Αφηρημένο

Σκοπός

Η θεραπεία ακτινοβολίας για διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης επιτρέπει για τη συντήρηση των οργάνων, αλλά τοξικότητα και τον τοπικό έλεγχο παραμένουν προβληματικές. Ως εκ τούτου, η βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας απαιτεί ραδιοευαισθητοποίησης των καρκινικών κυττάρων. Ο σκοπός της μελέτης είναι να διερευνηθεί εάν ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR), κατάντη της κινάσης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάση (PI3K) /ΑΚΤ οδού επιβίωσης, μπορεί να είναι ένας στόχος για ευαισθητοποίηση ακτινοβολίας.

Πειραματικός Σχεδιασμός

κλωνογόνος αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση καρκινικές κυτταρικές σειρές 6 ουροδόχου κύστης (UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, KU7, 253J-BV, και 253-JP), προκειμένου να εξετάσει τις επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας ( IR) μόνο και σε συνδυασμό με RAD001, έναν αναστολέα mTOR. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

In vivo

, αθυμικά ποντίκια έλαβαν υποδόρια ένεση με κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως 2. Η απόκριση στη θεραπεία με RAD001 (1,5 mg /kg, ημερησίως), κλασματοποιημένο IR (σύνολο 9 Gy = 3Gy χ 3), και ο συνδυασμός των RAD001 και IR ακολούθησε επί 4 εβδομάδες. Το βάρος του όγκου μετρήθηκε σε πειραματική παράμετρο.

Αποτελέσματα

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας αποκάλυψε ότι σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν κύστη, ένα προσθετικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνο. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι αυτό το αποτέλεσμα οφείλεται στην σύλληψη και στις δύο φάσεις G1 και G2 του κυτταρικού κύκλου όταν οι θεραπείες συνδυάζονται. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι αυτή η σύλληψη ρυθμίζεται κυρίως από τις αλλαγές στα επίπεδα της κυκλίνης D1, ρ27 και ρ21 ακόλουθες επεξεργασίες.

In vivo

, μια σημαντική μείωση του βάρους του όγκου παρατηρήθηκε στη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με είτε μόνη θεραπεία ή τον έλεγχο.

Συμπεράσματα

Η τροποποίηση του κυτταρικού κύκλου μέσω της αναστολής της σηματοδότησης mTOR μονοπάτι σε συνδυασμό με ακτινοβολία έχουν θετικά αποτελέσματα και είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική τροπικότητα για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Nassim R, Mansure JJ, Chevalier S, Cury F, Kassouf W (2013) Συνδυάζοντας mTOR Αναστολή με ακτινοβολία Βελτιώνει την Αντικαρκινική δραστηριότητα σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης

In Vitro

και

In Vivo

: Μια στρατηγική μυθιστόρημα για τη θεραπεία. PLoS ONE 8 (6): e65257. doi: 10.1371 /journal.pone.0065257

Επιμέλεια: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 24 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 17, Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Nassim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτείται με επιχορήγηση από το καναδικό Ινστιτούτο Ερευνών Υγείας (CIHR) MOP επιχορήγηση 89796. Ο Δρ W. Kassouf είναι αποδέκτης μιας κλινικής βραβείο έρευνα λόγιος από το Fonds de recherche du Québec-Santé (FRSQ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το RAD001 αναστολέας mTOR παρασχέθηκε ευγενώς από τον κατασκευαστή του, Novartis. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι μια πολύ διαδεδομένη ασθένεια Βόρεια Αμερική. Το 2012, 55.000 άνδρες και 18.000 γυναίκες διαγνώστηκαν με καρκίνο της ουροδόχου κύστης? 1 στους 5 άνδρες και 1 στις 4 γυναίκες θα πεθάνουν από τη νόσο τους [1]. . Ριζική κυστεκτομή το οποίο αποτελείται από την πλήρη αφαίρεση της ουροδόχου κύστης, παραμένει το «χρυσό πρότυπο» θεραπείας για διηθητική καρκίνο της ουροδόχου κύστης [2]. Η θεραπεία ακτινοβολίας είναι μια ελκυστική εναλλακτική λύση καθώς διατηρεί την ουροδόχο κύστη και επιτρέπει την κανονική του ουροποιητικού και σεξουαλικών λειτουργιών [3]. Ωστόσο, η έλλειψη του τοπικού ελέγχου της νόσου, καθώς και τη σημαντική τοξικότητα που σχετίζεται με θεραπεία ακτινοβολίας παραμένει προβληματική [4] – [6]. Για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα, αρκετές κλινικές δοκιμές για τη διαχείριση όργανο διάσωσης διεξήχθησαν για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα της συνδυασμένης χημειοθεραπείας και ακτινοβολίας [7], [8]. Ωστόσο, παρά τις πολυάριθμες προσπάθειες, μελέτες chemoradiation παραμένουν σχετίζονται με μη βέλτιστη τοπικό έλεγχο της νόσου και να μειώσουν την επιβίωση σε σύγκριση με την ριζική χειρουργική επέμβαση. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια επιτακτική ανάγκη να αυξηθεί ραδιοευαισθητοποίηση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης για την αύξηση της αποτελεσματικότητας μέσω της βελτίωσης τοπικό έλεγχο της νόσου και επιτρέπει την μείωση της δόσης για να μειωθεί η τοξικότητα της θεραπείας με ακτινοβολία.

