Αφηρημένο

Φλοριτζίνη (φλοριζίνη ή φλωρητίνη 2 ‘-

O

-γλυκοσίτη) είναι γνωστή για το κλείδωμα της εντερικής απορρόφησης της γλυκόζης. Ερευνήσαμε την αντικαρκινική δράση της φλοριτζίνη και τα νέα παράγωγά της, χρησιμοποιώντας ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Έχουμε συντίθενται νέα ακυλιωμένα παράγωγα φλοριτζίνη με έξι διαφορετικά λιπαρά οξέα μακράς αλύσου με χωροεκλεκτική ενζυμική ακυλίωση χρησιμοποιώντας

Candida Antarctica

λιπάση Β Τα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα των νέων ενώσεων διερευνήθηκε σε σύγκριση με τις μητρικές ενώσεις, φλοριτζίνη, αγλυκόνη phloretin, οι έξι ελεύθερα λιπαρά οξέα και χημειοθεραπευτικά φάρμακα (sorafenib, δοξορουβικίνη και η δαουνορουβικίνη) χρησιμοποιώντας ανθρώπινα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος κύτταρα HepG2, αδενοκαρκινώματος μαστού ανθρώπινα κύτταρα MDA-MB-231 και οξεία μονοκυτταρική λευχαιμία ΤΗΡ-1 κύτταρα μαζί με φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα και αρουραίου. Οι εστέρες λιπαρών οξέων του φλοριτζίνη ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των δύο κυττάρων καρκινώματος και λευχαιμία, ενώ παρόμοιες δόσεις θεραπεία δεν ήταν τοξικές σε φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα ή αρουραίου. Η αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα των λιπαρών εστέρων του φλοριτζίνη ήταν συγκρίσιμη με την δραστικότητα των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Οι εστέρες λιπαρών οξέων του φλοριτζίνη ανέστειλε τοποϊσομερασών DNA ΙΙα δραστηριότητα που μπορεί να ωθήσουν G

0 /G

1 φάση σύλληψης, επαγόμενη απόπτωση μέσω ενεργοποίησης της κασπάσης-3, και μειωμένο επίπεδο ΑΤΡ και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε κύτταρα HepG2. Με βάση την υψηλή επιλεκτικότητα για καρκινικά κύτταρα, decosahexaenoic οξύ (DHA) επιλέχθηκε εστέρα του φλοριτζίνη για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης με τη χρήση RT

2PCR συστοιχία ανθρώπινο στόχο φάρμακο του καρκίνου. Αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα του DHA εστέρα φλοριτζίνη θα μπορούσαν να σχετίζονται με την προς τα κάτω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων (BCL2), υποδοχείς αυξητικού παράγοντα (οικογένεια EBFR, IGF1R /IGF2, PDGFR) και οι συνεργάτες κατάντη σηματοδότησης της (ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR, Ras /Raf /MAPK), τα μηχανήματα του κυτταρικού κύκλου (CDKs, τ, TOP2A, TOP2B) καθώς και ρυθμιστές επιγενετική (HDACs). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι λιπαροί εστέρες του φλοριτζίνη έχουν πιθανές επιπτώσεις χημειοθεραπευτικών μεσολάβηση του εξασθενημένου έκφραση πολλών σημαντικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τοποϊσομερασών DNA ΙΙα δραστηριότητα και επιγενετικών μηχανισμών που ακολουθείται από διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Citation.: Nair SVG, Ziaullah, Rupasinghe HPV (2014) εστέρες λιπαρών οξέων Φλοριτζίνη επάγει απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του ήπατος μέσω αλλαγμένη έκφραση γονιδίου. PLoS ONE 9 (9): e107149. doi: 10.1371 /journal.pone.0107149

Επιμέλεια: Gnanasekar Munirathinam, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Μάρτη του 2014? Αποδεκτές: 12 Αύγ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 17, Σεπτέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Nair et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση: HPVR:. Το πρόγραμμα Discovery χορήγηση των Φυσικών Επιστημών και Μηχανικής Συμβούλιο (NSERC? Grant Αριθμός 327.056? https://www.nserc-crsng.gc.ca) της (? Grant Αριθμός 192.020? https://www.acoa-apeca.gc.ca ACOA) το πρόγραμμα Ατλαντικού ταμεία Καινοτομίας (ΟΕΕ) του Ατλαντικού Καναδά Οργανισμού Ευκαιρίες Καναδά και. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), η πιο κοινή μορφή καρκίνου του ήπατος, αντιπροσωπεύουν την πέμπτη σε όλο τον κόσμο κακοήθεια και την τρίτη αιτία θνησιμότητας μεταξύ θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο [1]. Στον Καναδά, η συχνότητα εμφάνισης ΗΚΚ έχει αυξηθεί κατά τις τελευταίες δεκαετίες [2]. HCC αντιπροσωπεύει το 71,9% των καρκίνων του ήπατος σε άνδρες και γυναίκες στον Καναδά. Σύμφωνα με την καναδική Στατιστικές καρκίνου το 2013, η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του ήπατος στον Καναδά έχει αυξηθεί κατά 3,6% ανά έτος, και το ποσοστό θνησιμότητας αυξήθηκε κατά 2,2% ετησίως. Οι παράγοντες που συμβάλλουν του HCC περιλαμβάνουν επαφή με hepatocarcinogens ιδιαίτερα αφλατοξίνες [3], ηπατική ιογενή λοίμωξη και κίρρωση του ήπατος [4]. Οι πιθανές θεραπευτικές επιλογές θεραπείας είναι η χειρουργική εκτομή, μεταμόσχευση ήπατος, και εκτομή ή διαρτηριακές εμβολισμός [1]. Η χημειοθεραπεία, προφορική κινασών αναστολέας sorafenib (Nexavar) είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη για τη θεραπεία της HCC, αλλά το κέρδος στην επιβίωση είναι μικρή [5]. Η μη διαθεσιμότητα αποτελεσματικών θεραπειών και το υψηλό ποσοστό επικράτησης έχει οδηγήσει στην αναζήτηση νέων προσεγγίσεων κατάλληλο για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος. Ως αποτέλεσμα, πολλές φυτοχημικά έχουν διερευνηθεί ως δυνητικούς παράγοντες προφύλαξης που μπορεί να ανατρέψει ή να καταστείλει ηπατοκαρκινογόνου εξέλιξη.

