Αφηρημένο

Μελετάμε την βελτιωτική δυναμικό της dimetylthiourea (DMTU), ένα ΟΗ

• ριζική κυνηγός και Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), πρόδρομος της γλουταθειόνης /H

2O

2 οδοκαθαριστής κατά νανοσωματίδια διοξειδίου του τιτανίου (TiO

2-NPS) και Πολύτοιχες νανοσωλήνες άνθρακα (MWCNTs) που προκαλείται από κυτταρο-γονοτοξικότητας σε καλλιεργημένα ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων-Α549. Cytogenotoxicity προκλήθηκε με έκθεση των κυττάρων σε επιλεγμένες συγκεντρώσεις (10 και 50 μg /ml) είτε της TiO

2-NPs ή MWCNTs για 24 ώρες. επιδράσεις αντι-cytogenotoxicity των DMTU και NAC μελετήθηκαν σε δύο ομάδες, δηλαδή, η θεραπεία 30 λεπτά πριν από την τοξική προσβολή (βραχυχρόνια έκθεση), ενώ η άλλη ομάδα έλαβε DMTU και NAC θεραπεία κατά τη διάρκεια της έκθεσης νανοσωματίδια, δηλαδή, 24 ώρες (μακροπρόθεσμα έκθεση). Διεξήχθησαν έρευνες για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), μικροπυρήνες (ΜΝ), και την έκφραση των δεικτών του οξειδωτικού στρες (HSP27, CYP2E1), γονιδιοτοξικότητα (Ρ

53) και CYP2E1 εξαρτώμενη η- nitrosodimethylamine- διμεθυλάση (NDMA-δ) δραστηριότητα. Γενικά, η θεραπεία τόσο DMTU και NAC βρέθηκε να είναι αποτελεσματική σημαντικά έναντι TiO

2-NPs και MWCNTs επάγεται cytogenotoxicity σε κύτταρα Α549. Μακροχρόνια θεραπεία των DMTU και NAC κατά τη διάρκεια τοξικές προσβολές έχει δείξει καλύτερη πρόληψη από τα βραχυπρόθεσμα προεπεξεργασία. Παρά το γεγονός ότι, τα κύτταρα ανταποκρίθηκαν σημαντικά τόσο DMTU και NAC, αλλά οι απαντήσεις ήταν χημική συγκεκριμένες. Εν μέρει, TiO

2-ΣΔ που προκαλείται από τοξικές ανταποκρίσεις με τη μεσολάβηση ΟΗ

• ρίζες γενιά και μείωση του αντιοξειδωτικό αμυντικό σύστημα. Ενώ στην περίπτωση των MWCNTs, ανεπιθύμητες ενέργειες οφείλονται κατά κύριο λόγο στην αλλαγή /παρεμποδίζουν την ενζυματική αντιοξειδωτικό σύστημα. Τα δεδομένα δείχνουν τη δυνατότητα εφαρμογής του ανθρώπινου πνεύμονα καρκινικά κύτταρα-Α549 ως εργαλείο προ-διαλογής για τον εντοπισμό του στόχου ειδικών προφυλακτική και θεραπευτική δυνατότητα των υποψηφίων φαρμάκων μορίων κατά νανοσωματιδίων σε κυτταρικό επίπεδο αποζημίωσης

Παράθεση:. Srivastava RK, Ραχμάν Q, Kashyap MP, Lohani Μ, Παντ AB (2011) βελτιωτικά αποτελέσματα της Dimetylthiourea και Ν-ακετυλοκυστεΐνη σε νανοσωματίδια Induced Cyto-γονοτοξικότητας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα-Α549. PLoS ONE 6 (9): e25767. doi: 10.1371 /journal.pone.0025767

Επιμέλεια: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2011? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Σεπτέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Srivastava, et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση ελήφθη από το Συμβούλιο Επιστημονικής & amp? Βιομηχανικής Έρευνας, Νέο Δελχί, (SIP-08). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

έχουν Ενδοκυτταρική βιολογικές αλληλεπιδράσεις των νανοσωματιδίων οξειδίου μετάλλου και νανοσωλήνες άνθρακα έχει αποδειχθεί στη βιβλιογραφία και σημειώνονται ανησυχητική για την ασφάλεια [1], [2]. νανοσωματίδια διοξειδίου του τιτανίου (TiO

2 -NPs) και multiwalled νανοσωλήνες άνθρακα (MWCNTs) είναι γνωστό ότι επάγουν κυτταροτοξικά και γονοτοξικές αποκρίσεις σε τόσο

in vitro

[3], [4], [5] και i

n vivo

μοντέλα [6], [7]. Σε γενικές γραμμές, η παραγωγή ROS μεσολάβηση οξειδωτικού στρες και διαταραχή αντιοξειδωτική κατάσταση έχει προταθεί ως σημαντική αιτία της κυτταροτοξικότητας και γονιδιοτοξικότητας των νανοσωματιδίων [8], [9], [10]. Εκτός αυτού, ο αριθμός των παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων του μεγέθους των σωματιδίων, χημική σύνθεση και επιφανειακά φορτία κλπ έχουν επίσης παίξει ρόλο να προσδιοριστεί η έκταση των νανοσωματιδίων τοξικότητας [11], [12], [13], [14]. Νανοσωματίδια επάγουν παραγωγή ROS από την ενεργοποίηση των ενζύμων του κυτοχρώματος Ρ450 οικογένειας [15], [16] και /ή διασπώντας λειτουργία της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων [9]. Η σύνδεση της παραγωγής ROS με επαγόμενη από τα επίπεδα της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 27 (HSP27), το κυτόχρωμα P450 2E1 (CYP2E1) και P

53 έχουν καθιερωθεί ως δείκτες της επαγόμενης χημικών οξειδωτικό στρες, απόπτωση και γονοτοξικότητας [10], [17] , [18].

