Αφηρημένο

Ιστορικό

Περιορισμένες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με τους μηχανισμούς με την οποία miRNAs συμβάλλουν στην πνευμονική καρκινογένεση. Η παρούσα μελέτη είχε αναλάβει να εξετάσει την έκφραση και τη λειτουργία των miRNAs που προκαλείται από συμπύκνωμα καπνού τσιγάρων (CSC) σε φυσιολογικό ανθρώπινο αναπνευστικό επιθήλιο και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Μεθοδολογία

μικρο-array και ποσοτική RT- PCR (qRT-PCR) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση miRNA και γονιδιακή έκφραση ξενιστή σε καλλιεργημένα κύτταρα, και χειρουργικά δείγματα. ανάλυση του λογισμικού-καθοδηγούμενη, ανοσοκατακρήμνιση RNA cross-link (CLIP), 3 ‘προσδιορισμοί λουσιφεράσης UTR, qRT-PCR, επικεντρώθηκε υπερ-συστοιχίες και τεχνικές κηλίδας western χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό και την επιβεβαίωση των στόχων του miR-31. Χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση σημάτων ιστόνης και παράγοντες μεταγραφής εντός του υποκινητή LOC554202. πειράματα αριθμός των κυττάρων και ξενομοσχεύματος χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του miR-31 στον πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων.

Αποτελέσματα

CSC αυξηθεί σημαντικά miR-31 έκφρασης και ενεργοποιείται LOC554202 στη φυσιολογική αναπνευστική επιθήλια και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα? miR-31 και της έκφρασης LOC554202 συνεχίστηκε μετά τη διακοπή της έκθεσης CSC. miR-31 και τα επίπεδα έκφρασης LOC554202 ήταν σημαντικά αυξημένα σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. δοκιμασίες CLIP και δημοσιογράφος αποδειχθεί άμεση αλληλεπίδραση των miR-31 με Dickkopf-1 (DKK-1) και dAct-3. Υπερ-έκφραση του miR-31 και αισθητά μειωμένο DKK-1 και τα επίπεδα έκφρασης σε φυσιολογικό DACT3 αναπνευστικά επιθήλια και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Knock-down του miR-31 αυξήθηκε DKK-1 και DACT3 επίπεδα, και κατήργησε CSC μεσολάβηση μειώσεις στα DKK-1 και της έκφρασης dAct-3. Περαιτέρω, η υπερ-έκφραση του miR-31 μειώθηκε SFRP1, SFRP4, και WIF-1, και η αυξημένη έκφραση Wnt-5a. CSC αυξημένη H3K4Me3, H3K9 /14ac και τα επίπεδα C /ΕΒΡ-β εντός του υποκινητή LOC554202. Νοκ-κάτω της C /ΕΒΡ-β καταργηθεί CSC-μεσολαβητική ενεργοποίηση του LOC554202. Υπερ-έκφραση του miR-31 ενισχύεται σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και ογκογονικότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα? knock-down του miR-31 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων αυτών.

Συμπεράσματα

Ο καπνός του τσιγάρου προκαλεί την έκφραση του miR-31 με στόχο αρκετών ανταγωνιστών της σηματοδότησης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων σε φυσιολογικά αναπνευστικά επιθήλια και τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα . miR-31 λειτουργεί ως oncomir κατά την ανθρώπινη πνευμονική καρκινογένεση

Παράθεση:. Xi S, Yang M, Τάο Υ, Xu Η Shan J, Inchauste S, et al. (2010) ο καπνός του τσιγάρου Προκαλεί Ο /ΕΒΡ-β-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του miR-31 σε φυσιολογικό ανθρώπινο αναπνευστικά επιθήλια και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. PLoS ONE 5 (10): e13764. doi: 10.1371 /journal.pone.0013764

Επιμέλεια: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 1 Ιούν του 2010? Αποδεκτές: 4, Οκτωβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου, 2010

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των τειχών κεφαλαίων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γενετική καθώς και επιγενετική διαταραχή της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια του κακοήθους μετασχηματισμού μπορεί να αποδοθεί εν μέρει στην ανώμαλη έκφραση των μικρο-RNAs (miRNAs) [1], [2]. Αυτά τα μικρά (-21-μερές) μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης σε 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (3’ UTR) του mRNA που στόχο, προκαλώντας αποδόμηση μεταγραφής ή της μεταφράσεως καταστολή ανάλογα με την έκταση της συμπληρωματικότητας μεταξύ της αλληλουχίας σπόρων της miRNA και το mRNA μοτίβο [3]. Περίπου το 30% όλων των mRNAs είναι πιθανοί στόχοι miRNA. Μέχρι σήμερα, περισσότερα από 800 miRNAs έχουν αναγνωριστεί σε ανθρώπους, καθένα από τα οποία στοχεύει πολλές λειτουργικώς σχετίζονται γονιδίων, έτσι μεσολαβώντας σύνθετων ρυθμιστικών δικτύων [3], [4].

