έχουν

Αφηρημένο

παρεμβάσεις Ανοσολογίας-based έχουν προταθεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική ευκαιρία να επιτεθεί αποτελεσματικά μετεγχειρητική ελάχιστης υπολειμματικής νόσου και μακρινή μεταστατική τοπικές προσαρμογές των όγκων του προστάτη. Αναπτύξαμε ένα χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου (CAR) κατασκεύασμα στόχευσης το αντιγόνο ανθρώπινο ειδικό προστατικό μεμβράνη (hPSMA), με βάση μία νέα και υψηλής συγγένειας ειδικό mAb. Ως μέθοδος μεταφοράς, χρησιμοποιήσαμε φορείς λεντοϊού τελευταίας γενιάς (LV) που φέρει ένα συνθετικό διπλής κατεύθυνσης υποκινητή ικανό ισχυρή και συντονισμένη έκφραση του μορίου CAR, και βιοφωταύγειας γονίδιο ρεπόρτερ για να επιτραπεί η παρακολούθηση των διαγονιδιακών κυττάρων Τ μετά

in vivo

θετή μεταφορά. Συνολικά, αποδείξαμε ότι CAR εκφράζουν LV αποτελεσματικά σε μεταγωγή βραχυπρόθεσμη ενεργοποιημένα PBMC, τα οποία με τη σειρά τους εύκολα διεγείρονται για να παράγουν κυτοκίνες και να ασκήσει μια σχετική κυτταροτοξική δραστικότητα από την εμπλοκή με το PSMA

+ κύτταρα όγκου του προστάτη. Κατά

in vivo

μεταφορά σε ποντίκια που φέρουν όγκο, CAR-μετατραπέντα κύτταρα Τ ήταν ικανά να εξαλείψουν εντελώς ένα διαδίδονται νεοπλασία στην πλειονότητα των ζώων υπό θεραπεία, υποστηρίζοντας έτσι την μετάφραση των εν λόγω προσέγγιση στο κλινικό περιβάλλον.

Παράθεση: Zuccolotto G, Fracasso G, Merlo Α, Montagner IM, Rondina Μ, Bobisse S, et al. (2014) PSMA-συγκεκριμένο αυτοκίνητο-Engineered Τ κύτταρα Εξάλειψη Διάχυτη καρκίνου του προστάτη σε προκλινικά μοντέλα. PLoS ONE 9 (10): e109427. doi: 10.1371 /journal.pone.0109427

Επιμέλεια: Ναταλία Lapteva, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 27, 2014? Δεκτές: 1 του Σεπτεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Zuccolotto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή έγινε εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από την Ένωση της Ιταλίας Cancer Research (AIRC, IG-13121? Και Ειδικό Πρόγραμμα Μοριακής Clinical Oncology 5 ανά mille ID 10016 για AR) και το Πανεπιστήμιο της Πάδοβας, «Progetti Strategici di Ateneo 2011″ στο AR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η επίκτητη κυτταρική θεραπεία με μη τροποποιημένα και

ex vivo

επεκταθεί Τ κύτταρα έχει αποδειχθεί αποτελεσματική έναντι διαφόρων οντοτήτων όγκου, ιδιαίτερα μελάνωμα και τους όγκους από EBV [1]. Σήμερα, η γενετική τροποποίηση των κυττάρων Τ μπορεί να προσδώσει νέα ακίνητα όγκων στόχευση σε φυσικά λεμφοκύτταρα, ξεπερνώντας έτσι την εξάρτηση από τα συστατικά του ενδογενούς ανοσοποιητικού συστήματος.

Ενώ η μεταγωγή με Ag-ειδική ΤΟΚ μπορεί να ανακατευθύνει μόνο των Τ κυττάρων δραστηριότητα με βάση τα ίδια χαρακτηριστικά αναγνώρισης, τεχνολογία χιμαιρικού αντιγόνου υποδοχέα (CAR) έχει την δυνατότητα να αποκτήσει τα Τ κύτταρα με τα πλεονεκτικά χαρακτηριστικά ενός αντισώματος, δηλαδή ειδικότητα, συγγένεια και η δυνατότητα για τη στόχευση αντιγόνων μη-πρωτεΐνης [2]. Επιπλέον, σε ένα μοναδικό μόριο CAR παρέχει κάποια μέτρα για την αντιμετώπιση των στρατηγικών όγκου ανοσοποιητικό φοροδιαφυγής: ανακουφίζει την αναγνώριση των Τ κυττάρων και τη δραστηριότητα των MHC περιορισμού και έκφρασης, και μπορεί να αναμεταδώσει συνδιεγερτικά σήματα μέσω ενδοκυτταρικών περιοχών της

Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της ΚΑΔ. Τ κύτταρα έχουν ήδη αναφερθεί σε ασθενείς, ιδίως έναντι χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (CLL) και οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ALL) [3] – [6] με πολύ ελπιδοφόρα αποτελέσματα σε όρους επιβίωσης χωρίς νόσο και πλήρη αιματολογική και μοριακές αποκρίσεις ακόμη και σε άτομα που απέτυχαν όλες τις προηγούμενες συνήθεις θεραπείες. Ωστόσο, αιματολογικές κακοήθειες, ιδίως εκείνων του κυττάρου προέλευσης Β, μπορεί να θεωρηθεί ως ένα ιδανικό στόχο για ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις [7]. Πράγματι, αυτά τα κακοήθη κύτταρα παρέχουν φυσικά συνδετήρες υποδοχέα συνδιεγερτικό και μοιράζονται τα ίδια φυσιολογική διαμερισμάτων με θετώς μεταφέρεται Τ κύτταρα. Τέλος, η εξάλειψη των φυσιολογικών Β κυττάρων που σχετίζονται με μη απειλητικές για τη ζωή ανεπιθύμητες ενέργειες, οι οποίες μπορούν να αντιμετωπιστούν κλινικά με ενδοφλέβια χορήγηση ανοσοσφαιρίνης.

