Αφηρημένο

Η υποξία είναι μια σημαντική περιβαλλοντική αλλαγή σε πολλούς καρκίνους. Υποξική κόγχες μπορεί να καταληφθεί από τον καρκίνο του στελέχους /προγονικά κύτταρα που μοιάζουν με τα οποία σχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου και αντίσταση στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Ωστόσο, δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως το πώς επηρεάζει η υποξία τα βλαστικά-όπως ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Στην έκθεση αυτή, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της υποξίας σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, PC-3 και DU145. Σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (20% O

2), 7% O

2 επάγεται υψηλότερες εκφράσεις του HIF-1α και HIF-2α, οι οποίες συνδέονται με την ρύθμιση προς τα πάνω του Oct3 /4 και Nanog? 1% O

2 επάγεται ακόμη μεγαλύτερα επίπεδα αυτών των παραγόντων. Η ρυθμισμένη προς τα πάνω

Nanog

έκφραση mRNA σε υποξία επιβεβαιώθηκε να είναι κατά κύριο λόγο retrogene

NANOGP8

. Παρόμοια ποσοστά ανάπτυξης παρατηρήθηκαν για τα κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από υποξικές και νορμοξικές συνθήκες για 48 ώρες? Ωστόσο, η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας αποκάλυψε ότι 48 ώρες υποξικών προεπεξεργασίας είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό των περισσότερων αποικιών. Η θεραπεία με 1% O

2 επεκταθεί επίσης το G

0 /G

1 στάδιο, οδηγώντας σε μεγαλύτερη πλευρά πληθυσμό κυττάρων και προκαλείται από CD44 και ABCG2 εκφράσεις. Η υποξία αύξησε επίσης τον αριθμό των κυττάρων που είναι θετικά για έκφραση ABCG2, οι οποίες κατά κύριο λόγο βρέθηκαν να είναι CD44

φωτεινά κύτταρα. Αντίστοιχα, η ταξινόμηση CD44

φωτεινά κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα ABCG2, Oct3 /4, και Nanog από CD44

dim κύτταρα και υποξικές προεπεξεργασίας αύξησε σημαντικά τις εκφράσεις αυτών των παραγόντων. CD44

φωτεινά κύτταρα κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση σχηματίζονται σημαντικά περισσότερες αποικίες και σφαίρες σε σύγκριση με τις αμυδρό κύτταρα CD44

, και υποξική προεπεξεργασίας ακόμη και να αυξηθεί αυτό το αποτέλεσμα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα κάτω από υποξία έχουν μεγαλύτερη ιδιότητες των βλαστικών όπως

Παράθεση:. Ma Υ, Liang D, Liu J, K Axcrona, Kvalheim G, Stokke T, et al. (2011) του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές κάτω από υποξία εμφανίζουν μεγαλύτερη Stem-Like Properties. PLoS ONE 6 (12): e29170. doi: 10.1371 /journal.pone.0029170

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Αυγ 2011? Αποδεκτές: 22 Νοέμβρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 Δεκ, 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το ράδιο Ίδρυμα Ερευνών Νοσοκομείο Norwegian με αριθμό επιχορήγηση 333.005 σε ZS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σωματικά όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, περιέχουν ένα μικρό υποσύνολο των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα, με ικανότητες για την αυτο-ανανέωση, τη διαφοροποίηση και την έναρξη νέων όγκων. Έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα μπορεί να ξεφύγει από την ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία, και είναι σε θέση να σχηματίσουν μεταστατικούς όγκους σε άλλα όργανα [1], [2]. Καρκινικά βλαστικά κύτταρα κατά προτίμηση να διαμένουν σε συγκεκριμένες υποξικό μικροπεριβάλλον-κόγχες, συχνά τα υπάρχοντα μέσα όγκους [3], [4]

Οι υποξία παράγοντες που διεγείρονται (HIFs) αποτελούν βασικούς ρυθμιστές βρίσκονται σε κύτταρα θηλαστικών υπό χαμηλότερη τάση οξυγόνου.? εμπλέκονται με πολλαπλές λειτουργίες, όπως την κυτταρική επιβίωση, αγγειογένεση, και βλαστικών κυττάρων συντήρηση, και παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην κυτταρική και συστημική ομοιόσταση σε απόκριση σε υποξία [5]. HIFs είναι ετεροδιμερή?

HIF1A

(HIF-1α) και

EPAS1

(HIF-2α) είναι οι δύο κύριες ισομορφές της α-υπομονάδας, και να μοιράζονται υψηλό βαθμό ομολογίας αλληλουχίας. Oct3 /4 (που ονομάζεται επίσης POU5F1) και Nanog είναι δείκτες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων που είναι σημαντικές για τη μεταγραφή και τη διατήρηση της αυτο-ανανέωσης των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων και αρχέγονα βλαστικά κύτταρα. Έχουν επίσης εντοπιστεί σε διάφορα σωματικά όγκους, συμπεριλαμβανομένων κεφαλής και του τραχήλου, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του προστάτη και του καρκίνου [6] – [11]. Συγκριτικά, οι εκφράσεις αυτών των γονιδίων είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε όλους τους διαφοροποιημένους τύπους σωματικών κυττάρων,

in vitro

καθώς και

in vivo

[12], [13].

