιακής παρακέντησης, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με χρήση Lethabarb R (100 mg /kg) ε.π. ένεση (VIRBAC, Sydney, Australia) και οι όγκοι αποκόπηκαν αμέσως και διατηρήθηκαν σε -80 ° C για ανάλυση στυπώματος western.

Η ανοσοκυτταροχημεία Χρώση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επάνω σε αποστειρωμένα καλυπτρίδες από γυαλί. Στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μινοκυκλίνη για 24 ώρες, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 100 μΙ ανά slide ψυχρής αιθανόλης 95%, 5% παγόμορφο οξικό οξύ για 10 λεπτά. Σταθερή κύτταρα μετά πλύθηκαν και επωάστηκαν σε 0.3% Tween 20 για 20 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, αποκλείστηκαν με 1% BSA, επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα σε 1% BSA που ακολουθείται από Alexafluor-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα σε 1% BSA. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (1:2000 αραίωση) για 1 λεπτό πριν τοποθετηθεί καλυπτρίδες σε γυάλινες πλάκες με τη χρήση γλυκερίνης, και αναλύθηκαν για έκφραση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας την Olympus IX71 μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ με φακό εμβάπτισης 60 × έλαιο.

Enzyme-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) για την IL-6

In vitro

, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 10% FBS μέσων για 24 ώρες για να ολοκληρωθεί προσάρτησης . Στη συνέχεια είτε διεγέρθηκαν με IL-1β (10 ng /ml) ή 4-ΟΗ-Ε2 (50 μg /ml) ή μη-διεγερμένα με ή χωρίς προεπεξεργασία με μινοκυκλίνη. IL-6 που παράγεται στο μέσο καλλιέργειας ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας την IL-6 ειδικές κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Biolegend Inc., San Diego, CA). Τα προσκολλημένα κύτταρα μετρήθηκαν για την ομαλοποίηση της IL-6 συγκεντρώσεις κατά τον αριθμό των κυττάρων. Ποσοτικός προσδιορισμός της IL-6 περιεχόμενο του πλάσματος από

in vivo

μελέτη διεξήχθη επίσης χρησιμοποιώντας την ίδια κιτ ELISA.

Ανάλυση Western Blot

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα μινοκυκλίνη για την κυτταρική έκφραση του gp130, IL-6Rα, ρ-STAT3, STAT3, Mcl-1, π-ΕΚΚ, ERK, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη σύμφωνα με την τυπική διαδικασία. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και εκχυλίζεται για 30 λεπτά με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM NaN3, 1% Triton Χ-100, 1% ΝΡ αναστολέα φωσφατάσης -40, 1 mM EGTA, 10% και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στις 13.000 χ

g

για 30 λεπτά και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με χρήση του προσδιορισμού Bio-κόκκινο πρωτεΐνη. Ισοδύναμες ποσότητες εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS-και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore Corporation, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα. Ανοσολογικά συμπλέγματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας υπεροξειδάση horseradish συζευγμένη με είτε αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού ακολουθούμενη από ανίχνευση χημειοφωταύγειας (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA). Για να καταδειχθεί ίση φόρτωση πρωτεϊνών, οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με ένα ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει β-ακτίνης.

Transwell μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασία

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα 24 φρεατίων σύστημα Transwell με πολυανθρακικό μεμβράνες μέγεθος των 8 mm πόρου (Life Technologies, Vic, Αυστραλία). Εν συντομία, 1 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 0.1% BSA μέσο RPMI που περιείχε διάφορες συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης στον άνω θάλαμο (κανονικό θάλαμο για δοκιμασία μετανάστευσης και επικαλυμμένα με Matrigel θάλαμο για δοκιμασία εισβολής). Η κάτω θάλαμος γέμισε με το ίδιο μέσο που περιέχει 1% FBS. Μετά από επώαση για 18 ώρες στους 37 ° C, τα κύτταρα στον άνω θάλαμο αφαιρέθηκαν προσεκτικά με μια μπατονέτα και τα κύτταρα που είχαν διασχίσει να αντιστραφεί όψη της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν με διάλυμα Giemsa. Για κάθε επανάληψη (n = 3), η μετανάστευση ή την εισβολή των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση των χρωματισμένων κυττάρων (κύτταρα ανά πέντε πεδία) υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

