Αφηρημένο

Ιστορικό

Η τυροσίνης του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα επιδερμικής αναστολείς κινάσης υπήρξαν αποτελεσματικά σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενών κυττάρων. Ωστόσο, επίκτητη αντοχή αναπτύσσεται τελικά στους περισσότερους ασθενείς παρά την αρχική θετική ανταπόκριση. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι υπάρχει μια μοριακή σύνδεση μεταξύ επίκτητη αντοχή και της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (ΕΜΤ). Ν-cadherin εμπλέκεται στην ΕΜΤ και στη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Εδώ, αναλύσαμε την έκφραση Ν-cadherin και η λειτουργία στην erlotinib ανθεκτικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών.

Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές H1650 χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί το ανθεκτικό σε erlotinib (H1650ER) υπογραμμή. Στη συνέχεια, η επαγωγή της ΕΜΤ αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοχρώση και κηλίδες Western σε κύτταρα H1650ER. έκφραση Ν-καντερίνης στα ανθεκτικά κύτταρα εξετάστηκε με τη χρήση FACS και στύπωμα western. Επιπλέον, ένας προσδιορισμός εισβολή πραγματοποιήθηκε για τον χαρακτηρισμό των ανθεκτικών κυττάρων. Αναλύθηκαν Τα αποτελέσματα της Ν-καντερίνης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή. Η συσχέτιση της έκφρασης Ν-καντερίνης με τον φαινότυπο EMT διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική ανάλυση των 13 αρχειοθετούνται, ιστών αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, πριν και μετά τη θεραπεία με erlotinib.

Αποτελέσματα

Σε κύτταρα H1650ER, Ν- έκφραση καντερίνης ρυθμίζεται αυξητικά, παράλληλα με τη μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης. Η σήμανση ιστολογική αλλαγή και η ανάπτυξη μιας ατράκτου που μοιάζει μορφολογία υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε H1650ER ΕΜΤ, συνοδευόμενη από μείωση της Ε-καδερίνης και αύξηση των βιμεντίνη. Μια αλλαγή στην κατάσταση EMT μεταξύ των προ-και μετα-επεξεργασία παρατηρήθηκε σε 11 από τις 13 περιπτώσεις (79%). Σε βιοψίες των ανθεκτικών μορφών καρκίνου, η έκφραση Ν-καδερίνης ήταν αυξημένη σε 10 από τις 13 περιπτώσεις. Επαγωγή της ΕΜΤ ήταν σύμφωνη με την επιθετική χαρακτηριστικά. Αναστολή της έκφρασης Ν-καντερίνης με siRNA ελέγχθηκε για τη μείωση του πολλαπλασιασμού και της εισβολής των κυττάρων H1650ER

in vitro

.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας παρέχουν αποδείξεις ότι η επαγωγή της συμβάλλει EMT με την επίκτητη αντοχή σε EGFR-TKIs στον καρκίνο του πνεύμονα. Προτείνει ότι η Ν-καντερίνη είναι ένας δυνητικός μοριακός στόχος για τη θεραπεία του NSCLC

Παράθεση:. Zhang Χ, Liu G, Kang Υ, Dong Ζ, Qian Q, Ma X (2013) Ν-καδερίνη έκφραση που σχετίζονται με την απόκτηση του EMT φαινότυπο και με Ενισχυμένη εισβολή στο Erlotinib-Resistant καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 8 (3): e57692. doi: 10.1371 /journal.pone.0057692

