Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα υιοθετήσουν γλυκόλυση ως κύρια πηγή παραγωγής μεταβολικής ενέργειας για τη γρήγορη ανάπτυξη των κυττάρων. Η HIF-1-επαγόμενη PFKFB3 διαδραματίζει βασικό ρόλο σε αυτή την προσαρμογή με την ανύψωση της συγκέντρωσης της Fru-2,6-BP, το πιο ισχυρό γλυκόλυση διεγέρτη. Καθώς αυτή η μεταβολική μετατροπή έχει προταθεί να είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου, PFKFB3 έχει αναδειχθεί ως ένα νέο στόχο για την χημειοθεραπεία του καρκίνου. Εδώ, αναφέρουμε ότι ένα μικρό μοριακό αναστολέα, N4A, αναγνωρίστηκε ως μία αρχική ένωση μολύβδου για αναστολέας PFKFB3 με θεραπευτικές δυνατότητες. Σε μια προσπάθεια να βελτιώσει την ισχύ της, προσδιορίσαμε την κρυσταλλική δομή του συμπλέγματος PFKFB3 • N4A στο 2,4 ψήφισμα A και, αξιοποιώντας το προκύπτον μοριακή πληροφορία, επιτυγχάνεται το πιο ισχυρό YN1. Όταν δοκιμάστηκε σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, τόσο N4A και YN1 ανέστειλαν PFKFB3, καταστέλλοντας το επίπεδο Fru-2,6-BP, η οποία με τη σειρά της καταστέλλεται γλυκόλυση και, τελικά, οδήγησε στο θάνατο των κυττάρων. Αυτή η μελέτη επικυρώνει PFKFB3 ως στόχο για νέες θεραπείες του καρκίνου και παρέχει ένα πλαίσιο για τις μελλοντικές προσπάθειες ανάπτυξης

Παράθεση:. Seo Μ, Kim JD, Neau D, Sehgal μου, Lee YH (2011) Δομή-Based Ανάπτυξη Αναστολείς μικρού μορίου PFKFB3: πλαίσιο για τα πιθανά Καρκίνο Θεραπευτικές παράγοντες που στοχεύουν το Φαινόμενο Warburg. PLoS ONE 6 (9): e24179. doi: 10.1371 /journal.pone.0024179

Επιμέλεια: Anil Kumar Tyagi, Πανεπιστήμιο του Δελχί, Ινδία

Ελήφθη: 2η Μαΐου, 2011? Αποδεκτές: 2 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 Σεπτέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Seo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου επιχορήγηση 1R01 CA124758-01 με το Υ-HL Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, τα καρκινικά κύτταρα έχουν αναφερθεί να μετατοπίσουν την ενέργεια του μεταβολισμού τους προς γλυκόλυση [1]. Το φαινόμενο αυτό, που ονομάζεται αρχικά το αποτέλεσμα Warburg και η μετάβαση αυτή επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να ικανοποιήσει αυξημένη βιοσυνθετικών απαιτήσεις για τη βιομάζα και την ενέργεια [2], [3]. Μελέτες έχουν δείξει σταθερά ένα ασυνήθιστα υψηλό γλυκολυτικό ρυθμό σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων αλλά οι μηχανισμοί αιτιολογικός υπεύθυνη για αυτή την μεταβολική προσαρμογή παραμένουν ανεπαρκώς κατανοητά [4], [5]. Μεταξύ των πιθανών μηχανισμών, οι μιτοχονδριακής αναπνευστικής ελαττώματα και υποξία στο μικροπεριβάλλον του όγκου που αποδίδεται ως δύο σημαντικοί παράγοντες για το αποτέλεσμα Warburg [6], [7], [8]. Παρά την πολυπλοκότητα και ασάφεια των υποκείμενων μηχανισμών που ευθύνονται για το φαινόμενο Warburg, οι μεταβολικές συνέπειες είναι ένας συνεπής μετασχηματισμός προς γλυκόλυση ως κύρια πηγή παραγωγής ΑΤΡ [4], [9]. Αυτή η μεταβολική ανωμαλία των καρκινικών κυττάρων παρέχει abiochemical βάση για να καταστείλουν επιλεκτικά την εξέλιξη των κακοήθων κυττάρων από εκλεκτική αναστολή της γλυκόλυσης [10], [11], [12].