Αντίθετα, επεξεργασίας στερεών όγκων παραμένει σημαντική πρόκληση και πρέπει να βελτιωθούν, τόσο από την άποψη της κλινική αποτελεσματικότητα και ασφάλεια. Μερική επιτυχίες ήταν έμπειροι από νευροβλάστωμα χρησιμοποιώντας GD2-συγκεκριμένο αυτοκίνητο Τ κύτταρα χωρίς θεραπευτική αγωγή προ-condition, στην εικονική απουσία παρενεργειών [8], [9]. Αντίθετα, δεν κλινικές αποκρίσεις καταγράφηκαν με την έγχυση των κυττάρων Τ ανακατευθύνονται έναντι του υποδοχέα φολικού σε ασθενείς καρκίνωμα των ωοθηκών [10], ούτε έναντι καρβοξυ-ανυδράσης IX (CAIX) σε ασθενείς με νεφρική καρκίνωμα [11], παρά το σχετικό «στη -target, off-όγκου «τοξικότητα αποδεικνύεται στην τελευταία περίπτωση. Διδάγματα από αυτές τις εμπειρίες δείχνουν ότι ο ορισμός του αντιγόνου-στόχου για θέματα ασφάλειας, και η επιμονή και παλιννόστησης όγκου ικανότητας των εγχυθεί κύτταρα είναι ιδιαίτερα κρίσιμη για την επιτυχή θεραπεία.

Εμείς απευθύνεται κάποια από αυτά τα ερωτήματα με τη στόχευση του προστάτη καρκίνο καρκινικών κυττάρων με Τ κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν ένα συγκεκριμένο αυτοκίνητο για το αντιγόνο μεμβράνης ανθρώπινο ειδικό προστατικό (hPSMA).

προστάτη όγκου αντιπροσωπεύει μια σοβαρή κλινική οντότητα, με κατ ‘εκτίμηση 233.000 νέες περιπτώσεις και 29.480 θάνατοι στις ΗΠΑ το 2014 [12], με το παρόν μόνο παρηγορητική θεραπεία για ορμονοάντοχο μεταστατικό μορφές [13]. Για τους ασθενείς αυτούς, η ανοσοθεραπεία έχει αποδειχθεί ότι είναι μια έγκυρη επιλογή βασίζεται σε εμβολιασμό με τροποποιημένα ολόκληρο προστάτη καρκινικών κυττάρων (GVAX [14]) ή PBMC που παρουσιάζουν σχετική προστατικό αντιγόνο (Sipuleucel-T [15]). Όσον αφορά τη θετή προσεγγίσεις κυτταρικής θεραπείας, προκλινικές μελέτες έχουν αναφερθεί ενθαρρυντικά αποτελέσματα [13], [16], [17] και κλινική αξιολόγηση υποβάλλεται (κλινικές δοκιμές αριθμός NCT01140373, NCT01929239, NCT00664196? Www.clinicaltrials.gov). Σε αυτό το σενάριο, PSMA μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν κατάλληλο στόχο και πράγματι το παρόν αξιοποιείται τόσο για απεικόνιση και θεραπευτικούς σκοπούς. Ειδικότερα, τα επίπεδα έκφρασης PSMA διαφοροποίηση φυσιολογικών και καρκινικών προστατικών ιστών, και παράλληλα το σκορ Gleason του προστατικού καρκίνου [18]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του PSMA περιλαμβάνει νεοαγγείωση πολλών φορέων του όγκου, προβλέποντας έτσι ένα επιπλέον αντιαγγειογόνο δράση.

Εδώ, αναφέρουμε το σχεδιασμό του CAR κατά hPSMA βασίζεται σε μια νέα και μεγάλη συγγένεια ειδικά mAb [19], και την φαινοτυπική και λειτουργικό χαρακτηρισμό των Τ-σώμα-hPSMA τόσο

in vitro

και

in vivo

. Για μεταγωγή, χρησιμοποιήσαμε ένα βραδέος ιού φορέα που φέρει ένα διπλής κατεύθυνσης υποκινητή που κινεί την ταυτόχρονη έκφραση του μορίου αυτοκίνητο και ένα γονίδιο ρεπόρτερ βιοφωταύγειας. Αυτό επέτρεψε την παρακολούθηση των εγχυθεί Τ κυττάρων και ως εκ τούτου την άμεση σχέση του θεραπευτικού αποτελέσματος με την επιμονή και παλιννόστησης ικανότητα των Τ κυττάρων. Συνολικά, CAR-μετατραπέντα κύτταρα Τ όχι μόνο εξασκείται μία σχετική τοπική-περιοχική θεραπευτική δράση, αλλά επίσης εξαλειφθεί εντελώς ένα διαδίδονται νεοπλασία στην πλειονότητα των ζώων υπό θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την μετάφραση των εν λόγω προσέγγιση στην κλινική

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη:. LNCaP και PC3 , ανθρώπινου προστάτη κυτταρικές γραμμές καρκινώματος? Jurkat, ανθρώπινα Τ λεμφοβλαστική λευχαιμία και 293 T [20], ανθρώπινη εμβρυϊκή κυτταρική σειρά νεφρού. Η κυτταρική γραμμή PC3-PIP, σταθερώς εκφράζουν ανθρώπινο PSMA (hPSMA) [21] γενναιόδωρα από τον Dr. Warren Heston? κυτταρική γραμμή LNCaP ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). LNCaP, κύτταρα PC3, PC3-PIP και Jurkat διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (EuroClone, Μιλάνο, Ιταλία), ενώ μέσο DMEM (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για 293 κύτταρα Τ? δύο μέσα συμπληρώθηκαν με 10% Εμβρυϊκό Βόειο Ορό (FBS, Gibco BRL Paisley, UK), 2 mM L-γλουταμίνη, 10 mM HEPES, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 U /ml στρεπτομυκίνη (όλα από την Lonza, BioWhittaker, Βασιλεία , Ελβετία), στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Anti-hPSMA γενιά αυτοκινήτου