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Ιταλία

Ελήφθη: 22 Ιουλ, 2012? Αποδεκτές: 28η Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Επιχορήγηση Συμβόλαιο χορηγός: το ερευνητικό πρόγραμμα Επιστήμης της επαρχίας Χενάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου που οφείλεται σε κακοήθη καρκινώματα, και η χρήση των παραδοσιακών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων έναντι καρκίνων του πνεύμονα είναι μόνο μετρίως αποτελεσματική [1] – [3]. Πρόσφατες πρόοδοι χρησιμοποιώντας αναστολείς κινάσης τυροσίνης που μπλοκάρουν ειδικά τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχουν παράσχει μία αξιοσημείωτη όφελος για υποσύνολα των ασθενών των οποίων οι όγκοι φιλοξενούν συγκεκριμένες γενετικές ανωμαλίες [4] – [7]. Τα φάρμακα αυτά έχουν οδηγήσει σε εντυπωσιακές βελτιώσεις στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) σε σύγκριση με τη χημειοθεραπεία. Ωστόσο, αντοχή φαρμάκου αναδύεται τελικά μέσω διαφόρων μηχανισμών [8] – [12]. Αυτή η επίκτητη αντοχή έχει αποδοθεί σε δύο κυρίως μηχανισμούς. Ένας προτεινόμενος μηχανισμός είναι η εμφάνιση ενός κακοήθους κλώνου με μια δευτερεύουσα μετάλλαξη στο πεδίο κινάσης EGFR (Τ790Μ), που καταργεί την ανασταλτική δράση της TKIs [13] – [14]. Ένα άλλο 15 έως 20% υποβάλλονται σε ενίσχυση του ΜΕΤ κινάσης τυροσίνης υποδοχέα, η οποία ενεργοποιεί καθοδικά ενδοκυτταρική σηματοδότηση ανεξάρτητα από το EGFR [15] – [16]. Επιπλέον, οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η απόκτηση του φαινοτύπου EMT σχετίζεται με την επίκτητη αντοχή σε αναστολείς της τυροσινικής κινάσης του EGFR (TKIs) [17] – [20]. Η ΕΜΤ χαρακτηρίζεται από τη συνδυασμένη απώλεια των επιθηλιακών πρωτεϊνών διασταύρωση κύτταρο, όπως Ε-καδερίνης, και το κέρδος των δεικτών μεσεγχυματικών, όπως βιμεντίνη. Κατά τη διαδικασία EMT, επιθηλιακά κύτταρα χάνουν τα χαρακτηριστικά τους, να αποκτήσουν τις ιδιότητες των μεσεγχυματικών, και να γίνει κινητήριος και επεμβατική [21].

N-cadherin, η cadherin μεσεγχυματικών που σχετίζονται με την EMT, είναι ζωτικής σημασίας για την εξέλιξη του καρκίνου, με σεβασμό τόσο μετάσταση και σε αντίσταση χημειοθεραπεία. E-cadherin και το μερίδιο Ν-cadherin πολλά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά. Αμφότερα τα μόρια καθιερώσει ασβέστιο-εξαρτώμενη ομοφιλική προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου με εξωκυτταρικές περιοχές τους και συνδέονται με κατενίνες σε ενδοκυτταρικές περιοχές τους [22]. Ένα χαρακτηριστικό της ΕΜΤ είναι η μείωση του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις, ειδικά η μείωση της Ε-καδερίνης η οποία είναι κρίσιμη για τη διατήρηση του φαινοτύπου.

Αυτή η μελέτη αξιολόγησε το αν η επαγωγή της ΕΜΤ είχε σχέση με την επίκτητη αντοχή παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της θεραπείας erlotinib και να προσδιοριστεί ο ρόλος του Ν-cadherin σε εκείνους τους ασθενείς με NSCLC πριν και μετά τη θεραπεία erlotinib.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα κυτταρική γραμμή H1650 ελήφθη από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκε σε υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή στους 37 ° C, σε ένα διάλυμα ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη. Η κυτταρική σειρά erlotinib ανθεκτική (H1650ER) ιδρύθηκε με την έκθεση γονικών κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib, έως 10 μΜ, για αρκετούς μήνες. Τα ανθεκτικά κύτταρα συνεχώς διατηρήθηκαν σε ένα μέσο που περιέχει 10 μΜ του erlotinib πριν από κάθε πείραμα.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

ποντικού αντι-Ε-καδερίνης αντίσωμα (sc-21791) και μονοκλωνικά αντι- βιμεντίνη αντίσωμα (sc-53464), ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (sc-47778), αντι-Ν-καντερίνης αντίσωμα κουνελιού (SC-59987), ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (SC-53800), και αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με ΡΕ κατσίκας (sc-53464) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Akt (# 9272), S473 ρ-Akt (# 4060), EGFR (# 2239), και ρ-42/44 ΜΑΡΚ (# 4695) ήταν όλα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). EGFR [pY1068] (CB11007889) και κουνελιού αντι-ΕΚΚ αντίσωμα (CB1241938) αγοράστηκαν από την Affinity Bioreagents (Χρυσή, CO.).