Στην οδό γλυκόλυση, φωσφοφρουκτοκινάση-1 (PFK- 1) καταλύει το σημαντικό βήμα περιορισμού του ρυθμού που μετατρέπει φρουκτόζη-6-φωσφορική (Fru-6-Ρ) προς φρουκτόζη-1, 6-διφωσφορικής (Fru-1, 6-BP) και αλλοστερικά ρυθμίζεται από φρουκτόζη-2,6 -bisphosphate (Fru-2,6-BP) [13], [14]. Σύμφωνα με άφθονη παροχή ενέργειας, τα υψηλά επίπεδα του ΑΤΡ αναστέλλουν ισχυρά δραστικότητα PFK-1? Ωστόσο, Fru-2,6-BP να παρακάμψετε αυτήν την ανασταλτική δράση και να ενισχύσει την πρόσληψη της γλυκόζης και γλυκολυτικής ροής [15]. Δεν αποτελεί έκπληξη, σύνθεση Fru-2,6-BP είναι επάνω ρυθμισμένη σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επιλεκτική εξάντληση των ενδοκυτταρικών Fru-2,6-BP σε καρκινικά κύτταρα μπορεί δυνητικά να χρησιμοποιηθούν για να εμποδίσουν γλυκολυτικής ροής και καταστέλλουν κακοήθη κυτταρική επιβίωση και την εξέλιξη [16], [17], [18].

Μια οικογένεια διλειτουργικών ενζύμων, 6-φωσφοφρουκτο-2-κινάση /φρουκτόζης-2,6-bisphosphatases (PFKFB1-4), είναι υπεύθυνοι για τα ενδοκυτταρικά επίπεδα Fru-2,6-BP [18], [19], [20]. Μεταξύ αυτών των ισοενζύμων, PFKFB3 είναι δεσπόζει υπερεκφράζεται σε θυρεοειδούς, μαστού, παχέος εντέρου, του προστάτη, και κυτταρικές γραμμές όγκου ωοθήκης [18], [21], [22]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η επαγωγή έκφρασης PFKFB3 με HIF-1 κάτω από υποξικές συνθήκες ακολουθείται από αυξημένη επιθετική πιθανότητα και αντοχή σε χημειοθεραπείες [21], [23]. Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες προτείνουν PFKFB3 είναι ένας πιθανός στόχος για μια νέα κατηγορία αντι-νεοπλασματικών παραγόντων που εμποδίζουν την έναρξη του καρκίνου ειδικής γλυκόλυση αναστέλλοντας την αύξηση Fru-2,6-BP και, τελικά, να προκαλέσουν το θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Κατά συνέπεια, η αναστολή της PFKFB3 ως θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο έχει προταθεί [22].

Παρά τις δυνατότητες ουσίας, εκμετάλλευση PFKFB3 για τη θεραπεία του καρκίνου παρέμεινε φτωχή. Clem et al (2008) ανέφεραν μια ένωση πυριδινυλ περιέχει ως πιθανή αναστολέας PFKFB3, με βάση τη δομή του υποδοχέα που προβλέπεται από εκείνη του PFKFB4 [24]. Αν και πολλά υποσχόμενη, αναστολείς βασίζονται σε δομές εκτός από την πραγματική ένζυμο PFKFB3 μπορεί να στερούνται ειδικότητας και περιορίζουν στρατηγική βελτίωση της ισχύος αναστολέα. Ήμασταν σε θέση να ξεπεράσει μια τέτοια εγγενή ελαττώματα με τη συμμετοχή στις δομικές μελέτες των PFKFB3 και συγκροτήματα του με συνδέτες. Στην έκθεση αυτή, έχουμε εντοπίσει N4A ως νέο ανταγωνιστικό αναστολέα και δοκιμάστηκε ανασταλτική δράση της σχετικά με τη δραστηριότητα PFKFB3. Για να κατανοήσουμε τον μοριακό μηχανισμό του αναστολέα αναγνώριση από PFKFB3, προσδιορίσαμε τη δομή του PFKFB3 σε συγκρότημα με N4A.Guided από τη διαρθρωτική βάση για τη δέσμευση του αναστολέα? ήμασταν τότε σε θέση να βελτιστοποιήσει N4A, χρησιμοποιώντας την αναζήτηση ομοιότητας και υπολογιστική αξιολόγηση, με αποτέλεσμα σε μία ένωση συνέχεια προβάδισμα με ένα 5-πλάσια βελτίωση στην ισχύ.