Ένας από τους αποτελεσματικότερους τρόπους για την πρόληψη της ROS μεσολάβηση κυτταρικής βλάβης είναι διαιτητικές ή φαρμακευτικά αύξηση των ελευθέρων ριζών. Ως εκ τούτου, έχουν γίνει προσπάθειες για την πρόληψη /αποκαταστήσει τα νανοσωματίδια να προκαλέσει cytogenotoxicity χρησιμοποιώντας μέσα δέσμευσης ριζών, όπως desferoxamine [8], τα αντιοξειδωτικά – ρεσβερατρόλη [19] και Ν-acetlylcysteine ​​(NAC) [4], [20], [21], σε ποικιλία συστημάτων κυττάρων ανθρώπινης και ζωικής προέλευσης. Ωστόσο, οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης (mRNA και πρωτεΐνη) των δεικτών που εμπλέκονται στην οξειδωτική καταπόνηση και γονοτοξικότητα σε καλλιεργημένα κύτταρα που εκτίθενται σε νανοσωματίδια δεν έχουν μελετηθεί μέχρι τώρα. Έτσι, οι παρούσες έρευνες είχαν ως στόχο να μελετήσει τις μηχανιστικές γνώσεις του TiO

2-ΣΔ και MWCNTs που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες και κυτταρο-γονοτοξικότητας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 και βελτιωτική επίδραση των ελευθέρων ριζών κυνηγός και αντιοξειδωτικά DMTU και NAC αντίστοιχα. DMTU, επιλέχθηκε για τη μελέτη, δεδομένου ότι αυτό thiogroup περιέχει ένωση έχει μεγάλη αντιδραστικότητα προς ΟΗ

• ρίζες λόγω των εξαιρετικά ευνοϊκές ηλεκτρονίων δωρίζοντας τα χαρακτηριστικά της ομάδας σουλφυδρυλίου? Έτσι, είναι γνωστή ως δυνητικός υδροξυλίου περισυλλέκτη ριζών [22]. Η άλλη ένωση που χρησιμοποιείται, δηλαδή, NAC είναι ένας πρόδρομος της γλουταθειόνης (GSH), είναι ένα σημαντικό κυτταρικό αντιοξειδωτικό και είναι γνωστό ότι διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων έναντι οξειδωτικού στρες μέσω της αναστολής του σχηματισμού H

2O

2 υπό in vitro συνθήκες [23]. NAC είναι επίσης γνωστή για τη βελτίωση κυτταρικό επίπεδο GSH κατευθύνοντας κυστίνη στην οδό σύνθεσης GSH, επειδή κυστίνη είναι ένα κοινό πρόδρομο τόσο του NAC και GSH [24].

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων

Τα μέση υδροδυναμική διάμετρο της TiO

2-NPs και MWCNTs εναιώρημα σε πλήρες μέσο ήταν 417,7 nm και 401,3 nm, και ζήτα (ζ) δυναμικά υπολογίστηκαν ως (-) 7,83 mV και (-) 14.4 mV αντίστοιχα (Σχήμα 1 α (Ι, ΙΙ) & amp? β (Ι, ΙΙ)). Οι μελέτες TEM δείχνουν το εύρος μεγέθους σωματιδίων 5-20 nm σε διάμετρο και 300-2000 nm σε μήκος για MWCNTs (τα δεδομένα έχουν ήδη δημοσιευθεί από εμάς) [15]. ΤίΟ

2-NPs (ανατάση) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ήταν καθαρότητας 99.7% και το μέγεθος των σωματιδίων κυμαίνεται μεταξύ 5-25 nm σε μελέτες ΤΕΜ. Τα σωματίδια προσκολλώνται στην επιφάνεια των κυττάρων μεταξύ μικρολάχνες και pseudopodes, όταν επωάζονται για 24 ώρες, στη συνέχεια εσωτερικεύεται σε μικρά κενοτόπια στο περιφερειακό κυτόπλασμα (Σχήμα 2 α & amp? Β). Εμείς δεν τήρησε καμία σημαντική αλλαγή στην υδροδυναμική σωματιδίων (TiO

2-ΣΔ και MWCNTs) το μέγεθος παρουσία DMTU και NAC κατά τη μέτρηση DLS. Μετά την αποστείρωση, ενδοτοξίνη δεν ανιχνεύθηκε σε αμφότερα τα νανοσωματίδια με δοκιμή LAL. Το όριο ανίχνευσης ήταν 0,03 EU /ml

κατανομή μεγέθους και ζήτα δυναμικό του TiO

2-ΣΔ (α, Ι & amp? II). Και MWCNTs (β, Ι & amp? ΙΙ) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δυναμική σκέδαση φωτός και ανάλυση σκέδαση φωτός φάση (PALS) σε μια Zetasizer Nano-ZS, Μοντέλο ZEN3600.

η

μικροφωτογραφίες TEM δείχνουν εσωτερίκευση του TiO

2-ΣΔ (α, β) στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα κύτταρα-Α549. Βέλη δείχνουν τα νανοσωματίδια είχαν προσκολληθεί στην επιφάνεια των κυττάρων μεταξύ μικρολάχνες και pseudopodes μέσα σε λίγα λεπτά από το χρόνο (α) και στη συνέχεια εσωτερικεύονται σε μικρά κενοτόπια βαθιά στο κυτταρόπλασμα, όταν παρατηρούνται στις 24 ώρες (b).

