Αφηρημένο

Το σύμπλεγμα των microRNAs miR-17-92 είναι αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και έχει ένα αιτιολογικό ρόλο στον καρκίνο ανάπτυξη. Από τις έξι miR-17-92 μέλη της συστάδας, miR-19a και b, ιδίως, αποτελούν βασικούς υποστηρικτές της ανάπτυξης του καρκίνου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ προκαταρκτικά στοιχεία δείχνουν ότι το miR-18a μπορεί να ενεργεί σε αντίθεση με τα άλλα μέλη του συμπλέγματος για να μειώσετε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ήταν η υπόθεση ότι το miR-18a μπορεί να έχει μια ομοιοστατική λειτουργία, συμβάλλοντας στην καταπολέμηση της ογκογόνο δράση του συνόλου του συμπλέγματος miR-17-92, και ότι αυξημένα miR-17-92 δραστηριότητα συμπλέγματος χωρίς αντίστοιχη αύξηση των miR-18a μπορεί να προωθήσει παχέος εξέλιξης του όγκου. Σε παχέος δείγματα καρκίνου και την αντίστοιχη κανονική του παχέος βλεννογόνο, miR-18a εμφανίζεται χαμηλότερη συνολική έκφραση από άλλα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92. miR-18a έδειξε να έχει μία αντίθετη ρόλο σε άλλα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92, ιδίως οι βασικές ογκογόνο miRNAs, miR-19a και b. Επιμόλυνση των HCT116 και LIM1215 ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές με μιμείται miR-18a μειωμένο πολλαπλασιασμό, ενώ ένα miR-18a αναστολέας αυξημένο πολλαπλασιασμό. miR-18a ήταν επίσης υπεύθυνη για τη μείωση της μετανάστευσης των κυττάρων, αλλάζοντας τη μορφολογία των κυττάρων, προκαλώντας τη σύλληψη G1 /S κυττάρων φάση του κύκλου, αυξάνοντας την απόπτωση, και την ενίσχυση της δράσης των προ-αποπτωτικών παράγοντα.

CDC42

, ένας μεσολαβητής του μονοπατιού PI3K, αναγνωρίστηκε ως στόχο μυθιστόρημα miR-18a. Η υπερέκφραση του miR-18a μείωσε

CDC42

έκφρασης, και μια δοκιμασία λουσιφεράσης επιβεβαίωσε ότι το miR-18a στοχεύει άμεσα την 3’UTR του

CDC42

. μιμείται miR-18a είχαν παρόμοια επίδραση στον πολλαπλασιασμό ως μια μικρή αναστολέας μόριο CDC42. Αναστολή της

CDC42

έκφραση είναι πιθανό να είναι ένας βασικός μηχανισμός με τον οποίο miR-18a παρεμποδίζει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, με ένα πείραμα προστατευτικό στόχο την αποκάλυψη miR-18a επιρροές πολλαπλασιασμό μέσω άμεσης αναστολής της

CDC42

. Αναστολή της

CCND1 από

miR-18a μπορεί επίσης να βοηθήσει σε αυτό το φαινόμενο της ανάπτυξης καταστολή. Η ομοιοστατική λειτουργία του miR-18a εντός του συμπλέγματος miR-17-92 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μπορεί να επιτευχθεί μέσω της καταστολής του

CDC42

και το μονοπάτι PI3K

Παράθεση:. Humphreys KJ, McKinnon RA , Michael MZ (2014) Αναστέλλει miR-18a

CDC42

και παίζει όγκου Καταστολή ρόλο στην κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (11): e112288. doi: 10.1371 /journal.pone.0112288

