Αφηρημένο

Ιστορικό

Η σουλινδάκη είναι ένα FDA-εγκεκριμένο μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο (ΜΣΑΦ) που επηρεάζει προσταγλανδίνης παραγωγή με αναστολή κυκλοοξυγενασών (COX) 1 και 2. η σουλινδάκη υπήρξε επίσης ενδιαφέρον για περισσότερο από δεκαετία ως χημειοπροληπτική για αδενωματώδεις πολύποδες του παχέος και του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Principal Εκτίμηση

η προεπεξεργασία του ανθρώπινου κόλου και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με sulindac ενισχύει θανάτωση από έναν οξειδωτικό παράγοντα όπως τ-βουτυλ υδροϋπεροξείδιο (ΤΒΗΡ) ή υπεροξείδιο του υδρογόνου. Αυτή η επίδραση δεν συνεπάγεται κυκλοοξυγενάσης (COX) αναστολή. Ωστόσο, κάτω από τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν, υπάρχει μία σημαντική αύξηση στην αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) εντός των καρκινικών κυττάρων και μια απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο κυτταρικός θάνατος οφείλεται σε απόπτωση, η οποία επιβεβαιώθηκε από δοκιμασία TUNEL. Αντίθετα, αυτή η αυξημένη θανάτωση δεν παρατηρήθηκε με το φυσιολογικό πνεύμονα ή το κόλον κύτταρα.

Η σημαντικότητα

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα φυσιολογικά και τα καρκινικά κύτταρα να χειριστεί το οξειδωτικό στρες με διάφορους τρόπους και μπορεί να ενισχύσει σουλινδάκη αυτή τη διαφορά. Ο συνδυασμός σουλινδάκης και οξειδωτικό παράγοντα θα μπορούσε να έχει θεραπευτική αξία

Παράθεση:. Marchetti M, L Resnick, Gamliel Ε, Kesaraju S, Weissbach Η, Binninger D (2009) σουλινδάκη Ενισχύει τη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων Εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες. PLoS ONE 4 (6): e5804. doi: 10.1371 /journal.pone.0005804

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Φεβρουαρίου 2009? Αποδεκτές: 11η Μάη του 2009? Δημοσιεύθηκε: 5, Ιούν, 2009

Copyright: © 2009 Marchetti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ένα Κέντρο αριστείας στη Βιοϊατρική και επιχορήγηση θαλάσσια βιοτεχνολογία από την Πολιτεία της Φλόριντα (επιχορήγηση 1140-190-43 απονέμεται σε DB και HW). Πρόσθετη στήριξη που παρέχεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (1 R15 CA 122001-01A1 απονέμεται σε HW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η σουλινδάκη ήταν ένα από τα πρώτα μη-στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), τα οποία επηρεάζουν την παραγωγή προσταγλανδίνης με αναστολή κυκλοοξυγενασών (COX) 1 και 2 [1]. Για περισσότερο από μια δεκαετία, σουλινδάκη έχει επίσης ενδιαφέρον ως χημειοπροληπτική θεραπεία για αδενωματώδεις πολύποδες του παχέος και του παχέος εντέρου [2] – [5], ιδιαίτερα σε ασθενείς με οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση [6]. Η σουλινδάκη έχει επίσης αναφερθεί ως χημειοπροληπτική παράγων για καρκίνο ποντίκι ουροδόχου κύστης [7]. Το αντι-ογκογόνο δράση του σουλινδάκης έναντι καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να περιλαμβάνει τόσο την αναστολή της COX [2] και οι δραστηριότητες που είναι ανεξάρτητες από την αναστολή της COX [8] – [11]. Έχει αναφερθεί ότι η σουλινδάκη προκαλεί απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του κόλον, [11], [12], η οποία φαίνεται να περιλαμβάνει αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση [12] – [18].