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

μετρήθηκαν προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων χρησιμοποιώντας το Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 δοκιμασία (CCK-8? Dojindo Laboratories, Santa Clara, CA), το οποίο χρησιμοποιεί την βιοαναγωγή του 2- (2-μεθοξυ-4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2, 4-δισουλφοφαινυλ) -2Η τετραζόλιο νάτριο (WST-8) προς πορτοκαλόχρουν φορμαζάνης για τη μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Εν συντομία, 100 μΐ κυττάρων H1650 και H1650ER, στα 2 × 10

4 /ml, επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της erlotinib σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων για 48 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο καλλιέργειας των 96 φρεατίων αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 5% CCK-8 αντιδραστήριο? μετά από μια ώρα, η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε και οι τιμές διορθώθηκαν με αφαίρεση της απορρόφησης των φρεατίων ελέγχου που δεν περιέχει κύτταρα.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί από 13 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, από τόσο πριν όσο και μετά τη θεραπεία erlotinib, συλλέχθηκαν μεταξύ Ιανουαρίου 2008 και τον Ιούλιο του 2011 στο Νοσοκομείο Henan Επαρχίας Λαϊκό, και ενσωματωμένα σε παραφίνη. διαφάνειες ιστό του όγκου-παραφινοποιήθηκαν και αφυδατωμένα χρήση διαφανειών Brite (Sasco Chemical Group, Inc.). Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας 0.05 Μ ρυθμιστικού διαλύματος γλυκίνης-ΗΟΙ, ρΗ 3,5, που περιέχει 0,01% (β /ο) ΕϋΤΑ, στους 95 ° C για 20 λεπτά και χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι ανθρώπινης Ε-καντερίνης, βιμεντίνη και Ν-cadherin, η οποία είναι ίδιες όπως και για τις in vitro δοκιμασίες ,. Η αξιολόγηση των ανοσοχρώση αυτών των τμημάτων έγινε τυφλή σε δύο εκπαιδευμένους παθολόγους που δεν γνώριζαν το κλινικό υπόβαθρο των δειγμάτων. Η ένταση της Ε-καδερίνης, βιμεντίνη και Ν-καδερίνης βαθμολογήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε τέσσερις κατηγορίες ανάλογα με χρώση: 0 για 0%? 1 για 1-33%? 2 για το 34-66%? και 3 για 67-100%. Όλα τα 13 ανθρώπινων ιστών που εμπλέκονται στη μελέτη μας πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις αρχές που ορίζονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι του 1964 και όλες τις επόμενες αναθεωρήσεις. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου Henan επαρχιακή ανθρώπων, Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα μαθήματα.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) Επιμόλυνση

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ειδικά για Ν-cadherin αγοράστηκε από την Invitrogen. Η ακολουθία που χρησιμοποιείται για την Ν-καντερίνης παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) ήταν 5′-CUAACAGGGAGUCAUAUGGUGGAGC-TdT-3 ‘. Για να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική επιδράσεις της παρεμβαλλόμενα RNA, μη-στόχευσης siRNA ελέγχου, που αγοράστηκε επίσης από την Invitrogen, χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Το αντιδραστήριο διαμόλυνσης siRNA (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές, ανεξάρτητα.

εισβολής σε Matrigel Δοκιμασία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ν-cadherin-ειδική siRNAs για 48 ώρες για να knockdown έκφραση Ν-καδερίνης. Εισβολή παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας transwell ένθετα καλλιέργειας με διάμετρο 6,5 mm και 8 μm φίλτρων πόρου (Greiner Βίο One-SAS, Courtaboeuf, France). Στη συνέχεια, 3 × 10

4 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου RPMI, με 1% FCS σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα, και 600 μΐ RPMI, με 10% FCS προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C. Μετά την απομάκρυνση των κυττάρων από την άνω πλευρά του transwell, τα κύτταρα στην κάτω πλευρά βάφτηκαν με διάλυμα 0,1% κρυσταλλικού ιώδους (Becton Dickinson) και λύθηκαν με 10% οξικό οξύ για την ποσοτικοποίηση με πυκνομετρική μέτρηση στα 550 nm. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Ανάλυση Western Blot

Οι πρωτεΐνες από τα προϊόντα λύσης κυττάρου, τα οποία παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% TritonX-100, 0,1 % δωδεκυλοθειϊκό νάτριο και 1% Nadeoxycholate (ρΗ 7.4)] συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 10 μg /ml πεπστατίνη Α, 10 μg /ml απροτινίνη και 5 μg /ml λευπεπτίνη), ανιχνεύθηκαν με SDS-PAGE και τότε ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε Immobilon μεμβράνες (Invitrogen)? Αυτές οι μεμβράνες στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν συζευγμένα με υπεροξειδάση αντισώματα χρένο και η μεμβράνη αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL (Thermo). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές, ανεξάρτητα.