Επιμέλεια: Junming Yue, Το Πανεπιστήμιο του Τενεσί Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιουν 2014? Αποδεκτές: ένατης Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 7, Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Humphreys et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Κέντρο Flinders για την Καινοτομία στο Cancer Research Grant. Η μελέτη αυτή εκπονήθηκε με την οικονομική και άλλη υποστήριξη νικήσει τον καρκίνο του Συμβουλίου Α.Ε. Καρκίνος του έργου για λογαριασμό των δοτών και την Πολιτειακή Κυβέρνηση της Νότιας Αυστραλίας μέσω του Υπουργείου Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η διακοπή των φυσιολογικών επιπέδων έκφρασης των miRNAs εμφανίζεται συχνά σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) ανάπτυξη [1]. miRNAs, τα οποία είναι μικρά μη-κωδικοποιητικές αλληλουχίες RNA, μπορεί να μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων με σύνδεση προς συμπληρωματικά mRNAs στόχο. Μπορούν να διασπάσει συμπληρωματικά mRNA, ή όπου υπάρχει ατελής συμπληρωματικότητα, μπορεί να δράσει μέσω της αναστολής της μετάφρασής και απομαγνητοφώνηση αποσταθεροποίηση [2] – [4]. Ενώ ανθρώπινων όγκων συχνά χαρακτηρίζεται από ένα γενικό ελάττωμα στην παραγωγή miRNA και την παγκόσμια miRNA κάτω ρύθμιση [5], [6], πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει επίσης ειδικές miRNAs να είναι αυξημένα σε CRC [1], [7]. Μειωμένα επίπεδα ογκοκατασταλτικών miRNAs, ή υπερ-έκφραση ογκογόνων miRNAs, συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου με μεταβολή έκφρασης γονιδίου και επηρεάζοντας μονοπάτια σηματοδότησης [8], [9]. Πράγματι, μερικές miRNAs έχουν δειχθεί ότι είναι οι οδηγοί της ογκογόνου διαδικασίας, και είναι ουσιώδης για την εξέλιξη του όγκου [10] – [13].

Ένα τέτοιο παράδειγμα ενός miRNA με ένα αιτιολογικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου είναι το miR -17 έως 92 σύμπλεγμα miRNAs, η οποία έχει οριστεί oncomir -1 λόγω ογκογόνο δυναμικό του [14]. Το σύμπλεγμα miR-17-92, η οποία περιλαμβάνει miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, και miR-92a, είναι συνήθως αυξημένα σε λεμφώματα και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του παχέος εντέρου [1 ], [14] – [17]. Οι λειτουργίες σύμπλεγμα τόσο κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη και τον ογκογόνο μετασχηματισμό για την προώθηση του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης, και αναστέλλουν διαφοροποίησης και απόπτωσης [11], [12]. miRNAs στο σύμπλεγμα miR-17-92 έχουν επίσης συσχετιστεί με την εισβολή και τη μετάσταση των κυττάρων CRC [18], καθώς και με τις φτωχότερες επιβίωσης [19]. Το σύμπλεγμα έχει δειχθεί να συντονίσουν πολλαπλές ογκογόνους οδούς, και η αναστολή αυτών των οδών έχει θεραπευτικό δυναμικό για τη θεραπεία καρκίνων που προκαλούνται από miR-17-92 απορύθμιση [13].

Από τις έξι miR-17-92 μέλη συμπλέγματος , miR-19a και b, ιδίως, αποτελούν βασικούς υποστηρικτές της ανάπτυξης του καρκίνου και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [11], [12], [20]. Σε κύτταρα CRC, έχουμε δείξει παλαιότερα ότι τα μέλη του συμπλέγματος, miR-19a και b είναι υπεύθυνα για την αύξηση του πολλαπλασιασμού [20]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι το miR-19a και b απαιτούνται και σε μεγάλο βαθμό επαρκή για την προώθηση των ογκογόνων ιδιοτήτων του συμπλέγματος σε μοντέλα λεμφώματος [11], [12].

In vivo

, miR-19 ήταν απαραίτητη για την προώθηση της lymphomagenesis σε ένα Εμ-myc μοντέλο Β-κυττάρων λεμφώματος ποντικών [11], [12]. miR-19 υπερέκφραση οδήγησε σε εξαιρετικά κακοήθη λεμφώματα πρώιμης έναρξης B, ενώ η απενεργοποίηση του miR-19 βιογένεση οδήγησε σε καθυστερημένη έναρξη του όγκου, ατελή διεισδυτικότητα, και εκτεταμένη διάρκεια ζωής [12]. Μετά miR-17-92 διαγραφή στα κύτταρα του λεμφώματος, επαναφορά του miR-19 και μόνο στην αποκατάσταση της ανάπτυξης και κατέστειλε την απόπτωση [11].