Nanog

, που ονομάζεται επίσης

NANOG1

, έχει αρκετές ψευδογονίδια, και ανάμεσά τους

NANOGP8

επιβεβαιώθηκε αργότερα να είναι ένα retrogene. Τόσο

NANOG1

και

έχουν NANOGP8

εκφράσεις έχουν εντοπιστεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [14], [15], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [16].

Ένας αριθμός των οι δείκτες επιφάνειας έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση υποθετική καρκινικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα. Στον καρκίνο του προστάτη, οι αρχές του προγονικά κύτταρα που συνδέονται με διάφορες ειδικές επιφανειακούς δείκτες, όπως CD44, CD133, και CXCR4 [17] – [19]. Side τεχνολογία πληθυσμός έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων με την ικανότητα να αντλεί έξω Hoechst 33342 [20]. Εκροής της βαφής αποδίδεται σε μέλη του ΑΤΡ-δέσμευσης οικογένεια κασέτα, όπως (πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού, BCRP) ABCG2. Η ρύθμιση προς τα πάνω του ABCG2 είναι επίσης υπεύθυνη για χημειοθεραπευτική αντοχή σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα [21]. Σε καρκίνους του μαστού και του προστάτη, προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει CD44

+ ή CD117

+ /ABCG2

+ κύτταρα με χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως, όπως η αυξημένη κλωνογονικού /ογκογόνων ιδιοτήτων, υψηλότερες εκφράσεις βλαστική ικανότητα των γονιδίων, και ισχυρότερη ικανότητα να σχηματίζουν όγκους σε ζωικά μοντέλα [19], [22], [23].

υποξία βοηθά εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα να διατηρούν βλαστική ικανότητα και υψηλότερες τάσεις οξυγόνου οδηγούν κυττάρων σε πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση, τα οποία είναι πιο ευαίσθητα σε συμβατικά μορφές θεραπείας [24], [25]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί σε ενήλικα κύτταρα, όπως τα λιποκύτταρα, ινοβλάστες, και διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [26] – [28]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της υποξίας σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τον προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 και DU145 σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου, προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα την επίδραση της υποξίας επί του στελέχους-όπως ιδιότητες των κυττάρων. Βλαστική ικανότητα παραγόντων, Oct3 /4 και Nanog, εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στα κύτταρα υπό υποξικές καλλιέργεια και τα κύτταρα αυτά παρουσίασαν αυξημένα δυναμικό σχηματισμού αποικίας σε σύγκριση με τα κύτταρα υπό ορθοξικές κατάσταση. Επιπλέον, η προς τα πάνω ρυθμισμένη

Nanog

έκφραση του mRNA υπό υποξία επιβεβαιώθηκε προέρχεται κυρίως από την retrogene

NANOGP8

. Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, υποξία αύξησε επίσης το κλάσμα των κυττάρων πλευρά πληθυσμού, παρέτεινε την G

0 /G

1 στάδιο και οδήγησε σε υψηλότερα επίπεδα ABCG2 και CD44 εκφράσεις. Επιπλέον πειράματα έδειξαν ότι το CD44

φωτεινά κύτταρα εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη βλαστική ικανότητα, όπως επαληθεύεται με τη δοκιμασία σχηματισμού αποικιών, δοκιμασία ανάπτυξης σφαίρα, και την έκφραση του παράγοντα βλαστική ικανότητα αναλύσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές του προστάτη, PC-3 και DU145, αγοράστηκαν από την ATCC (American Type Culture Collection, USA) και διατηρήθηκε στο εργαστήριο μας για αυτή τη μελέτη. Για τους συμβατικούς κυτταρικής καλλιέργειας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας με RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή σε ατμόσφαιρα 20% Ο

2, 5% CO

2, και το 75% Ν

2.

The Xvivo Κλειστή επώασης σύστημα (σύστημα Xvivo 300 C, BioSpherix, New York, USA) χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη προκειμένου να διατηρηθεί με ακρίβεια διαφορετικές τάσεις οξυγόνου σε διαφορετικούς θαλάμους. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας σε συμβατικές κυτταρική καλλιέργεια (επιτρέποντας κύτταρα να προσκολληθούν πάνω στα φιαλίδια), τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε διαφορετικούς θαλάμους με 1% O

2, 5% CO

2, και 94% Ν

2? 7% O

2, 5% CO

2, και 88% Ν

2? ή 20% O

2, 5% CO

2 και 75% Ν

2 για μεταβλητές χρονικές περιόδους πριν από τη συγκομιδή για περαιτέρω ανάλυση.

ποσοτικαί αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT- PCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το RNeasy κιτ (Qiagen, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να εξαλειφθεί κάθε DNA, ϋΝάση Ι χρησιμοποιήθηκε στην διαδικασία απομόνωσης RNA. Οι συγκεντρώσεις του δείγματος RNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Nanodrop ND-1000, USA) σε OD260 /280.