Μία ποικιλία miRNAs έχουν εμπλακεί σε η παθογένεση των ανθρώπινων καρκίνων του πνεύμονα, η συντριπτική πλειοψηφία των οποίων είναι άμεσα με το κάπνισμα τσιγάρων [5], [6]. Ορισμένα από αυτά τα miRNAs λειτουργούν ως ογκογονίδια (oncomirs), ενώ άλλα δρουν ως καταστολείς όγκων. Για παράδειγμα, miR-21, η οποία ενεργοποιείται εν μέρει μέσω παρεκκλίνουσα σηματοδότηση EGFR καταστέλλει την έκφραση του ΡΤΕΝ και PDCD4, διευκολύνοντας τον πολλαπλασιασμό, εισβολή, και αντοχή σε απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα [7] – [11]. Η ενεργοποίηση του miR-93, miR-98 και miR-197 αναστέλλει την έκφραση του FUS1, ενισχύοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και χημειο-αντίσταση στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [12], [13]. Καταστολή του miR-15Α και miR-16, οι οποίες στοχεύουν κυκλίνες D1, D2 και Ε, καταργεί Rb μεσολάβηση ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα [14]. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση του let-7 μέλη της οικογένειας στόχευσης πολυάριθμα mRNA που κωδικοποιούν ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου, όπως Ras, AURKA, AURKB, και E2F5 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και ογκογονικότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [7], [15], [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλές τροποποιήσεις miRNA που παρατηρείται συχνά σε καρκίνους του πνεύμονα, όπως ρύθμιση προς τα κάτω του ας-7 και υπερ-έκφραση του miR-17-92, ανιχνεύονται σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα [17], [18], καθώς και pseudoglandular πνευμονικό παρέγχυμα [19], γεγονός που υποδηλώνει εμβρυϊκά επαναπρογραμματισμός της έκφρασης των miRNAs κατά τη διάρκεια πνευμονική καρκινογένεση.

Παρά τις πρόσφατες μελέτες που αποδεικνύουν προφίλ έκφρασης των miRNAs συσχετίζεται με ιστολογία του όγκου, καθώς και το καθεστώς του καπνίσματος και την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνους του πνεύμονα πρωτοβάθμια, [6], [20] – [22], περιορισμένες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με miRNA αλλαγές που συμβάλλουν άμεσα στην έναρξη και πρώιμη εξέλιξη αυτών των κακοηθειών. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα μοντέλο in-vitro για να εξετάσουν τροποποιήσεις miRNA διαμεσολαβείται από συμπύκνωμα καπνού τσιγάρων (CSC) σε φυσιολογικό ανθρώπινο αναπνευστικά επιθήλια, και καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα που προέρχονται από τους καπνιστές όσο και τους μη καπνιστές. Εδώ, αναφέρουμε ότι η CSC επάγει την έκφραση του miR-31 στόχευση αρκετών ανταγωνιστές σηματοδότησης Wnt συμπεριλαμβανομένων Dickkhopf-1 (DKK-1) και DACT3 σε φυσιολογικό ανθρώπινο αναπνευστικά επιθήλια, καθώς και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Οι παρατηρήσεις αυτές παρέχουν μια άμεση μηχανιστική σύνδεση μεταξύ ο καπνός του τσιγάρου και την ενεργοποίηση ενός oncomir καταστολή ανταγωνιστές της σηματοδότησης των βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια του καπνού που προκαλούνται από την πνευμονική καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και οι συνθήκες επεξεργασίας

Όλες οι γραμμές καρκίνου του πνεύμονα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA), και διατηρούνται σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS, 10 mM γλουταμικού οξέος, και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Πρωτογενής φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα αεραγωγών μικρό (SAEC) και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ) ελήφθησαν από την Lonza, Inc. (Frederick, MD), και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEC) έχουν γενναιόδωρα παρέχεται από τον John D. Minna (UT Southwestern, Dallas, ΤΧ), και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο κερατινοκυττάρου-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5 μg /L επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ( EGF) και εκχύλισμα βόειας υποφύσεως 50 mg /L (ΒΡΕ). συμπυκνώματα καπνού του τσιγάρου (CSC) που προέρχεται από το Κεντάκι 3R4F Αναφοράς τσιγάρα έρευνα μείγμα (University of Kentucky) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [23], και επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 1 mg πίσσας /mL σε RPMI, το οποίο ορίζεται ως το 10% CSC [24 ]. Για πειράματα έκθεση σε καπνό, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα των 10 cm σε κατάλληλα φυσιολογικά μέσα (NM) με ή χωρίς CSC (1%). Το μέσο αλλάχθηκε καθημερινά με την προσθήκη φρέσκου CSC. Τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν όπως απαιτείται, και συλλέχθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία για ανάλυση.

Ανθρώπινοι ιστοί

Πρωτοβάθμια δείγματα καρκίνου του πνεύμονα και των παρακείμενων ιστολογικά φυσιολογικό πνευμονικό παρέγχυμα συλλέχθηκαν διεγχειρητικής από ασθενείς που υποβάλλονται σε δυνητικά θεραπευτική εκτομές για τα πρωτόκολλα του πλοίου εγκεκριμένο από την εσωτερική επανεξέταση ΝΙΗ, που απαιτούν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση. Όλοι οι ιστοί αμέσως snap-κατεψυγμένα με ένα τμήμα που συγκομίζονται ιστού που αποστέλλονται για άμεση ιστολογική επιβεβαίωση από ανεξάρτητο, ανατομικά παθολόγος με τυφλό τρόπο. δείγματα ιστού ήταν το μπαρ-κωδικοποιημένα και αποθηκεύονται στη θωρακική Ογκολογίας Εργαστήριο Χειρουργικής Branch, NCI. Για απομόνωση microRNA και ανάλυση έκφρασης, το μικρό κλάσμα RNA απομονώθηκε με το κιτ απομόνωσης RT2 qPCR-Grade miRNA (Qiagen? Valencia, CA), και η έκφραση miRNA ποσοτικοποιήθηκε με την qRT-PCR ανίχνευσης miRNA Kit (ΑΒΙ? Carlsbad, CA) .