κλωνογονική δοκιμασία

Τα κύτταρα H1650 και H1650ER υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05% θρυψίνη και τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 0.35% αγαρόζη σε μέσο ϋΜΕΜ σε επίπεδα πάνω από 0,7% αγαρόζη στο ίδιο μέσο. σχηματισμός αποικιών παρατηρήθηκε μετά από 2-3 εβδομάδες σε καλλιέργεια. Μετά χρώση με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες, οι αποικίες μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκαν και ο μέσος όρος για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης.

φθορισμού ανοσοκυτταροχημεία

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Είχαν σταθερό για 10 λεπτά με ψυχρή μεθανόλη και πλένεται τρεις φορές με PBS. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια δεσμεύτηκαν σε ένα διάλυμα PBS, 10% βόειο ορό, και 0.1% Tween 20 για 1 ώρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε είτε Ε-καδερίνης ή να βιμεντίνη σε 2 μg /ml για 1 ώρα, στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε PBS, 5 ή 10% βόειο ορό, και 0,1% Tween 20. Μετά από επώαση σε καλυπτρίδες για 1 ώρα στους 37 ° C οι καλυπτρίδες πλένονται όπως περιγράφεται παραπάνω και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια σε μέσο που περιέχει DAPI.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

τα καρκινικά κύτταρα ήταν διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 0.05% θρυψίνη? πλύθηκαν με PBS και 100 μΙ υποπολλαπλάσια 10

5 κύτταρα σε PBS τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων ν-πυθμένα και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με IgG. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Μετά τις πλύσεις με PBS, συνδεδεμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπου-ΡΕ ή κατσίκας αντι-ανθρώπου-CY3, και αναλύθηκαν με FACS (LSRII, Becton Dickinson).

Στατιστική Ανάλυση

το στατιστικό πακέτο SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση δεδομένων. Η σημασία της διαφοράς μεταξύ των συμμεταβλητές προσδιορίστηκε με δύο ουρών δοκιμή v2. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

1. Η Εξαγορά της erlotinib Αντίστασης H1650 Γραμμές κυττάρων Εκτίθενται Μεταβλητό Ενεργοποίηση μονοπάτι σηματοδότησης

Ο καρκίνος του πνεύμονα γραμμή erlotinib ανθεκτική H1650 (H1650ER), που αρχικά προέρχεται από την γονική H1650 κυτταρική γραμμή, έδειξε μια αυξημένη εξάρτηση από τις EGFR σηματοδότησης για ανάπτυξη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Με την καλλιέργεια αυτής της κυτταρικής γραμμής υπό την παρουσία μιας σταθερής υψηλής συγκέντρωσης erlotinib σε περίοδο αρκετών μηνών, ήμασταν σε θέση να απομονώσουν κυτταρικές γραμμές ικανές να αναπτύσσονται σε συγκεντρώσεις erlotinib έως 10 μΜ. Αργή αυξήσεις στην ανάπτυξη σημειώθηκαν, δείχνει ότι μια κυτταρική γραμμή ανθεκτική σε erlotinib είχε αναπτυχθεί. Οι καμπύλες ανάπτυξης που παρουσιάζονται στο Σχ. 1Α.