Συμπληρωματικό DNA (cDNA) στη συνέχεια συντίθεται από 5 μg ολικού RNA με τη χρήση του Multiscribe αντίστροφης μεταγραφάσης (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι συνθήκες για ανάστροφη μεταγραφή ήταν: 25 ° C για 10 λεπτά, 37 ° C για 12 λεπτά, 85 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από διατήρηση στους 4 ° C. cDNA αποθηκεύθηκε στους -70 ° C για μεταγενέστερη ανάλυση PCR

PCR ενίσχυση του cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα PCR (Doppio VWR, UK) και το ακόλουθο πρόγραμμα:. αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά? που ακολουθείται από 30 κύκλους (28 κύκλοι για GAPDH) των ανόπτηση στους 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα? που ακολουθείται από τερματισμό με ένα βήμα 10 λεπτά με τα πόδια επιμήκυνση στους 72 ° C. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την RT-PCR ήταν: για Nanog, F 5′-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘και 5′-R AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3’, ενίσχυση ενός 66-bp? για Oct3 /4, F-5’ACATGTGTAAGCTGCGGCC-3 ‘και 5′-R GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG-3′, την ενίσχυση ενός 297-bp? για HIF-1α, F 5’-AGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAA-3 ‘και 5′-R CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATCA-3′, την ενίσχυση ενός 113-bp? για HIF-2α, F 5’-GACCAGCAGATGGACAACTTGTAC-3 ‘και 5′-R CAGAAAGATCATGTCGCCATCTT-3′, ενίσχυση ενός 84-bp? και για GAPDH, F 5’-CCTCAAGATCATCAGCAATGC-3 ‘και 5′-R TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’, την ενίσχυση ενός 101-bp προϊόντος. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές

Τα ενισχυμένα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7,5%, χρωματίστηκαν με GelRed (Molecular Probes, Invitrogen), και οπτικοποιήθηκε με ένα σύστημα SynGene εικόνας (G:. ΚΟΥΤΙ Syngene , ΗΠΑ).

Οι εκφράσεις του mRNA της

NANOG1

και

NANOGP8

μετρήθηκαν με ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας ένα Taqman ΑΒΙ 7900 Sequence Detector System (Applied Biosystems). Οι δημοσιευμένες ειδικοί εκκινητές και ανιχνευτές [29] χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Για

NANOG1

: πρόσθιου εκκινητή ήταν 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT -3 ‘, αντίστροφος εκκινητής ήταν 5′-AGAAGCCGTCTCTGGCTATAGATAA -3’, και ο ανιχνευτής ήταν CTGCTAAGGACAACATTGAT? για

NANOGP8

: πρόσθιου εκκινητή ήταν 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT-3 ‘, αντίστροφος εκκινητής ήταν 5′-ACGAGTTTGGATATCTTTAGGGTTTAGAATC-3’, και ο ανιχνευτής ήταν CCTTGGCTGCCGTCTCTG. Όλες οι εκκινητές και οι ανιχνευτές σημάνθηκαν με FAM-MGB ελήφθησαν από την Applied Biosystems. Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός τις τιμές Ct σε 20% O

2 ελέγχου και χρησιμοποιήθηκαν ως βαθμονομητές για την αξιολόγηση

NANOG1

και

NANOGP8

επίπεδα έκφρασης σε απόκριση προς υποξία. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Τα επίπεδα έκφρασης του

NANOG1

και

NANOGP8

αναλύθηκαν με τη μέθοδο της ΔΔCt [29].

Ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα γρήγορα ξεπλένονται με πάγο κρύο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και αποξέστηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (25 mM Tris HCl ρΗ 7,6, 100 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS? Thermo Scientific Pierce, Γερμανία), με αναστολείς πρωτεάσης (0,1 μΜ απροτινίνη, 1,0 mM PMSF, 1 μΜ leupeptin, 1 μΜ pepstatin) προστίθεται αμέσως πριν από τη χρήση. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C και τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα θερμάνθηκαν με ένα θερμαντήρα benchtop (Μοντέλο 111002, Boekel Scientific, USA) στους 100 ° C για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα SDS-φόρτωσης (500 mM Tris-HCl ρΗ 6,8? 10% γλυκερόλη, 2% SDS, 0,6 Μ DTT, 0,05% κυανούν βρωμοφαινόλης), και στη συνέχεια μια ίση ποσότητα πρωτεΐνης (50 μg) ανά δείγμα υποβλήθηκε σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη μεταφοράς διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Bio-Rad, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBS-Tween για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα σε βέλτιστη αραίωση σε TBST /5% γάλα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι βελτιστοποιημένες αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνονται: HIF-1α (1 μg /ml MAB1536, R &? D), HIF-2α (1 μg /ml MAB2886, R &? D) amp, GAPDH (0,2 μg /ml AF5718, Ε &? D ), Oct3 /4 (1 μg /ml MAB1759, R &? D), Nanog (1 μg /ml AF1997, R &? D), και ABCG2 (0,5 μg /ml B7059, Sigma-Aldrich). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές συζευγμένο με HRP αντισώματα και ανοσοσύμπλοκα έγιναν ορατά με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (GE Healthcare, UK). Western blotting πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