Σε αντίθεση με την προ-πολλαπλασιαστική δράση του miR-19, προκαταρκτικά στοιχεία δείχνουν ότι το miR -18a μπορεί να δράσει ενάντια στα άλλα μέλη του συμπλέγματος για να μειώσετε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [20]. miR-18a μπορεί να είναι λιγότερο αυξημένα σε σχέση με άλλα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92 σε όγκους παχέος εντέρου [17], και αυτή η σχετική αύξηση σε άλλα μέλη του cluster miR-17-92 θα μπορούσε να ευνοήσει αυξημένο πολλαπλασιασμό. Είναι γνωστό ότι διάφορες μετα-μεταγραφικών ρυθμιστικών μηχανισμών μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικά επίπεδα των μεμονωμένων μελών του συμπλέγματος, με miR-18a το μόνο μέλος του συμπλέγματος να απαιτήσει hnRNPA1 για μεταποίηση [21]. Η τριτοταγής δομή της διπλωμένο pri-miR-17-92 μεταγραφή μπορεί επίσης να συμβάλει σε λιγότερο αποτελεσματική επεξεργασία του miR-18a [22], [23]. Υποθέσαμε ότι το miR-18a μπορεί να έχει μια ομοιοστατική λειτουργία, συμβάλλοντας στην καταπολέμηση της ογκογόνο δράση του συνόλου του συμπλέγματος miR-17-92, και ότι αυξημένα δραστηριότητα συμπλέγματος miR-17-92 χωρίς αντίστοιχη αύξηση των miR-18a μπορεί να προωθήσει ορθοκολικού όγκου προχώρηση. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να καθορίσει τις ιδιότητες ογκοκατασταλτικό του miR-18a σε κυτταρικές σειρές CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

καρκινικών κυττάρων HCT116 παχέος εντέρου (ATCC, Manassas, VA, USA) διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α Medium (τροποποιημένο) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Bovogen Biologicals, Essendon, VIC, Αυστραλία). κύτταρα καρκινώματος παχέος LIM1215 (ECACC, Salisbury, Wiltshire, Ηνωμένο Βασίλειο) διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2, διατηρείται σε & lt? 80% συρροή, και ήταν ελεύθερες μυκοπλάσματος

Δείγματα ανθρώπινου ορθοκολικού ιστού

δείγματα CRC και αντίστοιχο φυσιολογικό. ορθοκολικού βλεννογόνου ελήφθησαν από το Flinders Tissue Bank (n = 30). Αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν από αμβλεία ανατομή από φρέσκα χειρουργικές εκτομές, μετά από έγκριση της δεοντολογίας από την Νότια Αδελαΐδα Κλινική Επιτροπής Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής και γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς. Ειδική έγκριση μελέτη για να εξετάσει miRNA αλλαγές σε αυτόν τον ορθοκολικό ιστό ελήφθη από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Νότιας Αδελαΐδα Κλινική Ανθρωπίνων Ερευνών (αριθμός έγκρισης 204,13).

Οι επιμολύνσεις

Οι κυτταρικές σειρές αντίστροφη επιμολυσμένα με miRNA μιμείται, αναστολείς miRNA, siRNAs, πλασμίδιο κατασκευάσματα, και προστάτες στόχο χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, σε 24 και 96 σχήματα φρεατίων (100 000 και 20 000 κύτταρα ανά φρεάτιο, αντιστοίχως). Για τους μιμούνται τα πειράματα, miR-18a, miR-19a και b, και αρνητικό μάρτυρα (NC) miRNA ολιγονουκλεοτιδικά διπλά (GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν σε 20 nM η κάθε μία. miR-18a και NC κλειδωμένο οξύ (LNA) αναστολείς νουκλεϊνικών (Exiqon, Vedbaek, Denmark) (IDSs: 18α: 410101-00, NC: 199004-00) χρησιμοποιήθηκαν σε 50 ηΜ. Προσχεδιασμένες αποστολή siRNAs για

CDC42

(κύκλο κυτταρικής διαίρεσης 42) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) (IDs: SASI_Hs01_00222990, SASI_Hs02_00332553) ή NC siRNA (ID: SIC001) ήταν αντίστροφη επιμολυσμένα σε συνολική συγκέντρωση των 20 ηΜ. Πειράματα συν-επιμόλυνση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 200 ng πλασμιδιακού DNA (λεπτομέρειες των κατασκευασμάτων παρακάτω) με 50 ηΜ miR-18a ή NC miRNA μιμητικά. Πειράματα Πρόσθετες συνεπιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν με 20 ηΜ miR-18a ή NC miRNA μιμείται και με miScript προστατευτικά στόχο (Qiagen, Valencia, CA) σχεδιασμένο για την miR-18α προβλεπόμενη γονιδίου στόχου