Ένα μόριο σηματοδότησης που είναι εξαιρετικά ελκυστική και έχει που εκπονήθηκε πρόσφατα πολλή προσοχή για στοχευμένη θεραπεία είναι ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR). Πιο συγκεκριμένα, mTOR είναι μεταγενέστερος σερίνης /θρεονίνης πρωτεΐνης κινάσης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ οδός η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση [9], [10]. Απορρύθμιση της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR δημιουργεί ένα ευνοϊκό περιβάλλον ογκογόνο και έχει τεκμηριωθεί σε μια ποικιλία ανθρώπινων όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [11]. αναστολή mTOR έγινε ένας ενεργός τομέας της έρευνας για την ανάπτυξη και τη δοκιμή μικρά ανασταλτικά μόρια, όπως η ραπαμυκίνη ανάλογα -notably RAD001 (Everolimus, Novartis) και CCI-779 (Torisol, Wyeth) για τη θεραπεία ποικίλων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Πρόσφατα, η κλινική δοκιμή πρώτη επιτυχημένη φάσης ΙΙΙ σε έναν αναστολέα mTOR πραγματοποιήθηκε σε ασθενείς με προχωρημένο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα, που εμφάνισαν κάποια βελτίωση στη συνολική επιβίωση [12]. Εμείς δημοσίευσε πρόσφατα την πρώτη έκθεση καταδεικνύει σημαντική αντικαρκινική δράση

μέσω

αναστέλλοντας mTOR με RAD001 σε μοντέλα καρκίνου της ουροδόχου κύστης

in vitro

και

in vivo

[13]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αξιοσημείωτες διαφορές στην ευαισθησία σε αναστολή mTOR παρατηρήθηκαν μεταξύ εννέα ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές κύστης. Επιπλέον, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ ενεργοποιούνται επίπεδα ΑΚΤ και mTOR με κυτταρικές επιθετικά χαρακτηριστικά. Ωστόσο, αυτό δεν ήταν η περίπτωση για τον ενεργοποιημένο S6 των οποίων τα επίπεδα εμφανίστηκε υψηλότερη σε RAD001 ευαίσθητα σε σύγκριση με σχετικά ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Ενδιαφέρον, μερικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η αναστολή του mTOR μπορεί να ευαισθητοποιήσει όγκους του προστάτη, του μαστού, του εγκεφάλου και σε ιοντίζουσα ακτινοβολία [14] – [16]. Επειδή η ακτινοβολία δείχθηκε να ενεργοποιεί το μονοπάτι ΡΙ3Κ /Akt επιβίωση /ανάπτυξη η οποία μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη διαφυγή του κυτταρικού θανάτου και ραδιοαντοχή [17], [18], η ταυτόχρονη αναστολή mTOR μπορεί δυνητικά να ξεπεράσει την αντίσταση στην ακτινοβολία στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Να δώσει συνέχεια σε αυτή την υπόθεση, η παρούσα μελέτη εξέτασε τις επιδράσεις του συνδυασμού RAD001 και ιονίζουσας ακτινοβολίας,

in vitro

και

in vivo

, στην επιβίωση των κυττάρων και την ανάπτυξη σε μια σειρά από καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυττάρων γραμμές. Επιπλέον, προσπαθήσαμε να ρίξει φως στο μηχανισμό με τον οποίο αυτός ο συνδυασμός θεραπειών μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ηθικά πρότυπα που συνδέονται με την η χρήση του μοντέλου ξενομοσχεύματος ζώων μας ήταν πλήρως ακολουθούνται και τηρούνται. Διευκόλυνση του Πανεπιστημίου Κέντρο Υγείας McGill Επιτροπή Φροντίδας Ζώων εγκεκριμένα πρωτόκολλα των ζώων μας (πρωτόκολλο # 5428) πριν από την έναρξη της μελέτης. Επιπλέον, τα ζώα διατηρήθηκαν και διατηρούνται σε state-of-the-art εγκαταστάσεις που ακολουθούν τις αυστηρές διαδικασίες για τη διεξαγωγή έρευνας σε ζώα, η οποία περιλαμβάνει τη συνεχή παρακολούθηση και επιθεώρηση των ζώων και των χρηστών.