Εκτός από το μοριακό μηχανισμό αναστολής PFKFB3 και βελτίωση αναστολέα , διερευνήσαμε επίσης την αναστολή της παραγωγής και γλυκόλυσης Fru-2,6-BP σε κύτταρα HeLa με την κατεργασία αναστολέα PFKFB3. Οι αναστολείς PFKFB3 νέα, N4A και YN1 μείωσε τα επίπεδα Fru-2,6-BP και γλυκολυτικής ροής, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και μαζικό θάνατο των κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά δεν παρέχουν μόνο αποδεικτικό στοιχείο που επικυρώνει τη στόχευση των PFKFB3, αλλά και η πρώτη άμεση δομική κατανόηση των αλληλεπιδράσεων αναστολέα της πρωτεΐνης, για την ίδρυση ενός ιδρύματος για τη δομή με τη βοήθεια βελτιστοποίηση και την ανάπτυξη νέων αναστολέων PFKFB3 όπως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για τον καρκίνο.

αποτελέσματα

Συνολική στρατηγική για τον έλεγχο αναστολέα και βελτίωση

ένα σχηματικό διάγραμμα ροής που περιγράφει τη στρατηγική μας που εγκρίθηκε για την ανακάλυψη και τη βελτίωση των αναστολέων PFKFB3 φαίνεται στο Σχήμα επιλέχθηκαν 1. οι υποψήφιοι για μια ένωση μολύβδου από υπολογιστική διαλογή χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή του PFKFB3 που έχουμε ήδη καθοριστεί στο 2,1 ψήφισμα A [25] χρησιμοποιήθηκε ως μοριακό κόσκινο διαλογής (α). Οι προκύπτουσες hit ενώσεις από αυτό το μοριακό κόσκινο αξιολογήθηκαν με ενζυματική δοκιμασία αναστολής και οι ενώσεις με την υψηλότερη δραστικότητα αναστολής επιλέχθηκαν ως μόρια μολύβδου μετά από εξέταση των ναρκωτικών πιθανότητας (β). Στη συνέχεια, κινητικές ιδιότητες λεπτομερής χαρακτηρίστηκαν (γ) και βιολογικές επιδράσεις επί ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ερευνήθηκαν μετρώντας γλυκολυτικής ροής αναστολή ανάπτυξης και κυτταρικό θάνατο (d). Για να κατανοήσουμε τη μοριακή βάση της αναστολής της PFKFB3, ανάλυση ακτίνων Χ κρυσταλλογραφική δομή του PFKFB3 • σύμπλοκο αναστολέα διεξήχθη (ε). Με βάση τις μοριακές πληροφορίες που αποκτήθηκε από το βήμα (ε), πραγματοποιήσαμε μια αναζήτηση για νέες ενώσεις παράγωγο με βελτιωμένη δραστικότητα, χρησιμοποιώντας την ένωση μολύβδου ως πρότυπο (στ). Οι προκύπτουσες ενώσεις από αυτήν την αναζήτηση ομοιότητας αξιολογήθηκαν μέσω υπολογιστικών σύνδεσης χρησιμοποιώντας ΡΙθχΧ [26] (α) και η καλύτερη βελτιστοποιημένη ένωση πέρασε μέσα από αυτή τη διαδικασία επιλογής και πάλι. Μέσω επαναληπτική κύκλοι από αυτές τις διαδικασίες, ήμασταν σε θέση να ληφθεί μια ένωση με ανασταλτική δραστικότητα τάξεις μεγέθους πάνω από την αρχική μόλυβδο και το οποίο εμφανίζει ισχυρή αναστολή PFKFB3 in vitro.