Η σουλινδάκη είναι ένα προ-φάρμακο που πρέπει να μετατραπεί στη δραστική COX-αναστολέα, θειώδες σουλινδάκ [19]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η μετατροπή του σουλινδάκης να θειώδες σουλινδάκ μπορεί να καταλύεται από msrA, ένα μέλος της οικογένειας σουλφοξειδίου μεθειονίνης αναγωγάση (MSR) των ενζύμων [20]. Το σύστημα MSR έχει μελετηθεί λεπτομερώς κατά τα τελευταία χρόνια, αφού αποδείχθηκε ότι msrA μπορεί να παίζει ένα ρόλο στη γήρανση και τις ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία [21] – [23]. Η προφανής λειτουργία του συστήματος MSR είναι να μειώσει σουλφοξείδιο της μεθειονίνης (Met (o)) σε πρωτεΐνες πίσω σε μεθειονίνη (Met) (που επισκοπείται στο [23]), αν και λειτουργεί επίσης ως μέρος ενός συστήματος σαρωτή ROS, στην οποία το MSR άδειες σύστημα Met υπολειμμάτων σε πρωτεΐνη για να λειτουργήσει ως καταλυτικός αντιοξειδωτικά [24]. Υποστήριξη για την περισυλλέκτη ρόλος του Msra έχει προέλθει από τις πρόσφατες μελέτες τόσο με PC-12 νευρωνικά κύτταρα, στα οποία υπερεκφράστηκε Msra [25], και ανθρώπινα κύτταρα του φακού, όπου η έκφραση Msra ήταν κάτω ρυθμίζονται [26]. Έτσι, υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις ότι το σύστημα MSR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων από την οξειδωτική βλάβη.

Από σουλινδάκη είναι ένα υπόστρωμα για Msra [20], φαίνεται λογικό ότι η θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από σουλινδάκη μπορεί να περιλαμβάνει το οξειδωτικό στρες. Επιπλέον, θέλαμε να καθοριστεί αν τα φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα ανταποκρίθηκαν με παρόμοιο τρόπο (ες) μετά τη θεραπεία sulindac και το οξειδωτικό στρες. Σε μια προκαταρκτική μελέτη, δείξαμε ότι η αγωγή μίας πλακωδών κυττάρων γραμμή καρκινικών κυττάρων με sulindac και έναν οξειδωτικό παράγοντα οδήγησε σε σχεδόν αύξηση 500% στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS και σημαντική κυτταρικό θάνατο. Αντίθετα, κανονικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα δεν δείχνουν αύξηση στα επίπεδα ROS ή κυτταρικό θάνατο. Αυτά τα αποτελέσματα οδήγησαν σε περιορισμένη κλινική δοκιμή που έδειξε πολλά υποσχόμενη δυνατότητα χρήσης τοπική εφαρμογή της σουλινδάκης και υπεροξειδίου του υδρογόνου για θεραπεία ακτινικών κερατώσεων [27].

Στις παρούσες μελέτες επεκτείναμε αυτά τα προηγούμενα αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές καρκίνου που προέρχεται από πνεύμονα και του ιστού του παχέος εντέρου. Παρέχουμε περαιτέρω απόδειξη ότι η αυξημένη θανάτωση που παρατηρήθηκε με sulindac και το οξειδωτικό στρες περιλαμβάνει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης. Αυτά τα νέα δεδομένα ενισχύσει το δυναμικό για ειδικά ενισχύοντας τη θεραπευτική εφαρμογή σουλινδάκης και των παραγώγων της για τη θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση τους σε συνδυασμό με μια ένωση που παράγει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS).

Αποτελέσματα

η σουλινδάκη ενισχύει την θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από το οξειδωτικό στρες, αλλά δεν συνεπάγεται ούτε την αναστολή της COX ή το σύστημα MSR

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα και καρκίνο του παχέος εντέρου προεπωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία σουλινδάκης για 48 ώρες. Η περίσσεια σουλινδάκη απομακρύνθηκε με πλύση πριν από την επώαση 2 ώρες με ΤΒΗΡ όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Η σουλινδάκη χρησιμοποιήθηκε σε 500 μΜ τελική συγκέντρωση αφού προκαταρκτικά πειράματα χρησιμοποιώντας σουλινδάκη σε αυτή τη συγκέντρωση δεν έδειξε σημαντική επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα για οποιαδήποτε από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές.

Κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου είχε μια αξιοσημείωτη μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων στην παρουσία ΤΒΗΡ εξής προεπεξεργασίας με 500 μΜ σουλινδάκη (Σχήμα 1Α και 1Β). Η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα σε προεπεξεργασία με sulindac μειώθηκε κατά περισσότερο από 80% μετά από επώαση για 2 ώρες με 240 μΜ ΤΒΗΡ σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που δεν υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με σουλινδάκη (Σχήμα 1Α). Παρόμοια αποκρίσεις σε ΤΒΗΡ παρατηρήθηκαν με καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα κατεργασμένα σουλινδάκη (Σχήμα 1Β), αν και μια υψηλότερη συγκέντρωση του ΤΒΗΡ απαιτείτο για σημαντική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Η σουλινδάκη ενίσχυσαν επίσης τη θανάτωση δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου όταν ΤΒΗΡ αντικαταστάθηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου, σε συγκεντρώσεις μεταξύ 1.0 mM και 6.0 mM (Εικόνα 2).