καλλιέργειας κυττάρων

το UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, και KU7 κυτταρικές σειρές χαρακτηρίζονται και παρέχονται από το δείγμα πυρήνα του ουροποιογεννητικού εξειδικευμένα προγράμματα της ερευνητικής αριστείας στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε MD Anderson Cancer Center [19]. Το 253-JP και 253J-BV ευγενικά από τον Dr Colin Ρ.Ν. Dinney από M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas [20]. Οι κυτταρικές γραμμές ήταν ρουτίνας καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστήρα, διατηρήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (ΕΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Wisent, Saint-Jean-Baptiste QC) και περάστηκαν όταν φτάνει το 80% συρροή. Το RAD001 αναστολέας mTOR παρασχέθηκε ευγενώς από τον κατασκευαστή του, Novartis.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 6-φρεατίων σε πυκνότητα 200 κύτταρα ανά φρεάτιο και διατηρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης . Μόλις συνδεθεί, αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RAD001 σε δόσεις ισοδύναμες προς την GI50 για κάθε κυτταρική γραμμή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]: UM-UC3 (75 ηΜ), KU7 (50 ηΜ), 253J-BV (8 ηΜ), 253- JP (8 ηΜ), UM-UC5 (0,5 ηΜ) και UM-UC6 (0,5 ηΜ) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστή για 12 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από κατεργασία ακτινοβολίας σε διαφορετικές δοσολογίες, με και χωρίς RAD001. Οι έλεγχοι περιελάμβαναν μη επεξεργασμένα κύτταρα μαζί με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με κάθε ένα από ακτινοβολία και θεραπείας RAD001 μόνο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν περαιτέρω σε 37 ° C και αφέθηκε να σχηματίσουν αποικίες για 10-14 ημέρες. Μια προσέγγιση αποκοπής των 50 βιώσιμα κύτταρα /αποικία επιλέχθηκε. Τα κύτταρα πλύθηκαν με φωσφορικό ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα (PBS) και σταθεροποιήθηκαν για 15 λεπτά χρησιμοποιώντας 3.7% φορμαλδεΰδη σε PBS. Μετά από μία δεύτερη πλύση με PBS, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.4% β /ο σε PBS? Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) και αφέθηκαν να στεγνώσουν στον αέρα πριν από την καταμέτρηση των αποικιών. Κάθε θεραπεία αποτελούνταν από διπλά πηγάδια μιας πλάκας 6-φρεατίων και το πείραμα διεξήχθη δύο φορές. Το κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε ως (ο μέσος αριθμός αποικιών στο τέλος του πειράματος) /(κύτταρα εμβολιάστηκαν στην αρχή) × (επιμετάλλωση απόδοσης). Η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση ορίστηκε ως (μέση μέτρηση αποικιών) /(κύτταρα επιστρώνονται σε μη ακτινοβολούμενη ελέγχου). Οι μη ακτινοβολημένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας και αφήνονται να προσκολληθούν. RAD001 προστέθηκε στα κατάλληλα δείγματα 12 ώρες πριν από την ακτινοβολία σε μια δόση ισοδύναμη με την GI50 από κάθε κυτταρική σειρά. Αυτό ακολουθήθηκε από μία δόση 4Gy ιονίζουσας ακτινοβολίας (με βάση την προηγουμένως προσδιορισθείσα πειράματα ευαισθησία) και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν περαιτέρω για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν μία φορά με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 100% ψυχρή αιθανόλη για 60 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (50 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) σε PBS, συμπληρωμένο με RNase (100 g /ml? Invitrogen, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε φθορισμό -ενεργοποιημένου διαλογή κυττάρων σωλήνες (FACS) και επωάζονται στο σκοτάδι για 30 λεπτά στους 40 ° C για να επιτραπεί πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου στον πυρήνα. πρόσληψη ΡΙ στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρομετρητή Coulter ροής (BD Biosciences, Franklin, NJ).

κηλίδας Western

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και αντιμετωπίζονται σύμφωνα με το σχήμα που περιγράφεται παραπάνω (RAD001, ιονίζουσα ακτινοβολία, και τα δύο σε συνδυασμό), με μη κατεργασμένα κύτταρα εξυπηρετούν ως έλεγχοι. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα αποξέστηκαν σε πάγο και επαναιωρήθηκαν επί 30 λεπτά στους 4 ° C σε ψυχρό ρυθμιστικό RIPA (λύση) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ). εναιωρήματα κυττάρων στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για να συλλέξει σαφής λύματα στο υπερκείμενο. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη δοκιμασία δικινχονινικού οξέος (BCA) (Pierce Scientific-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Δείγματα πρωτεΐνης (40 μg-60 μ§) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Οι πρωτεΐνες σε πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες, αποκλείστηκαν με 5% γάλα χωρίς λιπαρά και /ή διάλυμα αλβουμίνης βόειου ορού 5%, και ανοσο-κηλιδώθηκαν με τα ακόλουθα μονοκλωνικά πρωτογενή αντισώματα (όλα κουνέλι): φωσφο-ΑΚΤ, ολική Akt, φωσφο S6, σύνολο S6, ρ21, p27kip1, και η κυκλίνη D1 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) σε συγκεντρώσεις που συνιστώνται από τον κατασκευαστή. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού και ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ECL (Amersham-GE Healthcare, Piscataway, NJ) χρησιμοποιήθηκε για να αποκαλύψει ζώνες πρωτεΐνης των συμφερόντων σε φιλμ ακτίνων Χ. Τα φιλμ σαρώθηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν έναντι ακτίνης (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), ένας έλεγχος 42 kDa πρωτεΐνη οικοκυρική παρούσα σε όλα τα δείγματα και υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης μας.