Πρόσφυση Κυττάρων Δοκιμασία

Η δοκιμασία ήταν διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [32]. Εν συντομία, SKOV-3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή, ορό εξαντληθεί, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης (0-100 μΜ) για 18 ώρες. Τα κύτταρα απομακρύνθηκαν με τη χρήση μη ενζυματική λύση αποκόλληση, πλύθηκαν δύο φορές, επαναιωρήθηκαν σε RPMI χωρίς ορό που περιέχει διαφορετικές συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης (0-100 μΜ), και επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 χ πλακών 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 96 φρεατίων επικαλυμμένων με κολλαγόνο IV. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, το μέσο απομακρύνθηκε και οι πλάκες πλύθηκαν δύο φορές σε PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με διάλυμα 0,1% crystal violet, απαλά πλύθηκαν 3 φορές με PBS, και κρυσταλλικό ιώδες-διαλυτοποιηθεί χρησιμοποιώντας οξικό οξύ /μεθανόλη /νερό (10:30:60), και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm.

στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με Graph Pad Prism έκδοση λογισμικού 5.0 (CA, USA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Ο μαθητής

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει δύο ανεξάρτητες ομάδες μέσα. Ένας τρόπος ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των στατιστικές διαφορές μεταξύ περισσότερες από δύο ομάδες και μία αμφίδρομη ΑΝΟνΑ επαναλαμβανόμενων μετρήσεων χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του χρόνου και της αλληλεπίδρασης θεραπείας συνέπειες για την εξαρτημένη μεταβλητή IL-6? μια σημαντική αλληλεπίδραση ερμηνεύτηκε από μεταγενέστερη απλό αποτελέσματα ανάλυσης με διόρθωση Bonferroni. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε στο

σ

& lt?. 0.05 επίπεδο

Αποτελέσματα

Η μινοκυκλίνη Μειώνει συστατική έκφραση της IL-6 σε κύτταρα των ωοθηκών Καρκίνο

Για να διερευνήσει την επίδραση της μινοκυκλίνης στην IL-6 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, χρώση ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε μετά από 24 ώρες επεξεργασία του OVCAR-3 (με χαμηλή IL-6 έκφραση), SKOV-3 (με μέσο IL-6 έκφραση), και CaOV -3 (με υψηλή IL-6 έκφραση) κυτταρικές γραμμές με μινοκυκλίνη (100 μΜ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μινοκυκλίνη μείωσε σημαντικά την έκφραση του IL-6 και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης (Εικ. 1). Για την ποσοτικοποίηση αυτού του αποτελέσματος, δοκιμασία ELISA χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των IL-6 επίπεδα σε κυτταρική καλλιέργεια κολύμβησης media OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με μινοκυκλίνη (100 μΜ) για 1, 2, 4, 6 και 24 h. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, για OVCAR-3 κύτταρα IL-6 δεν ήταν ανιχνεύσιμη στα μέσα ενημέρωσης. Ωστόσο, η θεραπεία μινοκυκλίνη οδήγησε σε εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση σε IL-6 έκφραση τόσο SKOV-3 και CaOV 3-κύτταρα, τα οποία ήταν σημαντική σε 6 ώρες με ποσοστό μείωσης σε σχέση με τον έλεγχο: 55 ± 5% για SKOV-3 (ρ & lt? 0.001 ), και 25 ± 4,5% για CaOV-3 (ρ & lt? 0,05)? και 24 ώρες με ποσοστό μείωσης σε σχέση με τον έλεγχο: 60 ± 7% για SKOV-3 (p & lt? 0.001) και 35 ± 3,5% για CaOV-3 (p & lt? 0.001)

Εκπρόσωπος εικόνες ομοεστιακό της IL-. 6 (πράσινο) σε OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3 κυττάρων υπό συνθήκες ελέγχου και εκτέθηκαν σε μινοκυκλίνη (100 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα επίσης χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ερυθρό). Εικόνες ελήφθησαν σε 60 × μεγέθυνση. Οι ράβδοι κλίμακας παριστούν 20 μm.

Η

Η μινοκυκλίνη (100 μΜ) μειώθηκε IL-6 έκφραση του SKOV-3 και κύτταρα CaOV-3 σε έναν χρονο-εξαρτώμενο πρότυπο όπως αναλύθηκε με ELISA. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD των δεδομένων από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*

σ

& lt? 0,05 και ***

σ

& lt?. 0,001

vs

ομάδα ελέγχου) .