miRNA υπερέκφραση και αναστολή

Προδρόμου και αναστολέα miRNAs pMiR-H31PA-1, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP αρνητικού ελέγχου, MZIP31-ΡΑ-1, pGreenPuro Scramble φουρκέτα αρνητικό μάρτυρα αγοράστηκαν από SBI (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA). miRNA προδρόμους ή αναστολείς (αμφότερα στα 50 ηΜ) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

διανύσματα Reporter και DNA κατασκευάσματα

Οι 3 ‘UTRs του DKK1 (850 bp) και DACT3 (2461 bp) ενισχύθηκαν με PCR από ανθρώπινο cDNA SAEC, και εισάγεται καθοδικά του CMV με γνώμονα λουσιφεράση πυγολαμπίδας κασέτα στον φορέα pMIR-REPORT (Ambion, Austin, ΤΧ) μεταξύ

Hind III

και

Spe Ι

sites. πλασμίδια μεταλλαγμένο δημοσιογράφος (3 ‘UTRs της DKK1 και DACT3) δημιουργήθηκαν με τη χρήση QuikChange ιστοσελίδας-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Wilmington, DE). Όλα τα θραύσματα ενθέματος επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση.

λουσιφεράσης miRNA δοκιμασίες ρεπόρτερ στόχος

Προς επιβεβαίωση στόχου miRNA, περίπου 2 × 10

4 κύτταρα SAEC ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων ήταν παροδικά επιμολυσμένα με 25 έως 50 ng από κάθε κατασκεύασμα πυγολαμπίδας αναφοράς λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI) ‘150 έως 175 ng pcDNA3 κενό φορέα, 200 ng PRTK-Luc (Promega) σαν εσωτερικός μάρτυρας, και 30 pmol του προ-miR-31 (SBI, Mountain View, CA). διάνυσμα λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης. Περίπου 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, πυγολαμπίδας και δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla προσδιορίστηκαν. Κανονικοποιημένη σχετικές μονάδες φωτός αντιπροσωπεύουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας δραστικότητα λουσιφεράσης δραστηριότητα /Renilla.

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε συγκέντρωση 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε NM με ή χωρίς CSC συν πλασμίδιο επιμόλυνσης. Φρεάτια εις τριπλούν συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν με trypan blue τεχνικές αποκλεισμού.

Ποσοτική RT-PCR

Για mRNA, παρασκευάστηκε ολικό RNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και γενωμικό DNA αποβλήθηκε με TURBO DNA- δωρεάν Kit (Ambion). Ενα μα του συνολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας iScript ανάστροφης μεταγραφάσης (Bio-Rad). Παράλειψη της αντίστροφης μεταγραφάσης χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). PCR διεξήχθη ως εξής: 5 λεπτά στους 94 ° C, 35 κύκλοι των 60 s στους 94 ° C, 60 s στους 57-60 ° C, και 60 s στους 72 ° C, που ακολουθείται από 5 λεπτά στους 72 ° C. Σε πραγματικό χρόνο ποσοτική ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [25] χρησιμοποιώντας DKK-1, DACT3, SFRP1, SFRP4, WIF-1, και β-ακτίνης εναρκτήρες από την Applied Biosystems ή Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ). Για την απομόνωση microRNA και την ανάλυση της έκφρασης, η έκφραση των miRNA απομονωθεί με το κιτ απομόνωσης RT2 qPCR-Grade miRNA (Qiagen) προσδιορίστηκε ποσοτικά με την qRT-PCR ανίχνευσης miRNA Kit (ΑΒΙ).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας)

τα κύτταρα συνδέθηκαν σταυροειδώς με 1% φορμαλδεΰδη, λύθηκαν και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους επί πάγου για τη δημιουργία θραυσμάτων DNA με ένα μέσο μήκος 200-800 bp [26]. Μετά την προ-εκκαθάρισης, 1% από κάθε δείγμα αποθηκεύτηκε ως κλάσμα εισόδου. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν ειδικά H3K4me3, H3K9Ac, H3K14Ac (Abcam), RNA πολυμεράση II (Upstate) ή IgG ελέγχου. DNA εκλούστηκε και καθαρίστηκε από τα σύμπλοκα, που ακολουθείται από PCR ενίσχυση του προαγωγού LOC554202 χρησιμοποιώντας εκκινητές και συνθήκες όπως περιγράφεται [27].

siRNA και shRNA knockdown

Calu-6 και H841 κύτταρα ήταν παροδικά επιμολυσμένα με siRNAs που στοχεύουν C /EBP-α και C /EPB-β, ή εικονική αλληλουχίες siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). γονιδίου στόχου knockdown επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και τεχνικές στυπώματος western.

Western ανάλυση κηλίδος

εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε 4-12% Τπδ-γλυκίνης SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής και κηλιδώθηκαν επί μεμβράνης Immobilon Ρ (Millipore, Billerica, ΜΑ)? πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη αντιδραστήρια ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση Western ήταν γίδινη αντι-DKK-1, ποντικού αντι-DACT3, και κατσίκα αντι-β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA).