παρασκευή μπλοκ κυττάρων

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή και κατόπιν υπέστησαν πέψη με 0,25% θρυψίνη και EDTA (Invitrogen, USA), συλλέχθηκαν, και φυγοκεντρήθηκε στις 2000 rpm για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα απορρίπτονται, 3 σταγόνες πλάσματος και 2 σταγόνες θρομβίνης προστέθηκαν στο καθίζηση, και τα περιεχόμενα αναμίχθηκαν προσεκτικά με περιστροφή του σωλήνα. Ένα λεπτό αργότερα, το μίγμα έπηξε και 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη προστέθηκε στο σωλήνα για στερέωση. Το πηγμένο μάζα στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε χαρτί λινό και χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή ενός μπλοκ παραφίνης με τη συμβατική διαδικασία.

Η ανοσοκυτταροχημεία

μπλοκ κυττάρων κόπηκαν σε τομές παραφίνης 4-μm που στη συνέχεια αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ΡΤ -LINK συσκευή. Στη συνέχεια, οι τομές ξεπλύθηκαν με ρυθμιστικό πλύσης ϋΑΚΟ, επωάστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου για 5 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται και οι συγκεντρώσεις τους ήταν: HIF-1α (ποντίκι, 1:200? Αριθμός καταλόγου: NB100-150, Novus), HIF-2α (κουνέλι, 1:100? Αριθμός καταλόγου: NB100-122, Novus), Oct3 /4, (αίγας, 10 μg /ml? αριθμός καταλόγου: AF1759, R & amp? D) και Nanog (κατσίκα, 5 μg /ml? αριθμός καταλόγου: AF1997, R & amp? D)

Μετά από μια άλλη ξεπλύνετε με DAKO. ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, ποντικού /κουνελιού αντιδραστήριο EnVision FLEX + Linker προστέθηκε και τα δείγματα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με EnVision FLEX + HRP επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Δείγματα με πρωτογενή αντισώματα από αίγα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-κατσίκας IgG ποντικού πριν την προσθήκη του ποντικιού αντιδραστηρίου EnVision FLEX + Linker και EnVision FLEX + HRP όπως περιγράφεται ανωτέρω. Οι τομές ξεπλένονται, χρωστική αντίδραση αναπτύχθηκε με αντιδραστήριο DAB, αντιχρωματίζεται σε αιματοξυλίνη για 20 δευτερόλεπτα, αφυδατωμένα, και τοποθετείται κάτω από γυάλινο κάλυμμα γλιστρά στο πλαίσιο της προετοιμασίας για την αξιολόγηση από το μικροσκόπιο.

καταμέτρηση των κυττάρων (ποσοστό πολλαπλασιασμού των κυττάρων)

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε μετρώντας τους αριθμούς των κυττάρων χρησιμοποιώντας το Counter τηλέφωνα Ηλεκτρονική κοντέσα Αυτοματοποιημένο (Invitrogen, USA). Μετά θρυψινοποίηση, τα επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν για να δημιουργήσουν ένα κυτταρικό εναιώρημα που περιείχε κανένα προφανές συστάδες κυττάρων. Σε κάθε παρασκεύασμα, 10 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος αναμίχθηκε με 0,4% trypan μπλε χρωστική (1:01) πριν φορτωθούν μια διαφάνεια θάλαμο μέτρησης κυττάρων για μέτρηση των κυττάρων. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων τα οποία ήταν σε θέση να αποκλείσει την χρωστική μετρήθηκε για κάθε πειραματική συνθήκη. Για κάθε δείγμα, ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Χρησιμοποιώντας τρυβλία έξι φρεατίων, 500 κύτταρα ανά φρεάτιο διατηρήθηκαν σε τάσεις οξυγόνου από 1%, 7% , και 20% για 48 ώρες. Όλες οι πλάκες στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα επωαστή με 20% O

2 για 2 εβδομάδες για την παρατήρηση του σχηματισμού αποικιών. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 15 λεπτά, και στη συνέχεια βάφονται με 1% κρυσταλλικού ιώδους για 30 λεπτά. Οι πλάκες πλύθηκαν ήπια με PBS και ξηραίνονται πριν μικροσκοπική αξιολόγηση αποικία. Αποικίες που περιείχαν περισσότερο από 30 κύτταρα μετρήθηκαν. αποδοτικότητα σχηματισμού αποικίας υπολογίστηκε ως εξής: αποδοτικότητα σχηματισμού αποικιών = αποικίες /κυττάρων εισόδου Χ 100%. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά από επώαση κάτω από διαφορετικές τάσεις οξυγόνου, που περιλαμβάνει 1% ή 20% O

2, τα κύτταρα PC-3 και DU145 ήταν συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη στους -20 ° C επί μία νύκτα. Αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων στο οποίο προστέθηκαν 1.5 μg /ml Hoechst 33258 του πριν τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Μετά από αυτό, τα δείγματα αναλύθηκαν με LSRII κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Side πληθυσμού δοκιμασία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή (περίπου 1 × 10