το αυτοκίνητο έναντι του αντιγόνου hPSMA περιέχει την πλήρη αλληλουχία του αντι- hPSMA scFv που προέρχεται από το υβρίδωμα αντι-hPSMA D2B [19]. Αυτή η αλληλουχία κλωνοποιήθηκε στη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (MCS) του ενδιάμεσου ξενιστή pSecTag2A (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Μιλάνο, Ιταλία). Η MCS του πλασμιδίου pSecTag2A περιλαμβάνεται μεταξύ δύο αλληλουχιών: σε 5 ‘, το μυϊκό Ig κάππα αλληλουχία οδηγό ελαφριάς αλυσίδας V-J2-C, και σε 3’ την αλληλουχία Tag Myc. Ετσι, η αλληλουχία οδηγός-ScFv-myc χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή CAR. Το Leader-ScFv-myc θραύσμα ενισχύθηκε με PCR και εισήχθη στο κατασκεύασμα pBS SKII (Invitrogen). Ένα τμήμα του CD28 (βάσεις 438-759) και η ενδοκυτταρική περιοχή CD3ζ (227 – 563 περιοχή), και τα δύο ελήφθησαν από cDNA του EBV-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα [22], συντήχθηκαν με PCR και στη συνέχεια εισάγεται εντός ο φορέας pBS SKII, κατάντη του Leader-ScFv-myc κομμάτι. Αυτός ο φορέας στη συνέχεια αλληλουχία στο Centro Ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Καινοτόμες (CRIBI) του Πανεπιστημίου της Πάντοβα, Ιταλία. Η αλληλουχία CAR αντι-hPSMA τελικά υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα pcDNA3.1 (Invitrogen). Για τον έλεγχο της ικανότητας να οδηγεί την έκφραση του μορίου CAR επί της μεμβράνης, αυτός ο φορέας χρησιμοποιήθηκε για να διαμολύνει κύτταρα 293 Τ χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

LV πλασμίδια και λεντοϊού προετοιμασία

χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι φορείς λεντοϊών συσκευασία: pMDLg /pRRE, pRSV-Rev, pMD2.VSVG και pADVantage, όλα παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. L. Naldini (San Raffaele, Μιλάνο, Ιταλία). Ο φορέας μεταφοράς # 945.pCCL.sin.cPPT.SV40ployA.eGFP.minCMV.hPGK.deltaLNGFR.Wpre είναι μια αυτο-αδρανοποίηση (SIN) HIV-προερχόμενο φορέα [23], η οποία φέρει ένα minCMVPGK αποκλίνουσα διπλής κατεύθυνσης υποκινητής οδηγεί το ταυτόχρονη έκφραση δύο γονιδίων σε αντιπληροφοριακό προσανατολισμό. Οι φορείς μεταφοράς που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη που την αλληλουχία CAR αντι-hPSMA (που ελήφθη από τον φορέα PMA-T-σώματος) υπό τον έλεγχο του υποκινητή hPGK, και ο eGFP (ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) ή Firefly λουσιφεράσης (διακύμανση των) γονιδίων ρεπόρτερ υπό ο έλεγχος της minCMV. διάνυσμα PMA-T-σώματος και διακύμανση των αλληλουχία συντέθηκαν με GeneArt, Life Technologies (Regensburg, Γερμανία). Λεντοϊών σε κύτταρα 293 Τ έχει περιγραφεί προηγουμένως [23]. Ένα φορέα λεντοϊού που κωδικοποιεί μόνο για διακύμανση των [24] χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή κυττάρων PC3-PIP.

Western ανάλυση κηλίδος

293 κύτταρα Τ, μη-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με pcDNA3.1-CAR, λύθηκαν σε ρυθμιστικό που περιέχει 50 μΜ Tris HCl ρΗ 6,8, 2% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 2% β-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερίνη, και 0,1-0,05% βρωμοφαινόλης μπλε (al από την Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA ) οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πηκτές 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Immobilion-P, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα (Sigma-Aldrich) σε TBS και 0,05% Tween 20, που ακολουθείται από επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα (ποντικού αντι-ο-Μγο mAb, 1:1000, Sigma-Aldrich) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρία 10 λεπτά πλύσεις σε PBS-Tween, αντι-ποντικού IgG δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με HRP αιγός (αραιωμένη 1:10000, Amersham, Μιλάνο, Ιταλία) προστέθηκε για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο γάλα. Η μεμβράνη αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, USA) και εμφανίσθηκε με τη χρήση χημειοφωταύγειας. ένταση του σήματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας Bio-Rad XRS (Science ομάδα ζωής, Μιλάνο, Ιταλία).

μεταγωγή των κυττάρων Jurkat

Για να αξιολογηθεί η λειτουργικότητα των φορέων LV, κύτταρα Jurkat επωάστηκαν με ιικό υπερκείμενο (CAR hPSMA /eGFP LV ή hPSMA /λουσιφεράσης LV CAR) για 15 ώρες παρουσία 8 μg /ml θειικής πρωταμίνης (Sigma-Aldrich). Κυτταρομετρία ροής και βιοφωταύγεια (BLI) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την μεταγωγή να αξιολογήσει CAR και eGFP έκφραση ή δραστηριότητα λουσιφεράσης.