Η

αποκατάσταση της βιωσιμότητας των κυττάρων

η τάση για την αποκατάσταση της βιωσιμότητας των κυττάρων ήταν παρόμοια και για τις τρεις δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Ωστόσο, ΜΤΤ δοκιμασία βρέθηκε να είναι πιο ευαίσθητο σε σύγκριση με τις άλλες δοκιμασίες δηλ. NRU και κυκλοφόρησε LDH. Τα αποτελέσματα των DMTU ή NAC επάγεται αποκατάσταση στο ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων Α549 εκτίθενται σε νανοσωματίδια συνοψίζονται στο Σχήμα 3 α & amp? σι. Ο βραχυπρόθεσμος προεπεξεργασίας (30 λεπτά) του DMTU δείχνει σημαντική προστασία της βιωσιμότητας του Α-549 κύτταρα που εκτίθενται σε TiO

2-NPs (10, 50 μg /ml), ενώ η απόκριση του NAC προκατεργασίας ήταν μη σημαντικές κατά TiO

2-ΝΡ που προκαλείται από την απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα κύτταρα που λαμβάνουν μακροχρόνια (24 h) έκθεση του DMTU (10 mM) ή NAC (2 mM) μαζί με ΤίΟ

2-NPs (10, 50 μg /ml) έκθεσης έδειξαν περισσότερο ή λιγότερο παρόμοιου μεγέθους και τάσεις όπως παρατηρείται σε βραχυχρόνια έκθεση (Σχήμα 3α). Σύγχρονη σε αυτό, βραχυπρόθεσμη έκθεση της NAC βρέθηκε να είναι σημαντικά τον αποτελεσματικό ενάντια στην έκθεση MWCNTs, ενώ, DMTU δεν ήταν αποτελεσματική. Μακροπρόθεσμη έκθεση τόσο NAC και DMTU έχει δείξει παρόμοια τάση και την αποτελεσματικότητα από την έκθεση MWCNTs, όπως ήταν στην περίπτωση της βραχυπρόθεσμης έκθεσης (Εικόνα 3 β). Σε γενικές γραμμές, μακροχρόνια έκθεση των DMTU και NAC έχει αποδειχθεί λίγο καλύτερη αποκατάσταση στην βιωσιμότητα των κυττάρων από βραχυπρόθεσμα.

(α) Σε βραχυπρόθεσμο ομάδα, τα κύτταρα προ-θεραπεία είτε με της DMTU ή NAC για 30 λεπτά που ακολουθείται από έκθεση του TiO

2-NPs (10 & amp? 50 μg /ml) για 24 ώρες. Σε μακροχρόνια ομάδα, τα κύτταρα λαμβάνουν ένα συν-έκθεσης (24 ώρες) του DMTU /NAC και TiO

2-NPs (10 & amp? 50 μg /ml). Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για μεσολάβηση DMTU /NAC αποκατάσταση της κυτταρικής βιωσιμότητας μειωμένη λόγω TiO

2 Έκθεση-NPs. Όλες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs TiO

2-ΣΔ έκθεσης). ## Ρ & lt? 0,01 (TiO

2-ΣΔ έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC). (Β) Σε βραχυχρόνιες ομάδα, τα κύτταρα προ-αγωγή με είτε DMTU ή NAC για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από έκθεση MWCNTs (10 & amp? 50 μg /ml) για 24 ώρες. Σε μακροχρόνια ομάδα, τα κύτταρα λαμβάνουν ένα συν-έκθεσης (24 ώρες) του DMTU /NAC και MWCNTs (10 & amp? 50 μg /ml). Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για μεσολάβηση DMTU /NAC αποκατάσταση στη βιωσιμότητα των κυττάρων μειώνεται λόγω της έκθεσης MWCNTs. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs έκθεση MWCNTs). ## Ρ & lt?. 0.01 (MWCNTs έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC)

Η

γενιάς ROS

Η στατιστικά σημαντική (p & lt? 0,01) παραγωγή ROS παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 που λαμβάνουν TiO

2-NPs και MWCNTs (10 & amp? 50 μg /ml) για 24 ώρες. Τόσο βραχυπρόθεσμα (30 λεπτά) και μακροπρόθεσμα (24 h) θεραπεία των DMTU και NAC βρέθηκε να είναι αποτελεσματικός σημαντικά (ρ & lt? 0,01) στη μείωση των επιπέδων ROS. Ωστόσο, το μέγεθος της μείωσης των επιπέδων του ROS ήταν μεγαλύτερη σε μακροχρόνια θεραπεία. Μακροχρόνια θεραπεία του NAC ήταν πιο αποτελεσματικό από DMTU (Σχήμα 4 α & amp? Β). Δεν παρατηρήσαμε καμία αύξηση στην ένταση φθορισμού εξαιτίας αιωρούμενα νανοσωματίδια στο μέσο καλλιέργειας (χωρίς κύτταρα). Παρομοίως, δεν παρατηρήθηκε αύξηση του φθορισμού παρατηρήθηκε με μόνη DCFH-DA χρωστικής στο μέσο καλλιέργειας (χωρίς κύτταρα). Οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι οι μεταβολές στην ένταση φθορισμού ήταν λόγω της ενδοκυτταρικής ROS παράγονται μόνο σε κύτταρα Α549.

Γενιάς

ROS ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ‘2, 7-dichlorofluorescin διοξεικό (DCFH-DA) βαφής. (Α) Στην βραχυπρόθεσμη ομάδα, τα κύτταρα προ-αγωγή με είτε DMTU ή NAC για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από έκθεση TiO

2-NPs (10 & amp? 50 μg /ml) για 24 ώρες. Σε μακροχρόνια ομάδα, τα κύτταρα λαμβάνουν ένα συν-έκθεσης (24 ώρες) του DMTU /NAC και TiO

2-NPs (10 & amp? 50 μg /ml). Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για μεσολάβηση DMTU /NAC αποκατάσταση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού ROS, η οποία προκλήθηκε από την έκθεση του TiO

2-NPs. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs TiO

2-ΣΔ έκθεσης). ## Ρ & lt? 0,01 (TiO

2-ΣΔ έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC). Η θετική ομάδα ελέγχου αποτελούμενη από Α549 κύτταρα προ-θεραπεία (1 ώρα) με 500 μΜ H

2O

2. (Β) Σε βραχυχρόνιες ομάδα, τα κύτταρα προ-αγωγή με είτε DMTU ή NAC για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από έκθεση MWCNTs (10 & amp? 50 μg /ml) για 24 ώρες. Σε μακροχρόνια ομάδα, τα κύτταρα λαμβάνουν ένα συν-έκθεσης (24 ώρες) του DMTU /NAC και MWCNTs (10 & amp? 50 μg /ml). Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για μεσολάβηση DMTU /NAC αποκατάσταση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού ROS, η οποία επάγεται από την έκθεση των MWCNTs. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs έκθεση MWCNTs). ## Ρ & lt? 0,01 (MWCNTs έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC). Η θετική ομάδα ελέγχου αποτελούμενη από Α549 κύτταρα προ-θεραπεία (1 ώρα) με 500 μΜ H

2O

2.