Τα φλαβονοειδή, μια από τις κύριες κατηγορίες των πολυφαινολών, έχουν δείξει κάποια χημειοπροληπτικές ιδιότητες κατά HCC σε ένα τεράστιο αριθμό των σε vitro [6], [7] και in vivo μελέτες [1], [8]. Φλοριτζίνη (φλοριζίνη ή phloretin 2 ‘-

O

-γλυκοσίτη), ένα διυδροχαλκόνη, είναι ένας από τους σημαντικότερους φαινολικών φλαβονοειδών γλυκοζιτών βρέθηκαν σε μήλο [9]. Η κύρια φαρμακολογική δράση της φλοριτζίνη είναι η αναστολή της μεταφορέων γλυκόζης που συνδέονται εξαρτώμενου από νάτριο (SGLT1 και SGLT2) που μπλοκάρει εντερικής απορρόφησης της γλυκόζης και να παράγει νεφρική γλυκοζουρία [9]. Εκτός από την αντιδιαβητική ιδιοκτησία τους, φλοριτζίνη έχει άλλες βιολογικές δραστηριότητες, όπως η αναστολή της υπεροξείδωσης λιπιδίων [10], την πρόληψη της οστικής απώλειας σε αρουραίους [11] και την ενίσχυση της μνήμης σε ποντικούς [12]. Φλοριτζίνη διεγείρουν μελανογένεση με την αύξηση της γονιδιακής έκφρασης τυροσινάσης μέσω της οδού σηματοδότησης cAMP [13]. Φλορετίνη, το άγλυκο του φλοριτζίνη, έχει αναφερθεί ότι έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση σε υπεροξεινιτρικό σάρωσης και την αναστολή της υπεροξείδωσης λιπιδίων [14]. Η γλυκοζυλίωση σε 2-ΟΗ μείωσε τις αντιοξειδωτικές δραστηριότητες των φλοριτζίνη κατά 18 φορές σε σύγκριση με Φλορετίνη [14]. Φλορετίνη στις συγκεντρώσεις 100 μΜ επαυξημένης ΤΝΡα σχετίζονται συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) προκληθείσα απόπτωση και κυτταροτοξικότητα σε LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη [15]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αναφορά σχετικά με τις καρκίνο χημειοπροληπτική επιδράσεις της φλοριτζίνη. Σε μια μελέτη αντικαρκινική δράση των πολυφαινολών μήλο, φλοριτζίνη δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των μεταμοσχευμένων είτε κύτταρα μελανώματος Β16 ποντικού ή κύτταρα μαστικού όγκου BALB-MC.E12 ποντικού [16].

Στο εργαστήριο μας, φλοριτζίνη ήταν χωροεκλεκτικώς ακυλιωμένη με μια σειρά από μακράς αλυσίδας, κορεσμένα, μονο- και πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα με τη χρήση ακινητοποιημένης λιπάσης Β, από

Candida antarctica

(Novozyme 435) [17]. Λιπάση καταλυόμενη εστεροποίηση και μετεστεροποίηση των φλαβονοειδών γλυκοζιτών έχουν αναφερθεί ότι αυξάνουν τη λιποφιλικότητα και βελτιωμένη αντικαρκινική δράση της μητρικής ένωσης [18]. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την κυτταροτοξικό δυναμικό των εστέρων λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη επί κυτταρικού πολλαπλασιασμού των συμπαγών όγκων, όπως το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων HepG2 και κύτταρα αδενοκαρκινώματος στήθους MDA-MB-231, καθώς και την οξεία λευχαιμία μονοκύτταρα ΤΗΡ-1 κύτταρα. Φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα HP-F και ηπατοκύτταρα αρουραίου RTCP10 χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να προσδιοριστεί η ειδικότητα των εστέρων επί καρκινικών κυττάρων. Αυτή είναι η πρώτη φορά που αυτές οι νέες εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη έχουν ελεγχθεί για αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον για τη διαλεύκανση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών των εστέρων λιπαρών οξέων των φλοριτζίνη επί κυττάρων HepG2, τοποϊσομερασών DNA ΙΙα δραστηριότητα, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης, δραστικότητα κασπάσης 3 και σχετικές διαδικασίες αποπτωτικό ερευνήθηκαν επίσης. Επιπλέον, αναλύσαμε την επίδραση της decosahexaenoic οξύ (DHA) εστέρα του φλοριτζίνη στην έκφραση των γονιδίων 84 ότι οι στόχοι για αντικαρκινικές θεραπευτικές ουσίες και ανάπτυξης φαρμάκων. Τα αποτελέσματά μας παρέχεται πειραματική απόδειξη για να υποστηρίξει την περαιτέρω διερεύνηση των εστέρων λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη ειδικά DHA εστέρα φλοριτζίνη ως αποτελεσματικό και ασφαλές χημειοθεραπευτικών υποψήφιος.