T-φορείς γενιάς

Για να δημιουργήσετε T-φορείς, PBMC από υγιείς δότες ενεργοποιήθηκαν 48 ώρες με ΟΚΤ-3 (50 ng /ml? Ortho Biotech Inc, Raritan, NJ, USA) και ανθρώπινη IL-2 (hIL-2, 300 U /ml? προλευκίνη? Novartis Pharmaceuticals, Horsham, Ηνωμένο Βασίλειο ). Τ κύτταρα στη συνέχεια μολύνθηκαν με το ιικό υπερκείμενο για 18 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2, υπό την παρουσία θειικής πρωταμίνης (40 μg /ml? Sigma-Aldrich) και hIL-2 (500 U /ml ). Το υπερκείμενο στη συνέχεια άλλαξε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο που περιέχει hIL-2 (100 U /ml). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, τα PBMC αναλύθηκαν για το αυτοκίνητο και την έκφραση eGFP, και για δραστικότητα λουσιφεράσης. PBMC αναφέρονται ως Τ-σώμα-hPSMA /eGFP και T-σώμα-hPSMA /διακύμανση των κατά την μεταγωγή με hPSMA /eGFP LV αυτοκίνητο ή hPSMA /λουσιφεράσης LV CAR, αντίστοιχα. T-σώματα επαναδιεγέρθηκαν μία φορά την εβδομάδα με ακτινοβολημένα (60 Gy) PC3-PIP σε αναλογία 10:01. Το πλήρες μέσο με φρέσκο ​​IL-2 αναπληρώθηκε δύο φορές την εβδομάδα

Αντισώματα

κύτταρα CAR εκφράζουν σημάνθηκαν με αντι-c-myc mAb (κλώνος 9Ε10? Sigma-Aldrich). Ή το έλεγχος ισοτύπου (IgG 1 ποντικού, Southern Biotech, Μιλάνο, Ιταλία), που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα (ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG? Southern Biotech). Οι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας την APC, FITC- ή ΡΕ-συζευγμένα αντισώματα προς CD4, CD8, CD57, CD27, CD28, CD62L (BioLegend, San Diego, CA, USA), CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, USA) , και οι σχετικές έλεγχοι ισοτόπου που αγοράζονται από τις ίδιες τις εταιρείες.

Η κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

Η κυτταροτοξική δράση των Τ-σώμα-hPSMA /eGFP και T-σώμα-hPSMA /διακύμανση των αξιολογήθηκε σε ένα πρότυπο 4 h

δοκιμασία 51Cr-απελευθέρωσης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25], σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την μεταγωγή. PC3, PC3-PIP και LNCaP χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα-στόχους.

δοκιμασίες απελευθέρωσης κυτοκίνης

Για την αξιολόγηση της παραγωγής ΙΡΝ-γ, ένα ELISA ΙΡΝ-γ Screening Set (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

6 Τ κύτταρα σπάρθηκαν με 1 × 10

6 κύτταρα στόχους (PC3 ή PC3-PIP) σε φρεάτια εις τριπλούν σε πλάκες των 96 φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα. έκκρισης κυτοκίνης μετρήθηκε μετά από 12 ώρες επώασης με χρήση Τ-όργανα σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης. Αρνητικά και θετικά δείγματα αναφοράς αντιπροσωπεύθηκαν από μη μεταδιηγερμένα PBMC και Τ-φορείς μη διεγερμένα ή σε επεξεργασία με 40 ng /ml ΡΜΑ και 4 μg /ml ιονομυκίνης (Sigma-Aldrich), αντίστοιχα. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια αναλύονται σε VICTOR Χ4 (PerkinElmer, Zaventem, Βέλγιο).

Ποντίκια και

in vivo πειράματα

In vivo πειράματα

συμμετέχουν 6 έως 8 εβδομάδων αρσενικά SCID, RAG2

– /- /γc

– /- και NOD /SCID ποντίκια (Charles River Laboratories, Calco, Como, Ιταλία), τα οποία στεγάζονται στο συγκεκριμένο ζώο άνευ παθογόνων εγκατάσταση του Τμήματος Χειρουργικής, Ογκολογίας και Γαστρεντερολογίας του Πανεπιστημίου της Πάντοβα (Ιταλία). Τα ζώα στεγάστηκαν με ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός, σε θερμοκρασία (22 +/- 1 ° C) και υγρασίας (55 +/- 5%) ελέγχεται δωματίου. Όλοι οι ποντικοί είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και μια δίαιτα συντήρησης. Όλα τα κλουβιά στεγάζεται έως 6 ζώα και περιείχε ροκανίδια ξύλου και ένα σωλήνα από χαρτόνι για εμπλουτισμό του περιβάλλοντος. Διαδικασιών που αφορούν τα ζώα και τη φροντίδα τους ήταν σύμφωνη με τις κατευθυντήριες οδηγίες που συμμορφώνονται με τους εθνικούς και διεθνείς νόμους και πολιτικές (DL 116/92 και τις μεταγενέστερες εγκυκλίους εφαρμογής), και το πειραματικό πρωτόκολλο (n ° 7/2012) εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Πάδοβας (CEASA). Κατά τη διάρκεια του

in vivo

πειράματα, τα ζώα σε όλες τις πειραματικές ομάδες εξετάστηκαν καθημερινά για μείωση της σωματικής δραστηριότητας και άλλα συμπτώματα της νόσου? σοβαρά άρρωστος ζώα (απώλεια βάρους που υπερβαίνει το 15%, λήθαργος, αναστατωμένα μαλλιά, χαμηλή θερμοκρασία) υποβλήθηκαν σε ευθανασία με υπερβολική δόση διοξειδίου του άνθρακα.

Winn δοκιμασία.

δοκιμασία Winn εκτελέστηκε με ένεση υποδορίως SCID ποντικών με 5 × 10

6 PC3 ή καρκινικά κύτταρα PC3-PIP ανά ζώο, αναμιγνύεται είτε με RPMI ή κύτταρα Τ-σώμα-hPSMA /eGFP (5 × 10

6 /ποντικό? 6 ποντίκια /ομάδα). Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε σύμφωνα με την ακόλουθη εξίσωση: V (mm

3) = (d

2 * D) /2, όπου d (mm) και D (mm) είναι τα μικρότερα και μεγαλύτερα κάθετες διάμετροι του όγκου, αντιστοίχως, όπως αξιολογήθηκε με μέτρηση της δαγκάνας.

Loco-περιφερειακό θεραπεία.