6 κύτταρα) συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε προθερμασμένο RPMI 1640 που περιέχει 2% ορό εμβρύου βοοειδών και 2 mM ρυθμιστικό HEPES. Hoechst (μητρικό διάλυμα 1 mg /ml? Sigma) 33342 βαφή συνέχεια προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 5 μg /ml, και το μίγμα επωάστηκε με διαλείπουσα ανατάραξη για 90 λεπτά στους 37 ° C, υπό την παρουσία ή απουσία του verapamil (50 μΜ? Sigma). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο HBSS με 2% FBS, φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C, και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο HBSS που περιέχει 2% FBS. ιωδιούχου προπιδίου προστέθηκαν στα αιωρούμενα κύτταρα σε μια τελική συγκέντρωση 2 μg /ml, για να αποκαλύψει τα βιώσιμα κύτταρα. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα διηθήθηκαν μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 70 μm για να ληφθεί ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Τα συσσωματώματα κυττάρων απορρίφθηκαν από την ανάλυση από τις διακρίσεις διπλή και μεμονωμένα κύτταρα αναλύθηκαν σε LSRII κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences). Χρωστική Hoechst 33342 ήταν ενθουσιασμένος στα 350 nm και τα κύτταρα πλευρικά πληθυσμού έγιναν ορατά με τη χρήση του κόκκινου (κόκκινο, 660/10 nm) έναντι του μπλε (μπλε, 424/44 nm).

ABCG2 /φαινότυπο CD44 και ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS)

Μετά από 48 ώρες επώασης στους τάσεων οξυγόνου 1% και 20%, τα κύτταρα PC-3 και DU145 θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό ρυθμιστικό FACS ( PBS + BSA 0,03%), και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 10

6 κύτταρα /ml. Τα κύτταρα προ-μπλοκαρίστηκαν με 5% BSA για 30 λεπτά σε πάγο πριν από τη χρώση με πρωτεύοντα αντισώματα (μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CD44 συζευγμένο απευθείας με APC (allophycoyanin) και αντι-ABCG2 μονοκλωνικό αντίσωμα συζευγμένο απευθείας με FE (phycoerythin)? BD Pharmingen Company) επί πάγου, στο σκοτάδι, για 30 λεπτά. εναιωρήματα κυττάρων πλύθηκαν δύο φορές, επαναιωρήθηκαν σε 400 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος FACS, και διηθείται μέσω ενός νάιλον πλέγματος 70-μm. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) για την ανίχνευση του ABCG2 και CD44, και ένα διαλογέα ντίβα κύτταρο FACS χρησιμοποιήθηκε για κυτταρική διαλογή. Μετά την καλλιέργεια σε 1% ή 20% O

2 για 48 ώρες, τα κύτταρα PC-3 και DU145 ταξινομήθηκαν με βάση την έκφραση CD44. Για τα θετικά κύτταρα CD44, επιλέχθηκαν μόνο οι κορυφαίες 10% των κυττάρων που εκφράζουν (που ονομάζεται CD44

φωτεινό)? για τα αρνητικά κύτταρα CD44, οι κάτω του 10% που εκφράζουν κύτταρα απομονώθηκαν (που ονομάζεται CD44

dim). Για κάθε δείγμα, βιώσιμη και μονά κύτταρα με πύλη? APC Mouse IgG2b (BD Pharmingen, USA) και FE Mouse IgG2b (BD Pharmingen, USA) έλεγχοι ισοτύπου χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού

Η δοκιμασία που χρησιμοποιήθηκε βασίστηκε σε περιγράφηκε προηγουμένως μεθόδους [30]. Αφού τα CD44

φωτεινά κύτταρα ταξινομήθηκαν με τη μέθοδο όπως περιγράφεται παραπάνω, σε ένα CD44

φωτεινά και CD44

dim κύτταρα απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 300 κύτταρα ανά φρεάτιο, σε ultralow συνημμένο πλάκες έξι φρεατίων (Ultra πλάκες χαμηλής διασποράς, Βιοεπιστήμες). Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού DMEM /F12 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 20 ng /ml EGF και 20 ng /ml bFGF επί δέκα ημέρες κάτω από συνθήκες νορμοξία προτού οι σφαίρες αξιολογήθηκαν υπό αντίστροφο miscopy και μετρήθηκαν (πάνω από 30 κύτταρα εντός ενός σφαίρα θεωρήθηκε ότι είναι μια πλήρης σφαίρα). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

Στατιστικές αναλύσεις

Για κάθε πείραμα, τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.? λογισμικό SPSS (έκδοση 16.0) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας one-way ANOVA και Φοιτητών

t-test

(

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική).