η

η μινοκυκλίνη Blocks IL-6 Surge στον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα διεγερμένα με IL-1β ή 4-ΟΗ-E2

IL-1β είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της IL-6 σε ανθρώπινα κύτταρα [33]. Έχει δειχθεί ότι τόσο φυσιολογικών και κακοηθών επιθηλιακών ωοθηκών κύτταρα μαζί με ενεργοποιημένα ανοσοκύτταρα στο στρώμα παράγουν IL-1β. Επιπλέον, συστατική παραγωγή IL-1β από κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών διεγείρει την παραγωγή κυτοκινών όπως η IL-6 [34]. Για την προσομοίωση τι συμβαίνει σε όγκους των ωοθηκών, χρησιμοποιήσαμε IL-1β (10 ng /ml) για την επαγωγή της IL-6 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και στη συνέχεια εξετάστηκε αν η μινοκυκλίνη μπορεί να εμποδίσει την αύξηση των IL-6 έκφραση. Χρησιμοποιώντας το πρότυπο κιτ ELISA, IL-6 συγκεντρώσεις στα μέσα του OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3 μετρήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την διέγερση με IL-1β. Παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση IL-6 αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με την παρουσία της IL-1β στην κολύμβηση μέσα ενημέρωσης και τις τρεις κυτταρικές σειρές. Η μέγιστη αύξηση παρατηρήθηκε σε 6 ώρες με την ποσοστιαία αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο των 335 ± 15% για OVCAR-3 (p & lt? 0.001), 110 ± 6% για SKOV-3 και 90 ± 5% για CaOV-3 (p & lt? 0,01)? και 24 ώρες με το ποσοστό αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο των 940 ± 13% για OVCAR-3, 185 ± 7,8% για SKOV-3 και 100 ± 5,4% για CaOV-3 (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3Α).. Προεπεξεργασία της IL-1β-διεγερμένα κύτταρα με μινοκυκλίνη (100 μΜ) οδήγησε σε σημαντική αναστολή της IL-6 κύμα στις 6 ώρες (το ποσοστό μείωσης σε σχέση με διεγερμένα ομάδα IL-1β: 40 ± 7,3% για OVCAR-3, 50 ± 4,5 % για SKOV-3 και 35 ± 6,2% για CaOV-3, σ & lt? 0,05)? και 24 ώρες (το ποσοστό αναστολής σε σχέση με την IL-1β διεγερμένα ομάδα: 50 ± 3,8% για OVCAR-3, 50 ± 2,5% SKOV-3 και 30 ± 5% για CaOV-3, ρ & lt? 0.001). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η παραγωγή IL-6 ρυθμιστική δράση μινοκυκλίνης, η επίδραση του φαρμάκου εξετάσθηκε σε 4-ΟΗ-E2-κατεργασία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι οι στεροειδείς ορμόνες, ιδιαίτερα τα οιστρογόνα μπορούν να ρυθμίσουν την παραγωγή κυτοκινών μέσω επαγωγής γονιδίου IL-1β στο επίπεδο της μεταγραφής [35]. 4-ΟΗ-E2 είναι η κατεχόλη μεταβολίτης της 17β-οιστραδιόλη η οποία είναι η πλέον βιολογικά δραστική οιστρογόνου ωοθηκών. Σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, 4-ΟΗ-E2 είναι ένας ισχυρός μιτογόνος ουσία [36] η οποία επάγει άλλοι αυξητικοί παράγοντες και καρκινογόνα οδών [37]. Εδώ, OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4-ΟΗ-Ε2 (50 μg /ml) και η συγκέντρωση IL-6 μετρήθηκε σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας μετά από 6 και 24 ώρες. Για OVCAR-3 κύτταρα, η IL-6 δεν ήταν ανιχνεύσιμη στα μέσα μαζικής ενημέρωσης μέχρι 24 ώρες μετά 4-ΟΗ-E2 θεραπεία. Ωστόσο, 4-ΟΗ-E2 θεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση των IL-6 συγκεντρώσεις και στις δύο SKOV-3 και CaOV-3 κύτταρα μέσου σε 6 ώρες (5 και 12 φορές αύξηση για SKOV-3 και CaOV-3, αντίστοιχα) ( p & lt? 0.001)? και 24 ώρες (6 και 3 φορές αύξηση για SKOV-3 και CaOV-3, αντίστοιχα) (ρ & lt? 0,01) (Εικ. 3Β). Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 3Β, μινοκυκλίνη προεπεξεργασία 4-ΟΗ-E2-διεγερμένα κύτταρα είχε σαν αποτέλεσμα εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της IL-6 έκφραση. Στη συγκέντρωση των 100 μΜ μινοκυκλίνης μπλοκαριστεί εντελώς IL-6 που προκαλείται από κύμα 4-ΟΗ-Ε2 στις δύο κυτταρικές σειρές SKOV-3 και CaOV-3.