συστοιχίες RT-PCR

Wnt σηματοδότησης RT-PCR υπερ-συστοιχίες (ΠΑΥ-043A) ελήφθησαν από SABiosciences (Frederick, MD). 1 μg του ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή και το σύνολο της αντίδρασης cDNA αραιώθηκε και διανέμεται μεταξύ των 96 φρεάτια της πλάκας υπερ-συστοιχία. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με RT

2 SYBR Green /ROX PCR Master Mix (SABiosciences). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό που παρέχεται από τον πωλητή https://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.

microRNA μικροσυστοιχιών ανάλυση

χαμηλού μοριακού RNAs (μικρά RNAs) έχουν εξαχθεί από πλάκες κυττάρων χρησιμοποιώντας mirVana ™ miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, ΤΧ) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο εμπλουτισμού miRNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τριακόσια νανογραμμάρια μικρών RNAs από δείγματα ιστού απευθείας επισημασμένο με κιτ miRNA Ν-επισήμανση Κωδικός (Invitrogen) ανά πρωτόκολλα προμηθευτή. Εν συντομία, ώριμη miRNAs στα μικρά δείγματα RNA πρώτα ουρά με πολυ (Α)? πολυ (Α) ουρά miRNAs στη συνέχεια επισημαίνονται με αλληλουχία δέσμευσης που ακολουθείται από υβριδισμό με Cy5 /Cy3 σημασμένο δενδριμερή 3DNA. Για την επεξεργασία των δεδομένων των μικροσυστοιχιών και κανονικοποίηση, μικροσυστοιχιών chips σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή GenePix 4000B (Αχοη Instruments, Union City, CA) και η διάμεση εντάσεις σημείο παρήχθησαν χρησιμοποιώντας GenePix 5.0 (Αχοη Instruments, Union City, CA). δεδομένα μικροσυστοιχιών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και κανονικοποιούνται (50%) με τη χρήση GeneSpring (Agilent, CA). Στατιστική και ομαδοποίηση αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού GeneSpring. Τα επίπεδα έκφρασης του miRNAs υποβλήθηκαν σε 2-way ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για CSC επεξεργασία vs ανεπεξέργαστων συνθήκες για τις διάφορες κυτταρικές σειρές.

πριν CLIP (Αναγνώριση AGO-1 που σχετίζεται mRNAs)

τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα πειράματα CLIP πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας είτε αντι-AGO οικογένεια ή αντισώματα elF2C όπως περιγράφεται (28). Εν συντομία, τα κύτταρα σταυροειδείς δεσμούς με ακτινοβολία για 400 mJ /cm

2 και επιπλέον 200 mJ /cm

2 σε Stratalinker, και λύθηκαν για την παραγωγή RNA /πρωτεϊνών (AGO) σύμπλοκα [28] – [30]. Μετά την προ-εκκαθάρισης, 1% από κάθε δείγμα αποθηκεύτηκε ως κλάσμα εισόδου. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα εναντίον είτε AGO οικογένεια (Millipore, Billerica, ΜΑ), ή elF2C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ή IgG ελέγχου. RNA απομονώθηκε και καθαρίστηκε από τα σύμπλοκα, που ακολουθείται από PCR ενίσχυση του 3 ‘UTRs του miR-31 στόχους.

Ποντικού πειράματα ξενομοσχεύματος

Calu-6 και Η358 κύτταρα επιμολυσμένα με pCDH-CMV-MCS -EF1-copGFP φορέα ελέγχου και pMiR-H31PA-1 αιωρήθηκαν σε PBS σε μια συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /100 μL, και εμβολιάστηκαν υποδορίως σε ετερόπλευρη λαγόνες των αθυμικών γυμνών ποντικών (10 ποντικοί ανά ομάδα θεραπείας ανά πείραμα ). Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με βάση κάθετων διαμέτρων. Περίπου 21 ημέρες και 35 ημέρες αργότερα για Calu-6 και πειράματα Η358, αντίστοιχα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία, και αξιολογήθηκαν για την παραλαβή τοις εκατό του όγκου, και η μάζα του αποκόπηκε ξενομοσχεύματα. Στη συνέχεια, οι ιστοί όγκων καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο, και αποθηκεύεται για μελλοντική ανάλυση. Όλες οι διαδικασίες ζώων εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, και ήταν σύμφωνα με τον Οδηγό ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου.

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ συμφωνημένα δείγματα από τους ίδιους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, όπως όγκο και φυσιολογικό ιστό ελέγχθηκαν με τη δοκιμασία που υπογράφηκε-rank. Ομάδες συγκρίθηκαν με τη δοκιμή Wilcoxon-Mann-Whitney. διαστήματα εμπιστοσύνης για τις διαφορές στις διαμέσους ανάμεσα σε δύο ομάδες που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους προκατάληψη-διορθώνεται και επιτάχυνση bootstrapping. Οι διαφορές στον όγκο του όγκου μεταξύ των απέναντι πλευρών των ποντικών που φέρουν όγκο δοκιμάστηκαν με την Wilcoxon-υπογεγραμμένο δοκιμή rank σε διαστήματα 5 ημερών.

P τιμές

προσαρμόστηκαν για πολλαπλές δοκιμές με πλήρη αναδειγματοληψία [31]. διαστήματα εμπιστοσύνης για τη μέση τιμή των διαφορών πλευρά υπολογίστηκαν ως ακριβή μη-παραμετρική δίπλευρη διαστήματα εμπιστοσύνης με βάση το Wilcoxon signed-rank test.