Υλικά και Μέθοδοι

Δοκιμή των ενώσεων και των χημικών ουσιών

Οι εστέρες λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη (Ρζ) δηλ. εστέρας στεατικού οξέος του Pz (Pz-στεατικό οξύ), εστέρας ελαϊκού οξέος του Pz (Pz-ελαϊκό οξύ), εστέρα λινελαϊκού οξέος Pz (Pz-λινολεϊκό οξύ), εστέρα α-λινολενικό οξύ του Pz (Pz-α-λινολενικό οξύ ), DHA εστέρα Pz (Ρζ-DHA) και εστέρα εικοσιπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) των Pz (Ρζ-ΕΡΑ) συντέθηκαν στο εργαστήριο μας όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [17].

Φλοριτζίνη, φλορετίνη, κασπάσης 3 χρωματομετρική κιτ δοκιμασίας, ιωδιούχο προπίδιο, λιπαρά οξέα δηλαδή ελαϊκό οξύ, στεατικό οξύ, λινελαϊκό οξύ, α-λινολενικό οξύ, ΕΡΑ και DHA αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Καναδά. Κυττάρων Titer 96 Aqueous δοκιμασία Μία λύση πολλαπλασιασμού των κυττάρων (MTS), CytoTox 96 μη ραδιενεργά κυτταροτοξικότητα (LDH) προσδιορισμού και κιτ δοκιμασίας φωταύγειας CellTiter-Glo αγοράστηκαν από την Promega, Madison, WI, USA. Αποστειρωμένο διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (ATCC), GFP-πιστοποιημένων κιτ ανίχνευσης απόπτωσης /νέκρωσης για μικροσκοπία από Enzo Life Sciences, Brockville, ON, Καναδάς? ApoTarget Γρήγορη αποπτωτικά DNA κιτ ανίχνευσης Ladder από Invitrogen, Burlington, ON, Καναδάς? DCFDA-Cellular Reactive Oxygen Είδος δοκιμασία ανίχνευσης μορφή κιτ Abcam, Toronto, ON, Καναδάς? και 5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδίδιο (JC-1) από την Cayman Chemicals, Burlington, ΟΝ, Canada χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την μελέτη.

οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HepG2) και ΤΗΡ-1 μονοκυτταρικά κύτταρα οξείας λευχαιμίας αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA (Dalhousie University βιοασφάλεια αριθμό πιστοποιητικού για χρήση των κυτταρικών σειρών είναι 2.013 – 10). κύτταρα HepG2 αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (ΕΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% FBS (ATCC) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (ΑΤΟΟ). Τα κύτταρα ΤΗΡ-1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο 0.05 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό σε μια τελική συγκέντρωση 10%. MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού (ATCC ΗΤΒ-26) ελήφθησαν από την Cedarlane, Berlington, ΟΝ, Canada) και διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM (Sigma-Aldrich Καναδά) συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη , 2 mM Ε-γλουταμίνη, 5 mM HEPES (ρΗ 7.4) και 10% θερμικά-αδρανοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen, Burlington, ΟΝ, Canada). Κρυοσυντηρημένα φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (HP-F), επιμετάλλωση μέσο και συντήρηση των ηπατοκυττάρων μέσο ηπατοκυττάρων αγοράστηκαν από Zen-Bio, Έρευνας Tiangle Park, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα απλώνονται επί πλακών επικαλυμμένων 96 φρεατίων κολλαγόνο 1 κυτταρικής καλλιέργειας (Life Technologies) και διατηρήθηκαν σε μέσον συντήρησης ηπατοκυττάρων για 24 ώρες για να καταστεί δυνατή η ανάκτηση των κυττάρων και προσκόλληση. ηπατοκύτταρα αρουραίου (RTCP10), απόψυξη των μέσων ενημέρωσης και των μέσων ενημέρωσης επώασης αγοράστηκαν από την Life Technologies. ηπατοκύτταρα αρουραίου επιστρώθηκαν σε κολλαγόνο 1 επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων (Life Technologies, Burlington, ΟΝ, Canada) χρησιμοποιώντας μέσα απόψυξη και διατηρήθηκαν σε μέσο επώασης. Όλοι οι τύποι κυττάρων διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα κάτω από 5% CO

2/95% ατμόσφαιρα αέρα σε σταθερή υγρασία.

Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο (Bright-Line αιμοκυτταρόμετρο Sigma-Aldrich Canada) και απλώθηκαν ανάλογα με τον αριθμό των κυττάρων για κάθε πείραμα σε 6, 24 ή 96 φρεατίων για 24 ώρες πριν από την προσθήκη των δειγμάτων δοκιμής. Όλα τα δείγματα δοκιμής διαλυτοποιήθηκαν σε στείρο διηθημένο DMSO (& lt? 0,5% στο μέσο καλλιέργειας) πριν από την προσθήκη στο μέσο καλλιέργειας. Τα κύτταρα ελέγχου ήταν επίσης λειτουργούν παράλληλα και υποβάλλεται στις ίδιες αλλαγές σε μέσα με & lt? 0,5% DMSO

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας MTS.. Εν συντομία, τα κύτταρα HepG2 (5 × 10

3 κύτταρα /100 μί /φρεάτιο), MDA-MB-231 (5 × 10

3 κύτταρα /100 μί /φρεάτιο), ΤΗΡ-1 (25 × 10

3/100 μί /φρεάτιο), φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα αρουραίου και (1 × 10