(Α) OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV -3 κύτταρα προεπεξεργασμένα με μινοκυκλίνη (100 μΜ) ακολουθούμενη από διέγερση με IL-1β (10 ng /ml) για διάφορα χρονικά σημεία. Επίπεδα της IL-6 στο μέσο καλλιέργειας ποσοτικοποιήθηκαν με σάντουιτς ELISA. Κάθε δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (*

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt?. 0,001

vs

ομάδα ελέγχου,

# p & lt? 0,05 και

###

σ

& lt?. 0.01

vs IL-1β-διεγείρονται ομάδα

). (Β) OVCAR-3, SKOV-3 και CaOV-3 κύτταρα σε προεπεξεργασία επί 1 ώρα με διάφορες συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης (0-100 μΜ) ακολουθούμενη από διέγερση με 4-OH-Ε2 (50 μg /ml) για 6 και 24 ώρες. Μέσα συλλέχθηκαν και IL-6 επίπεδο αναλύθηκε με ELISA. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD των δεδομένων από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt ? 0,001

vs

4-ΟΗ-Ε2-διεγείρονται ομάδα)

Η

Η μινοκυκλίνη Down-ρυθμίζει IL-6R και έκφραση της gp130 σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών

Για να.. προσδιοριστεί εάν μινοκυκλίνη επηρεάζει συστήματος υποδοχέα της IL-6, ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η IL-6Rα και έκφραση gp130 σε SKOV-3 κύτταρα (IL-6Rα θετικό) μετά μινοκυκλίνη (100 μΜ) αγωγή με ή χωρίς IL-1β διέγερση. Η έκθεση των δύο μη διεγερμένα και IL-1β που διεγείρεται SKOV-3 κύτταρα για να μινοκυκλίνη οδήγησε σε σημαντικές κάτω ρύθμιση της IL-6Rα (Εικ. 4Α) και gp130 (Εικ. 4Β) σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

Για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του (Α) IL-6Rα ή (Β) gp130, SKOV-3 κύτταρα είτε διεγέρθηκαν με IL-1β (10 ng /ml) ή μη διεγερμένα, με ή χωρίς προ-θεραπεία με μινοκυκλίνη (100 μΜ) για διάφορα χρονικά σημεία. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση για IL-6Rα, gp130 και β-ακτίνη αντισώματα. β-ακτίνη ήταν ο έλεγχος φόρτωσης. IL-6Rα και πρωτεΐνη gp130 επίπεδα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και οι σχετικές διαφορές τους με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου εμφανίζονται (*

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt? 0,01

vs

κύτταρα ελέγχου,

#

σ

& lt? 0,05 και

##

σ

& lt?. 0.01

vs

IL-1β επεξεργασμένων κυττάρων).

Η

Επίδραση των μινοκυκλίνη για STAT3 και ERK1 /2 φωσφορυλίωση και Mcl-1 Έκφραση IL-1β τονωθεί και μη διεγερμένα κύτταρα των ωοθηκών Καρκίνος

για να εξεταστεί κατά πόσον η μινοκυκλίνη αναστέλλει τη φωσφορυλίωση STAT3 στον καρκίνο των ωοθηκών, SKOV-3 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά ενεργοποιημένη STAT3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με μινοκυκλίνη με ή χωρίς IL-1β διέγερση, για διαφορετικά χρονικά σημεία. Παρατηρήθηκε ότι η αγωγή οδήγησε σε μινοκυκλίνη ρύθμιση προς τα κάτω της βασικής ρ-STAT3 σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με την μέγιστη ανασταλτική δράση που εμφανίζονται σε 6 ώρες (2.5 φορές μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο, ρ & lt? 0,01). IL-1β διέγερση επάνω ρυθμισμένη τη φωσφορυλίωση STAT3 χρονικά εξαρτώμενο με τη μέγιστη αύξηση στις 6 ώρες (2.5 φορές αύξηση σε σύγκριση με τον έλεγχο). Προεπεξεργασία της IL-1β-διεγερμένα κύτταρα με μινοκυκλίνη ανέστειλε φωσφορυλίωση STAT3 με το βέλτιστο αποτέλεσμα στις 6 ώρες (μείωση 5 φορές σε σύγκριση με την IL-1β-διεγερμένα ομάδα, ρ & lt? 0.001). Ωστόσο, αυτή η επίδραση ήταν αναστρέψιμη και τα επίπεδα ρ-STAT3 επέστρεψε στα επίπεδα ελέγχου μετά από 24 ώρες θεραπείας. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στα συνολικά επίπεδα STAT3 (Εικ. 5Α).