Η

Inhibitor Διαλογή και Ιδιότητες πρόσδεσης

Κατά προηγούμενη μελέτη μας, αρκετές ενώσεις ικανές σύνδεσης προς το Fru-6-P τσέπη του PFKFB3 ταυτοποιήθηκαν από εικονικά διαλογής. Για την επιβεβαίωση των ανασταλτικών δραστηριοτήτων και για την εξάλειψη των ψευδώς θετικά από αυτούς υποψήφιων φαρμάκων, η αναστολή PFKFB3 δοκιμάστηκε σε 10 μΜ κάθε μία από τις ενώσεις (Σχήμα 2Α). Για να αποφευχθεί η μη ειδική αναστολή που προκαλείται από τυχαία υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ αναστολέα και πρωτεΐνη, μια ίδια δοκιμή εκτελέσθηκε υπό την παρουσία 0,1% Tween-20. Μεταξύ των δοκιμασμένων ενώσεων, ZINC04887558 (N4A, 5, 6, 7, 8-τετραϋδροξυ-2- (4-υδροξυφαινυλ) χρωμεν-4-όνη) ανέστειλαν δραστικότητα ενζύμου μεγαλύτερη από 65% κάτω από συνθήκες υποστρώματος-κορεσμού και αυτή η αναστολή δεν επηρεάστηκε από την παρουσία του Tween-20. Έχουμε επιλέξει N4A ως αρχική «επικεφαλής» (Εικόνα 2Β). Η επακόλουθη κινητική μελέτη αποκάλυψε ότι N4A αναστέλλει PFKFB3 με IC

50 αξία of2.97 ± 0,16 μΜ (Πίνακας 1). Μια σταθερή κατάσταση Μελέτη αναστολής έδειξε ότι N4A αναστέλλει PFKFB3 ως ανταγωνιστικός αναστολέας ενάντια Φρου-6-Pwith ένα K

i των 1.29 ± 0.26 μΜ, όπως αναμενόταν από εικονικό έλεγχο και όπως αποδεικνύεται σε οικόπεδο Lineweaver-Burk (Σχήμα 2C) .

(Α) δυναμοποιήσεις Αναστολή των υποψηφίων ενώσεων. Τα μεγέθη της αναστολής από τις ενώσεις στα 10 μΜ το καθένα μετρήθηκε μέσω της δοκιμασίας ενζύμου και παρουσιάζονται ως εκατοστημόρια έναντι του ελέγχου (□). Ένα ίδιο πείραμα εκτελέστηκε επίσης με την παρουσία 0,1% Tween-20 (▪), για την εξάλειψη των ψευδώς θετικών που προκαλείται από μη ειδικές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. (Β) Δομές των αναστολέων PFKFB3. (C) Lineweaver-Burk γραφικές παραστάσεις που δείχνουν την ανταγωνιστική αναστολή από N4A κατά Fru-6-P. Οι συγκεντρώσεις αναστολέα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 0 μΜ (▪), 1 μΜ (○), 2 μΜ (▴), και 3 μΜ (□) του N4A. Έχουν επίσης επισημανθεί δίπλα σε μεμονωμένα οικόπεδα. (D) Lineweaver-Burk γραφικές παραστάσεις που δείχνουν την ανταγωνιστική αναστολή από YN1 κατά Fru-6-P. Οι συγκεντρώσεις αναστολέα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 0 μΜ (▪), 1 μΜ (○), 2 μΜ (▴), και 3 μΜ (□) του N4A. (Ε) Η επιλεκτικότητα των N4A και YN1 στις ισομορφές PFKFB. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό αναστολή κατά το διπλάσιο του IC

50 συγκέντρωση κατά PFKFB3 (N4A = 6 μΜ, YN1 = 1,3 μΜ).

Η

Η βελτίωση της αποτελεσματικότητας αναστολής της ένωσης οδηγού, N4A, από τη δομή καθοδηγούμενη βελτιστοποίηση είναι ένας σημαντικός στόχος αυτής της μελέτης. Καθώς οι λεπτομέρειες θα συζητηθούν στις ενότητες που ακολουθούν, μόνο μια σύντομη τελικό αποτέλεσμα εισάγεται εδώ για την πρόωρη συγκρίσεις. Δύο επιπλέον αναστολείς N4A, YN1 (7, 8-διυδροξυ-3- (4-υδροξυφαινυλ) χρωμεν-4-όνη) και YZ9 (7-υδροξυ-2-oxochromene-3-καρβοξυλικό) (Σχήμα 2Β) έχουν ληφθεί χρησιμοποιώντας δομή-καθοδηγούμενη βελτιστοποίησης. Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1, YN1 exhibitsIC

50 = 0.67 μΜ και Κ

i = 0,24 ± 0,03 μΜ, δείχνοντας ένα 5-πλάσια αύξηση της αναστολής. Η ένωση YZ9 δείχνει ακόμη μεγαλύτερη αναστολή-μία τάξη μεγέθους πάνω από το αρχικό μόλυβδο, N4A. Όλες οι ενώσεις που δοκιμάστηκαν είναι διαλυτές σε διάφορα υδατικά διαλύματα μέχρι και 50 μΜ εύρη παρουσία & lt?. 1% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO)