Η

κυτταροκίνησης μπλοκάρει δοκιμασία μικροπυρήνων (CBMN-ανάλυση)

οι

Αποτελέσματα του σχηματισμού ΜΝ σε κύτταρα Α549 δείχνεται στο Σχήμα 5 α & amp? σι. Η έκθεση των δύο TiO

2 και MWCNTs επάγει σημαντικό αριθμό ΜΝ σε κύτταρα Α549 σε 24 ώρες από την έκθεση. Σε περίπτωση TiO

2-ΣΔ, η απάντηση ήταν δοσοεξαρτώμενη δηλαδή (12.66 ± 0.66 & amp? 17,33 ± 0,33) σε 10 & amp? 50 μg /ml αντίστοιχα, ενώ η χαμηλότερη δόση MWCNTs (10 μg /ml) προκάλεσε περισσότερο ΜΝ (16,00 ± 0,57) από ό, τι υψηλότερη δόση (50 μg /ml) δηλαδή (13.66 ± 0.33). Τόσο DMTU και NAC βρέθηκαν να είναι αποτελεσματική στη μείωση MN σημαντικά (ρ & lt? 0,01). Η απάντηση της DMTU ήταν μεγαλύτερη κατά TiO

2-ΝΡ από MWCNTs, ενώ, NAC έχει δείξει καλύτερα αποτελέσματα κατά MWCNTs. Αν και, η επίδραση των δύο DMTU και NAC ήταν στατιστικά σημαντικές (ρ & lt? 0.01), αλλά οι τιμές ήταν ακόμη μεγαλύτερες από τις μη εκτεθέντα κύτταρα ελέγχου σε όλες τις συγκεντρώσεις έκθεσης (Σχήμα 5 a & amp? Β). Η διαφορά στην επαγωγή ΜΝ ήταν ασήμαντη ανάμεσα καθαριστή αγωγή Vs ομάδες μη-καθαριστή αγωγή

(α) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε TiO

2-NPs (10 & amp? 50 μg /ml). Με ή χωρίς DMTU (10 mM) και NAC (2 mM) για 24 ώρες. Αιθυλεστέρα (που 6mM) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών διαφάνειες. Ένα σύνολο 1000 κύτταρα bi-πυρήνες (ΒΝ) με σαφώς καθορισμένες κυτταρόπλασμα βαθμολογήθηκαν. Παράλληλες σύνολα επίσης να τρέξει κάτω από τις ίδιες συνθήκες με έκθεση των κυττάρων μόνο με ένα από DMTU ή NAC. Η ομάδα αυτή χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των δεδομένων μεταξύ των οδοκαθαριστών αντιμετωπίζονται Vs κύτταρα επεξεργασμένα μη οδοκαθαριστών. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs TiO

2-ΣΔ έκθεσης). ## Ρ & lt? 0,01 (TiO

2-ΣΔ έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC). (Β) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε MWCNTs (10 & amp? 50 μg /ml) με ή χωρίς DMTU (10 mM) και NAC (2 mM) για 24 ώρες. Αιθυλεστέρα (που 6mM) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών διαφάνειες. Ένα σύνολο 1000 κύτταρα bi-πυρήνες (ΒΝ) με σαφώς καθορισμένες κυτταρόπλασμα βαθμολογήθηκαν. Παράλληλες σύνολα επίσης να τρέξει κάτω από τις ίδιες συνθήκες με έκθεση των κυττάρων μόνο με ένα από DMTU ή NAC. Η ομάδα αυτή χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των δεδομένων μεταξύ των οδοκαθαριστών αντιμετωπίζονται Vs κύτταρα επεξεργασμένα μη οδοκαθαριστών. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων

** P & lt?. 0.01 (που δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs έκθεση MWCNTs). ## Ρ & lt?. 0.01 (MWCNTs έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC)

Η

ανάλυση Western blot

Σε γενικές γραμμές, η έκθεση των δύο (TiO

2-ΣΔ & amp? MWCNTs ) στα 50 μg /ml επάγουν σημαντική ρύθμιση προς τα επάνω των πρωτεϊνών δεικτών γονιδιοτοξικότητας και το οξειδωτικό στρες, δηλαδή, P

53 (3,61 ± 0,40 & amp?. 3.24 ± 0.26 φορές), CYP2E1 (2,62 ± 0,30 & amp? 2,02 ± 0,39 φορές) , HSP27 (1,69 ± 0,47 & amp? 2,56 ± 0,34 φορές) αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του Ρ

53 πρωτεΐνη βρέθηκε να μειωθεί σημαντικά (ρ & lt? 0,01) μετά την αγωγή των δύο DMTU και NAC. Ωστόσο, η ανταπόκριση ήταν πιο έντονη σε κύτταρα Α549 που λαμβάνουν την έκθεση του TiO

2-NPs. Σε περίπτωση CYP2E1, κύτταρα που εκτέθηκαν σε MWCNTs δείξει καλύτερη απόκριση στο DMTU και NAC με πιο έντονο εφέ της NAC. Σε αντίθεση με αυτό, η επίδραση της DMTU ήταν μη σημαντική στα κύτταρα που εκτίθενται σε TiO

2-NPs. Ωστόσο, τόσο DMTU και NAC δεν θα μπορούσε να αποκαταστήσει την έκφραση της HSP27 πρωτεϊνών σημαντικά σε κύτταρα που εκτίθενται σε TiO

2-ΕΠ /MWCNTs (Σχήμα 6 α & amp? Β).