4 κύτταρα /100 μL /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν, σε 96 φρεατίων αποστειρωμένες επίπεδες πλάκες ιστοκαλλιέργειας πυθμένα. Μετά από επώαση 24 h, φλοριτζίνη λιπαροί εστέρες, φλοριτζίνη, φλορετίνη, ελεύθερα λιπαρά οξέα των αντίστοιχων εστέρων ή sorafenib παρασκευάστηκαν σε μέσα και 100 μL από κάθε θεραπεία προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, κάθε θεραπεία σε τρεις επαναλήψεις. Με αυτόν τον τρόπο, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.1, 1, 10, 25, 50, 75, 100 μΜ) κάθε θεραπείας. Έλεγχοι αποτελούνται από κύτταρα με μέσα που περιέχουν DMSO (& lt? 0,5%), δοκιμή κενό φρεάτια περιείχαν την ένωση δοκιμής σε μέσο χωρίς κύτταρα και κενό φρέατα περιείχαν μέσο χωρίς κύτταρα. Μετά από επιπλέον 3, 6, 12, 18 ή 24 ώρες, 20 μL του αντιδραστηρίου MTS, σε συνδυασμό με τον παράγοντα σύζευξης ηλεκτρονίων, φαιναζίνη προστέθηκαν στα φρεάτια και τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή για 3 ώρες. Απορρόφηση στα 490 nm (OD490) μετρήθηκε με τη χρήση ενός αναγνώστη μικροπλακός Flurostar Optima (BMG Labtech, Cary, NC, USA) για να ληφθεί ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τον πληθυσμό ελέγχου. Ποσοστό βιωσιμότητα των κυττάρων ένωσης δοκιμής σε επεξεργασία εκφράζονται ως ποσοστό συγκριτικά με τον έλεγχο (& lt? 0,5% DMSO). ΕΚ

50 τιμές (συγκέντρωση που απαιτείται για να μειωθεί κύτταρα βιωσιμότητα κατά 50% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου) για κάθε ένωση δοκιμής αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Graphpad Prism λογισμικό, La Jolla, CA, USA. Η επιλεκτική δείκτης (SI) του λιπαρού οξέος εστέρες φλοριτζίνη ορίζεται ως ο λόγος της κυτταροτοξικότητας (ΕΚ

50 τιμές) σε φυσιολογικά κύτταρα ΗΡ-F σε στερεά καρκίνο HepG2, MDA-MB-231 κύτταρα (SI = ΕΚ

50 σε κύτταρα HP-F /ΕΚ

50 σε στερεά καρκινικά κύτταρα). Δείγματα με SI τιμές μεγαλύτερες από τρεις θεωρήθηκαν ότι έχουν υψηλή εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα.

δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) είναι μια σταθερή κυτοσολικό ένζυμο που απελευθερώνεται κατά την βλάβη της μεμβράνης σε αποπτωτικά /νεκρωτικά κύτταρα. δραστηριότητα LDH μετρήθηκε χρησιμοποιώντας CytoTox 96 μη ραδιενεργό ποσοτικό προσδιορισμό κυτταροτοξικότητας (Promega, Madison, WI, USA), στην οποία LDH αποδεσμεύεται στα υπερκείμενα καλλιέργειας μετράται με ένα συζευγμένο ενζυμικό προσδιορισμό, με αποτέλεσμα μετατροπή ενός άλατος τετραζολίου σε ένα κόκκινο προϊόντος φορμαζάνης. κύτταρα HepG2 (5000/100 μλ /φρεάτιο) σπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 μΜ εστέρων φλοριτζίνη λιπαρών οξέων, φλοριτζίνη, φλορετίνη, ελεύθερα λιπαρά οξέα των αντίστοιχων εστέρων ή sorafenib παρασκευάζονται σε μέσο ελεύθερο ορού και επωάστηκαν (37 ° C, 5% CO

2) επί 6 ώρες. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε σε πλάκα δοκιμασίας, και η LDH αποδεσμεύεται από τα κύτταρα σε μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε. Η μέγιστη απελευθέρωση λήφθηκε μετά την αγωγή κύτταρα μάρτυρες με 1% Triton Χ-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αποπτωτική /νεκρωτική ποσοστό εκφράστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: (τιμή δείγματος /μέγιστη απελευθέρωση) χ 100%. Προηγούμενες μελέτες από τον προμηθευτή ανέφερε σαφώς ότι σε κύτταρα HepG2, η μέγιστη συγκέντρωση δραστηριότητα LDH είναι 1 έως 6 ώρες επωάσεων επειδή δραστηριότητα LDH που απελευθερώνεται από κύτταρα έχει χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 9 ώρες [19]. MTS αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι όλες οι εστέρες λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη ανέστειλε 70-80% του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε 6 ώρες, ως εκ τούτου, αναλύσαμε δραστηριότητα LDH μετά από 6 ώρες επώασης.

Η μορφολογική παρατήρηση απόπτωσης σε κύτταρα HepG2

2.5.1. παρατήρηση μορφολογική υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων.

κύτταρα HepG2 ήταν εξίσου σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων επίπεδων πλακών καλλιέργειας κατεργάζεται κάτω ιστού (BD Biosciences), και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 μΜ από εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη , sorafenib και DMSO (& lt? 0,5%) έλεγχο. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, η μορφολογία των κυττάρων HepG2 παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης ανεστραμμένης φάσης (Nikon Eclipse Ε 100, Nikon, Mississauga, ON, Καναδάς) και συνελήφθησαν σε μεγέθυνση 400Χ χρησιμοποιώντας Infinity ψηφιακή φωτογραφική μηχανή μικροσκόπιο (Lumenera Corporation, Οττάβα, ON, Canada).