In vivo-Ξενομοσχεύματος μοντέλο

Όλες οι εγκρίσεις πρωτόκολλο ελήφθησαν πριν από την έναρξη της μελέτης από την Επιτροπή Φροντίδας ζώων του Κέντρου Υγείας του Πανεπιστημίου McGill. Θηλυκοί αθυμικοί ποντικοί (στέλεχος Νυ /Νυ, ηλικίας 4-6 εβδομάδων? Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για το μοντέλο μας ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, οι ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με KU7 (10

6 κύτταρα ανά ένεση). Ένα άλλο πείραμα με την ίδια μεθοδολογία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως 253J-BV. Για να διευκολυνθεί η προσκόλληση, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ Matrigel (BD Biosciences, Franklin, NJ) πριν από την ένεση. Οι όγκοι αφέθηκαν να εμφυτευτούν και να αναπτυχθούν επί μία εβδομάδα πριν την τυχαιοποίηση σε 4 ομάδες που αντιστοιχούν στις διάφορες σκέλη θεραπείας, με κάθε ομάδα αποτελούμενη από 14 ποντικούς. Η ομάδα 1

st υπέστη επεξεργασία με ένα εικονικό φάρμακο (5% διάλυμα γλυκόζης σε νερό). Το 2

nd ομάδα έλαβε από του στόματος RAD001 (μικρογαλάκτωμα αραιωμένο σε διάλυμα γλυκόζης 5%) σε μία δόση 1,5 mg /kg ημερησίως. Στο 3

ομάδα rd, οι όγκοι εξετέθησαν σε ιονίζουσα ακτινοβολία σε ένα κλασματοποιημένο δοσολογία συνολικού ύψους 9 Gy (3 χ 3Gy) κάθε δεύτερη ημέρα κατά την πρώτη εβδομάδα της θεραπείας. Στο 4

ου ομάδα, ποντικοί έλαβαν RAD001 κατά την προαναφερθείσα δοσολογία 1 ημέρα πριν την έναρξη της θεραπείας ακτινοβολίας όγκου. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν για 4 εβδομάδες από την έναρξη της θεραπείας. Το σωματικό βάρος και η συμπεριφορά των ζώων παρακολουθούνταν σε όλο το πείραμα. Οι όγκοι μετρήθηκαν (μήκος και πλάτος) δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα παχυμέτρου, προκειμένου να υπολογίσει τον όγκο (V = [(μήκος Χ πλάτος

2) × (π /6)], όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε CO

2 θάλαμος στο τέλος της θεραπείας. οι όγκοι συλλέχθηκαν, αμέσως ζυγίζεται και διατηρούμενες σταθερές ή κατεψυγμένα για μελλοντικές μελέτες.

Ανοσοϊστοχημεία

τομές όγκου ελήφθησαν από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με το εικονικό φάρμακο, ακτινοβολία, RAD001 και το σχήμα συνδυασμού. τα τμήματα παραφίνης ενσωματωμένα όγκοι τοποθετημένα σε γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα για χρώση. Μετά απο-παραφινοποίησης και ενυδάτωση, ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε σε θέρμανση των δειγμάτων με 5% κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 7.0). Οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με ένα ειδικό αντίσωμα ρ21 (1:25 αραίωση). HRP-συζευγμένο κατσίκας πολυκλωνικό αντι-κουνελιού IgG δευτερεύον αντίσωμα προστέθηκε και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. 3,3′-διαμινοβενζιδίνη ( DAB) υπόστρωμα (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη χρώματος σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διαφάνειες έχουν δει κάτω από ένα Leica Diaplan ανεστραμμένο μικροσκόπιο εξοπλισμένο με μια Leica DFC300FX κάμερα (Leica, Wetzlar, Γερμανία). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μια σουίτα Leica Application. Η ανάλυση βασίστηκε σε ένα μέσο όρο 5 εστίες, σε μεγέθυνση 40 φορές, δείχνοντας βιώσιμα κύτταρα, και υπολογιστικής H-score ήταν υπολογίζονται αθροίζοντας τα προϊόντα του ποσοστού κυττάρων βάφονται σε ένταση δεδομένη χρώση (0-100) και την ένταση της χρώσης (0 για αρνητική χρώση, 1 για χαμηλή και 2 για την υψηλή χρώση).

T-test στατιστική ανάλυση

του Student (μη ζευγαρωμένα, two-tailed) χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Σημαντικότητας ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η σχετική ευαισθησία ενός πάνελ των κυτταρικών σειρών καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε RAD001 και ιονίζουσα ακτινοβολία

Εμείς απέδειξε πρόσφατα ότι μια ομάδα εννέα καρκινικές κυτταρικές σειρές ουροδόχου κύστης επιδεικνύει σχετικές διαφορές στην ευαισθησία RAD001 τους και, κατά συνέπεια, η θεραπεία RAD001 οδήγησε σε σχετικές διαφορές στις αναστολή mTOR και διακοπή αύξησης, όπως παρακολουθήθηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Με αυτά τα δεδομένα, ήμασταν σε θέση να διαιρέσει γραμμές κυττάρων μας σε 3 ομάδες με βάση την ευαισθησία τους RAD001 [13] ως εξής: σχετικώς ανθεκτικά (UM-UC3, UM-UC13, KU7 (GI50≥50 nmol /L)), μετρίως ευαίσθητος (253J-P, 253J-BV, RT4 (GI50 & lt? 50 nmol /L)). και, τέλος, εξαιρετικά ευαίσθητη (UM-UC1, UM-UC5, UM-UC6 (GI50≤0.5 nmol /L) στη μελέτη αυτή εξετάζει το επιδράσεις των συνδυασμένων θεραπειών (RAD001 και ακτινοβολία), κλωνογόνο δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των έξι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν σύμφωνα με τη σχετική ευαισθησίες τους σε IR σε διάφορες δόσεις ακτινοβολίας (Εικ. 1Α). Με βάση αυτές τις σχετικές ευαισθησίες σε ακτινοβολία, κυτταρικές γραμμές ήταν χωρίζονται σε τρεις ομάδες, ανθεκτικά, μετρίως ανθεκτικά και ευαίσθητα. η ανθεκτική ομάδα περιλαμβάνει UM-UC5 με το υψηλότερο κλάσμα επιβίωσης, η μέτρια ανθεκτικό περιλαμβάνονται UM-UC13, KU7, UM-UC3, UM-UC6 ενώ 253J-BV είχε ένα χαμηλότερο επιζών κλάσμα και ως εκ τούτου ορίζεται ως μια ευαίσθητη στην ακτινοβολία κυτταρική γραμμή. Συγκρίναμε την απόκριση αυτών των έξι κυτταρικών γραμμών σε κάθε ένα από RAD001 και ιονίζουσας ακτινοβολίας. Με βάση τα στοιχεία στην Εικόνα 1Β και τον Πίνακα 1, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας στην RAD001 και την ευαισθησία στην ιονίζουσα ακτινοβολία.