(Α) Η erlotinib-ανθεκτικά κύτταρα (H1650ER) ιδρύθηκαν από τη μακροχρόνια έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib. H1650 γονικά κύτταρα και H1650ER σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 103 κύτταρα σε 100 μλ ανά φρεάτιο, καλλιεργήθηκαν επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της erlotinib για 72 ώρες σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO2. Τα επιζώντα κλάσματα προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασίας. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και S.D.s υπολογίστηκαν. *, P & lt? 0,01. (Β) H1650 γονικών και H1650ER κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες με ή χωρίς θεραπεία erlotinib (10 μmol /L). Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδα Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τον μηχανισμό αντοχής στην erlotinib EGFR-ΤΚΙ. Χρησιμοποιώντας Western blots, εμείς ανιχνεύθηκαν προϊόντα λύσης από αμφότερα γονική H1650 και H1650ER κύτταρα σε αγωγή για 6 ώρες με erlotinib. θεραπεία Η erlotinib μπλοκάρει αποτελεσματικά EGFR και φωσφορυλίωση της Akt στα γονικά κύτταρα H1650 αλλά όχι στα κύτταρα H1650ER. Σε αυτά τα ανθεκτικά κύτταρα, P-Ακί ήταν ρυθμιζόμενα και αξιολογήθηκε ως υποψήφιο για την εμπλοκή στο μηχανισμό της επίκτητης αντοχής. Σε αντίθεση με την επίμονη Akt φωσφορυλίωση, φωσφορυλίωση Erk ήταν κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία erlotinib στα ανθεκτικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι erlotinib-ανθεκτικά κύτταρα υιοθέτησε ένα νέο μηχανισμό για την ενεργοποίηση της PI3K /Akt μονοπατιού (Εικ. 1Β).

2. Ν-cadherin υπερέκφραση Προκαλεί Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβασης (EMT) σε Erlotinib ανθεκτικά H1650ER κύτταρα

Για τον προσδιορισμό των δεικτών αντίστασης erlotinib, συγκρίναμε την έκφραση του γονιδίου σε ζεύγη των γονέων και ανθεκτικές κυτταρικές σειρές. έκφραση Ν-καδερίνης ήταν ιδιαίτερα αυξημένα σε κυτταρικές σειρές H1650ER, την οποία επιβεβαιώνεται από FACS και στύπωμα western. (Σχ. 2Α, Β). Στη συνέχεια, μορφολογικές διαφορές μεταξύ των γονικών ανθεκτικών H1650ER κυτταρικές γραμμές H1650 και ήταν εύκολα παρατηρήθηκαν (Σχ. 2C). Στο μοριακό επίπεδο, αυτά τα εντυπωσιακά μορφολογικά χαρακτηριστικά συσχετίστηκαν με αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης μεσεγχυματικών βιμεντίνη και μειωμένη έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης (Εικ. 2D, E). Μαζί, αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η εξαγορά της αντίστασης erlotinib προκαλείται από μοριακές αλλαγές που ήταν σύμφωνες με το EMT.

(Α) Η υπερέκφραση του Ν-cadherin ανιχνεύθηκε με ανάλυση FACS. (Β) Κυτταρολύματα από κύτταρα H1650 και H1650ER ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western? τα προϊόντα λύσης αξιολογήθηκε επίσης για το επίπεδο πρωτεΐνης Ν-καδερίνης. γονικών κυττάρων (Γ) Το H1650 και τα ανθεκτικά κύτταρα H1650ER αξιολογήθηκαν για μορφολογικές αλλαγές που συνάδουν με EMT. Ράβδοι κλίμακας: 25 μm. (D) Μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση του βιμεντίνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Western blot. (Ε) χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για την επικύρωση των αλλαγών των πρωτεϊνών δείκτη από είτε την επιθηλιακών ή των μεσεγχυματικών φαινοτύπων. Ράβδοι κλίμακας: 25 μm

Η

3.. Up-ρύθμιση της έκφρασης Ν-cadherin και η EMT βρέθηκαν σε βιοψίες των ανθεκτικών Καρκίνοι

Για τον προσδιορισμό της έκφρασης του Ν-cadherin και EMT βιοδεικτών σε δείγματα ιστών NSCLC EGFR-μεταλλαγμένο, πραγματοποιήσαμε βιοψίες σε ασθενείς πριν ερλοτινίμπη θεραπείας και κατά τη στιγμή που η αντίσταση του φαρμάκου αποκτήθηκε. Δεκατρείς ασθενείς είχαν καρκινικό ιστό διαθέσιμη τόσο πριν όσο και μετά τη θεραπεία ΤΚΙ. Τα χαρακτηριστικά των 13 ασθενείς παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Ανοσοϊστοχημική χρώση των δειγμάτων όγκου χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της πρωτεΐνης έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης και της μεσεγχυματικά βιμεντίνη δείκτη. Τα επιθηλιακά δείκτες ανιχνεύθηκαν σε όλα σχεδόν τα δείγματα βιοψίας από ασθενείς με NSCLC πριν την erlotinib θεραπεία, ενώ τα μεσεγχυματικά δείκτες ανιχνεύθηκαν σε 2 από τα 13 καρκινικών ιστών. Στα ανθεκτικά καρκίνους, η έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε σε 5 από 13 βιοψίες. Επιπλέον, σε 11 (84.6%) από τα 13 όγκους, η έκφραση βιμεντίνη αυξήθηκε μετά αντίσταση erlotinib αποκτήθηκε? Έτσι, ένα σύνολο 11 δειγμάτων έδειξε σημάδια μιας EMT ως απάντηση στην επαγωγή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα.