Για την αξιολόγηση του θεραπευτικού δυναμικού της τοπική-περιοχική θεραπεία, τα ποντίκια SCID ενέθηκαν sc με 5 × 10

6 κύτταρα PC3-PIP. Όταν οι όγκοι γίνονται ψηλαφητοί περίπου τέσσερις ημέρες αργότερα, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα ελέγχου (έμειναν χωρίς αγωγή) ή την πειραματική ομάδα (είχαν εγχυθεί στο εσωτερικό της αλλοιώσεως με CAR-μετατραπέντα κύτταρα Τ στις 72 ώρες μετά την μεταγωγή? 6 ποντίκια /ομάδα). Δύο πρωτογενείς εκβάσεις αναλύθηκαν: η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε συναρτήσει του χρόνου με μέτρηση με παχύμετρο και το συνολικό επιβίωση καταγράφηκε

Η συστηματική θεραπεία υποδόριων όγκων του προστάτη

Για να αξιολογηθεί η θεραπευτική δραστικότητα της συστημικής Τ.. -Body διοίκηση, ποντίκια SCID ενέθηκαν sc με 5 × 10

6 κύτταρα PC3-PIP και 4 ημέρες αργότερα έλαβαν ενδοφλεβίως T-σώμα-hPSMA /διακύμανση των (10 × 10

6 /ποντικό) σε 72 ώρες ή 5-6 εβδομάδες μετά την μεταγωγή (n = 6)? χωρίς θεραπεία ζώα χρησίμευσαν ως ομάδα ελέγχου (n = 6). βιοκατανομή των κυττάρων Τ εκτιμήθηκε με βιοφωταύγεια απεικόνισης (BLI) υπό τις ίδιες συνθήκες, εκτός του ότι ποντικοί εγχύθηκαν με τα δύο κύτταρα PC3-PIP ή PC3 όγκου στα δεξιά και αριστερό πλευρό, αντίστοιχα.

Διάχυτη προστάτη μοντέλο όγκου.

Για να δημιουργήσετε ένα μοντέλο διαδίδονται προστατικού όγκου, SCID, rag2

– /- /γο

– /- και NOD /SCID ποντίκια ενέθηκαν IV με διαφορετικούς αριθμούς (που κυμαίνονται από 1 × 10

5 – 5 × 10

6) των κυττάρων διακύμανση των μεταγωγή PC3-PIP (6 ποντίκια /ομάδα). Tumor εμφύτευση και την ανάπτυξη εκτιμήθηκαν με BLI. Επιπλέον, SCID χωρίς όγκο, rag2

– /- /γο

– /- και NOD /SCID ποντικοί ενέθηκαν με 20 × 10

6 T-σώμα-hPSMA /διακύμανση των, να αξιολογήσει τη μοίρα τους με BLI (6 ποντίκια /ομάδα).

θετή πειράματα ανοσοθεραπείας.

Σε θετή πειράματα ανοσοθεραπείας, βιοφωταυγή PC3-PIP ενέθηκαν IV σε NOD /SCID και rag2

– /- /γο

– /- ποντίκια (1 × 10

5 /ποντίκι). Τέσσερις ημέρες αργότερα, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα ελέγχου (έμειναν χωρίς αγωγή) ή την πειραματική ομάδα, όπου έλαβαν ί.ν. 20 × 10

6 T-σώμα-hPSMA /eGFP για 3 φορές μέσα σε μια εβδομάδα (6 ποντικοί /ομάδα). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία από BLI, και η επιβίωση καταγράφηκε.

Ποσοτική βιοφωταύγεια

Ποσοτική BLI είναι μια ισχυρή τεχνολογία που επιτρέπει την απόκτηση πολλαπλών εικόνων κατά μήκος και, συγχρόνως, να μειωθεί ζώο αριθμούς. εικόνες βιοφωτισμός συλλέχθηκαν με το Σύστημα Απεικόνισης IVIS Lumina ΙΙ (PerkinElmer). Δέκα έως 15 λεπτά πριν από την απεικόνιση, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνη /οξυγόνο και χορηγούνται i.p. με 150 mg /kg D-λουσιφερίνης (PerkinElmer) σε PBS. Τρία ποντίκια απεικονίστηκαν ταυτόχρονα με χρόνους έκθεσης που κυμαίνονται από 0,5 έως 3 λεπτά. Ένα πεδίο 12 × 12 cm από την άποψη και χαμηλή, μεσαία ή υψηλά επίπεδα ενδοχείαση εφαρμόστηκαν για να μεγιστοποιήσει την ευαισθησία και χωρική ανάλυση. Κοιλιακό εικόνες ελήφθησαν για κάθε ζώο και ποσοτικοποιείται μέσω της περιοχής ενδιαφέροντος (ROI). Ζώντας Λογισμικό εικόνας (PerkinElmer) χρησιμοποιήθηκε για να αποκτήσουν και να ποσοτικοποιηθούν τα σύνολα δεδομένων απεικόνισης βιοφωταύγεια.

αξιολόγηση κυτταροφθορισμομετρικής έκφρασης hPSMA στην ανάπτυξη όγκων

Τα καρκινικά κύτταρα αναστολές λήφθηκαν με ενζυματική πέψη με 270 μονάδες /ml DNase, 35 U /ml υαλουρονιδάση, και 200 ​​U /ml ρυθμιστικού διαλύματος κολλαγενάσης (όλα από την Sigma-Aldrich). Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα διήλθαν μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 70-μm (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Τα δείγματα στη συνέχεια χρωματίστηκαν σε 4 ° C με ένα αντι-ποντικού hPSMA mAb [19] που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού IgG1 ΡΕ-συζευγμένο (BioLegend) και αναλύθηκαν σε ένα FACSCalibur (BD) κυτταρόμετρο ροής. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν με FlowJo λογισμικού (TreeStar Inc., Olten, Ελβετία).

Η στατιστική ανάλυση

Kaplan-Meier μέθοδο του προϊόντος-ορίου διεξήχθη για να εκτιμήσει τις καμπύλες επιβίωσης, καθώς και η σύγκριση της επιβίωσης μεταξύ ομάδες διεξήχθη χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη Sigmaplot (έκδοση 12.3) στατιστικό πακέτο.