Primer Ακολουθίες

Υποβλήθηκε όπως Πίνακα S1.

Αποτελέσματα

Up-ρύθμιση του miR-31 σε καλλιεργημένα κύτταρα που εκτίθενται σε CSC

Προκαταρκτικά πειράματα με τη χρήση τεχνικών συστοιχίας διεξήχθησαν για να εξετάσει προφίλ έκφρασης miRNA σε ένα πάνελ κανονικών αναπνευστικά επιθήλια ( SAEC και ΝΗΒΕ), αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBEC) και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Calu-6 H841, Η1299, H1650, H1975 και) καλλιεργήθηκαν σε φυσιολογικά μέσα, με ή χωρίς CSC. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε μοναδικό βασικό προφίλ έκφρασης των miRNAs που συμπίπτει με ιστολογία (κανονική vs κακοήθη). Επιπλέον, πνεύμονα γραμμές καρκίνου που προέρχεται από τους καπνιστές (Calu-6 Η1299, H841) ήταν εύκολα διακρίνονται από αυτά από τους μη καπνιστές (H1650, H1975) (Μ Yang, χειρόγραφο υπό προετοιμασία).

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον , προαναφερθείσα πειράματα μικρο-συστοιχία πρότειναν ότι η θεραπεία CSC επαγόμενη έκφραση του miR-31 σε φυσιολογικά αναπνευστικά επιθήλια, καθώς και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Για την περαιτέρω διερεύνηση αυτού του φαινομένου, ποσοτική RT-PCR πειραμάτων (qRT-PCR) διεξήχθησαν για να εξετάσει miR-31 έκφραση σε SAEC, HBEC, Calu-6, και H841 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο (ΝΜ) με ή χωρίς CSC για 5 ημέρες . Αυτά τα πειράματα (Σχήμα 1Α) έδειξαν ότι μη επεξεργασμένα Calu-6 και H841cells εμφάνισαν υψηλότερα ενδογενή επίπεδα του miR-31 σε σχέση με κύτταρα SAEC και HBEC? πρόσθετη ανάλυση αποκάλυψε ότι πέντε ημέρες η έκθεση CSC up-ρυθμίζεται miR-31 έκφρασης 5,5 φορές και 3,6 φορές σε SAEC και HBEC, αντίστοιχα, σε σχέση με τους μάρτυρες. Παρόμοια κατεργασία αύξησε miR-31 έκφραση 3.1 και 6.5 φορές σε Calu-6 και H841 κύτταρα, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). πειράματα πορεία του χρόνου αποκάλυψε up-ρύθμιση του miR-31 στο SAEC και H841 κύτταρα μέσα σε 24 ώρες μετά την έναρξη της έκθεσης CSC, με την έκφραση κορυφώθηκε και σταθεροποιείται περίπου 96 ώρες αργότερα (σχήμα 1Γ). Είναι ενδιαφέρον, up-ρύθμιση του miR-31 από την CSC συνεχίστηκε για 20 ημέρες μετά την απομάκρυνση της CSC από μέσα καλλιέργειας (Εικόνα 1Β).

Α) qRT-PCR ανάλυση των ενδογενών miR-31 έκφρασης κανονικοποιούνται με έλεγχο miRNA ( RNU44) σε SAEC, HBEC, Calu-6, και H841cells. Τα βασικά επίπεδα του miR-31 είναι υψηλότερες σε καρκίνων του πνεύμονα σε σχέση με καλλιεργημένα φυσιολογικά ή αθανατοποιημένα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος. Β) Ανάλυση qRT-PCR του miR-31 έκφραση σε SAEC, HBEC, Calu-6, και H841cells καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο (ΝΜ) με ή χωρίς CSC για 5 ημέρες. Αυξημένη έκφραση του miR-31 ήταν εμφανής 20 ημέρες μετά τη διακοπή της θεραπείας CSC. Ανάλυση C) qRT-PCR αποδεικνύει χρονο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του miR-31 σε SAEC και H841cells καλλιεργήθηκαν σε NM με ή χωρίς CSC για 0, 12, 24, 48, 72, 96, και 120 ώρες. Δ) Ανάλυση qRT-PCR αποδεικνύει miR-31 έκφρασης σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα σε σχέση με ζεύγη παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα. miR-31 επίπεδα σε όγκους ήταν υψηλότερη από τις αντίστοιχες φυσιολογικό πνεύμονα. Επιπλέον, miR-31 επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκίνους του πνεύμονα από την ενεργό /πρώην καπνιστές σε σύγκριση με εκείνες από ποτέ καπνιστές.

Η

miR-31 έκφρασης σε πρωτογενή δείγματα καρκίνου του πνεύμονα

Πρόσθετα πειράματα qRT-PCR διεξήχθησαν για να εξετάσει miR-31 επίπεδα έκφρασης σε ένα τυχαία επιλεγμένο πάνελ πρωτογενών μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και των παρακείμενων ιστολογικά φυσιολογικό πνευμονικό παρέγχυμα (κλινικά και παθολογικά δεδομένα συνοψίζονται στον πίνακα 1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, miR-31 εκφράσεως είναι αυξημένο (μέση 4,13 φορές? Εύρος 1,47 έως 12,46 φορές) σε καρκίνους του πνεύμονα σε σχέση με αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Είναι ενδιαφέρον ότι, miR-31 επίπεδα σε καρκίνους του πνεύμονα από τους καπνιστές ήταν υψηλότερες από εκείνες που παρατηρούνται σε μη-καπνιστές (5.2 vs 1.65 φορές, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,01). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν προκαταρκτικά πειράματα καταδεικνύουν υψηλότερα επίπεδα miR-31 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σε σχέση με καλλιεργημένα κανονικά αναπνευστικά επιθήλια (Σχήμα 1Α), και πρότεινε ότι η ενεργοποίηση του miR-31 μπορεί να είναι ένα βιολογικώς σχετικό φαινόμενο κατά την ανθρώπινη πνευμονική καρκινογένεση.