Αποτελέσματα

η υποξία επάγει την έκφραση του HIF-1α, HIF-2α, Oct3 /4 και Nanog

HIF-1α και HIF-2α, οι μεγάλοι μεταγραφικοί παράγοντες απαντώντας στην υποξία, εξετάστηκαν σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC- 3 και DU145 που έχουν εκτεθεί σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου για μεταβλητό χρονικό διάστημα. Σε 20% O

2 έντασης, HIF-1α και HIF-2α ήταν ασθενώς εκφράζεται σε δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης? συγκριτικά υψηλότερα επίπεδα των HIF-1α και η έκφραση του HIF-2α παρατηρήθηκαν στο 7% O

2 έντασης, και τα υψηλότερα επίπεδα παρατηρήθηκαν στο 1% O

2 έντασης (Σχήμα 1Α). Σε μειωμένα επίπεδα τάσης οξυγόνου, αυτοί οι δύο παράγοντες έχουν ήδη ρυθμίζεται αυξητικά μετά από 6 ώρες καλλιέργειας. εκφράσεις τους έφθασε στα υψηλότερα επίπεδα στις 12 ώρες καλλιέργειας σε 7% O

2 έντασης, αλλά έφθασε στο υψηλότερο επίπεδο σε μόλις 6 ώρες καλλιέργειας σε 1% O

2. Η έκφραση πρωτεΐνης μετά από 48 ώρες καλλιέργειας σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου μελετήθηκε επίσης με ανοσοκυτταροχημεία (Σχήμα 1Β). Οι εκφράσεις του HIF-1α και HIF-2α ήταν σταθερά υψηλότερες στα κύτταρα υποξία-θεραπεία, σε συμφωνία με τα ευρήματα που λαμβάνονται με RT-PCR και ανοσοκηλίδωση.

(Α) Σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 20 % O

2, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 7% O

2 δείχνουν υψηλότερα επίπεδα HIF-1α και HIF-2α, και τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 1% O

2 παρουσιάζουν τα υψηλότερα επίπεδα του HIF-1α και HIF-2α τόσο από RT-PCR και ανοσοστύπωμα. (Β) Η ανοσοκυτταροχημεία αποκαλύπτει υψηλότερα επίπεδα HIF-1α και HIF-2α εκφράσεις στα κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από 7% O

2 και τα υψηλότερα επίπεδα του HIF-1α και HIF-2α εκφράσεις στα κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από 1% O

2 και για τις δύο κυτταρικές σειρές. Οι τομές καρκινώματος του μαστού χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι τόσο για HIF-1α και HIF-2α. Όλες οι φωτογραφίες είχαν αρχικά ληφθεί σε 200 × και όλα τα ένθετα ελήφθησαν στα 400 ×.

Η

Oct3 /4 και Nanog χρησιμοποιούνται συχνά ως δείκτες για τα αδιαφοροποίητα κύτταρα και διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της ικανότητας του αυτο-ανανέωσης σε ενήλικα βλαστικά κύτταρα [31], [32]. Οι εκφράσεις αυτών των παραγόντων μεταγραφής εξετάστηκαν επίσης σε PC-3 και DU145 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου. Τόσο τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α), αδύναμη εκφράσεις Oct3 /4 και Nanog αποκαλύφθηκαν σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές που καλλιεργούνται σε 20% O

2 έντασης, ενώ οι εκφράσεις τους ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα που καλλιεργούνται κάτω από 7% και 1% O

2 συνθήκες. Και στις δύο κυτταρικές σειρές, οι εκφράσεις των δύο αυτών παραγόντων ήταν υψηλότερα κατά 1% O

2 από 7% O

2. Όπως παρατηρήθηκε επίσης σε αναλύσεις ανοσοκηλίδωσης (Σχήμα 2Α), Oct3 /4 και Nanog άρχισαν να αυξάνονται αισθητά ήδη 6 ώρες μετά τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε 1% O

2, και έφθασε μέγιστα επίπεδα στις 12 ώρες για τις δύο κυτταρικές γραμμές. Όταν τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 7% O

2, οι εκφράσεις αυτών των δύο παραγόντων ήταν επίσης σημαντικά αυξημένα μετά από 6 ώρες, και έφτασε στα υψηλότερα επίπεδα σε καλλιέργεια 12 ώρες? Ωστόσο, αυτά τα επίπεδα έκφρασης ήταν ασθενέστερη από εκείνες που παρατηρούνται σε κύτταρα που εκτίθενται σε 1% O

2. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης με ανοσοκυτταροχημεία (Σχήμα 2Β). Μετά την έκθεση σε υποξικές συνθήκες, η ενισχυμένη Oct3 /4 και Nanog εκφράσεις παρατηρήθηκαν και στα δύο κύτταρα PC-3 και DU145.

(Α) Σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 20% O

2, τα κύτταρα καλλιεργείται σε 7% O

2 δείχνουν υψηλότερα επίπεδα Oct3 /4 και Nanog εκφράσεις, και τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 1% O

2 παρουσιάζουν τα υψηλότερα επίπεδα των Oct3 /4 και Nanog εκφράσεις σε PC-3 και DU145 κυττάρων γραμμές τόσο από RT-PCR και ανοσοστύπωμα. (Β) Η ανοσοκυτταροχημεία αποκαλύπτει αντίστοιχη υψηλότερα επίπεδα Oct3 /4 και Nanog εκφράσεις κατά 7% O

2 και τα υψηλότερα επίπεδα Oct3 /4 και Nanog εκφράσεις στο 1% O

2, σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 20% O

2 και για τις δύο κυτταρικές σειρές. τομές ιστών Ανθρώπινα σεμίνωμα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι για αυτά τα δύο αντισώματα. Όλες οι φωτογραφίες είχαν αρχικά ληφθεί σε 200 × και όλα τα ένθετα ελήφθησαν στα 400 ×.