Αποτελέσματα

Κατασκευή και ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής αμφίδρομης LV για αντι-hPSMA έκφραση CAR

A CAR αλληλουχία σχεδιάστηκε που κωδικοποιούσε τα ακόλουθα συστατικά εντός-πλαισίου από 5 ‘προς 3’ άκρα (Σχήμα 1Α).: αλληλουχία-οδηγό, το μεταβλητό θραύσμα μονής αλυσίδας (ScFv) του νέου αντι-hPSMA αντίσωμα IgGD2B [19], η αλληλουχία ετικέτας c-myc, και το μόριο CD28 συνδιεγερτικού συνδεδεμένο με την αλληλουχία CD3ζ. Αποφασίσαμε να εκμεταλλευτεί αυτό το νέο αντι-PSMA scFv (scFvD2B) για την κατασκευή του αυτοκινήτου μας, λόγω των πολύ ελκυστικό χαρακτηριστικά της, ιδιαίτερα την νανομοριακή συγγένεια για τον στόχο που είναι παρόμοια με εκείνη που αποδεικνύεται από το σύνολο του αντισώματος J591 [19] . Επιπλέον, scFvD2B μας δείχνει υψηλή ειδικότητα και προσδιορίζει ένα διαφορετικό επίτοπο από αυτό που αναγνωρίζεται από το αντίσωμα J591, όπως εκτιμάται από πειράματα ανταγωνισμού διενεργούνται με ράδιο-immunoligands ή επισημασμένο με βιοτίνη αντισώματα ([19] και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Αντι-hPSMA χάρτη CAR. ΕΚ: εξωκυτταρική περιοχή? TM: διαμεμβρανική περιοχή? IC: ενδοκυτταρικής περιοχής. (Β) κυτταροφθορισμομετρικής προφίλ της έκφρασης CAR σε κύτταρα επιμολυσμένα 293 Τ. Κύτταρα 293 Τ μορφομετατράπηκαν με φορέα pcDNA3.1 που φέρει αλληλουχία CAR και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από 24 ώρες (σκοτεινή γραμμή). Μη επιμολυσμένα κύτταρα (γκρι οικόπεδο) χρησίμευσε ως έλεγχος. (C) έκφραση CAR όπως εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western σε 24 ώρες (γραμμή 1) και 7 ημέρες (γραμμή 2) μετά 293 επιμόλυνση των Τ κυττάρων. Οι αρνητικοί έλεγχοι ήταν μέσο μόνο (γραμμή 3) και κύτταρα μη επιμολυσμένα 293 Τ (γραμμή 4). Γραμμή 5, δείκτες μοριακού βάρους. (D) Γραμμική χάρτης του ιικού φορέα που περιέχει ανασυνδυασμένο την αμφίδρομη προαγωγό minCMVPGK (22). Ειδικότερα, το γονίδιο ανταποκριτής (eGFP ή λουσιφεράση) είναι υπό τον έλεγχο του υποκινητή minCMV, ενώ το γονίδιο CAR είναι υπό τον έλεγχο του υποκινητή hPGK. (Ε) Μεταγωγή των κυττάρων Jurkat με LV CAR αντι-hPSMA /eGFP. Συν-έκφραση του c-myc και eGFP σε LV-μεταχθέντα κύτταρα Jurkat, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Dot οικόπεδο αναφέρει τα γεγονότα με περίφραξη σε συνολικό βιώσιμα κύτταρα? περισσότερο από το 90% των κυττάρων συν-εκφράζουν τόσο c-myc και eGFP. (F) μεταγωγή των κυττάρων Jurkat με LV CAR αντι-hPSMA /λουσιφεράσης.

Αριστερό πλαίσιο

, c-myc έκφρασης (μαύρο) σε Jurkat κύτταρα σε 72 ώρες μετά την μεταγωγή, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Γκρι οικόπεδο αντιπροσωπεύει τον έλεγχο ισοτόπου.

δεξί πάνελ

, Αξιολόγηση της δραστηριότητας λουσιφεράσης σε LV-μετάγονται Jurkat κύτταρα (2 × 10

5 /καλά) από BLI.

Η

Για να εκτιμηθεί η ικανότητα της κατασκευής να οδηγούν την έκφραση ενός υποδοχέα ο οποίος συναρμολογείται σωστά στην κυτταρική μεμβράνη, η αλληλουχία CAR αντι-hPSMA κλωνοποιήθηκε στον φορέα pcDNA3.1 και το προκύπτον πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε για παροδική διαμόλυνση 293 κυττάρων Τ. Σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά, η έκφραση του χιμαιρικού υποδοχέα αξιολογήθηκε με κυτταροφθορισμομετρική και κηλίδωση Western ανάλυση (σχ. 1Β και 1C, αντίστοιχα), με τη χρήση του mAb αντι-c-myc. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το αυτοκίνητο ήταν τοποθετημένα σωστά πάνω στη μεμβράνη και είχε το αναμενόμενο μοριακό βάρος (περίπου 60 kDa)? έκφραση αυτοκίνητο ήταν ήδη ανιχνεύσιμη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, να εξαφανίζονται ταχέως τις επόμενες ημέρες λόγω της έλλειψης ενός σταδίου επιλογής (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια, η αλληλουχία CAR εισήχθη μέσα σε ένα LV φέρει ένα διπλής κατεύθυνσης υποκινητή που επέτρεψε τη μεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς (eGFP ή διακύμανση των) από το ανάντη ελάχιστο προαγωγέα minCMV, χωρίς να επηρεάζει κατάντη έκφραση του CAR αντι-hPSMA από τον προαγωγό αποτελεσματικό hPGK (Σχ . 1D). Για να αξιολογηθεί η λειτουργικότητα των λεντοϊών, Jurkat κύτταρα μετατράπηκαν με LV CAR hPSMA /eGFP και LV CAR hPSMA /διακύμανση των. CAR αποδείχθηκε ότι εκφράζεται υψηλά ήδη 72 ώρες μετά την μεταγωγή, όπως αποδεικνύεται από το υψηλό ποσοστό των c-myc