Plated κύτταρα εκτέθηκαν σε ιονίζουσα ακτινοβολία για τη μέτρηση των επιπτώσεων στην ανάπτυξη από κλωνογονική δοκιμασία, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Α) Με βάση τα αποτελέσματα που συγκεντρώθηκαν, ήμασταν σε θέση να χαρακτηρίσει αυτές τις κυτταρικές σειρές, όπως ευαίσθητο στην ακτινοβολία, μετρίως ευαίσθητα και -Σχετικά ανθεκτικά. (Β) Το RAD001 IC50 ήταν συναρτήσει της κλίσης της καμπύλης για κάθε κυτταρική σειρά στην κλωνογονική δοκιμασία, όταν αντιμετωπίζονται με IR.

Η

ιονίζουσα ακτινοβολία ενεργοποιεί ΑΚΤ ενώ RAD001 αναστέλλει τη φωσφορυλίωση S6

έχει αναφερθεί ότι ιονίζουσα ακτινοβολία ενεργοποιεί ΑΚΤ στο κλάσμα επιζών κυττάρου [17], [21]. Καθώς αυτό μπορεί να σχετίζεται με την αντίσταση στη θεραπεία, διαφυγή κυτταρικό θάνατο και επιβίωση, επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν η έκθεση στην ακτινοβολία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα θα οδηγήσει σε ενεργοποίηση ΑΚΤ. Για το σκοπό αυτό, μία σχετικά ανθεκτική κυτταρική γραμμή, KU7, εκτέθηκε σε ιονίζουσα ακτινοβολία πάροδο του χρόνου (0 έως 60 λεπτά) και λύθηκαν για την ανάλυση ρΑΚΤ με άμεση κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα ΑΚΤ φωσφο-ειδικά κατευθύνονται έναντι του θέση φωσφορυλίωσης S473. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2Α δείχνουν ότι πράγματι ΑΚΤ ταχέως ενεργοποιούνται μετά από 15 λεπτά από τη ραδιοθεραπεία και αυτή η ενεργοποίηση συνεχίστηκε σε 30 και 60 λεπτά. έτσι Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι KU7 υποβληθούν σε ενεργοποίηση της οδού επιβίωσης προ-ογκογόνο μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία. Σε όλα τα πειράματα, τα επίπεδα του pAkt αυξήθηκε μετά την κατεργασία με ιοντίζουσα ακτινοβολία σε ένα μέγιστο και στη συνέχεια μειώθηκαν. Ομοίως, τα κύτταρα KU7 είναι επίσης σχετικά RAD001 ανθεκτικά, που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RAD001 να διαπιστωθεί ότι ο στόχος της mTOR ανεστάλη. Για το σκοπό αυτό, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης S6 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για υπολείμματα σερίνης 240/244 στην πρωτεΐνη S6. Όπως ήταν αναμενόμενο, RAD001 ήταν ισχυρός σε μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης στην κατάντη μόριο σηματοδότησης mTOR και στόχος S6, όπως φαίνεται στα 30 λεπτά μετά την αγωγή (σχ. 2Β) και αυτή η αναστολή διατηρείται στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με άλλα κύτταρα σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (253J-BV, UM-UC3 και UM-UC6) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ακτινοβολία και RAD001 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία KU7 με 4 Gy της ιονίζουσας ακτινοβολίας. Τα κύτταρα λύθηκαν 15, 30 και 60 λεπτά μετά την αγωγή για την ανάλυση της ενεργοποίησης ΑΚΤ (ΑΚΤ-p? Ανώτερη σειρά) με κηλίδα Western. Τα συνολικά επίπεδα ΑΚΤ εμφανίζονται στην κάτω σειρά. κύτταρα (Β) KU7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 Gy ακτινοβολίας, 100 ηΜ RAD001 ή και τα δύο, και λύθηκαν. Επίπεδα φωσφορυλίωσης Akt και S6 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Τα συνολικά επίπεδα της Akt και έκφραση S6 απεικονίζεται. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν 253J-BV, UM-UC3 και UM-UC6 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ακτινοβολία και RAD001 μόνο και σε συνδυασμό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Συνδυάζοντας RAD001 με ιοντίζουσα ακτινοβολία μειώνει σημαντικά αποικία σχηματισμό