2.5.2. Προσδιορισμός απόπτωσης /νέκρωσης με μικροσκόπιο φθορισμού.

κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε Nunc Lab-Tek δύο slide θάλαμο (Sigma-Aldrich Καναδά) σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /θάλαμο. Τα προσκολλημένα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με εστέρες 100 μΜ λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib ή φορέα DMSO (ως έλεγχος) για 24 ώρες. Τα πλακίδια πλύθηκαν με αραιωμένο ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά. Μετά την απομάκρυνση του θαλάμου, κάθε διαφάνεια προστέθηκε με 50 μι Αντιδραστηρίου Διπλή Ανίχνευσης που περιέχει αντιδραστήριο ανίχνευσης απόπτωσης (αννεξίνη V-EnzoGold) και αντιδραστήριο ανίχνευσης νέκρωση (7-AAD) σε ρυθμιστικό σύνδεσης 1Χ. Τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης και καλύπτονται με καλυπτρίδα γυάλινη. Τα χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα φθορισμού Zeiss Axiovert 200 m ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Toronto, ON, Καναδάς) σε μεγέθυνση × 40 με ένα φίλτρο που για Annexin V-EnzoGold (Ex /Em: 550/570 nm) και 7 -Aad (Ex /Em: 546/647 nm).

Ανάλυση της απόπτωσης από DNA κατακερματισμός

HepG2 (1 × 10

5) κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 24 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με εστέρες 100 μΜ λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib ή φορέα DMSO (ως έλεγχος). Οι πλάκες ξανά επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες. κατάτμηση DNA ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης Ladder ApoTarget Quick αποπτωτικά DNA (Invitrogen, Burlington, ΟΝ, Canada) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αρχή περιλαμβάνει την ανίχνευση των ενδοπυρηνοσωμικού θραύσματα DNA που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της απόπτωσης. Εν συντομία, τα επιπλέοντα τα νεκρά κύτταρα και επεξεργασία με θρυψίνη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 rpm για 10 λεπτά. Μετά από πλύσιμο με αραιωμένο ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά, τα κύτταρα λύθηκαν με 35 μΐ ΤΕ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (ένα συστατικό κιτ). Στο προϊόν λύσης, 5 μΐ ενζύμου Α (ένα συστατικό κιτ) προστέθηκε και επωάστηκε στους 37 ° C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, 5 μΐ ενζύμου Β (ένα συστατικό κιτ) προστέθηκε, αναμίχθηκαν απαλά και επωάστηκαν σε 50 ° C για 30 λεπτά. Το DNA καταβυθίστηκε με την οξικό αμμώνιο και απόλυτης αιθανόλης στους -20 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση (10 λεπτά στις 12.000 rpm) και ξήρανση στον αέρα, το σφαιρίδιο DNA διαλύεται σε 30 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αναστολής DNA. Για την ανίχνευση της σκάλας DNA, τα εκχυλισμένα δείγματα DNA έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,2% που περιέχει 0,5 μg /mL κόκκινο γέλη σε Τρις-βορικό-ΕϋΤΑ (ΤΒΕ) ρυθμιστικό διάλυμα. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η εικόνα τζελ συνελήφθη χρησιμοποιώντας Gel Doc 100 σύστημα (Bio-Rad, Mississauga, ON, Καναδάς).

Δοκιμασία της κασπάσης-3 Δραστηριότητα

Η δράση της κασπάσης 3 ενζύμου ήταν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κασπάσης 3 χρωματομετρική κιτ δοκιμασίας αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich. HepG2 κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο), αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 100 μΜ εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib ή φορέα DMSO (ως έλεγχος). Τα κύτταρα λύθηκαν και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του κυτταρολύματος ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Ottawa, ΟΝ, Canada). δραστικότητα κασπάσης-3 μετρήθηκε στα 200 μg του κυτταρικού λύματος χρησιμοποιώντας κασπάσης-ειδικό πεπτίδιο υπόστρωμα, DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), συζευγμένο με ρεπόρτερ ρ-νιτροανιλίνης (ρ-ΝΑ) μόρια. Η διάσπαση αυτού του πεπτιδίου από την κασπάση απελευθερώνει το χρωμοφόρο η οποία μετράται χρωματομετρικά σε μήκος κύματος 405 nm, όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του προμηθευτή.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

κύτταρα HepG2 επιστρώθηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα ανά ml σε μια έξι-φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώασης (37 ° C, 5% CO

2), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib ή DMSO (& lt? 0,5%) ελέγχου παρασκευάστηκε σε μέσα και επωάζονται για επιπλέον 24 ώρες. Μετά θρυψινοποίηση, τα κύτταρα πλύθηκαν και υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 2000 χ g για 10 λεπτά και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 0.5 mL PBS. Η σταθεροποίηση ολοκληρώθηκε με την προσθήκη 1,2 ml 70% ψυχρής αιθανόλης για 2 ώρες. Τα στερεωμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και φυγοκεντρήθηκε στα 2000 χ g για 10 λεπτά. Μετά την αναστολή κυττάρων σε 0,3 mL PBS, 8 μλ ϋΝΑάση δωρεάν RNAse (10 mg /ml) προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα. Μετά την προσθήκη, 15 μλ ιωδιούχου προπιδίου (0.5 mg /mL), τα κύτταρα επωάστηκαν σε 4 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα αναλύθηκαν για κυτταρικό κύκλο με χρήση κυτταρομέτρου ροής FACS Calibur (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και εκπομπή στα 670 nm. περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε με ModFit λογισμικού (Verity Software House, Topsham, ME, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής), το οποίο προέβλεπε ιστογράμματα για να αξιολογήσει τη διανομή του κυτταρικού κύκλου.