SKOV-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με μινοκυκλίνη (100 μΜ), με ή χωρίς IL-1β (10 ng /ml) διέγερσης για διαφορετικά χρονικά σημεία . Τα επίπεδα έκφρασης του (Α) ρ-STAT3, STAT3? (Β) Mcl-1 ή (Γ) π-ERK1 /2, ERK1 /2 εκτιμήθηκαν με ανάλυση στυπώματος western. Η πυκνομετρική ανάλυση εκφράζεται ως μέση ± SD ένταση της οπτικής πυκνότητας που λαμβάνεται με τρία ανεξάρτητα πειράματα (*

ρ

& lt? 0,05, **

ρ

& lt? 0,01 και ***

p

& lt? 0.001

vs

κύτταρα ελέγχου,

#

σ

& lt?. 0.05,

##

σ

& lt? 0,01

vs.

IL-1β κατεργασμένα κύτταρα).

η

MCL-1 είναι μια πρωτεΐνη ανασταλτική απόπτωση κατάντη της IL-6 /STAT-3 οδό. Αξιολογήσαμε έτσι την επίδραση της μινοκυκλίνης επί Mcl-1 σε SKOV-3 κύτταρα τόσο υπό κανονικές όσο και IL-1β-διεγερμένες συνθήκες. Σε μη-διεγερμένα SKOV-3 κύτταρα, η θεραπεία μινοκυκλίνη οδήγησε σε προς τα κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης Mcl-1 ξεκινώντας από 2 ώρες (1.5 φορές μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο, ρ & lt? 0,05) με τη μέγιστη αναστολή σε 6 ώρες (μείωση 3 φορές σε σύγκριση με ελέγχου, p & lt? 0,01). Αλλά τελικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης επέστρεψε στην κανονική τιμή ελέγχου από 24 ώρες. Θεραπεία της IL 1β-διεγερμένα κύτταρα οδήγησε επίσης σε μια εξαρτώμενη από το χρόνο ανασταλτική επίδραση στην πρωτεΐνη Mcl-1 όπου η μέγιστη αναστολή θα μπορούσε να παρατηρηθεί στις 24 ώρες (6 φορές μείωση σε σύγκριση με IL-1β-διεγερμένα ομάδα, ρ & lt? 0,01) ( Σχ. 5Β).

σε μια προσπάθεια να καθοριστεί εάν μινοκυκλίνη αναστέλλει ΜΑΡΚ μονοπάτι, εξετάστηκαν οι επιδράσεις της μινοκυκλίνης στην φωσφορυλίωση των ERK1 /2 σε φυσιολογικούς και IL-1β επαγόμενη SKOV-3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ-ERK1 /2 από μη-διεγερμένα κύτταρα μετά την επεξεργασία μινοκυκλίνη. διέγερση IL-1β αυξημένη phorphorylation των ERK1 /2 σε εύθετο χρόνο. Η θεραπεία με μινοκυκλίνη πριν από την IL-1β διέγερση κατέστειλε εντυπωσιακά την φωσφορυλίωση των ERK1 /2 στα 2 h (μείωση 8 φορές σε σύγκριση με IL-1β-διεγερμένα ομάδα, ρ & lt? 0,01). Ωστόσο, p-ERK1 /2 επίπεδα πρωτεΐνης επέστρεψε στις φυσιολογικές τιμές ελέγχου από 24 ώρες. θεραπεία μινοκυκλίνη δεν μεταβάλλει τη συνολική έκφραση του /πρωτεΐνης ERK1 2.

Η μινοκυκλίνη Αναστέλλει μετατόπιση του STAT3 προς τον πυρήνα

Μετά φωσφορυλίωση σε κυτταρόπλασμα, STAT3 μετατοπίζεται στον πυρήνα για να καταστήσει μεταγραφική δραστηριότητα της. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού συνεστιακή με αντισώματα που συνδέονται ειδικά με π-STAT3 (Tyr 705) ή ολική STAT3 να επιβεβαιώσει ότι η μινοκυκλίνη μπλοκ φωσφορυλίωση και την πυρηνική μετατόπιση του STAT3. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 6Α, μινοκυκλίνη (100 μΜ) αγωγή καταστέλλεται φωσφορυλίωση του STAT3 σε SKOV-3 κύτταρα τα οποία είναι σύμφωνα με τα αποτελέσματα Western Blot ανάλυση. Επιπλέον, πυρηνική μετατόπιση της STAT3 αναστάλθηκε σε κύτταρα που εκτίθενται σε μινοκυκλίνη (100 μΜ) (Σχ. 6Β).