Η

Από το σύνολο των περιπτώσεων, 12 από 13 περιπτώσεις ήταν αρνητικές για Ν-καντερίνης με την εξαίρεση του μια περίπτωση αδενοκαρκινώματος που είχε εστιακό έκφραση Ν-cadherin πριν από τη θεραπεία της erlotinib. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του Ν-καδερίνης ήταν αυξημένη σε 10 από τις 13 βιοψίες σε ανθεκτικούς καρκίνους. Ανοσοϊστοχημική έκφραση συνοψίστηκαν στον πίνακα 2. Οι Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική χρώσεις που φαίνεται στο Σχήμα 3Α.

(Α) Η απώλεια Ε-καδερίνης και μια αύξηση τόσο βιμεντίνη και Ν-cadherin έκφραση παρατηρήθηκε σε αυτούς τους όγκους (κατώτερο πίνακας), σε σύγκριση με τις αντίστοιχες πρωτογενείς όγκους (άνω πάνελ). Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. Μεγέθυνσης, × 200.

Η

4. Η ικανότητα ανάπτυξης και εισβολή αυξήθηκε στο H1650ER Cells

Επαγωγή της ΕΜΤ ήταν σύμφωνη με την επιθετική χαρακτηριστικά, όπως αυξημένη κλωνογονική ανάπτυξη, κυτταρική κινητικότητα και εισβολή. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των κυττάρων H1650ER, συγκρίναμε την αύξηση των γονικών και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυττάρου-καταμέτρηση? το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκε σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής (Σχ. 4Α). Πραγματοποιήσαμε επίσης μια δοκιμασία Matrigel επικαλυμμένα θάλαμος που έδειξαν αυξημένη κυτταρική εισβολή των κυττάρων H1650ER συγκριτικά με γονικά κύτταρα (Εικ. 4Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα κύτταρα H1650ER αποκτήσει μια πιο ογκογόνο φαινότυπο, όπως τεκμηριώνεται από την αυξημένη κλωνογόνο αύξηση (Εικ. 4C).

(Α) Καμπύλες ανάπτυξης του H1650, τα κύτταρα H1650ER και όλα τα άλλα κύτταρα διεξήχθησαν σε συνήθη καλλιέργεια μέσον. Τιμές δείχνουν τον αριθμό μέση κυττάρων ± Τ.Α. φρεατίων εις τριπλούν σε κάθε χρονικό σημείο και παριστάνουν τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD? *, P & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001. (Β) γονικά κύτταρα και κύτταρα H1650ER σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα πολυανθρακικού να αναλύσουν επεμβατική δυναμικό τους. Ράβδοι κλίμακας: 25 μm. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία πειράματα, και οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν S.D.s? *, P & lt? 0,01. (Γ) γονικά κύτταρα και κυτταρικές σειρές H1650ER ήταν επίσης καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ για να δοκιμάσουν την ικανότητά τους να σχηματίζουν αποικίες μετά από 15 ημέρες επώασης. Αρχική μεγέθυνση, × 10. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία πειράματα.

Η

5. Down-διαμόρφωση της έκφρασης Ν-καντερίνης στα κύτταρα H1650ER οδήγησε σε μειωμένη Invasion

Τα κύτταρα H1650ER που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του Ν-καδερίνης ήταν κάτω διαμορφωμένο με παροδική επιμόλυνση με siRNAs. Αυτές αποτελεσματική siRNAs παράγονται σημαντικές μειώσεις πρωτεΐνης Ν-καδερίνης (Σχήμα 5Α)., Σε σύγκριση με δύο κυτταρικές σειρές ελέγχου: Η κυτταρική γραμμή αγρίου τύπου και κυτταρική σειρά επιμολυσμένη με λιποφεκταμίνη. Ταυτόχρονα, Ν-cadherin σίγηση μειωμένη φωσφορυλίωση ΑΚΤ (Εικ. 5Β). Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ν-καδερίνης συνδέθηκε με μειωμένη ικανότητες εισβολή στο Matrigel επικαλυμμένα θάλαμο όταν συγκρίνονται με κύτταρα άγριου τύπου ή ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5C).