α (Ι) Αξιολόγηση των αλλοιωθεί εκφράσεις πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επαγωγή του οξειδωτικού στρες (HSP27 και CYP2E1) και γονοτοξικότητα (Ρ

53) σε κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε TiO

2-NPs (50 μg /ml) για 24 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Lane (1) δεν έχουν εκτεθεί ελέγχου (2) 50,0 μg /ml TiO

2-NPs (3) 50,0 μg /ml TiO

2-NPs + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml TiO

2-ΝΡ + NAC (2 mM). (II) Σχετική ποσοτικοποίηση (πάσο αλλαγή) πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επαγωγή του οξειδωτικού στρες (HSP27 και CYP2E1) και γονοτοξικότητα (Ρ

53) σε κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε TiO

2-NPs για 24 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Η ποσοτικοποίηση έγινε στο Σύστημα Gel Τεκμηρίωσης (η Alpha Innotech, USA) με τη βοήθεια του λογισμικού AlphaEase

TM FC StandAlone ν.4.0. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs TiO

2-ΣΔ έκθεσης). ## Ρ & lt? 0,01 (TiO

2-ΣΔ έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC). b (i) εκτίμηση των αλλαγμένων εκφράσεων των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επαγωγή του οξειδωτικού στρες (HSP27 και CYP2E1) και γονοτοξικότητα (Ρ

53) σε κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε MWCNTs (50 μg /ml) για 24 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Lane (1) δεν έχουν εκτεθεί ελέγχου (2) 50,0 μg /ml MWCNTs (3) 50,0 μg /ml MWCNTs + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml MWCNTs + NAC (2 mM). (III) Σχετική ποσοτικοποίηση (πάσο αλλαγή) πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επαγωγή του οξειδωτικού στρες (HSP27 και CYP2E1) και γονοτοξικότητα (Ρ

53) σε κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε MWCNTs για 24 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Η ποσοτικοποίηση έγινε στο Σύστημα Gel Τεκμηρίωσης (η Alpha Innotech, USA) με τη βοήθεια του λογισμικού AlphaEase

TM FC StandAlone ν.4.0. Ολες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs έκθεση MWCNTs). ## Ρ & lt? 0,01 (MWCNTs έκθεση Vs θεραπεία DMTU /NAC)

Η

CYP2E1 εξαρτάται n- Νιτρωδοδιμεθυλαμίνη-διμεθυλάση (NDMA-δ) δραστηριότητα

Τα δεδομένα του CYP2E1 εξαρτάται καταλυτική δράση. παρουσιάζονται στο Σχήμα 7. Η καταλυτική δραστικότητα εμφανίζει παρόμοιες τάσεις όπως παρατηρείται στην ανάλυση στυπώματος Western για έκφραση πρωτεΐνης για CYP2E1 σε κύτταρα που εκτίθενται σε TiO

2-NPs και MWCNTs (50 μg /ml). Αυτές οι αλλαγές ήταν σημαντικές (ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με μη εκτεθειμένα ομάδα ελέγχου, καθώς και προς κύτταρα που κατεργάζονται με DMTU /NAC μόνο δηλαδή, 7,54 + 0,86 και 10,96 + 1,20 nmol /mg πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Αν και, τόσο οι περισυλλέκτες δείχνουν σημαντική αποκατάσταση στην ενζυματική δραστηριότητα στα κύτταρα που εκτίθενται σε TiO2-NPs και MWCNTs, αλλά η αποτελεσματικότητα μέγεθος o ήταν περισσότερο σε περίπτωση θεραπείας NAC. Θεραπεία της DMTU ή NAC μόνη δεν έδειξε καμία επίδραση στην ενζυματική δραστικότητα σε σύγκριση με μη εκτεθειμένα ομάδα ελέγχου. Αιθανόλη (10 mM), ένας γνωστός επαγωγέας του CYP2E1 δείχνει πολύ σημαντική (ρ & lt? 0.001). Αυξήσει την NDMA-d δραστικότητα (Εικόνα 7)

Όλες οι τιμές είναι μέσες ± S.E. 3 πειραμάτων.

** P & lt? 0,01 (δεν έχουν εκτεθεί έλεγχο Vs TiO

2 -NPs /MWCNTs έκθεσης). ## Ρ & lt? 0,01 (TiO

2-ΕΠ /MWCNTs έκθεσης Vs θεραπεία DMTU /NAC). Η ειδική δραστικότητα εκφράζεται σε nmol HCHO /min /mg πρωτεΐνης. Αιθανόλη (100 mM), ένας γνωστός επαγωγέας του CYP2E1, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας.

Η

Συζήτηση

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) με τη μεσολάβηση οξειδωτικού στρες έχει προταθεί ένα από τα βασικά συμβάντα πυροδοτεί την νανοσωματίδια που προκαλείται κυτταρο-γονοτοξικότητας [25]. Παρατηρήσαμε επίσης μια δοσοεξαρτώμενη παραγωγή ROS στα κύτταρα Α549 είτε εκτίθενται σε TiO

2-ΣΔ ή MWCNTs στις 10 & amp? 50 μg /ml για 24 ώρες. Το πιο σημαντικό ROS στη σηματοδότηση οξειδοαναγωγής είναι πιθανά H

2O

2 /ΟΗ

• ριζική. Έτσι, για να επιβεβαιωθεί η σηματοδότηση ROS οξειδοαναγωγής, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε H

2O

2 (500 μΜ) για 1 ώρα υπό τις ίδιες συνθήκες, το οποίο χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος πάρα πολύ. H