συνεστιακή ανοσοκυτταροχημεία του (Α) p-STAT3 και (Β) STAT3 (πράσινο) σε SKOV-3 κύτταρα κατεργασμένα με 100 μΜ μινοκυκλίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με ιωδιούχο προπίδιο (ερυθρό). Εικόνες ελήφθησαν σε 60 × μεγέθυνση. Οι μπάρες κλίμακας αντιπροσωπεύουν 10 μm.

Η

Η μινοκυκλίνη μειώνει καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων Μεταστατικό δυναμικό το οποίο σχετίζεται με μειωμένο MMP-2 και MMP-9 έκφρασης

IL-6 συμβάλλει στην μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών μέσω ενός συμπλόκου πολλαπλών βημάτων διαδικασία που περιλαμβάνει την πρόσφυση, μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων [7]. Εμείς επόμενη εκτελείται δοκιμασία μετανάστευσης Boyden θαλάμων των κυττάρων και προσδιορισμού Matrigel εισβολής για να καθοριστεί εάν επάγεται μινοκυκλίνη IL-6 καταστολή οδηγεί σε αναστολή SKOV-3 κύτταρα μεταστατικού δραστηριότητα. Η θεραπεία με μινοκυκλίνη (18 ώρες) εξασθένισε σημαντικά τη μετανάστευση (Εικ. 7Α) και εισβολή ικανότητα (Εικ. 7Β) του SKOV-3 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, μινοκυκλίνη ανέστειλε την ικανότητα του SKOV-3 κύτταρα να προσκολληθούν σε φρεάτια επικαλυμμένα με ανθρώπινη κολλαγόνο τύπου IV δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 7d).

Οι επιδράσεις της μινοκυκλίνης σε SKOV-3 (Α) την κυτταρική μετανάστευση και (Β) εισβολή μετρήθηκε με δοκιμασία Transwell. Η μινοκυκλίνη εφαρμόστηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0-100 μΜ) για 18 ώρες. (Γ) έκφραση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 υπολογίστηκε με ανάλυση κηλίδος western μετά από 18 ώρες επεξεργασία του SKOV-3 κύτταρα με διάφορες συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης. (D) προσκόλληση κυττάρων μετά από 18 ώρες έκθεσης σε διάφορες συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους (*

ρ

& lt? 0,05, **

ρ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001

vs

ελέγχου)

η

η έκφραση των MMPs, ειδικά ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, μπορεί να προωθήσει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή από την.. επιλεκτική πρωτεόλυση συστατικών εξωκυτταρικής μήτρας [38]. Για να μελετηθεί η επίδραση της μινοκυκλίνης στο ΜΜΡ δραστικότητα στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αναλύσαμε την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε SKOV-3 κύτταρα μετά από επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις μινοκυκλίνης για 18 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, μινοκυκλίνη μειωθεί τόσο ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφραση δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με μινοκυκλίνη σχετίζεται με μειωμένη έκφραση ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9.

Η μινοκυκλίνη αναστέλλει την IL-6 σε ένα πειραματικό μοντέλο του καρκίνου των ωοθηκών σε ποντίκια

Η ικανότητα της μινοκυκλίνης να αναστέλλουν την IL-6 και τα μονοπάτια της σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vitro

ήταν μια καλή ένδειξη ότι έχει τη δυνατότητα να επηρεάσει τα επίπεδα της IL-6 em

in vivo

. Εδώ, παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία μινοκυκλίνη μονής δόσης οδήγησε σε σημαντική μείωση στο πλάσμα (Σχ. 8Α) και του όγκου (Εικ. 8Β) IL-6 επίπεδα μετά τόσο 4 και 24 ώρες. Επιπλέον, όγκων εκφράσεις ρ-STAT3 και MCL-1 ήταν σημαντικά ανέστειλε σε δείγματα h θεραπείας 4 και 24. Η αναστολή της ενεργοποίησης 2 /ERK1 παρατηρήθηκε στα 4 ώρες κατεργάζεται δείγματα όγκων που συνάδουν με τις

in vitro

αποτελέσματα, φαίνεται να ανακτηθεί με 24 ώρες (Εικ. 8Β).

( Α) IL-6 επίπεδα προσδιορίστηκαν με ELISA σε πλάσμα ποντικών που φέρουν ip