Η ένωση μολύβδου, N4A, και ένα παράγωγο, YN1, ελέγχθηκαν για ανασταλτική δράση τους σε άλλες ισομορφές του ανθρώπινου PFKFB. Οι αναστολείς είχε ισχυρότερη επίδραση στην PFKFB3 από ό, τι σε άλλες ισομορφές PFKFB. Σε δύο φορές το IC

50 για PFKFB3 όπου PFKFB3 ήταν πάνω από 80% αναστέλλεται, N4A εμφανίζει λιγότερο από 50% αναστολή και YN1 δείχνει λιγότερο από 40% αναστολή στο PFKFB1, PFKFB2 και PFKFB4 (Σχήμα 2Ε). N4A και YN1 είναι συγκριτικά εκλεκτικοί αναστολείς της PFKFB3. Βελτίωση της ειδικότητας ισομορφή πρέπει να είναι ο κύριος στόχος της επόμενης βελτιστοποίησης στάδιο και αυτές οι προσπάθειες γίνονται.

Επιπτώσεις της N4A και YN1 στο Fru-2,6-BP επίπεδα, γλυκόλυση, και την ανάπτυξη των κυττάρων

Στη συνέχεια ερευνήσαμε αποτελέσματα της εφαρμογής του N4A και YN1inhibitors να ζήσουν κύτταρα HeLa. Η αναστολή της PFKFB3 αναμένεται να προκαλέσει μείωση των επιπέδων της Fru-2,6-BP σε κύτταρα HeLa. Μετά από μια έκθεση 8 ωρών σε N4A και YN1, Φρου-2,6-BP μειώθηκαν περίπου 20%? μετά από μία έκθεση 48 ωρών, Fru-2,6-BP μειώθηκε πάνω από 40% (Σχήμα 3Α). Κάτω ρύθμιση των επιπέδων Fru-2,6-BP από N4A και YN1 συνοδευόταν από μειωμένη γλυκόλυση, όπως αναμενόταν. Η μείωση της Fru-2,6-BP επίπεδα μετά από έκθεση σε N4A και YN1 οδήγησαν σε μείωση της παραγωγής γαλακτικού οξέος, η οποία αντικατοπτρίζεται από μία μείωση μεγαλύτερη από 30% σε εκκρίσεις γαλακτικό. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν N4A και YN1 αναστέλλουν PFKFB3 αποτέλεσμα την καταστολή της γλυκόλυσης (Σχήμα 3Β).

Τα επίπεδα Fru-2,6-BP (Α) και τα επίπεδα της εκκρινόμενης γαλακτικού (Β) προσδιορίστηκαν ενζυμικά σε χρονικά σημεία 0, 4, 8, 12, 24, ή 48 ώρες μετά από τις θεραπείες αναστολέας των κυττάρων HeLa. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς τις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης δείγματος και εκφράζεται ως αναλογία προς την αξία του οχήματος φάρμακο. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± S.E.M. από τουλάχιστον τρία πειράματα. εξαρτώνται από την ώρα επιδράσεις των 25 μΜ εκάστου των N4A (γραμμή με διαμάντι) και YN1 (διακεκομμένη γραμμή με κοίλο τετράγωνο) σχετικά με τα κυτταρικά επίπεδα Fru-2,6-BP (Α) και των εκκρίσεων γαλακτικό (Β) απεικονίζεται. (Γ) Η αναστολή της ανάπτυξης από N4A, YN1 και YZ9 σε κύτταρα HeLa και T47D. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν πάνω από 36 ώρες με την trypan blue καταμέτρηση ή ΧΤΤ δοκιμασία. Τα σημεία δεδομένα εκφράζονται ως% την κυτταρική ανάπτυξη του ελέγχου που περιείχαν όχημα κατά λογαριθμική κλίμακα συγκεντρώσεων αναστολέα. Σφάλμα μπάρες σταθεί για intraexperimental αναπαράγει τυπική απόκλιση.