Ο καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων (Α) ή καρκινικά κύτταρα κόλου (Β) επωάστηκαν με την παρουσία (▪) ή απουσία (□) 500 μΜ σουλινδάκης για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν για να απομακρυνθεί το ελεύθερο σουλινδάκη πριν από την επώαση για 2 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του ΤΒΗΡ και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με χρήση της ανάλυσης MTS περιγράφεται στο Υλικά & amp? Μεθόδους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράζεται ως% του ελέγχου (κύτταρα που δεν προεπεξεργασία με σουλινδάκ ή εκτίθενται σε ΤΒΗΡ). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) που εκφράζεται ως ποσοστό% της μέσης τιμής των τεσσάρων ομοίων δειγμάτων από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Σημασία των διαφορών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με και χωρίς σουλινδάκη, αλλά εκτίθενται στην ίδια συγκέντρωση του ΤΒΗΡ: * ρ ​​& lt? 0,01? ** P & lt? 0.001? *** Ρ & lt? 0,0001

Η

Ο καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων (Α) ή καρκινικά κύτταρα κόλου (Β) επωάστηκαν με την παρουσία (▪) ή απουσία (□) 500 μΜ σουλινδάκης για 48 ώρες.. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν για να απομακρυνθεί το ελεύθερο σουλινδάκη πριν από την επώαση για 2 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό MTS περιγράφεται στο Υλικά & amp? Μεθόδους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράζεται ως% του ελέγχου (κύτταρα που δεν προεπεξεργασία με σουλινδάκ ή εκτέθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) που εκφράζεται ως ποσοστό% της μέσης τιμής των τεσσάρων ομοίων δειγμάτων από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Σημασία των διαφορών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με και χωρίς σουλινδάκη, αλλά εκτίθενται στην ίδια συγκέντρωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου: * ρ ​​& lt? 0,01? ** P & lt? 0.001? *** P & lt?. 0.0001

Η

Πολλά στοιχεία δείχνουν ότι η αυξημένη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από σουλινδάκη και το οξειδωτικό στρες δεν συνεπάγεται αναστολή της COX. Δύο άλλα ΜΣΑΦ, ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ασπιρίνη) και ibuprofen, στα 500 μΜ, απέτυχε να αυξήσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε οξειδωτικό στρες (Σχήμα 3Α και 3Β, αντιστοίχως). Όπως σημειώνεται παραπάνω, σουλινδάκη είναι ένα προ-φάρμακο που πρέπει να μετατραπεί στο δραστικό COX-αναστολέα, θειώδες σουλινδάκ [19], κυρίως μέσω της δραστηριότητας των Msra [20]. Για να καθοριστεί εάν η ενισχυμένη θανάτωση σουλινδάκη αγωγή καρκινικών κυττάρων με ΤΒΗΡ εμπλέκονται μείωση του σουλινδάκης να θειώδες σουλινδάκ, το δραστικό αναστολέα του κυκλοοξυγενασών, τα πειράματα που περιγράφονται παραπάνω επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας sulindac σουλφόνη, η οποία δεν είναι ένα υπόστρωμα για Msra (μη δημοσιευμένα δεδομένα) ή ένας αναστολέας COX [28]. Λόγω της αυξημένης τοξικότητας των σουλφονικό σουλινδάκ μια χαμηλότερη συγκέντρωση (250 μΜ) χρησιμοποιήθηκε για αυτά τα πειράματα. Προκατεργασία των πνευμόνων καρκινικών κυττάρων με 250 μΜ sulindac σουλφόνη (Σχήμα 3C), ακολουθούμενη από έκθεση σε ΤΒΗΡ έδωσαν συγκρίσιμα αποτελέσματα με εκείνα που παρατηρούνται με τη χρήση 500 μΜ σουλινδάκη (σύγκρινε Σχήματα 1Α και 3C). Παρόμοια αποτελέσματα χρησιμοποιώντας σουλφονικό σουλινδάκ ελήφθησαν επίσης με τις γραμμές κυττάρων καρκίνου του κόλου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, οι συλλογικές δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αυξημένη ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε επεξεργασία σουλινδάκη σε οξειδωτικό στρες, υπό χρησιμοποιούνται οι συνθήκες, δεν περιλαμβάνει ούτε το σύστημα MSR ή την αναστολή της COX.

Ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία ( ▪) ή απουσία (□) είτε με 500 μΜ ακετυλοσαλικυλικό οξύ (Α), 500 μΜ ιβουπροφαίνη (Β) ή 250 μΜ sulindac σουλφόνη (Γ) για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν για να απομακρυνθεί η ελεύθερη NSAID ή sulindac σουλφόνη πριν από την επώαση για 2 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του ΤΒΗΡ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό MTS περιγράφεται στο Υλικά & amp? Μεθόδους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράζεται ως% του ελέγχου (κύτταρα που δεν εκτέθηκαν σε ένα NSAID, σουλινδάκη σουλφόνη, ή ΤΒΗΡ). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) που εκφράζεται ως ποσοστό% της μέσης τιμής των τεσσάρων ομοίων δειγμάτων από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Σημασία των διαφορών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με και χωρίς sulindac σουλφόνη, αλλά εκτίθενται στην ίδια συγκέντρωση του ΤΒΗΡ: * ρ ​​& lt? 0,01? ** P & lt? 0.001? *** P & lt?. 0.0001

Η

Η σουλινδάκη δεν ενισχύει τη θανάτωση των φυσιολογικών κυττάρων που εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες

Ήταν σημαντικό να καθοριστεί αν η ενισχυμένη θανάτωση επίδραση της σουλινδάκης και σουλφόνη σουλινδάκης σε καρκινικά κύτταρα με την παρουσία του ΤΒΗΡ (Σχήμα 1) εμφανίστηκε επίσης με φυσιολογικά, μη-αθανατοποιημένων κυττάρων. Το Σχήμα 4 δείχνει την επίδραση της προκατεργασίας φυσιολογικού πνεύμονα κυττάρων με σουλινδάκ ή sulindac σουλφόνη στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά το οξειδωτικό στρες χρησιμοποιώντας ΤΒΗΡ. Η επώαση των φυσιολογικού πνεύμονα κυττάρων με 500 μΜ sulindac για 48 ώρες πριν από την έκθεση σε ΤΒΗΡ όχι μόνο δεν ενίσχυσε τη θανάτωσή τους, αλλά σουλινδάκη παρέχεται προστασία από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από ΤΒΗΡ (Σχήμα 4Α). Η προστατευτική δράση από το οξειδωτικό στρες σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα παρατηρήθηκε επίσης όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με sulindac σουλφόνη (Σχήμα 4Β).

φυσιολογικού πνεύμονα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες στο (Α) η παρουσία (▪) ή απουσία (□) 500 μΜ σουλινδάκ ή (Β) την παρουσία (▪) ή απουσία (□) 250 μΜ σουλινδάκης. Βλέπε Υλικά και Μέθοδοι και λεζάντα στο Σχήμα 1 για περισσότερες λεπτομέρειες. Σημασία των διαφορών μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με και χωρίς σουλινδάκ ή σουλφονικό σουλινδάκ, αλλά εκτίθενται στην ίδια συγκέντρωση του ΤΒΗΡ: * ρ ​​& lt? 0,01? ** P & lt? 0.001? *** P & lt?. 0.0001

Η

Παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τα φυσιολογικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Δεν υπήρξε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων με την παρουσία του ΤΒΗΡ όταν τα φυσιολογικά κύτταρα του κόλου υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία είτε με 500 μΜ σουλινδάκη ή 250 μΜ sulindac σουλφόνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, ούτε φυσιολογικό πνεύμονα ούτε φυσιολογικά κύτταρα κόλον έδειξαν αυξημένη θανάτωση από ΤΒΗΡ μετά από αγωγή με σουλινδάκ ή sulindac σουλφόνη, όπως παρατηρήθηκε με τις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου.

Η σουλινδάκη προεπεξεργασία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα ROS και απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυνητικών

καρκινικά κύτταρα πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν για να αποκτήσουν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό της ενισχυμένης θανάτωση επίδραση της σουλινδάκης παρουσία ΤΒΗΡ. Για να διερευνηθεί κατά πόσο η αυξημένη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων που παρατηρείται με sulindac και το οξειδωτικό στρες μπορεί να περιλαμβάνει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, προσδιορίστηκαν αλλαγές στο επίπεδο της ενδοκυτταρικής ROS. Για τα πειράματα αυτά τα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σουλινδάκ για 48 ώρες, εκτέθηκαν σε ΤΒΗΡ και, στη συνέχεια, το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φθορίζουσα χρωστική όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 5. Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 5Α), κύτταρα κατεργασμένα με sulindac μόνο του (Σχήμα 5Β) ή ΤΒΗΡ μόνο του (Σχήμα 5C) παρουσίασε μέτρια αύξηση (53-58%) στα επίπεδα ROS με βάση εμφάνιση πράσινου φθορισμού. Ωστόσο, ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα που προκατεργάστηκαν με 500 μΜ sulindac ακολουθούμενη από επώαση 2 ωρών με 80 μΜ ΤΒΗΡ (Σχήμα 5D) είχαν μια αύξηση 400% σε ενδοκυτταρική πράσινο φθορισμό σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (σύγκρινε Σχήμα 5Α και 5Δ). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι προκατεργασία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με sulindac οδηγεί σε μεγάλη αύξηση στην ενδοκυτταρική ROS μετά από έκθεση σε οξειδωτικό στρες, υποστηρίζοντας τα αποτελέσματα για τον καρκίνο του δέρματος κυττάρων αναφέρθηκε πρόσφατα [27].

Οι πίνακες δείχνουν ενδοκυτταρικά ROS φθορισμού. (Α) μη επεξεργασμένα κύτταρα? κύτταρα (Β) υποβάλλεται σε επεξεργασία με μόνο sulindac? κύτταρα (C) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μόνο ΤΒΗΡ? (D) κύτταρα επεξεργασμένα με τόσο sulindac και ΤΒΗΡ. Οι συνθήκες επώασης που περιγράφονται στο Σχήμα 1. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν για μικροσκοπία φθορισμού και το πράσινο σήμα φθορισμού ποσοτικοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. τα επίπεδα φθορισμού είναι ο μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων και προσαρμόστηκαν για το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων. Το SEM ήταν μικρότερη από 10% για κάθε δείγμα. Η αύξηση του φθορισμού σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου στον πίνακα Α είναι: Β, 53%? C, 57%? Α, 401%.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η μηχανισμός θανάτωσης καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες μετά από προθεραπεία με sulindac, διερευνήσαμε κατά πόσον υπάρχει ταυτόχρονη απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η οποία είναι γνωστή για την κίνηση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Επιδράσεις στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μεταβολές του φθορισμού της χρωστικής JC-1 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 6. Τα κορυφαία πάνελ δείχνουν κόκκινη φθορίζουσα εικόνες και τα κατώτερα πλαίσια πράσινη φθορίζουσα εικόνων. Απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης θα έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη κόκκινου φθορισμού και μια αντίστοιχη αύξηση στο πράσινο φθορισμό. Σχετική με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 6Α) ή κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με σουλινδάκη (Σχήμα 6Β) ή ΤΒΗΡ μόνο του (Σχήμα 6C), σουλινδάκη προεπεξεργασία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα που ακολουθείται από το οξειδωτικό στρες (Σχήμα 6D) είχε ως αποτέλεσμα διάσπαση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, όπως αποδεικνύεται από σχεδόν ένα αύξηση 20 φορές σε πράσινο φθορισμό (βλέπε λεζάντα του Σχήματος 6 για περισσότερες λεπτομέρειες). Συνοπτικά, προεπεξεργασία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με sulindac ακολουθούμενη από κατεργασία με ΤΒΗΡ οδηγεί σε μια σημαντική αύξηση στην ενδοκυτταρική ROS και σημαντική απώλεια δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο κυτταρικός θάνατος συμβαίνει μέσω απόπτωσης, η οποία επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Tunel (Συμπληρωματική Εικόνα S1)

Άνω πάνελ δείχνουν κόκκινο εικόνων φθορισμού, ενώ κάτω πάνελ δείχνουν πράσινο εικόνες φθορισμού. Απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης ανιχνεύθηκε από τη μείωση του κόκκινου φθορισμού με ταυτόχρονη αύξηση του πράσινου φθορισμού. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιγράφεται στις λεζάντες του Σχήματος 1. (Α) μη επεξεργασμένα κύτταρα? κύτταρα (Β) υποβάλλεται σε επεξεργασία με μόνο sulindac? κύτταρα (C) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μόνο ΤΒΗΡ? (D) κύτταρα επεξεργασμένα με τόσο sulindac και ΤΒΗΡ. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν για μικροσκοπία φθορισμού και το σήμα φθορισμού ποσοτικοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα είναι ένας μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. SEM ήταν μικρότερη από 10% για κάθε δείγμα. Ποσοτική ανάλυση του πράσινου φθορισμού εκφράζεται ως εξής σε αυθαίρετες μονάδες: πίνακας Α -1,39? Πίνακας Β -1,23? πίνακα C -1,29? πίνακας D -25,3.