+ κύτταρα ανιχνεύεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Σχ. 1 Ε και 1 F). Ειδικότερα, τα κύτταρα CAR εκφράζουν ήταν περισσότερο από 90% κατά τη μεταγωγή με LV CAR hPSMA /eGFP (Εικ. 1 Ε) και περισσότερο από 60% κατά τη χρήση LV CAR hPSMA /διακύμανση των (Εικ. 1F,

αριστερό πάνελ

). Ειδικότερα, οι διπλής κατεύθυνσης φορείς LV φάνηκε να οδηγεί την έκφραση είτε του αυτοκινήτου και των γονιδίων ρεπόρτερ με μια πολύ ισορροπημένη απόδοση, όπως αποδεικνύεται από την υψηλή ένταση του σήματος eGFP (Εικ. 1 Ε) και το σχετικό δραστικότητα λουσιφεράσης (Σχ. 1F,

δεξί πάνελ

).

η φαινοτυπική χαρακτηρισμό των κυτταρικών πληθυσμών Τ CAR-μετάγονται

Για την παραγωγή των κυτταρικών πληθυσμών Τ εκφράζουν το CAR αντι-hPSMA, ένα πρωτόκολλο ταχεία επέκταση αναπτύχθηκε . Ο βέλτιστος χρόνος μόλυνσης συστάθηκε μετά από 48 ώρες ενεργοποιήσεως ΟΚΤ3, δεδομένου ότι σε αυτό το χρονικό σημείο πήραμε το μεγαλύτερο ποσοστό CAR εκφράζουν Τ κυττάρων (Σχ. 2Α,

αριστερό πλαίσιο

), και ένα λιγότερο διαφοροποιημένο φαινότυπο , όπως εκτιμάται από την υψηλή έκφραση του CD27, CD28 και CD62L δείκτες (Εικ. 2Α,

κεντρικό πλαίσιο

). Στη συνέχεια, το πρωτόκολλο επέκτασης εμπλέκονται εβδομαδιαία επαναδιέγερση με κύτταρα PC3-ΡΙΡ που επέτρεψε την ταχεία και παρατεταμένη πολλαπλασιασμός των δύο Τ-σώμα-hPSMA /eGFP και Τ-σώμα-hPSMA /διακύμανση των πληθυσμών (Εικ. 2Α,

δεξί πάνελ

).

(Α) Ρύθμιση του πρωτοκόλλου μεταγωγής και κινητική ανάπτυξη.

Αριστερό πλαίσιο

, PBMC ενεργοποιήθηκαν με ΟΚΤ3 στο χρόνο 0 και σε μεταγωγή ταυτόχρονα (Td0), ή μετά από 48-h (Τδ2) ή 72-h (Τδ3) ώρες. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης c-myc επιγραφής διεξήχθη 72 ώρες μετά τη μόλυνση.

Κεντρική πίνακα

αναφέρει την έκφραση του CD27, CD28 και CD62L σε τρεις διαφορετικές συνθήκες ενεργοποίησης /λοίμωξης αναφέρθηκαν στο

αριστερό πάνελ

.

δεξί πάνελ,

Επέκταση των Τ-σώμα-hPSMA /διακύμανση των και T-σώμα-hPSMA /eGFP μετάγονται μετά την ενεργοποίηση 48 ώρες απαντώντας σε εβδομαδιαία επαναδιέγερση με κύτταρα PC3-PIP. Μη μεταδιηγερμένα PBMC χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. (Β) φαινότυπο και έκφραση CAR σε μετατραπέντα κύτταρα Τ κατά τη διέγερση.

Αριστερό

πάνελ, έκφραση δεικτών επιφανείας σε Τ-σώμα-anti-hPSMA /διακύμανση των σε διαφορετικά χρονικά σημεία (3, 11 και 18 ημέρες) μετά την μεταγωγή, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. Επικαλυπτόμενα αποτελέσματα ελήφθησαν σε Τ-σώμα-anti-hPSMA /eGFP.

δεξί πάνελ,

ποσοστό του c-myc

+ κυττάρων σε LV CAR hPSMA /διακύμανση των και LV CAR hPSMA /eGFP-μετάγονται πληθυσμών Τ κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την μεταγωγή. Το σχήμα δείχνει μέση τιμή +/- SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) Κινητική CD4 και CD8 υποσύνολα σε μεταγόμενα πληθυσμών Τ κυττάρων. Έκφραση των δεικτών CD4 και CD8 στο c-myc

+ – περιφραγμένη T-σώμα-hPSMA /eGFP

(αριστερό πάνελ)

και T-σώμα-hPSMA /διακύμανση των (

δεξί πάνελ)

πληθυσμών σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την μεταγωγή, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα είναι από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τρία που παράγονται παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Για να καθοριστεί καλύτερα η κατάσταση διαφοροποίησης του CAR-μετάγονται Τ λεμφοκυττάρων κατά την περίοδο μετά τη μόλυνση κατά τη διάρκεια αντιγονική επαναδιεγέρσεις, η έκφραση των διαφόρων δεικτών επιφανείας (CD62L, CD27, CD28, CCR7, CD57) εκτιμήθηκε με κυτταροφθορισμομετρική ανάλυση. Εβδομήντα δύο ώρες μετά την μεταγωγή, το αναδυόμενο προφίλ ήταν ουσιαστικά πρόωρης δραστικά Τ κύτταρα, όπως φαίνεται από την υψηλή έκφραση του CD62L, CD27 και CD28, την παρουσία CCR7 θετικών κυττάρων και τη χαμηλή έκφραση του CD57 (Σχ. 2Β,

αριστερό πάνελ

). Μετά επαναδιεγέρσεις με το αντιγόνο, τα κύτταρα Τ απέκτησε ενδιάμεσο φαινότυπο μνήμης τελεστών με την προοδευτική προς τα κάτω διαμόρφωση του CD62L, CD28 και CCR7 και μια ελαφρά αύξηση στην έκφραση CD57 (Σχ. 2Β,