η

Επιπτώσεις του miR-31 σε ανταγωνιστές της σηματοδότηση Wnt

ανάλυση λογισμικού καθοδηγούμενη έδειξε ότι αρκετές ανταγωνιστές της Wnt σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων DKK-1 [32] και DACT3 [33] ήταν το δυναμικό miR-31 στόχους. Για την επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων, SAEC, HBEC, Calu-6, και τα κύτταρα H841 επιμολύνθηκαν παροδικά με miR-31. Πειράματα ποσοτικής RT-PCR αποκάλυψε ~ 12 φορές αυξήσεις στη miR-31 έκφραση σε κύτταρα miR-31-επιμολυσμένα σχέση με τους μάρτυρες φορέα (Σχήμα 2Α). Υπερ-έκφραση του miR-31 μειώθηκαν DKK-1, καθώς και DACT3 (~5-8 φορές και ~1.5-7 φορές αντίστοιχα, σε σχέση με τους ελέγχους) σε αυτές τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές (Σχήματα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα εμφανίστηκαν κάπως πιο έντονες σε κανονική SAEC και αθανατοποιημένα HBEC, πιθανώς λόγω των χαμηλότερων επιπέδων ενδογενούς miR-31 και υψηλότερα επίπεδα DKK-1 και DACT3 σε αυτά τα κύτταρα σε σχέση με το Calu-6 και H841 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Α) miR-31 ήταν υπερ-εκφράζεται σε SAEC, HBEC, Calu-6, και H841 κύτταρα μέσω παροδική επιμόλυνση των πρωτογενών miR-31 κατασκευάσματα. qRT-PCR ανάλυση επιβεβαίωσε το υψηλό επίπεδο miR-31 έκφρασης σε miR-31-επιμολυσμένα σε σχέση με τον έλεγχο των κυττάρων. Β) Ανάλυση qRT-PCR των επιπέδων DKK-1 και την έκφραση DACT3 σε SAEC, HBEC, Calu-6, και H841 κύτταρα με ή χωρίς υπερ-έκφραση του miR-31. Υπερ-έκφραση του miR-31 μειώθηκαν DKK-1 και DACT3 σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές. Γ) Ανάλυση qRT-PCR αποδεικνύοντας μειωμένα επίπεδα ενδογενούς miR-31 σε SAEC, HBEC, Calu-6, και H841 κύτταρα μετά από παροδική επιμόλυνση αντινοηματικού miR-31 (Zip-miR-31) κατασκευάσματα σε σχέση με τους μάρτυρες. Δ) Ανάλυση qRT-PCR των επιπέδων DKK-1 και την έκφραση DACT3 σε SAEC, HBEC, Calu-6 και H841 κύτταρα με ή χωρίς προς τα κάτω ρύθμιση του miR-31. Knock-down του miR-31 ενισχύει τα βασικά επίπεδα του DKK-1 και DACT3 σε αυτά τα κύτταρα. Ανάλυση E) qRT-PCR αποδεικνύει ότι η εξουδετέρωση του miR-31 μερικώς μπλοκ CSC μεσολάβηση μειώσεις των DKK-1 και DACT3 σε SAEC. ΣΤ) Ανάλυση Western blot της έκφρασης DKK-1 και DACT3 σε γονικά και φορέα μάρτυρα SAEC και Calu-6 κυττάρων, καθώς επίσης και SAEC Calu-6 κυττάρων που εμφανίζουν συστατική υπερέκφραση ή knock-down του miR-31. οι τιμές πυκνότητας είναι κανονικοποιημένες με β-ακτίνη ελέγχου. DKK-1 και το επίπεδο DACT3 μειώθηκαν, ή κάπως αυξημένη σε αυτά τα κύτταρα μετά από υπερέκφραση ή knock-down του miR-31, αντίστοιχα.