Η

Για να προσδιοριστεί εάν η αυξημένη

Nanog

έκφραση προήλθε από το

NANOG1

ή

NANOGP8

, ποσοτική RT-PCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω, με τα αντίστοιχα κύτταρα καλλιεργούνται υπό φυσιολογική οξυγόνωση ως βαθμονομητές. Είχε επανειλημμένα διαπιστώσει ότι η

NANOG1

έκφραση στα κύτταρα κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση ήταν σε πολύ χαμηλό επίπεδο, με τιμές κατά μέσο όρο Ct 37,24 και 37,37 για τα PC-3 κυττάρων και DU145 κύτταρα, αντίστοιχα. Ωστόσο, η

NANOGP8

έκφραση στα κύτταρα κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση ήταν σχετικά υψηλή, με μέση Ct τιμές 33,56 και 33,51 για τα PC-3 κυττάρων και DU145 κύτταρα, αντίστοιχα. Παρά το γεγονός ότι τα υψηλότερα επίπεδα

NANOG1

και

NANOGP8

εκφράσεις μπορεί να παρατηρηθεί και στις δύο κυτταρικές σειρές κάτω από υποξία, η αυξημένα

Nanog

έκφραση επιβεβαιώθηκε κυρίως

NANOGP8

, με έως 6-πλάσια και 10-πλάσια αύξηση στην έκφραση στα κύτταρα PC-3 και DU145 κάτω από 1% O

2, αντίστοιχα (Σχήμα 3). Δεδομένου ότι το

NANOG1

έκφραση στα κύτταρα κάτω από νορμοξία ήταν εξαιρετικά χαμηλή, η 2,6-φορές και 3,1-φορές αύξηση στην έκφραση αυτού του γονιδίου στα κύτταρα PC-3 και DU145 κάτω από 1% O

2 αντιπροσωπεύεται εξακολουθεί να είναι αρκετά χαμηλό επίπεδο έκφρασης.

σε σύγκριση με τα κύτταρα κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση, υπάρχουν αυξημένα

NANOG1

και

NONOGP8

εκφράσεις στα κύτταρα κάτω από 7% O

2 για δύο κυτταρικές σειρές, με έως και 1,8-φορές αύξηση

NANOG1

έκφρασης και έως 2,5 φορές

NONOGP8

αύξηση και στις δύο κυτταρικές σειρές? τα κύτταρα κάτω από 1% O

2 εκφράζουν ακόμη υψηλότερα επίπεδα

NANOG1

και

NONOGP8

, με 2,6 φορές και 3,1 φορές αύξηση στο

NANOG1

έκφρασης οι κυτταρικές σειρές PC-3 και DU145, αντίστοιχα, και με 6-πλάσια και 10-πλάσια αύξηση σε

NONOGP8

εκφράσεις στις κυτταρικές γραμμές PC-3 και DU145, αντίστοιχα.

η

η υποξία αυξάνει την ικανότητα σχηματισμού αποικιών και εκτείνεται G

0 /G

1 στάδιο

από την υποξία αύξησε την έκφραση βλαστική ικανότητα παράγοντες, είμαστε δίπλα διερευνηθεί κατά πόσον η υποξία επηρέασε τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων. Τα κύτταρα PC-3 και DU145 καλλιεργήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (20% O

2) ή συνθήκες υποξίας (1% O

2 και 7% O

2) για 48 ώρες για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, για κάθε κυτταρική σειρά δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που καλλιεργούνται σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου (

P

& gt? 0,05), αν και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν κάπως βραδύτερος υπό υποξία από νορμοξία. Στη συνέχεια, το ερώτημα εάν υποξία προεπεξεργασίας θα μπορούσε να επηρεάσει clonogenicty σε αυτά τα κύτταρα. Τα κύτταρα αρχικά εκτέθηκαν σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου για 48 ώρες, ακολουθούμενη από μεταφορά σε ένα θάλαμο νορμοξικό (20% O

2) για 14 ημέρες για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν σταθερά καλλιεργούνται σε 20% O

2, περισσότερες αποικίες παρατηρήθηκαν στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία κατά 7% O

2, και ακόμη περισσότερες αποικίες παρατηρήθηκαν στα κύτταρα προκατεργάζονται κατά 1% O

2 (Σχήμα 4Β). Σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργούνται υπό πάντοτε νορμοξία, στατιστικώς σημαντικά υψηλότερη αποδοτικότητα σχηματισμού αποικίας που προσδιορίζονται στις υποξία προεπεξεργασμένων PC-3 και DU145 ells (Σχήμα 4C). Οι αναλύσεις κυτταρικού κύκλου επέδειξε μια εκτεταμένη G

0 /G

1 στάδιο στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε 1% O

2 για 48 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 20% O

2, όπως ελέγχους (

P

& lt? 0,05). (Εικόνα 4D και Ε), υποδεικνύοντας περισσότερα κύτταρα σε μία ήρεμη κατάσταση υπό υποξία