για να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις επιπτώσεις του συνδυασμού RAD001 με ιοντίζουσα ακτινοβολία για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές, παρακολουθήσαμε το κλάσμα των κυττάρων που επιβιώνουν την πάροδο του χρόνου, χρησιμοποιώντας κλωνογενείς δοκιμασίες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα επιστρώθηκαν παρακολουθήθηκαν συναρτήσει του χρόνου και ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε. Η δόση RAD001 διατηρήθηκε στο GI50 για κάθε κυτταρική σειρά, ενώ η δόση ακτινοβολίας μεταβλήθηκε. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (253J-BV, UM-UC6, KU7, UM-UC3, UM-UC13, και UM-UC5), παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση στον αριθμό των αποικιών για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με είτε ιονίζουσα ακτινοβολία μόνα τους, ή το μη επεξεργασμένο έλεγχο (Εικ. 3). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ αυτή η μείωση στο κλάσμα επιβίωσης παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, η πιο δραματική σχετική μείωση όταν και οι δύο αγωγές συνδυάστηκαν παρατηρήθηκε με δύο πιο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές να RAD001 (UM-UC5 και UM-UC6). Σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ένα πρόσθετο αποτέλεσμα επί της ανάπτυξης κατά το συνδυασμό RAD001 με ιονίζουσα ακτινοβολία. Αξίζει να σημειωθεί ότι ένα χαμηλότερο αναστολή του σχηματισμού του κόλου παρατηρήθηκε σε δύο κυτταρικές σειρές (UM-UC5 και UM-UC6) τα οποία χαρακτηρίστηκαν αρχικά από το εργαστήριο μας για να είναι η πιο ευαίσθητη σε RAD001. Αυτό έγκειται κυρίως στο ίδιο το colonogenic δοκιμασία όπου κολικής σχηματισμός (όπως προσδιορίζεται με μια καθολικά ρυθμίσετε το μέγεθος της αποικίας), ενώ η ευαισθησία σε RAD001 έγινε με μία ενζυματική δοκιμασία (ΜΤΤ). Αυτή η διαφορά σε ευαισθησίες των δοκιμασιών, η διάρκεια της δοκιμασίας, σε συνδυασμό με το γρήγορο χρόνο διπλασιασμού, θα μπορούσε να εξηγήσει τα αποτελέσματα κλωνογόνων για αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές.

Έξι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RAD001 για 12 ώρες πριν από την έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία και αναπτύχθηκαν περαιτέρω όπως υποδεικνύεται στις μεθόδους. σχηματισμός αποικιών μετρήθηκε μετά από στερέωση των κυττάρων και χρώση με κρυσταλλικό ιώδες, 10-14 ημέρες μετά τη θεραπεία, ανάλογα με κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα ήταν στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,05). Στη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνη της σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές

Η

Η θεραπεία με RAD001 και η ιοντίζουσα ακτινοβολία επάγει τόσο την αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε ο οι φάσεις G2 του κυτταρικού κύκλου

για να λάβετε πληροφορίες στο μηχανισμό βασίζεται η παρατηρούμενη αναστολή της ανάπτυξης G0 /G1 και, ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής για να μελετηθεί η κατανομή των κυττάρων κατά τις διάφορες φάσεις της κυτταρικό κύκλο 48 ώρες μετά από κάθε θεραπεία μόνο και σε συνδυασμό. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία δόση ισοδύναμη με RAD001 GI50 τους (που κυμαίνεται από 0.5 έως 75 nmol /L), καθώς και 4Gy της ιονίζουσας ακτινοβολίας. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4. RAD001 προκάλεσε μια σύλληψη G0 /G1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης που δοκιμάστηκαν: KU7 62% ± 4%, UM-UC3 71% ± 6%, UM-UC6 77% ± 3% και 253J- BV 67% ± 4% σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες τους, 54% ± 3%, 64% ± 2%, 66% ± 2% και 55% ± 3%, αντίστοιχα. Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν την αναλογία των κυττάρων σε κάθε φάση σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ιοντίζουσα ακτινοβολία οδήγησε κυρίως στην σύλληψη G2, που απεικονίζεται από τη σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε αυτήν την φάση μετά από θεραπεία με ιοντίζουσα ακτινοβολία: KU7 38% ± 4%, UM-UC3 23% ± 4%, UM-UC6 19% ± 4% και 253J-BV 22% ± 3% σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη κατεργασμένους μάρτυρες τους: 23% ± 2%, 19% ± 3%, 14% ± 3% και 4% ± 2%, αντίστοιχα. Στη συνδυασμένη βραχίονας με RAD001 και ιονίζουσα ακτινοβολία, παρατηρήσαμε τόσο μια αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε φάσεις G0 /G1 και G2 (Εικ. 4). Πιο συγκεκριμένα, μια μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στην S-φάση παρατηρήθηκε σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνη της ή με τον έλεγχο (χωρίς επεξεργασία) και αυτό παραλληλίζεται με μία αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στο G0 /G1 και το G2 φάσεις. Στο σύνολό τους, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η κυτταροστατική δράση του RAD001 σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία εμφανίζει μια ανασταλτική αθροιστική επίδραση στην εξέλιξη των κυττάρων μέσω του κύκλου τους.

Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν και έλαβαν μόνο RAD001, ιονίζουσα ακτινοβολία μόνα τους και με τον συνδυασμό του RAD001 και ακτινοβολίας. Για την τελευταία σειρά, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή με RAD001 για 6 ώρες πριν από την ακτινοβολία. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου σε 48 ώρες μετά τη θεραπεία, και, στη συνέχεια, οι μετρήσεις έγιναν με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυτταρικών πληθυσμών στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου εμφανίζεται για κάθε κυτταρική σειρά από χρωματιστές μπάρες (G0 /G1: Πορτοκαλί /Μπλε? S: Κόκκινο και G2: Κίτρινο)

Η

RAD001. και ιονίζουσα ακτινοβολία μεταβάλλει τα επίπεδα της σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου κυκλίνη D1, ρ21 p27kip1 και

με βάση τα παραπάνω δεδομένα ανάλυσης κυτταρικού κύκλου και για την περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίο RAD001 και ιονίζουσα ακτινοβολία πράξη μαζί για να αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη, ελέγξαμε την πιθανότητα αλλαγών στα επίπεδα έκφρασης των διαφόρων ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, ιδιαίτερα που σχετίζονται με τα σημεία ελέγχου όπως κυκλίνη D1, ρ27, και ρ21. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5 απεικονίζουν την περίπτωση KU7, που χρησιμοποιείται ως εκπρόσωπος της ομάδας των κυτταρικών σειρών βρέθηκε να είναι σχετικά ανθεκτική τόσο ιονίζουσα ακτινοβολία και RAD001. Τούτου λεχθέντος, η δόση των RAD001 ισοδύναμο με το GI50 της κυτταρικής σειράς χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ανταπόκριση στη θεραπεία RAD001. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το επίπεδο της κυκλίνης D1, η οποία είναι μια πρωτεΐνη που απαιτείται για την G1 /μετάβαση S μέσω του κυτταρικού κύκλου, μειώθηκε μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με RAD001 (Εικ. 5), ένα εύρημα που υποστηρίζει τις παρατηρήσεις μας επί του κυτταρικού κύκλου αλλαγές. Σε αντίθεση, τα επίπεδα του ρ27, η οποία είναι μια πρωτεΐνη επίσης συνδέεται με την G1 /S μετάβαση, άλλαξε σε μια αντίστροφη συσχέτιση (αυξημένη) μετά 24 ώρες θεραπείας με RAD001, ιονίζουσα ακτινοβολία, και η συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με τον μάρτυρα (Σχ. 5). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα του ρ21, η οποία συνδέεται επίσης με την αναστολή της εξελίξεως του κυτταρικού κύκλου, μειώθηκαν σε κύτταρα που κατεργάζονται με RAD001 μόνη σύγκριση με τον έλεγχο, είτε με ακτινοβολία (Εικ. 5). Τα επίπεδα του ρ21 αυξήθηκε σε απόκριση στη θεραπεία σε ακτινοβολία σε σύγκριση με τον έλεγχο, και τα επίπεδα ρ21 είναι στο υψηλότερο σημείο τους όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με αμφότερα RAD001 και ιονίζουσας ακτινοβολίας. Αξίζει να σημειωθεί ότι ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα για κυκλίνη D1, ρ27, και ρ21, σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές:. UM-UC3, UM-UC6 και 253J-BV

καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RAD001, ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) ή η συνδυασμένη θεραπεία. Αυτά λύθηκαν 24 ώρες μετά την κατεργασία όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ανάλυση κηλίδας Western για Κυκλίνη D1, p27kip1 και ρ21 σε κύτταρα KU7 και κανονικοποιούνται σε χαμηλότερες πάνελ ως συνάρτηση του επιπέδου της ακτίνης μετρήθηκαν παράλληλα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν, UM-UC3, UM-UC6 και 253J-BV (δεν φαίνεται).

Η

Συνδυάζοντας θεραπεία RAD001 με ιοντίζουσα ακτινοβολία αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ανθρώπινο κύστη ξενομοσχεύματος καρκίνου του μοντέλο, σε σύγκριση με είτε θεραπεία μόνο

για να εξακριβωθεί η σημασία και να επαληθεύσει εάν

in vitro

μπορούν να μεταφερθούν τα δεδομένα σε σχέση με τις επιδράσεις του συνδυασμού RAD001 και της ιοντίζουσας ακτινοβολίας στην ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου της ουροδόχου κύστης

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε το καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική γραμμή KU7 να αυξάνεται καθώς υποδόρια ξενομοσχεύματα όγκου σε αθυμικούς ποντικούς. Σε όλους τους ποντικούς, οι όγκοι αποδεικνύεται εντός των πρώτων 10 ημερών μετά την εμφύτευση. Δεν υπήρξε καμία απώλεια σωματικού βάρους ή οποιαδήποτε σημαντική τοξικότητα σχετίζονται άμεσα με RAD001 και ιονίζουσα ακτινοβολία θεραπείες καθ ‘όλη τη διάρκεια της μελέτης (συνολικά 5 εβδομάδες). Σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με συνδυασμένη RAD001 και ιονίζουσα ακτινοβολία, υπήρξε μια μέγιστη ανασταλτική επίδραση στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, όπως υποδεικνύεται από την σημαντική μείωση στο βάρος του όγκου σε σύγκριση με είτε μόνη θεραπεία ή την ομάδα του εικονικού φαρμάκου (κατά βάρος μέσο όγκο 31 mg για συνδυασμό βραχίονα έναντι 117 mg μόνο με RAD001, 80 mg με IR, ή 340 mg για το εικονικό φάρμακο, η P & lt? 0,05) (Σχήμα 6).. Παρόμοια ευρήματα ελήφθησαν επίσης με τη χρήση των κυτταρικών σειρών 253J-BV όπου συνδυασμένη θεραπεία επιτυγχάνεται μέγιστη ανασταλτική επίδραση στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας σε σύγκριση με τον έλεγχο. Τα ίδια αποτελέσματα καταδειχθεί χρησιμοποιώντας κινητική ανάπτυξης του όγκου όταν ο όγκος του όγκου μετρήθηκε καθ ‘όλη τη διάρκεια της θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μας χρώση p21 ανοσοϊστοχημεία σε τμήματα ξενομοσχεύματος επιβεβαίωσε τα ευρήματά μας από την ανάλυση της Western Blot για ρ21 επίπεδα