Η

Συζήτηση

Η σουλινδάκη και των μεταβολιτών της, όπως θειώδες σουλινδάκ και σουλφονικό σουλινδάκ, έχουν δειχθεί ότι έχουν αντικαρκινική δράση [29]. Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας των καρκινικών κυττάρων του δέρματος [27], έχουμε δείξει ότι η θανάτωση κυτταρικών γραμμών του πνεύμονα και καρκίνου του κόλου μπορεί να ενισχυθεί σημαντικά εάν η σουλινδάκη συνδυάζεται με ένα οξειδωτικό, όπως ΤΒΗΡ ή υπεροξείδιο του υδρογόνου. Έχουμε επίσης δείξει ότι η προεπεξεργασία σουλινδάκη μπορεί να ενισχύσει την θανάτωση των καρκινικών κυττάρων του δέρματος που προκαλείται από το τριοξείδιο του αρσενικού (τα δεδομένα δεν φαίνονται), η οποία σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα με τη δημιουργία ενδοκυτταρικών ROS, όπως αναφέρθηκε αλλού για τον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [30]. Φαίνεται λογικό ότι η σουλινδάκη μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα του κάθε αντικαρκινικού φαρμάκου, όπου ο μηχανισμός δράσης περιλαμβάνει την οξειδωτική βλάβη. Η επιτυχής εφαρμογή μιας θεραπείας σε πολλαπλά φάρμακα έχει αναφερθεί πρόσφατα για μια κλινική δοκιμή που περιλαμβάνει περίπου 300 ασθενείς σε κίνδυνο για υποτροπή του ορθοκολικού αδενώματος που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό σουλινδάκ και διφθορομεθυλορνιθίνη, ένας αναστολέας της σύνθεσης πολυαμίνης [31].

φαίνεται πιθανόν ότι ο μηχανισμός της επιλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκαν σε αυτές τις μελέτες περιλαμβάνει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, πιθανώς ως αποτέλεσμα της αυξημένης παραγωγής ROS. Ενώ επεξεργασία των καρκινικών κυττάρων με sulindac ή ΤΒΗΡ οδηγεί μεμονωμένα σε μια μέτρια αύξηση του επιπέδου του ROS (Σχήμα 5Β και [27], [32]), υπάρχει μια δραματική αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων του ROS στα κύτταρα προκατεργάστηκαν με sulindac και στη συνέχεια εκτίθενται σε ΤΒΗΡ (Εικόνα 5D). Επιπλέον, υπάρχει μια σημαντική διαταραχή των δυνητικών μιτοχονδριακής μεμβράνης κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (Σχήμα 6), υποδηλώνοντας ότι η σουλινδάκη προκαλεί απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες. Η αντικαρκινική δράση του και μόνο σουλινδάκης έχει αναφερθεί να εμπλέξει αποπτωτικό θάνατο [33]. Τα αποτελέσματα με sulindac σουλφόνη και άλλα ΜΣΑΦ δείχνουν ότι η επίδραση της σουλινδάκης στο σύστημά μας δεν περιλαμβάνει την αναστολή της COX ή το σύστημα MSR.

Τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν μια θεμελιώδη διαφορά στον τρόπο φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων ανταποκρίνονται σε οξειδωτική στρες. Η σουλινδάκη και οι μεταβολίτες του μπορούν να επιτείνει τη διαφορά αυτή, η οποία οδηγεί σε αυξημένη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι κανονικά κύτταρα, από το οξειδωτικό στρες. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι ο καρκίνος και τα φυσιολογικά κύτταρα διαφέρουν στην οξειδωτικό μεταβολισμό τους και ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν υψηλότερο ποσοστό της γλυκόλυσης από τα φυσιολογικά κύτταρα, ένα φαινόμενο που περιγράφηκε πρώτα από Warburg [34]. Υπάρχουν επίσης είναι πειστικές αποδείξεις ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι τυπικώς υπό μεγαλύτερο οξειδωτικό στρες σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [35]. Μια διαφορά μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε οξειδωτικό στρες που έχει αναφερθεί είναι η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από στέρηση γλυκόζης. Μελέτες από Spitz και συνεργάτες [36] έδειξαν σαφώς ότι αυτή η επίδραση προκαλείται από μιτοχονδριακό παραγωγή ROS.