(Α) καμπύλες πολλαπλασιασμός των κυττάρων δεν δείχνουν στατιστική διαφορά για την κυτταρική ανάπτυξη κάτω από διαφορετικές τάσεις οξυγόνου (

P & gt? 0,05

). (Β) δοκιμασία σχηματισμού αποικίας και για τις δύο κυτταρικές σειρές εμφανίζει περισσότερες αποικίες στα κύτταρα προ-κατεργασία σε 7% O

2 για 48 ώρες και ακόμη περισσότερο αποικίες στα κύτταρα προεπεξεργασμένα κάτω από 1% O

2 (C ) ιστογράμματα για την αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας δείχνει στατιστικώς υψηλότερη αποτελεσματικότητα στα κύτταρα προ-επεξεργασία υπό υποξία (7% ή 1% O

2) για αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (

P

& lt? 0,0001). (Δ) Η κυτταρομετρία ροής δείχνει επεκταθεί G

0 /G

1 στάδιο και για τις δύο κυτταρικές σειρές οι οποίες έχουν καλλιεργηθεί κάτω από 1% O

2 για 48 ώρες, σε σύγκριση με τα κύτταρα διατηρούνται πάντα κάτω από νορμοξία. (Ε) Στατιστικές αναλύσεις αποκαλύπτουν σημαντικά επεκταθεί G

0 /G

1 στάδιο τα κύτταρα καλλιεργούνται υπό υποξία και για τις δύο κυτταρικές σειρές (

P

& lt? 0,05).

Η

υποξία αυξάνει το κλάσμα των κυττάρων με βλαστικά φαινότυπο

κύτταρα Side πληθυσμού, θεωρείται ότι περιέχει υποτιθέμενο βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη, είναι γνωστό ότι η άντληση του χρωστική Hoechst 33342 [20], [33]. Κύτταρα που εμφανίζουν αυτή τη δραστηριότητα ήταν να αξιολογούνται περαιτέρω κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας σε διαφορετικές τάσεις οξυγόνου. Υψηλότερες κλάσματα αυτών των κυττάρων πλευρά πληθυσμός παρατηρήθηκαν σε καλλιέργειες διατηρούνται σε 1% O

2 ένταση για 48 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 20% O

2 (Σχήμα 5Α και Β).

κύτταρα PC-3 και DU145 καλλιεργήθηκαν σε 1% O

2 και 20% O

2 coditions για 48 ώρες για να αναλύσει φαινότυπο στέλεχος που μοιάζει με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. (Α) Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχνουν ότι τα κύτταρα πλευρά πληθυσμός προκλήθηκαν σε δύο κυτταρικές γραμμές μετά από υποξική θεραπεία. (Β) Στατιστικά αναλύσεις δείχνουν σημαντική διαφορά στο πλευρό του πληθυσμού. (Γ) Αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής δείχνουν υψηλότερα επίπεδα έντασης ABCG2 έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές υπό υποξία. (D) ιστόγραμμα δείχνει στατιστικώς σημαντική διαφορά στην έκφραση ABCG2. (Ε) Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις δείχνουν υψηλότερη ένταση της έκφρασης CD44 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές υπό υποξία. (F) ιστόγραμμα δείχνει στατιστικώς σημαντική διαφορά στην έκφραση CD44.

Η

ABCG2 και CD44 έχουν περιγραφεί ως δείκτες καρκίνου του προστάτη βλαστικά σαν βάση την κλινικές έρευνες και μελέτες σε καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές [19], [ ,,,0],33]. Ως εκ τούτου, ABCG2 και CD44 εκφράσεις στα κύτταρα PC-3 και DU145 που επωάστηκαν σε 1% ή 20% O

2 εντάσεις για 48 ώρες εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στα σχήματα 5C και D, έριξε ήταν 1,20 φορές και 1,42 φορές αύξηση στην έκφραση ABCG2 στα κύτταρα PC-3 και DU145 κάτω από 1% O

2, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα πάντοτε καλλιεργούνται υπό φυσιολογική οξυγόνωση. Ομοίως, υπήρχαν 1,50 φορές και 1,45 φορές αυξήσεις στην έκφραση CD44 στα κύτταρα PC-3 και DU145 κάτω από 1% O

2, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα πάντοτε καλλιεργηθεί υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήματα 5Ε και F).

Από την υποξία θα μπορούσε να προκαλέσει τόσο ABCG2 και έκφραση CD44 στις δύο κυτταρικές σειρές, ερευνήσαμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ CD44 και ABCG2. Διπλή χρώση αυτών των δύο δεικτών επιφανείας αποκάλυψε ότι η υποξία προκαλούμενη ABCG2

+ κύτταρα ήταν κυρίως CD44

φωτεινά κύτταρα και ο CD44

dim κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας ήταν ως επί το πλείστον αρνητικά για έκφραση ABCG2 (Σχήμα 6Α ).

(Α) Διπλή χρώση CD44 και επιφάνεια ABCG2 δείκτες με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας δείχνει υψηλότερα επίπεδα έκφρασης αυτών των παραγόντων στις δύο κυτταρικές σειρές υπό υποξία για 48 ώρες.