2O

2 προκάλεσε παρόμοιες απαντήσεις για την παραγωγή ROS, όπως στην περίπτωση των νανοσωματιδίων, γεγονός που υποδηλώνει εμμέσως παρόμοιων μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Η μείωση των ROS με προ /συν-θεραπεία του DMTU και NAC σε κύτταρα Α549, επιβεβαιώνουν περαιτέρω τη συμμετοχή των ROS στη διαδικασία της τοξικότητας και είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [4], [8]. NAC, ένας πρόδρομος της γλουταθειόνης (GSH), είναι ένα σημαντικό κυτταρικό αντιοξειδωτικό και παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων έναντι οξειδωτικού στρες και αναστέλλει το σχηματισμό του H

2O

2

in vitro

[ ,,,0],23], [26]. θεραπεία NAC προκαλεί βελτίωση των κυτταρικό επίπεδο GSH κατευθύνοντας κυστίνη στο μονοπάτι σύνθεσης GSH, επειδή κυστίνη είναι ένα κοινό πρόδρομο τόσο του NAC και GSH [24]. Ενώ η μεγάλη δραστικότητα του μορίου DMTU προς ΟΗ

• οφείλεται στις εξαιρετικά ευνοϊκές ηλεκτρονίων δωρίζοντας τα χαρακτηριστικά της ομάδας σουλφυδρυλίου [22].

Στην παρούσα μελέτη, η κυτταροτοξικότητα του TiO

2-NPs και MWCNTs βρέθηκε να είναι εξαρτώμενη από τη δόση και το χρόνο. Σε περίπτωση TiO

2-NPs, η θεραπεία με DMTU και NAC μειώνει την κυτταροτοξική δράση, γεγονός που υποδηλώνει ότι τόσο το ΟΗ

• ρίζες (ROS) παραγωγή και μείωση στην αντιοξειδωτική άμυνα του συστήματος είναι υπεύθυνα για την μειωμένη βιωσιμότητα. Ενώ στην περίπτωση του MWCNTs η κυτταροτοξικότητα ήταν σημαντικά μειωμένη με κατεργασία NAC. Είναι αξιοσημείωτο ότι DMTU, μια πιο συγκεκριμένη ρίζα υδροξυλίου καθαριστή, δεν ήταν αποτελεσματική στη σαρώσεως ριζών υδροξυλίου στις μετρήσεις μας. Αυτό, απλοποιεί ότι MWCNTs προκαλεί τοξικότητα με τροποποίηση /hampaering την ενζυμική αντιοξειδωτικό σύστημα και όχι από την άμεση πρόκληση ΟΗ

• ριζών στα κύτταρα Α549. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το κλάσμα των ROS που αναστέλλεται από NAC, αλλά όχι από DMTU, θα μπορούσε να είναι ένα διαφορετικό είδος των ελεύθερων ριζών και επίσης η διαφορά στη συμπεριφορά των δύο (TiO

2 και MWCNTs) θα μπορούσε να είναι λόγω της διαφοράς τους σε επιφανειακή δομή [27], το μήκος [28], και η παρουσία του μεταλλικού καταλύτη [29] κλπ Έχουμε επίσης αναφερθεί νωρίτερα ότι MWCNTs μείωσε σημαντικά τα επίπεδα γλουταθειόνης στο δόση και χρονο-εξαρτώμενη τρόπο [15]. Έχει προταθεί ότι η απώλεια της GSH μπορεί να θέσει σε κίνδυνο την κυτταρική αντιοξειδωτικές άμυνες και να οδηγήσει σε επαγωγή ROS [30].

Περαιτέρω, θεραπεία NAC παρέχεται επαρκώς ισχυρή αντιοξειδωτική άμυνα του συστήματος, με αποτέλεσμα την αυξημένη κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων που εκτίθενται σε TiO

2 και MWCNTs. Παρόμοιο είδος της επίδρασης παρατηρήθηκε με ανθρώπινα επιθηλιακά πνεύμονα και επιθηλιακά αεραγωγών γραμμή κυττάρων (HEp-2), όταν συν-θεραπεία με αντιοξειδωτικές NAC και Resverartrol κατά ZnO και νανοσωματιδίων CuO αντίστοιχα [19], [21].

Τόσο ο τύπος νανοσωματιδίων (TiO

2 και MWCNTs) είναι γνωστό ότι επάγουν μικροπυρήνες (MN) σε εξαρτώνται από τη δόση τρόπο, ο οποίος είναι καλά καθορισμένη βιοδείκτη για δοκιμασία γονιδιοτοξικότητα [31]. Τα ευρήματά μας από επαγωγή ΜΝ είναι καλά συνεπής με προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν νανο-TiO

2 σε λεμφοβλαστοειδή κύτταρα [32], και επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα αρουραίου εκτέθηκαν σε MWCNTs [33]. Η προστατευτική δράση του DMTU (10 mM) και NAC (2 mM) για επαγωγή ΜΝ θα μπορούσε να παρατηρηθεί σαφώς στα παρούσες έρευνες (Σχήμα 5 a & amp? Β). μελέτες MN μας ενισχύσει περαιτέρω τον ρόλο του οξειδωτικού στρες στην γονοτοξικότητας που προκαλείται από TiO

2-ΣΔ και MWCNTs σε κύτταρα Α549. Στα προηγούμενα ίνες crocidoloite έρευνα και χρυσότιλου έχουν επίσης αναφερθεί ότι επάγει ΜΝ, οι οποίες μειώνουν σημαντικά μετά από θεραπεία με NAL, ένα συντεθεί άλας της Ν-ακετυλοκυστεΐνη (0,2 mM) και DMTU (20 mM) σε ανθρώπινα μεσοθηλιακών κυττάρων [34].