Η

Τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί αν η εξάντληση του ενδογενούς miR-31 που επηρεάζονται έκφραση DKK-1 και DACT3 σε καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, miR-31 επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν ~7-10 φορές σε SAEC, HBEC, Calu-6, και τα κύτταρα H841 παροδικά επιμολυσμένα με αντινόημα-miR-31 (Zip-miR-31) κατασκευάσματα σχέση με τους ελέγχους διάνυσμα . Μείωση του miR-31 έκφραση αυξήθηκε DKK-1, καθώς και την έκφραση DACT3 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (~1.47-8 φορές και ~4.7-9 φορές αντίστοιχα? Εικόνα 2D). Μετέπειτα πειράματα αποκάλυψαν ότι knockdown του miR-31 σημαντικά εξασθενημένο CSC μεσολάβηση μειώσεις στα DKK-1 και DACT3 σε SAEC καθώς H841 κύτταρα (Σχήμα 2Ε). Συνεπής με πιο πάνω αποτελέσματα, ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι DKK-1 και DACT3 επίπεδα πρωτεΐνης σε SAEC και Calu-6 κύτταρα μειώθηκαν κατά υπερ-έκφραση του miR-31 (Σχήμα 2F). Σε αντίθεση, knock-down του ενδογενούς miR-31 φάνηκε να αυξάνει DKK-1 και DACT3 επίπεδα πρωτεΐνης σε SAEC και Calu-6 κυττάρων, αν και αυτές οι αλλαγές δεν συσχετίζονται με ακρίβεια με μεταβολές στην έκφραση mRNA, πιθανώς οφείλεται, εν μέρει, στην πρωτεΐνη σταθερότητα και αντίσωμα συγγένειες. Συλλογικά, αυτά τα πειράματα υποδηλώνουν έντονα ότι το miR-31 ρυθμίζει DKK-1 και DACT3 μέσω μετα-μεταγραφικά και μεταφραστικά-ανασταλτικών μηχανισμών σε καλλιεργημένα φυσιολογική αναπνευστική επιθήλια και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Σούπερ-συστοιχίες χρησιμοποιήθηκαν για να εξετάσει περαιτέρω το επιδράσεις του miR-31 για σηματοδότηση Wnt σε SAEC και Calu-6 κυττάρων. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε 7-14 φορές κάτω ρύθμιση των DKK-1, καθώς και πρόσθετες ανταγωνιστές σηματοδότηση Wnt, συμπεριλαμβανομένων SFRP1, SFRP4, και WIF1, καθώς και μια αύξηση κατά 5 φορές σε CTNNB1, TCF7 και Wnt-5a (διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με αίτημα). Μετέπειτα πειράματα qRT-PCR επιβεβαίωσε καταστολή SFRP1, SFRP4, και WIF-1, και προς τα πάνω ρύθμιση του Wnt-5a σε SAEC και Calu-6 κυττάρων που υπερεκφράζουν miR-31 (Σχήμα S1A). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-31 ενεργοποιεί σηματοδότηση Wnt σε καλλιεργημένα καρκίνο του πνεύμονα και φυσιολογική αναπνευστική επιθηλιακών κυττάρων.

DKK-1 και DACT3 είναι άμεσοι υποψήφιοι στόχος του miR-31

Πρόσθετα πειράματα αναλάβει την υποχρέωση να εξετάσει αν miR-31 αλληλεπιδρά άμεσα με 3 ‘UTRs των DKK-1 και DACT3. Εν συντομία, RNA cross-link ανοσοκαταβύθιση (CLIP) τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της αλληλεπίδρασης του miR-31 με αυτές τις πιθανούς στόχους σε SAEC κύτταρα [28]. Το σχήμα 3Α απεικονίζει τις πιθανές θέσεις σύνδεσης miR-31 στο πλαίσιο των 3 ‘UTRs των DKK-1 και DACT3 μεταγραφές. ανάλυση RT- PCR αποκάλυψε ότι η οικογένεια AGO αντίσωμα καθιζάνει DKK-1 και DACT3 μεταγραφές στο κυτταρόπλασμα των μη επεξεργασμένων SAEC (Σχήμα 3Β). Εμφανή αυξήσεις στην PCR προϊόντα που αντιστοιχούν σε 3 ‘UTRs του DKK-1 και DACT3 παρατηρήθηκαν σε SAEC υπερεκφράζουν miR-31? Το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε σε miR-31-εξαντλημένο κύτταρα SAEC. Σε αυτά τα πειράματα, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος δεδομένου ότι δεν αλληλουχίες μπορεί να στοχεύονται από miR-31 (Σχήμα 3Β). Επειδή miR-21 έχει βρεθεί να στοχεύουν απευθείας το 3 ‘UTR του PDCD4 ανθρώπινων ιστών [34], ανοσοκαταβυθίστηκαν RNA από κύτταρα SAEC υπερεκφράζουν miR-21 χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για CLIP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπής με την πιο πάνω αποτελέσματα Wnt SuperArray, επιπλέον πειράματα CLIP αποδειχθεί αλληλεπίδραση του miR-31 με SFRP4 (Σχήμα S1B).

Α) πιθανές θέσεις-στόχους των miR-31 στο πλαίσιο DKK-1 3 ‘UTR (επάνω) και DACT3 3 ‘UTR (κάτω). Β) miRNA στοχευμένες μεταγραφές σε RISC καταβυθίστηκαν με πριν από την οικογένεια αντισωμάτων μετά επάγεται υν εγκάρσια σύνδεση RNAs σε δεσμευτικές πρωτεΐνες τους, ακολουθούμενη από ενίσχυση RT-PCR. Υπερ-έκφραση του miR-31 αυξήθηκε σημαντικά κατακρήμνιση του DKK-1 και στόχος DACT3 μεταγραφές σε κύτταρα SAEC. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος δεδομένου ότι δεν αλληλουχιών στην 3 ‘UTR που μπορούν να στοχευθούν από miR-31. Γ) δοκιμασίες λουσιφεράσης καταδεικνύοντας μείωση στην ενεργότητα λουσιφεράσης σε SAEC επιμολυσμένα με pMiR-Αναφορά φορέων με ή χωρίς προσθήκη 3 ‘UTR ή μεταλλαγμένης 3’ UTR ανταγωνιστών σηματοδότηση Wnt.