in vitro

(Εικ. 7). Τα επίπεδα του ρ21 σημαντικά (ρ & lt? 0,05) αυξήθηκε μετά την αγωγή με ακτινοβολία και σχήμα συνδυασμού σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο. Επιπλέον τα δεδομένα μας έδειξε μια ελαφρά μείωση, αν και στατιστικά μη σημαντική, των επιπέδων ρ21 στο RAD001 αγωγή ομάδα και μόνο. ​​

Το αθυμικούς ποντικούς μοντέλο όγκου της ουροδόχου κύστης του KU7 χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα βάρη του όγκου (σε γραμμάρια) που επετεύχθη κατά την πειραματική τελικό σημείο και εκφράζεται ως μέσο βάρος των όγκων συλλέχθηκαν για κάθε ομάδα ποντικών στους βραχίονες θεραπείας 4, όπως υποδεικνύεται. Παρόμοια ευρήματα που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας κύτταρα 253J-BV (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

(Α) Η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των επιπέδων των ρ21 σε ιστούς παραφίνης ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης ποντικού θεραπεία με εικονικό φάρμακο, IR, RAD001 και σε συνδυασμό. (Β) Ποσοτικοποίηση των δεδομένων ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του p21, όπως παρατηρείται σε όγκους υποστεί επεξεργασία με ιοντίζουσα ακτινοβολία και σε συνδυασμό σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο και RAD001.

Η

Συζήτηση

η θεραπεία ακτινοβολίας είναι ένα βασικό στοιχείο της πολλά σχήματα θεραπείας του καρκίνου, ως εκ τούτου η ευρεία χρήση του. Ωστόσο, ιονίζουσα ακτινοβολία φαίνεται να συμβάλλουν σε μια αρνητική αύξηση στη σηματοδότηση μέσω της ΑΚΤ mTOR μονοπάτι προ-επιβίωσης PI3K //. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε διαφορές στην ευαισθησία ενός πάνελ κυτταρικών γραμμών έξι κύστη σε ιονίζουσα ακτινοβολία, με κάποια να είναι ήταν πιο ανθεκτικά από άλλα. Δείξαμε επίσης την ενεργοποίηση της ΑΚΤ μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία. Αρκετοί παράγοντες μπορεί ενδεχομένως να είναι καθοριστικός παράγοντας στους μηχανισμούς ενεργοποίησης του μονοπατιού PI3K /AKT μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία και στη συνέχεια να βοηθήσει τα καρκινικά κύτταρα για τη δημιουργία της αντίστασης [22]. Μεταξύ άλλων, η αυξημένη δραστικότητα των βασικών ενζύμων όπως τη δράση της τελομεράσης [23], καθώς και την εμπλοκή των μορίων σηματοδότησης όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και RAS [24], [25] μπορεί να εξηγήσει γιατί μερικοί όγκοι δεν ανταποκρίνονται σε ακτινοβολία τόσο αποτελεσματικά όσο άλλες. Αξιοσημείωτα, EGFR σηματοδότηση μέσω του PI3K /ΑΚΤ αναφέρθηκε για τη ρύθμιση των καταλυτικές υπομονάδες κινάσης πρωτεΐνης DNA-εξαρτώμενη, τα οποία αποτελούν μέρος του μηχανήματος επιδιόρθωσης DNA ενεργοποιημένη εξής ακτινοβολία [26]. Αν και αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν τον σημαντικό ρόλο που η ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ παίζει στο ραδιοαντοχή καρκίνου, αποδεικνύουμε ότι η παρεμπόδιση της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR με RAD001 εμφανίζεται ως ένα πολύτιμο μέσο για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας ακτινοβολίας σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Ο μηχανισμός με τον οποίο RAD001 εκθέματα αυτό το ενισχυμένο αποτέλεσμα εξακολουθεί να χρειάζεται περαιτέρω αξιολόγηση. Θα μπορούσε απλώς να είναι ότι εμποδίζουν την ενεργοποίηση της ανάκρουσης του μονοπατιού εξής ακτινοβολίας είναι αρκετές για να μειώνεται ραδιοαντοχή? ένας εύλογος μηχανισμός, καθώς οι δύο θεραπείες μοιράζονται κοινούς στόχους στο κύτταρο, όπως η υποξία διεγέρσιμο παράγοντα μεταγραφής (HIF-1), ένα μόριο κατάντη του mTOR [27].

Εκτός από την κυτταρική σηματοδότηση, την αποτελεσματικότητα