(Α) Ν-καδερίνης έκφραση στα κύτταρα επιμολυσμένα με H1650ER siRNAs που στοχεύουν Ν-καδερίνης μετά από 48 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. (Β) Η ικανότητα εισβολής αξιολογήθηκαν μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο επικαλυμμένα με Matrigel και 20% FCS ως χημειοπροσελκυστικό. Ράβδοι κλίμακας: 25 μm. (C) Αλλαγές στην ΑΚΤ και το επίπεδο δραστηριότητας της κινάσης φωσφο-AKT κατά Ν-cadherin siRNA αποσιώπηση με κηλίδα Western.

Η

Συζήτηση

Εδώ, παρουσιάζουμε στοιχεία που δείχνουν ότι απέκτησε την αντίσταση, αναστολέας κινάσης EGFR-τυροσίνη, erlotinib σε καρκίνο του πνεύμονα προκαλείται από την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι H1650 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα αναπτύξει αντίσταση σε erlotinib και υπέστησαν αλλαγές EMT φαινοτυπικές, οι οποίες ήταν σύμφωνες με μειωμένη έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση του βιμεντίνη δεικτών μεσεγχυματικά. Επιπλέον, σε αυτά τα κλινικά δείγματα, οι καρκίνοι προεπεξεργασίας παρουσίασαν αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας με διατηρημένα μεμβρανώδη χρώση για το E-cadherin, ενώ θετική έκφραση για vimentin ήταν πιο συχνά αναγνωρίζεται στις προηγμένες, μετά τη θεραπεία καρκίνων, υποδεικνύοντας ότι ορισμένοι όγκοι υποβλήθηκαν το EMT. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η EMT συνδέεται με την αντίσταση στην erlotinib σε NSCLC, όπως έχει ήδη αναφερθεί [24] – [25]

Η ανώμαλη έκφραση καντερίνες, ή αλλαγή cadherin, είναι ένα από τα βασικά γεγονότα της EMT. σε ορισμένους τύπους καρκίνου [26] – [27]. Η απενεργοποίηση της Ε-καδερίνης είναι ένα σημαντικό γεγονός στην εξέλιξη του όγκου [28] – [29]. Ανώμαλη ενεργοποίηση ενός καντερίνης, όπως Ν-cadherin, θα ήταν ένα μεταγενέστερο γεγονός που προάγει την αγγειογένεση, μετάσταση εγκεφάλου, και σχετίζεται με κακή επιβίωση [30] – [31]. Στη μελέτη μας, το επίπεδο Ν-cadherin είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα H1650ER. Ανοσοϊστοχημείας έδειξε επίσης ότι η έκφραση Ν-καντερίνη ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε επαναλαμβανόμενες, μετά τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα δείγματα που συγκεντρώθηκαν από 10 από τους 13 ασθενείς. Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση knockdown του Ν-καντερίνης μειώνει την ανάπτυξη και την εισβολή των κυττάρων H1650ER

in vitro

. Η παρεκκλίνουσα Ν-cadherin εκφραστική ιδιότητα τόσο

in vitro

και

in vivo

φωτίζει την υπόθεσή μας ότι, οι κρίσιμους ρόλους του Ν-cadherin δεν περιορίζεται μόνο στο EMT, αλλά και στη μετάσταση του όγκου και ερλοτινίμπη αντίσταση. Ωστόσο, πιο expremental δεδομένα είναι ανάγκη να ελέγξει την υπόθεσή μας. Καθώς δεν είναι όλα τα αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα είναι sentitve να ΤΚΙ, καθώς μόνο μερικές κυτταρικές σειρές είναι ευαίσθητα σε ΤΚΙ, όπως Α549, PC9, HCC827, CALU-3, HCC4006 εκείνα που φέρουν το αποκτήθηκαν μετάλλαξη στο γονίδιο EGFR [21], [32 ] – [35]. Στον περιορισμένο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, η έρευνα για τη σχέση μεταξύ Ν-καντερίνης και της αντίστασης είναι ακόμη λιγότερο. Yamauchi M, et al [32] διαπίστωσε επίσης έκφραση Ν-καδερίνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε gefitinib ανθεκτικά PC9 /κυττάρων ZD φιλοξενούν το αποκτήθηκε Τ790Μ ανθεκτική μετάλλαξη στο γονίδιο EGFR, και άλλα κύτταρα που εκφράζουν Ν-καντερίνη βρέθηκαν ανθεκτικά στην erlotinib (Α549, Η157, και H322) και ότι η αναστολή της έκφρασης Ν-καδερίνης, χρησιμοποιώντας siRNA οδήγησε σε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας σε Α549 και H322 κύτταρα.