μιτοχονδριακού μεταβολισμού της ενέργειας Αναλύσεις

δοκιμασία επιπέδου ATP.

επίπεδα Cellular ΑΤΡ μετρήθηκαν με CellTiter-Glo κιτ δοκιμασίας φωταύγειας που λαμβάνεται από την Promega σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. HepG2 κύτταρα απλώνονται σε μαύρο τοιχώματα σαφής κάτω πλάκα 96 φρεατίων επωάστηκαν με εστέρες 100 μΜ λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib, ελεύθερα λιπαρά οξέα ή DMSO (& lt? 0,5%) ελέγχου στα μέσα ενημέρωσης. Μετά από 24 ώρες, CellTiter-Glo Αντιδραστήριο ίσος με τον όγκο του κυτταροκαλλιέργειας παρούσης μέσο σε κάθε φρεάτιο και αναμιγνύεται περιεχομένων για 2 λεπτά σε τροχιακό αναδευτήρα για να επάγει κυτταρική λύση. Η φωταύγεια καταγράφηκε σε Flurostar Optima ανάγνωσης μικροπλάκας (BMG Labtech) μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά για να σταθεροποιηθεί φωταύγειας του σήματος. Το επίπεδο της ΑΤΡ σε ένα δείγμα παρουσιάστηκε ως ποσοστό σε σύγκριση με το μάρτυρα.

δυναμικού της μεμβράνης μιτοχονδριακού (ΜΜΡ).

κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε ένα μαύρο τοιχώματα σαφές κάτω των 96 και στείρα επίπεδη πλάκες πυθμένα καλλιέργειας ιστού (BD Biosciences, USA) σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο (100 μL) και επωάζονται σε

2 επωαστήρα για 24 ώρες στους 37 ° C CO. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib, ελεύθερα λιπαρά οξέα ή DMSO (& lt? 0,5%) ελέγχου παρασκευάστηκε σε μέσα και επωάζονται για 24 ώρες. Το διάλυμα χρώσης JC-1 παρασκευάστηκε με PBS και 5 μΜ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά την έκπλυση της πλάκας με PBS δύο φορές, ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών Fluostar Optima (BMG Labtech) στα 535 nm για JC-1 μονομερών και στα 590 nm για JC-1 συσσωματώματα.

Ανθρώπινο τοποϊσομεράση ΙΙα ( topo ΙΙα) καταλυτική δραστηριότητα

καταλυτική δραστηριότητα της topo ΙΙα παρακολουθήθηκε μέσω ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιώντας τοποϊσομεράσης II κιτ διαλογής φαρμάκων (TopoGEN, Inc., Columbus, Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Εν συντομία, 20 μΙ μιγμάτων αντίδρασης περιείχε 0.5 Μ Tris-HCl, ρΗ 8.0, 1.5 Μ NaCl, 100 mM MgCl

2, 20 mM ΑΤΡ, 300 μg BSA /ml και 5 mM διθειοθρεϊτόλη. Υπερελίκωση DNA (pHOT1 DNA), υπερελικωμένου παρέχεται στο κιτ προσδιορίστηκε ότι είναι ιδανικό για την δοκιμασία αυτή, επειδή είναι μικρό και εύκολο στο χειρισμό και έχει ένα μεγάλο αριθμό από στοιχεία αναγνώρισης topo ΙΙα. Μετά προστέθηκε 2 μι (0,25 μg) του pHOT1 DNA, που ακολουθείται από την προσθήκη 100 μΜ εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, φλορετίνη, sorafenib ή DMSO (& lt? 0,5%) έλεγχος σε διαλύτη, η αντίδραση άρχισε με προσθήκη 4 μονάδων (2 μί) του ανθρώπινου DNA topo ΙΙα και διεξάγεται σε 37 ° C για 30 λεπτά. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 2 μΙ 10% δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS) που ακολουθείται από πέψη με 2 μι πρωτεϊνάση Κ (50 μg /mL) στους 37 ° C για 15 λεπτά για να υποβαθμίσει ένζυμο. Μετά την προσθήκη 2 μι ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (0,25% κυανούν βρωμοφαινόλης και 50% γλυκερόλη) προστέθηκε στο μίγμα, τα δείγματα φορτώθηκαν σε πήκτωμα 1% αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη σε 66 V (2 V /cm) για 5 ώρες σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ χρησιμοποιώντας Biorad ηλεκτροφορητικής System Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Υπερελίκωση DNA (pHOT1 DNA) και χαλαρή DNA συμπεριλήφθηκαν στην ηλεκτροφόρηση τρέξει ως δείκτες για την τοπολογία του DNA. Τα πήγματα στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,5 μg κόκκινο γέλη /mL σε ΤΒΕ για 30 λεπτά και αποχρωματίζονται για 15 λεπτά σε απεσταγμένο νερό πριν από την απόκτηση ψηφιακής εικόνας χρησιμοποιώντας Gel Doc 100 σύστημα (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Μία μονάδα δραστικότητας τοποϊσομεράσης II ορίστηκε ως η ελάχιστη ποσότητα ενζύμου που απαιτείται για να επιτευχθεί πλήρης χαλάρωση του 0,5 mg υπερελικοειδή DNA pHOT1 σε 30 λεπτά στους 37 ° C. Η αναστολή της δραστηριότητας χαλάρωσης τοποϊσομεράσης II διερευνήθηκε με την ίδια διαδικασία χρησιμοποιώντας τέσσερις μονάδες ενζύμου και 100 ενώσεις δοκιμής μΜ. Η επί τοις εκατό αναστολής υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: όπου S