στις παρούσες έρευνες, ανάλυση στυπώματος western έγινε για να εκτιμηθεί η αλλαγμένη έκφραση των πρωτεϊνών όπως HSP27 και CYP2E1, οι δείκτες του οξειδωτικού στρες, και Ρ

53 ως βιοδείκτη γονιδιοτοξικότητας. Οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs) περιλαμβάνουν αρκετές διαφορετικές οικογένειες πρωτεϊνών που επάγονται σε απόκριση ευρείας ποικιλίας φυσιολογικών και τις περιβαλλοντικές προσβολές. Μία τέτοια πρωτεΐνη είναι HSP27, η οποία επάγεται κατά την διάρκεια ιδιαίτερα συνθήκες στρες. HSP27 είναι γνωστό ότι παρεμβαίνει με ROS προκαλούμενη βασικά συστατικά του αποπτωτικού μονοπατιού σηματοδότησης, και συσχετίζεται με αυξημένη επιβίωση σε απόκριση σε ερεθίσματα κυτταροτοξικών [18]. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ότι σε 50 συγκέντρωση μg /ml, αμφότερα τα νανοσωματίδια (TiO

2-NPs και MWCNTs) επάγεται σημαντική έκφραση της HSP27, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ήταν υπό πίεση. Η θεραπεία της DMTU και NAC δεν παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές στα νανοσωματίδια που προκαλείται από την έκφραση της HSP27. Αυτό δείχνει ότι είτε τα κύτταρα είναι ακόμη υπό συνθήκες στρες ή DMTU και NAC μειώσει το οξειδωτικό στρες με κάποια άλλη διαδρομή υπό τις πειραματικές μας συνθήκες. Περαιτέρω πειράματα με διαφορετικό εύρος των χρονικών σημείων, συγκεντρώσεις έκθεσης, κ.λπ. διεξάγεται για να εξερευνήσετε τη σημασία των αυξημένων επιπέδων της HSP27 στην παρουσία DMTU και NAC σε κύτταρα που εκτίθενται σε αυτά τα νανοσωματίδια.

Η ρύθμιση προς τα πάνω στο έκφραση της πρωτεΐνης του CYP2E1 έχει συσχετισθεί με επαγόμενη σχηματισμό ROS, ανύψωση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων και κυτταροτοξικών βλάβη σε αλκοόλη που προκαλείται hepatotoxcity [35], [36]. Αναφέρουμε το TiO

2-ΣΔ και MWCNTs που προκαλείται από επαγωγή στο συγκεκριμένο NDMA-d καταλυτική δραστηριότητα CYP2E1 και σημαντική αποκατάσταση από δύο scavenges-DMTU και NAC σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα-Α549. Εξ όσων γνωρίζει, τα νανοσωματίδια που επάγεται εκφράσεις πρωτεΐνης και δραστικότητα του CYP2E1 και επακόλουθη επαγόμενη επίπεδα ROS αυτές παρουσιάζονται για πρώτη φορά στην ανθρώπινη καρκίνου του πνεύμονα Α549 κύτταρα. Που προκαλείται από τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CYP2E1 και NDMA-d δραστηριότητα στο παρόν έρευνες υποστηρίζουν επίσης νωρίτερα εύρημα μας στα ίδια κύτταρα που MWCNTs επάγουν την παραγωγή ROS από μικτή δραστηριότητα λειτουργία οξειδάσης παρά μιτοχονδριακή διαταραχή [15]. Μετά την έκθεση του TiO

2-NPs και MWCNTs, επαγόμενη έκφραση και δραστικότητα του CYP2E1 παρατηρήθηκαν, η οποία μπορεί να συσχετισθεί με την επαγωγή ROS και το οξειδωτικό στρες. Καθώς τα δεδομένα μας παραγωγής ROS μετράται με DCFH-DA είναι καλά επιβεβαιωτικά με επαγωγή CYP2E1. Η παρόμοιο είδος συσχέτιση μεταξύ της παραγωγής και CYP2E1 ROS μετά την έκθεση του monocrotophos, ένα οργανοφωσφορικό παρασιτοκτόνο, σε κύτταρα PC12 έχει επίσης αναφερθεί πρόσφατα [37]. Πήραμε μια σημαντική μείωση στα επίπεδα των MWCNTs επάγεται οξειδωτικού στρες και CYP2E1 (έκφραση και δραστικότητα) παρουσία του DMTU και NAC, η οποία επιβεβαιώνει το ρόλο του CYP2E1 σε MWCNTs επαγόμενων τοξικών αποκρίσεων. Ενώ στην περίπτωση του TiO

2-NPs, μόνο NAC βρέθηκε αποτελεσματική στη μείωση της έκφρασης και της δραστηριότητας του CYP2E1. Αυτό δείχνει ότι TiO

2-ΣΔ ασκείται το οξειδωτικό στρες κατά κύριο λόγο από την H

2O

2 παραγωγή και όχι ΟΗ ριζών. Όπως είναι γνωστό DMTU για την εξουδετέρωση του ΟΗ

• ρίζες που σχηματίζονται με μετατροπή της O

2

– παρουσία σιδήρου με μια τροποποιημένη αντίδραση Haber-Weiss [38]. Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρθηκαν επίσης σε παρουσία διαλλυλ-σουλφίδιο (άλλη ομάδα θειόλης που περιέχει την ένωση) σε αιθανόλη μεσολάβηση έκφραση του CYP2E1 στο πολωμένο ηπατικά κύτταρα WIF-Β [39].

Στις παρούσες έρευνες, τα επίπεδα του έκφραση της πρωτεΐνης του Ρ

53 ήταν καλά συσχετίζεται με τα δεδομένα που ελήφθησαν για μικροπυρήνες επαγωγή (MN). Ρ

53 είναι ένα από τα σημαντικά ενεργοποίησης μοριακούς δείκτες για την αξιολόγηση της γονιδιοτοξικότητας σε περίπτωση του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από βλάβη του DNA [10]. Κυτταρική βλάβη από ROS συνδέεται θετικά με P

53 ενεργοποίησης, και επαγωγή της έκφρασης της P

53 πρωτεΐνη έχει προταθεί ως εργαλείο για την ανίχνευση οξειδωτικό στρες που προκαλείται κυτταρο-γονοτοξικότητας [10]. Έτσι, τα αυξημένα επίπεδα Ρ

53 πρωτεΐνη είναι μια ένδειξη της TiO

2-NPs και MWCNTs επάγεται οξειδωτικό στρες που προκαλείται γονιδιοτοξικότητα. Θεραπεία της DMTU και NAC βρέθηκε να είναι αποτελεσματική σημαντικά για να φέρει τους αυξημένα επίπεδα του p

53 πρωτεΐνης σε TiO

2 και MWCNTs εκτεθειμένα κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να συσχετιστεί με την ισχυρή αντιοξειδωτική και αντι-ROS ενεργότητα του DMTU και NAC παρατηρήθηκε στις παρούσες έρευνες, καθώς και σε άλλες μελέτες [34]. Σε μια παρόμοια διαπίστωση Mroz et al. [40] Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η NAC μπλοκάρει τα σωματίδια οδηγούνται π-Ser15-p

53 απόκριση σε κύτταρα Α549.