Άλλοι ερευνητές έχουν αναφέρει ότι η Ν-cadherin ελέγχει την κινητικότητα και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων με καταστολή της φωσφορυλίωσης Akt [36] – [37]. Σε συμφωνία με την μερική ευθύνη του ρ-Akt ενεργοποίηση σε εισβολή κάποιων καρκινικών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν Ν-καδερίνης, βρήκαμε ότι erlotinib μπλοκάρει EGFR και φωσφορυλίωση ERK, αλλά δεν Akt φωσφορυλίωση στα ερλοτινίμπη-ανθεκτικά κύτταρα H1650ER. Επίμονη Akt φωσφορυλίωση σε erlotinib ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα προτείνουν ότι αυτά τα κύτταρα υιοθετήσει έναν εναλλακτικό μηχανισμό για την ενεργοποίηση ΡΙ3Κ /Akt να επιβιώσουν [38] – [39]. Προτείνουμε ότι η ενεργοποίηση της Akt μπορεί να σχετίζεται με το Ν-cadherin πάνω ρύθμιση, η οποία υποστηρίχθηκε από τα αποτελέσματά μας ότι η επίμονη Akt φωσφορυλίωση στην erlotinib ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα θα μπορούσε να ξεπεραστεί με έναν αναστολέα Ν-cadherin. Αυτό φαίνεται να είναι συνεπής με την τρέχουσα βιβλιογραφία. Tanaka Η et al. δείχνουν ότι η Ν-cadherin αποσιώπηση μειώνει την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, ενώ N-cadherin υπερέκφραση αυξάνει τη δραστηριότητα ΑΚΤ στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη [40]? Παρομοίως, Wallerand Η et al. δείχνουν ότι η έκφραση Ν-καντερίνης συσχετίζεται με Akt ενεργοποίηση και υψηλή διεισδυτικότητα σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές [41]. Έτσι φαίνεται ότι N-cadherin δεν είναι μόνο ένας βιολογικός δείκτης της αντίστασης ΤΚΙ μετά από έκθεση σε αναστολείς του EGFR, αλλά επίσης μια λειτουργία μόριο.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας παρέχει μια περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην NSCLC και ΤΚΙ αντίσταση, αποκαλύπτοντας ότι η ρύθμιση προς τα άνω του Ν-καντερίνης στα κύτταρα ER H1650 οδηγεί σε αυξημένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και ογκογόνο δυναμικό. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι η διατήρηση του φαινοτύπου ΕΜΤ σε κύτταρα H1650ER μπορεί να σχετίζεται με την παρατεταμένη έκφραση του Ν-καδερίνης. Ως εκ τούτου, η Ν-καντερίνης μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πολλά υποσχόμενη νέος στόχος για τη θεραπεία των καρκίνων με επίκτητη αντίσταση σε EGFR TKIs. Επειδή Ν-cadherin εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια, μπορούμε επίσης να αναλογιστούν εάν θεραπευτικοί στόχοι χρησιμοποιώντας Ν-καντερίνης-ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα θα έχουν αποτελεσματικότητα σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα με επίκτητη αντοχή στην τυροσίνης κινάσης του EGFR.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες προς Zheng Wang (Τμήμα Πνευμονολογίας, Νοσοκομείο Hefei Νο.1 Λαϊκής, Hefei, Anhui, Κίνα) και Xiao Li (Τμήμα Πνευμονολογίας, Νοσοκομείο Henan Provincial Λαϊκού, Zhengzhou, Henan, Κίνα) για παρατηρήσεις σχετικά με το χειρόγραφο.