Τα αποτελέσματα που περιγράφονται παρέχουν περαιτέρω αποδείξεις ότι ο συνδυασμός σουλινδάκης και ένας οξειδωτικός παράγοντας μπορεί να έχει κλινική θεραπευτική αξία στη θεραπεία μιας ποικιλίας καρκίνων. Σε προηγούμενη προκαταρκτική μελέτη αναφέραμε ότι τα αποτελέσματα μιας περιορισμένης απόδειξη της έννοιας ανθρώπινη κλινική δοκιμή χρησιμοποιώντας σουλινδάκη (1-5%) και υπεροξείδιο του υδρογόνου (25%) γέλες εφαρμόζεται καθημερινά για τρεις εβδομάδες σε ακτινικές κερατώσεις (AK) με τη συμμετοχή των άνω άκρων [27]. Μετά την ολοκλήρωση, και οι δέκα ΑΚ αγωγή παρουσίασαν μείωση σε μέγεθος, όπως φαίνεται από κλινικές φωτογραφία με πέντε εμφανίζουν πλήρη εξαφάνιση των προκαρκινικών κυττάρων μετά τη βιοψία δέρματος. Τα προκαταρκτικά αυτά αποτελέσματα απαιτούν πιο εκτεταμένες κλινικές δοκιμές

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

σουλινδάκη, ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ασπιρίνη), (S) -. (+) – Ibuprofen, και tert βουτυλο-υδροϋπεροξείδιο (ΤΒΗΡ) ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Sulindac σουλφόνη συντέθηκε με προσαρμοσμένη σύνθεση Inc. (Boca Raton, FL). Όλα τα μέσα καλλιέργειας ιστού συμπεριλαμβανομένων εμβρυϊκό βόειο ορό και άλλα συμπληρώματα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Rockville, MD).

Cell Culture

Ένα κόλου κυτταρική σειρά καρκίνου (RKO), ένα καρκινική κυτταρική σειρά πνεύμονα (Α549), και κυτταρικές σειρές που προέρχονται ινοβλαστών από φυσιολογικό ιστό ανθρώπινου κόλου (CCD-18Co) και φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα (MRC-5) ελήφθησαν από την ATCC (Rockville, MD). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε συνιστώμενη μέσο καλλιέργειας. Οι φυσιολογικές κυτταρικές σειρές δεν είχαν αθανατοποιημένα και στις αρχές κύτταρα πέρασμα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα που αναφέρονται εδώ. Οι κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκαν να είναι απαλλαγμένα από μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας το VenorGeM® Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich), το οποίο είναι ένα εξαιρετικά ευαίσθητο ποσοτικό προσδιορισμό που βασίζεται σε PCR.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά , τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με σουλινδάκ, σουλφονικό ή άλλο NSAID για 48 ώρες πριν από την έκθεση σε ΤΒΗΡ για 2 ώρες. Κυτταρικά εναιωρήματα (~100,000 κύτταρα) που περιέχει την υποδεικνυόμενη συμπλήρωμα απλώθηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας 100 μΙ του υποδεικνυόμενου κυτταρικού εναιωρήματος. Οι πλάκες επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας με ορό. Μετά την απομάκρυνση του διαλύματος πλύσεως, φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας με ορό που περιείχε την ενδεικνυόμενη τελική συγκέντρωση του ΤΒΗΡ ή υπεροξείδιο του υδρογόνου προστέθηκε στα κύτταρα, και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν η σουλινδάκη περιλήφθηκε κατά την διάρκεια της θεραπείας 2 ώρες με τον οξειδωτικό παράγοντα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την CellTiter Δοκιμασία 96 Υδατικά Ένα κυτταρικού πολλαπλασιασμού. (Promega? Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δοκιμασία χρησιμοποιεί μία νέα ένωση τετραζολίου που μεταβολικά ενεργά κύτταρα μετατρέπουν σε ένα υδατοδιαλυτό φορμαζάνη με τη δράση της κυτταρικής δεϋδρογενασών, η οποία μετράται με απορρόφηση στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη χρωματομετρική πλάκας μικροτίτλου (SpectraMax Plus

384? Molecular Devices) . απορρόφηση Ιστορικό αφαιρέθηκε από το κάθε δείγμα. Έχει αναφερθεί ότι ορισμένα αντικαρκινικά φάρμακα μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στην απορρόφηση σε δοκιμασίες MTS με βάση για την κυτταρική βιωσιμότητα σε απουσία των κυττάρων [37]. Πειράματα ελέγχου χρησιμοποιώντας μόνος σουλινδάκη, ΤΒΗΡ μόνες ή συνδυασμούς σουλινδάκη και ΤΒΗΡ με εύρος συγκέντρωσης που χρησιμοποιούνται στα πειράματα που αναφέρθηκαν δεν έδειξαν επίδραση της κάθε μια ένωση μόνη της ή σε συνδυασμό για την απορρόφηση.