Εν κατακλείδι, παρούσες έρευνες αποκαλύπτουν ότι TiO

2-ΝΡ (10, 50 μg /ml) και MWCNTs (10, 50 μg /ml) έκθεση για 24 ώρες προκαλεί τους δείκτες του οξειδωτικού στρες και κυτταροπροστατευτικές-γονοτοξικότητα σε κύτταρα Α549. TiO

2-ΣΔ που προκαλείται από τοξικές ανταποκρίσεις με τη μεσολάβηση κυρίως μέσω H

2O

2 γενιάς, και μείωση αντιοξειδωτικό σύστημα άμυνας. Ενώ, στην περίπτωση των MWCNTs, ανεπιθύμητες ενέργειες οφείλονταν κυρίως στην αλλοίωση /παρεμποδίζουν την ενζυματική αντιοξειδωτικό σύστημα. DMTU και NAC βρέθηκαν να είναι αποτελεσματικές σημαντικά στη μείωση των επιπέδων των δεικτών οξειδωτικού στρες και γονιδιοτοξικότητα μελετήθηκε εκτός HSP27.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλες οι συγκεκριμένες χημικές ουσίες και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Chemical Company Pvt. Ltd. St. Louis, ΜΟ, USA, εκτός εάν δηλώνεται διαφορετικά. Όλα τα χημικά και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της υψηλότερης δυνατής καθαρότητας

νανοσωματίδια προετοιμασία

TiO

2-ΣΔ (d & lt?. 25 nm, ειδική επιφάνεια 200-220 m

2 /g, 99.7% βάση καθαρό ίχνος μετάλλου, τετράγωνος σε κρυσταλλογραφικές σύστημα, σφαιρικού σχήματος) χωρίς καμία επικάλυψη αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich, USA, (Cat Νο. 637254), ενώ οι MWCNTs χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη γενναιόδωρα προικισμένη από Dieter g . Weiss, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογικών Επιστημών, Ινστιτούτο Βιολογίας Κυττάρου και Biosystems Τεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Rostock, Γερμανία. Αποστείρωση των νανοσωματιδίων διεξήχθησαν με θέρμανση στους 120 ° C για 2 ώρες και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε πλήρες μέσο DMEM-F12. Στοκ διαλύματα (1 mg /ml) των νανοσωματιδίων υποβλήθηκαν σε υπερήχους για να εξασφαλιστεί η ομοιόμορφη εναιώρημα πριν αραιωθεί με μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποιείται για την έκθεση των κυττάρων [15], [41]. Πριν τη χρήση στα πειράματα, τόσο τα νανοσωματίδια αναλύθηκαν για την παρουσία βακτηριακής ενδοτοξίνης χρησιμοποιώντας Limulus Amebocyte Lysate δοκιμής (LAL).

Χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων

ηλεκτρονίου μικροσκοπία Μεταφοράς.

Η υπερ-δομικός χαρακτηρισμός συμπεριλαμβανομένων υφή, το μέγεθος και την εσωτερίκευση έγινε από τον Ludwig Jonas, Καθηγητής στο Τμήμα Παθολογίας, Electron Μικροσκοπική Κέντρο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο του Rostock, Γερμανίας. Εν συντομία, ΤίΟ

2-NPs και MWCNTs εναιωρήθηκαν σε αποσταγμένο νερό και πέσει σε πλέγματα χαλκού άνθρακα επικαλυμμένο με υμένιο για Ηλεκτρονική Μικροσκοπία. Η διάμετρος του TiO

2-ΣΔ και μήκους /διαμέτρου MWCNTs μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας TEM Libra 120 (Carl Zeiss Oberkochen, Γερμανία) εξοπλισμένο με μορφομετρικών λογισμικό ανάλυσης (στοιχείο OSIS Münster, Γερμανία). Παράλληλη σύνολα των κυττάρων εκτέθηκαν σε TiO

2-NPs και MWCNTs για 24 ώρες στους 37 ° C, σταθεροποιήθηκαν σε γλουταραλδεΰδη (4% σε PBS) και υποβάλλονται σε επεξεργασία για να μελετήσει την φαγοκυττάρωση και πινοκυττάρωση χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΤΕΜ). Εικόνες ελήφθησαν σε διάφορες μεγεθύνσεις από 2K Proscan κάμερα χρησιμοποιώντας το στοιχείο λογισμικού (OSIS Münster, Γερμανία).

σκέδασης Δυναμική φως.

κατανομή μεγέθους και ζήτα δυναμικό του TiO

2-ΣΔ και MWCNTs, μόνες καθώς και με την παρουσία του DMTU και NAC, προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δυναμική σκέδαση φωτός και ανάλυση σκέδασης φωτός φάσης (PALS) σε Zetasizer Nano-ZS, Model ZEN3600 εξοπλισμένο με 4.0mW, 633nm λέιζερ (Malvern Instruments Ltd. , UK) όπως περιγράφεται νωρίτερα από εμάς [15]

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα -. Α549 (ATCC Νο CCL-185TM) που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη είχαν αρχικά αγοραστεί από το Εθνικό Κέντρο