Η

Αυξημένα επίπεδα Fru-2,6-BP προηγείται αυξημένη γλυκόλυση συχνά συνοδεύει τον πολλαπλασιασμό των μετασχηματισμένων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων καρκίνου [3]. Εξετάσαμε την επίδραση των αναστολέων PFKFB3, N4A και YN1, σχετικά με το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων κυττάρων αδενοκαρκινώματος. Θεραπείες με 25 μΜ εκάστου των N4A και YN1 προκάλεσε το 70% και πάνω από 90% μειώσεις, αντίστοιχα, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε σύγκριση με μη εκτεθειμένα κύτταρα (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης επιβεβαιώνεται με συνέπεια ότι η αναστολή της PFKFB3 από N4A και YN1 καταστέλλει τον μεταβολισμό κυτταρική ενέργεια και, τελικά, την ανάπτυξη των κυττάρων και ότι YN1 είναι ένας πιο ισχυρός αναστολέας με ΓΕ

50 8,2 ± 0,8 μΜ σε σύγκριση με N4A (GI

50 = 14,2 ± 1,5 μΜ) (Πίνακας 1). N4A και YN1 ήταν επίσης ικανά να αναστέλλουν μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας σε κύτταρα HeLa (Εικόνα 4). κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ με διαφορετικές συγκεντρώσεις N4A ή YN1 και αναπτύχθηκαν για 3 εβδομάδες για να επιτραπεί ο σχηματισμός αποικιών. Αμφότερες οι ενώσεις ανέστειλαν σημαντικά το σχηματισμό αποικιών στους 25, 50 και 100 μΜ. σχηματισμός αποικιών ανεστάλη κατά 64% και 79% με την παρουσία 25 μΜ N4A και YN1, αντίστοιχα.

(Α) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων σε μαλακό άγαρ. Τα κύτταρα HeLa αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ για 21 ημέρες με την παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων N4A και YN1 αντίστοιχα (20 ×). (Β) Στατιστική ανάλυση του πειράματος. Στήλες, σημαίνει (n = 5)? μπαρ, SD.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός που ευθύνεται για την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των αναστολέων PFKFB3, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού θανάτου εκτελέστηκε. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι N4A και YN1 επάγεται τόσο αποπτωτικών και νεκρωτικών κυτταρικό θάνατο. Αυτή η μικτή πρότυπο σχετίζεται με την φύση της απόπτωσης, η οποία, σε αντίθεση με νέκρωση, είναι μια ΑΤΡ-εξαρτώμενη διαδικασία [27], [28]. Κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τους αναστολείς PFKFB3 πρέπει να συσχετίζεται με την ικανότητά τους να καταστρέφουν την κυτταρική ΑΤΡ και η εξάντληση του ΑΤΡ ευνοεί νέκρωση όπως εικάζουν στο παρελθόν [11], [27], [28]. Τα δεδομένα μας στηρίζει αυτό το επιχείρημα: σε μία σχετικά χαμηλή συγκέντρωση (25 μΜ) του N4A ή YN1, ένα περιβάλλον στο οποίο εξάντληση της εξάντλησης κυτταρικής ενέργειας είναι μέτρια, τα κύτταρα βρέθηκαν να είναι επιρρεπείς σε απόπτωση, ενώ, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (50 μΜ) αναστολέων, θάνατο από νέκρωση αυξήθηκε σημαντικά λόγω της ανεπαρκούς κυτταρικής ενέργειας για την υποστήριξη της αποπτωτικής διεργασίας (Σχήμα 5).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις των αναστολέων, 25 μΜ και 50 μΜ. (Α) κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του N4A μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με διπλό Annexin V και ΡΙ. (Β) ποσοτικός προσδιορισμός των δεδομένων κυτταρομετρίας ροής (μέση ± SD) δείχνει μία δοσο-σχετιζόμενη επίδραση του N4A. (C) Cytograms της YN- που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο και (Δ) την ποσοτικοποίηση των δεδομένων κυτταρομετρίας ροής.

Η

Δομή του PFKFB3 • N4A συγκρότημα

Θα ήθελε να χρησιμοποιήσει το N4A αναστολέα ως ένα προβάδισμα για τη δομή καθοδηγούμενη βελτιστοποίηση της περαιτέρω αναστολέων. Για τη διευκόλυνση του έργου αυτού, ήταν απαραίτητο να τον προσδιορισμό των μοριακών χαρακτηριστικών των N4A σύνδεσης προς PFKFB3 με κρυστάλλωση ανθρώπινη PFKFB3 παρουσία N4A. Έχουμε καθορίζεται η δομή του σύνθετου αυτού το ψήφισμα 2.4 Å με μια μέθοδο της μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιώντας την πρώτη δομή PFKFB3 (κωδικός ΠΠ: 2AXN) ως μοντέλο αναζήτησης [29]. Μια