αριστερό πλαίσιο

). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ η επόμενη συνάντηση με το αντιγόνο οδήγησε στην επέκταση του πληθυσμού CAR-εκφράζουν (Σχ. 2Β,

δεξί πάνελ

), μια διχοτόμηση μπορεί να παρατηρηθεί μεταξύ των επεκτείνεται υποσύνολα Τ κυττάρων. Πράγματι, ενώ η έκφραση αυτοκίνητο ήταν σχεδόν ίσος εντός του CD4

+ και CD8

+ Τ κυτταρικοί πληθυσμοί αμέσως μετά την μόλυνση, η αντιγονική επαναδιέγερση καθόρισαν την προοδευτική συσσώρευση του CD8

μόνο + υποσύνολο κυττάρων Τ, η οποία σχεδόν εντελώς ξεπέρασε CD4

+ Τ κύτταρα από μήνα η μία μετά την μεταγωγή (Εικ. 2C).

Λειτουργικός χαρακτηρισμός της CAR εκφράζουν τα Τ κύτταρα

έκφραση CAR υπό την προϋπόθεση ότι μετάγονται πληθυσμού με την ικανότητα να αναγνωρίζουν το αντιγόνο hPSMA επί της επιφανείας κυτταρικών γραμμών όγκου του προστάτη, και να μεσολαβήσει ένα υψηλό και ειδική κυτταροτοξικότητα (Εικ. 3Α). Πράγματι, τόσο η T-σώμα-hPSMA /διακύμανση των πληθυσμών και T-σώμα-hPSMA /eGFP λυμένα τα hPSMA-επιμολυσμένα κύτταρα PC3 ενώ διαφυλάσσει το αντιγόνο-αρνητική ομόλογό? το πιο σημαντικό, ήταν επίσης σε θέση να αναγνωρίζουν τα κύτταρα-στόχους LNCaP που φυσικά φιλοξενούν το αντιγόνο hPSMA. Η κυτταροτοξικότητα ήταν ήδη εμφανής, αν και σε χαμηλά επίπεδα, 3 ημέρες μετά την επαγωγή και αυξημένη σε μέγιστα επίπεδα ακριβώς μετά ένα γύρο επαναδιέγερσης αντιγόνου, να παραμένει σταθερή στη συνέχεια μέχρι και 2 μήνες μετά τη μόλυνση. Άλλα από ασκώντας μια σχετική κυτταροτοξική δραστικότητα, CAR-μετατραπέντα κύτταρα Τ σε διάφορα στάδια της διαφοροποίησης παράγεται επίσης υψηλά επίπεδα της ΙΡΝ-γ σε απόκριση προς hPSMA εκφράζουν κύτταρα όγκου (Σχ. 3Β και 3C), αλλά όχι κατά hPSMA κύτταρα αρνητικού ελέγχου. Ως αρνητικός έλεγχος, μη μολυσμένα κύτταρα Τ δεν παράγουν ΙΡΝ-γ όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC3 τροποποιημένα να εκφράζουν το επιφανειακό αντιγόνο hPSMA.

(Α) λυτική δράση των Τ-σώματος-hPSMA /eGFP και Τ -Body-hPSMA /διακύμανση των. Η κυτταροτοξικότητα αναλύθηκε στις 3, 11 και 60 ημέρες μετά την μεταγωγή? PC3, PC3-PIP και LNCaP κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα-στόχους. Μη μεταδιηγερμένα PBMC χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας. Στην επάνω αριστερή γωνία του κάθε πάνελ τα ποσοστά του c-myc

Τα + Τ κύτταρα έχουν αναφερθεί. Το σχήμα δείχνει μέση τιμή +/- SD από 4 ανεξάρτητα πειράματα. (Β) έκκριση ΙΡΝ-γ κατά την διέγερση αντιγόνου. παραγωγή IFN-γ αναλύθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά PBMC μεταγωγή με την τόνωση Τ-σώμα-hPSMA /διακύμανση των με PC3-PIP hPSMA

+ ή PC3 hPSMA

– καρκινικές κυτταρικές σειρές. T-φορείς μη διεγερμένα ή σε επεξεργασία με ΡΜΑ /ιονομυκίνη αντιπροσώπευαν τα αρνητικά και θετικά συγκριτικά, αντίστοιχα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την T-σώμα-hPSMA /eGFP. (C) c-myc έκφραση σε Τ-σώμα-hPSMA /διακύμανση των πληθυσμών δοκιμάστηκαν για την ΙΡΝ-γ παραγωγή.

Η

Ανάλυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των αντι-hPSMA χορήγηση Τ-σώμα κατά των τοπικών όγκων του προστάτη

In vivo

θεραπευτική αποτελεσματικότητα του CAR-μετατραπέντα κύτταρα Τ σε διάφορα στάδια της διαφοροποίησης (72 ώρες ή 5 εβδομάδες μετά την μεταγωγή) αρχικά αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία Winn (Σχ. 4Α). Ειδικότερα, όταν τα καρκινικά κύτταρα PC3-PIP συν-ένεση με T-σώμα-hPSMA /eGFP δεν παρατηρήθηκε καμία ανάπτυξη του όγκου (Εικ. 4Α,

αριστερό πλαίσιο

), ανεξάρτητα από το στάδιο διαφοροποίησης των Τ-σωμάτων . Από την άλλη πλευρά, η μεταφορά Τ κυττάρων δεν επηρέασε σημαντικά την ανάπτυξη της hPSMA αρνητικών PC3 κύτταρα όγκου (Σχ. 4Α,

δεξί πάνελ

).

(Α) Δοκιμασία Winn. PC3-PIP (

αριστερό πλαίσιο

) και PC3 (

δεξί πάνελ

) καρκινικά κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε ποντίκια SCID, μόνο του ή αναμεμειγμένο με 1:01 T-σώμα-hPSMA /eGFP στις αντίθετες πλευρές του ίδιου ζώου. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε συναρτήσει του χρόνου με μέτρηση με παχύμετρο.