έλεγχος είναι το ποσοστό του υπερελικωμένου DNA στη λωρίδα ελέγχου (χωρίς ένζυμο και ενώσεις δοκιμής), S

0 είναι η επί τοις εκατό του υπερελικωμένου DNA στη λωρίδα χωρίς ενώσεις δοκιμής και S είναι το ποσοστό του υπερελικωμένου DNA στη λωρίδα με υπό εξέταση ενώσεις και το ένζυμο.

ανάλυση Real Time RT-PCR

προφίλ γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν από κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με DHA εστέρες φλοριτζίνη ή sorafenib ή DMSO επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Σύνολο εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Arum Ολικό RNA MINIKIT (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση φορμαλδεΰδης πηκτής αγαρόζης. RNA (400 ng) χρησιμοποιήθηκε για να συνθέσει cDNA χρησιμοποιώντας RT

2 κιτ First Strand (SABiosciences, Frederick, MD, USA). RT

2 RNA QC PCR συστοιχίες (SABiosciences, Frederick, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η ποιότητα των δειγμάτων cDNA πριν το χαρακτηρισμό με τους στόχους του ανθρώπου φάρμακο για τον καρκίνο RT

2 profiler σειρά PCR (SABiosciences, Frederick, MD, ΗΠΑ). προφίλ γονιδιακής έκφρασης των 84 γονιδίων διερευνήθηκαν με τη χρήση των στόχων ανθρώπινων καρκινικών φαρμάκων RT

2 profiler σειρά PCR (PAH-507ZD) σε Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιώντας RT

2 σε πραγματικό χρόνο SYBR πράσινο κύριου μείγματος PCR (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Η συστοιχία έχει επίσης πέντε γονίδια αναφοράς (βήτα-2-μικροσφαιρίνη (Β2Μ), φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της υποξανθίνης-1 (HPRT1), ριβοσωμική πρωτεΐνη L13a (RPL13A), αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), και βήτα ακτίνης (ACTB), τρεις αντίστροφη ελέγχους μεταγραφής (ΔΔΠ που είχαν), τρεις θετικοί έλεγχοι PCR (τα PPC), και ένα γονιδιωματικό ελέγχου DNA (GDC), κάνοντας μέχρι και 96 προσδιορισμούς. Μετά από κανονικοποίηση με γονίδιο αναφοράς RPL13A, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μεμονωμένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον κύκλο κατωφλίου (Ct) τιμές χρησιμοποιώντας RT

2 profiler PCR λογισμικό ανάλυσης δεδομένων array (Microsoft Excel με βάση το πρόγραμμα της SABiosciences, Mississauga, ON, Καναδάς) υπολογίζει: 1) ΔΟΙ κάθε γονιδίου = Ct του γονιδίου που μας ενδιαφέρει – μέσο Ct των επιλεγμένων αναφοράς. γονίδια 2) ΔΔCt για κάθε γονίδιο σε δύο ομάδες? ΔΔCt = ΔCt (εστέρα ή sorafenib Pz-DHA) – ΔΟΙ (ελέγχου) & amp? 3) φορές αλλαγή για κάθε γονίδιο από την ομάδα ελέγχου για την ομάδα που έλαβε αγωγή Pz-DHA εστέρα ως 2

(- ΔΔCt). RT

2 στοιχεία RNA QC PCR έδειξε καμία μόλυνση γονιδιακό DNA (Ct & lt? 35 θα δείξει τουλάχιστον GDC) ή παρουσία προσμίξεων στα δείγματα RNA με βάση την τιμή Ct της ΔΕΗ (Ct πρέπει να είναι 20 ± 2 σε κάθε σειρά) και δεν έδειξε αναστολή της ανάστροφης μεταγραφής με βάση τις τιμές Ct των RTC και ΔΕΗ. Αναπαραγωγιμότητα διατηρήθηκε με τη χρήση τριών βιολογικά αντίγραφα από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Στατιστικές αναλύσεις

ΕΚ

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 6 λογισμικό (GraphPad Software Inc., San Diego CA, ΗΠΑ). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Συστήματος Στατιστικής Ανάλυσης (SAS, Version 9.2). Μονόδρομη ANOVA με συγκρίσεις post hoc κατά Tukey σε P & lt? 0,001 χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές συγκρίσεις. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή με την τυπική απόκλιση υποδεικνύεται (Μέση τιμή ± SD).