Η

Πρόσθετα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση pMiR- φορείς έκθεση με βάρος ή μεταλλαγμένη 3 ‘UTRs των DKK-1 ή DACT3, παροδικά συν-επιμολυσμένα με miR-31 πρωτογενείς δομές ή φορείς ελέγχου σε SAEC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, λουσιφεράση δραστηριότητες του wt 3 ‘UTRs του DKK-1 και DACT3 μειώθηκαν ~ 70% σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα ή μεταλλαγμένης 3’ UTRs, αντίστοιχα. Συλλογικά, αυτά τα πειράματα δείχνουν έντονα ότι το miR-31 αλληλεπιδρά άμεσα με 3 ‘UTRs των DKK-1 και DACT3.

επιγενετικές διαταραχές που συμπίπτει με την CSC με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης του miR-31

Πρόσφατες αναλύσεις ChIP από μοτίβα κατανομής των H3K4Me3, H3K9 /14ac και H2AZ πρότεινε ότι το γονίδιο υποδοχής για miR-31 είναι LOC554202 [35]. Ως εκ τούτου, επιπλέον πειράματα για να εξετάσουν εάν CSC διαμορφωμένο έκφραση LOC554202 σε SAEC. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που αφορούν την miR-31 (Σχήμα 1Α), 5-ημερών αγωγή CSC επαγόμενη έκφραση του LOC554202, η οποία διατηρήθηκε για 20 ημέρες μετά την αφαίρεση του CSC από μέσα καλλιέργειας (Σχήμα 4Α)? αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά που σχετίζονται με CSC μεσολάβηση ανοδική ρύθμιση του miR-31 (Σχήμα 1). Πειράματα qRT-PCR αποκάλυψε ότι 6 από 7 πρωτογενών δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα που εκφράζουν ≥2 φορές υψηλότερη miR-31 επίπεδα σε σχέση με αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων επίσης παρουσίασαν υπερέκφραση του LOC554202 (Σχήμα 4Β).

Α) RT- ανάλυση που αποδεικνύει PCR up-ρύθμιση της έκφρασης LOC554202 στο SAEC παρακάτω 5 ημερών έκθεσης CSC. Σύμφωνα με τα δεδομένα που αφορούν τη ρύθμιση του miR-31 από την CSC, έκφραση LOC554202 συνεχίστηκε για 20 ημέρες μετά την παύση της έκθεσης CSC. Β) Ανάλυση qRT-PCR αποδεικνύει επίπεδα έκφρασης του LOC554202 σε πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα σε σχέση με γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. C) Σχηματική αναπαράσταση του LOC554202, το υποτιθέμενο γονίδιο υποδοχής του miR-31. Α, Β, C, και D αντιπροσωπεύουν θέσεις των ζευγών εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση chip. ανάλυση D) ChIP απεικονίζει H3K4Me3 και /14 επίπεδα ακετυλίωσης H3K9 εντός τεσσάρων περιοχών του υποκινητή LOC554202 (~ 1 kb, 2 kb, 3 kb, και, 5 kb από το TSS) σε SAEC καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς CSC. Αυξημένη σήματα ενεργοποίησης παρατηρήθηκαν στην περιοχή του εγγύς υποκινητή μετά από έκθεση CSC.

Η

Η ανάλυση της αλληλουχίας αποκάλυψε κανένα κλασικό νησί CpG στην περιοχή του υποκινητή της LOC554202, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό το γονίδιο υποδοχής δεν ρυθμίζεται κυρίως μέσω των μηχανισμών της μεθυλίωσης του DNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετέπειτα πειράματα ChIP κατέδειξε αυξημένα επίπεδα των σημάτων ενεργοποίησης H3K4Me3 και H3K9 /14ac στην περιοχή του εγγύς υποκινητή (μηδέν έως -1,5 ια) του LOC554202 (η οποία περιέχει προφανώς τα ρυθμιστικά στοιχεία για miR-31) σε SAEC παρακάτω CSC έκθεσης (Εικόνες 4C και D ). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα σήματα ενεργοποίησης στην περιοχή του υποκινητή LOC554202 στο SAEC ήταν ακόμη παρούσα προθεσμία 20 ημερών από τη διακοπή της θεραπείας CSC. Αυτά τα ευρήματα συμφωνούν με τα αποτελέσματα RT-PCR που απεικονίζονται στην Εικόνα 4Α.

Ο ρόλος της Ο /ΕΒΡ-β σε CSC διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της miR-31

Επιπλέον πειράματα διεξήχθησαν για να εξετάσει περαιτέρω μηχανισμούς με την οποία CSC μεσολαβεί η ενεργοποίηση των LOC554202. Προκαταρκτική ανάλυση λογισμικό δεν αποκάλυψε χαρακτηριστικές ακολουθίες XRE εντός 5 kb της θέσης έναρξης της μεταγραφής υποτιθέμενη (TSS) για LOC554202, γεγονός που υποδηλώνει ότι πάνω ρύθμιση LOC554202 η CSC δεν διαμεσολαβείται κυρίως μέσω του υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα σηματοδότησης [36]. Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η ανάλυση αυτή αποκάλυψε πολλαπλές πιθανές θέσεις πρόσδεσης για το C /EBP-β, η οποία έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι μεσολαβεί πάνω ρύθμιση της Bcl-xL σε καρκινικά κύτταρα του μαστού εκτέθηκαν σε καπνό τσιγάρου [37]. Ως εκ τούτου, επιπλέον πειράματα για να διαπιστωθεί αν ο παράγοντας αυτός μεταγραφής συνέβαλε στην CSC διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της miR-31 σε καλλιεργημένα αναπνευστικά επιθήλια.