Δοκιμασία Ενδοκυτταρική ROS

ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν με τη χρήση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) αντιδραστηρίων ανίχνευσης από την Molecular Probes (Eugene, OR) όπως περιγράφεται αλλού [38]. Αυξημένα επίπεδα των ROS οδηγούν σε αυξημένη πράσινο φθορισμό, η οποία οπτικοποιήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού.

JC-1 δοκιμασία για να μετρηθεί το δυναμικό

απώλεια μιτοχονδριακής μεμβράνης του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το JC-1 βαφή από την Molecular Probes (Eugene, OR). Απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό οδηγεί σε αυξημένη πράσινο φθορισμό στο κυτοσόλιο και μια αντίστοιχη μείωση στην μιτοχονδριακή κόκκινο φθορισμό. Έτσι, οι αλλαγές στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης προσδιορίστηκαν ακολουθώντας το κόκκινο στο πράσινο μετατόπιση χρώση χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο FITC (Zeiss ανεστραμμένο μικροσκόπιο-Axiovert 40 CFL). Ο ποσοτικός προσδιορισμός των σημάτων φθορισμού χρησιμοποιούνται δύο τυπικές πυκνομετρικές μεθόδους και Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) ανάλυση με βάση την εικόνα [39].

ΤΟΥΝΕΛ Δοκιμασία για να αποδείξει την απόπτωση

κυττάρων

Τα αποπτωτικά ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το αδιέξοδο (Promega) χρωματομετρική δοκιμασία TUNEL που καταλήγουν ετικέτες κατακερματισμένη DNA. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη πριν διαπερατά με 0,2% Triton-X-100. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS πριν από την επώαση με ανασυνδυασμένη τελική δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράση (TdT) και βιοτινυλιωμένα νουκλεοτίδια για 1 ώρα στους 37 ° C, η οποία ενσωματώνει τις βιοτινυλιωμένα νουκλεοτίδια στο 3 ‘άκρα του κατακερματισμένου DNA. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-στρεπταβιδίνη (HRP-στρεπταβιδίνη) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. HRP-στρεπταβιδίνης επισημασμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου και διαμινοβενζιδίνης (DAB). Τα αποπτωτικά κύτταρα ορατά με σκούρο καφέ πυρηνική χρώση.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα των πειραμάτων κυτταρικής βιωσιμότητας εκφράζονται ως ο μέσος όρος των τεσσάρων επαναλήψεων ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Μέσα συγκρίθηκαν με χρήση πρότυπων δοκιμασιών t και οι Ρ-τιμές που υποδεικνύονται στις επεξηγήσεις εικόνων. Ρ τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των σημάτων φθορισμού χρησιμοποιούνται δύο τυπικές πυκνομετρικές μεθόδους και Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) ανάλυση με βάση την εικόνα [39].

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

κυττάρων θάνατος οφείλεται σε απόπτωση. Μια δοκιμασία TUNEL χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της απόπτωσης των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. (Α) μη επεξεργασμένα κύτταρα? κύτταρα (Β) υποβάλλεται σε επεξεργασία με μόνο 500 μΜ σουλινδάκη? (C) κύτταρα κατεργασμένα με μόνο 180 μΜ ΤΒΗΡ? (D) κύτταρα κατεργασμένα με 500 μΜ τόσο σουλινδάκη και 180 μΜ ΤΒΗΡ. Αυξημένα επίπεδα απόπτωσης υποδεικνύονται από ενισχυμένο σχηματισμό του καφέ χρωματισμό. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιγράφεται στις λεζάντες του Σχήματος 1 στο χειρόγραφο. Πρόσθετες λεπτομέρειες της ανάλυσης TUNEL παρέχεται στα Υλικά και Μέθοδοι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0005804.s001

(0,22 MB ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

θα ήθελα να γνωρίσω τον Δρ Daphna Sagher για τη βοήθειά της και χρήσιμες συζητήσεις. Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε Kelsey Binninger για τη βοήθειά της με το έργο τέχνης.