Αποτελέσματα

αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα των εστέρων λιπαρών οξέων των φλοριτζίνη σε διάφορες καρκινικές και φυσιολογικά κύτταρα

στην παρούσα μελέτη, οι δυνητικές κυτταροτοξικά αποτελέσματα του εστέρες λιπαρών οξέων φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, ελεύθερα λιπαρά οξέα και φλορετίνη, καθώς και πρότυπο εμπορικό αντικαρκινικά φάρμακα διερευνήθηκαν για τα ανθρώπινα ηπατοκαρκινώματος (HepG2), αδενοκαρκίνωμα του μαστού (MDA-MB-231) και οξεία μονοκυτταρική λευχαιμία (ΤΗΡ-1) κυτταρικές σειρές, πρωτογενή φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα και ηπατοκύτταρα αρουραίου χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS. Η δοκιμασία έδειξε ότι οι εστέρες λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη σκοτώνει HepG2, MDA-MB-231 και ΤΗΡ-1 κύτταρα σε παρόμοιο βαθμό και σε μια δοσο (Σχήμα 1) και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Πίνακας 1). Μετά από 24 ώρες επώασης, στα κύτταρα HepG2, του πολλαπλασιασμού ΕΚ

50 για το στεατικό οξύ, ελαϊκό οξύ, λινολεϊκό οξύ, α-λινολενικό οξύ, DHA και ΕΡΑ εστέρες φλοριτζίνη ήταν 37.8, 31.5, 29.2, 53.1, 51.9 και 26.8 μΜ αντίστοιχα . ΕΚ

50 ήταν 35,2, 37,9, 32,3, 63,8, 55,5, και 26,5 μΜ σε MDA-MB-231 κύτταρα. ΕΚ

50 τιμές αυτών των εστέρων σε κύτταρα ΤΗΡ-1 ήταν 40,7, 2,1, 6,2, 35,7, 27,3, και 14,8 μΜ. Παρά το γεγονός ότι οι εστέρες λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη επεδείκνυε υψηλή δυναμικότητα ως αντιπολλαπλασιαστικός παράγοντας, κανένας από το μητρικό μόριο, φλοριτζίνη και μεμονωμένων λιπαρών οξέων έδειξε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου (ΕΚ

50 & gt? 100 μΜ) του HepG2, MDA-ΜΒ-231 ή ΤΗΡ -1 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, αγλυκόνη φλορετίνη έδειξαν σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δράση (ΕΚ

50 39.6 μΜ) σε κύτταρα ΤΗΡ-1 (Πίνακας 1).

κύτταρα ηπατικό καρκίνωμα (HepG2) και φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (ΗΡ-F) και ηπατοκύτταρα αρουραίου κύτταρα (RTCP10) εκτέθηκαν σε υπό εξέταση ενώσεις σε 1, 10, 50, 100 μΜ για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται ως το ποσοστό βιωσιμότητας σε σχέση με το όχημα αντιμετωπίζονται μόνο ομάδα ελέγχου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD (η = 3) είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ξεχωριστών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 σημαντικά διαφορετικό από το όχημα ελέγχουν μόνο ομάδα (Tukey HSD, Ρ & lt? 0,01).

Η

Για να αξιολογηθεί η εξειδίκευση των εστέρων λιπαρών οξέων φλοριτζίνη σε καρκινικά κύτταρα, το αποτέλεσμα του φαρμάκου επί βιωσιμότητα των κυττάρων σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα ποσοστώθηκε με δοκιμασία κυτταροτοξικότητας στις δύο φυσιολογικό ανθρώπινο (ΗΡ-F) και αρουραίου (RTCP10) ηπατοκύτταρα. κύτταρα ΗΡ-F υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μΜ και χαμηλότερες συγκεντρώσεις όλων των εστέρων λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη, φλοριτζίνη, λιπαρό οξύ, sorafenib και φλορετίνη για 24 ώρες (Πίνακας 1). Οι εστέρες λιπαρών οξέων του φλοριτζίνη δεν επηρέασε την βιωσιμότητα των φυσιολογικών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων με ΕΚ

50 & gt? 100 μΜ και είναι πιο ειδικά για καρκινικές κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1, Σχήμα 1). Στη θεραπεία 100 μΜ εστέρων λιπαρών οξέων του φλοριτζίνη για 24 ώρες, εστέρες λιπαρών οξέων του φλοριτζίνη έδειξαν τουλάχιστον τοξικότητα (& gt? 90% βιωσιμότητα) σε ηπατοκύτταρα αρουραίου επίσης (Σχήμα 1). Οι πιο ελπιδοφόρα και επιλεκτική κυτταροτοξική δραστηριότητες ανιχνεύθηκαν σε Pz-DHA και EPA Pz-εστέρες. Των λιπαρών οξέων του φλοριτζίνη εκτός Pz-στεατικό οξύ (περίπου 50% βιωσιμότητα) έδειξαν επίσης πολύ λιγότερη δραστηριότητα στην αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων (& gt? 80% βιωσιμότητα) του ηπατοκύτταρα αρουραίου από εκείνη του καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι εστέρες λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη μπορεί να έχουν μέτρια έως ελάχιστες παρενέργειες. Οι πιο ελπιδοφόρα και επιλεκτική κυτταροτοξική δραστηριότητες ανιχνεύθηκαν με Pz-DHA εστέρα. Το ΕΚ

50 (μΜ) και τιμές SI του PZ-DHA σε HepG2, MDA-MB-231, ΤΗΡ-1 ήταν 51,9 (SI = 11,2), 55,5 (SI = 10,5) και 27,3 (SI = 21.38) , αντίστοιχα (Πίνακας 1). DHA είναι ένα κοινό διαιτητικών ωμέγα-3 λιπαρών οξέων και διαθέτει επίσης αντιπολλαπλασιαστικές ιδιότητες [20]. Ως εκ τούτου, επελέγη Pz-DHA εστέρα για μελέτη γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας ανθρώπινο στόχο φάρμακο RT

array 2-PCR όπως έδειξε το ισχυρότερο κυτταροτοξικό αποτέλεσμα σε καρκινικά κύτταρα και ήταν το λιγότερο τοξικό σε φυσιολογικά κύτταρα σε σύγκριση με άλλους εστέρες λιπαρών οξέων της φλοριτζίνη