CDC42

, ή ένα αρνητικό μάρτυρα miScript προστάτης στόχου (ID: MTP0000002). προστατευτικά στόχο έχουν σχεδιαστεί για τις δύο πιθανές θέσεις πρόσδεσης miR-18a στο

CDC42

3’ΙΙΤΡ χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο Qiagen, και αντίστροφα επιμολυσμένα στη συνιστώμενη συγκέντρωση 500 nM για κάθε προστατευτικό στόχο. Η ακολουθία πλαίσιο προστάτης στόχου (η περιοχή της 3’UTR που πλαισιώνει την θέση πρόσδεσης) για την πρώτη θέση στόχο του

CDC42

3’ΙΙΤΡ ήταν 5’AATGAAGAAAAGTATTGCACCTTTGAAATGCACCAAATGA3 », καθώς και για τη δεύτερη θέση στόχο του

CDC42

3’ΙΙΤΡ ήταν 5’GTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTG3 ». Πρόσθετες προστάτες στόχο έχουν σχεδιαστεί για την ενιαία πιθανή θέση δέσμευσης miR-18a στο

CCND1

3’ΙΙΤΡ (ακολουθία πλαίσιο: 5’TAGATGTGTAACCTCTTCACCTTATTCATGGCTGAAGTCA3 »), και τα πειράματα διεξήχθησαν όπως για

CDC42

παραπάνω . Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Σχετική ποσοτικοποίηση πραγματικού χρόνου RT-PCR

Αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να λυθούν καλλιεργημένα κύτταρα και τα δείγματα ανθρώπινου ιστού. Ολικό RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο Nanodrop-8000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). ανάλυση έκφρασης miRNA διεξήχθη με σχετική ποσοτικοποίηση πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς TaqMan miRNA (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). cDNA συντέθηκε από 20 ng ολικού RNA χρησιμοποιώντας miRNA-ειδικούς εκκινητές σύμφωνα με το πρωτόκολλο TaqMan miRNA Δοκιμασία, χρησιμοποιώντας 3,5 μΙ μάστερ μιξ και 1,5 μΙ RT εκκινητή σε έναν μΐ τελικό όγκο 7,5. Real-time PCR διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο TaqMan, χρησιμοποιώντας αντιδράσεις εις τριπλούν 10 μΐ για κάθε βιολογικό επαναληπτικές συμπεριλαμβανομένων 1 μΙ προϊόν αντίστροφης μεταγραφής, 0,5 μΙ miRNA-ειδικό εναρκτήρα και διερευνητή μίγματος δοκιμασίας (IDs δοκιμασία: miR-17: 002308, miR-18a: 002422, miR-19a: 000395, miR-20a: 000580, miR-19b: 000396, miR-92a: 000431), και 1 × TaqMan Οικουμενική PCR Master Mix Δεν AmpErase UNG (Applied Biosystems). Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ρότορα-Gene Q (Qiagen, Valencia, CA, USA). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με την ενδογενή μικρού πυρηνικού RNA, RNU6B (ID δοκιμασία: 001093). Σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν από τις τιμές Ct χρησιμοποιώντας Qgene [24].

Για την ανάλυση της έκφρασης mRNA, RNA ήταν κατεργασμένο με ϋΝάση Ι, και cDNA συνετέθη από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας τα M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση, ΚΝάση Η μείον (Promega, Madison, WI, USA) και τυχαία εξαμερή εκκινητήρια μόρια σε μια αντίδραση 25 μΙ. Real-time PCR διεξήχθη σύμφωνα με την Πράσινη πρωτόκολλο Ισχύς SYBR (Applied Biosystems) με τους ακόλουθους εκκινητές για

CDC42

: 5’ACGACCGCTGAGTTATCCAC3 »(προς τα εμπρός) και 5’GGCACCCACTTTTCTTTCACG3» (reverse) και για

CCND1

: 5’GATCAAGTGTGACCCGGACTG3 »(προς τα εμπρός) και 5’CCTTGGGGTCCATGTTCTGC3» (reverse), χρησιμοποιώντας εις τριπλούν 20 αντιδράσεις μl συμπεριλαμβανομένων 2 μl του προϊόντος αντίστροφης μεταγραφής, 300 nM εμπρός και όπισθεν αστάρια, και 1 × Ισχύς SYBR Green κύριο μείγμα (Applied Biosystems). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με την ενδογενή έλεγχο

ACTB

επίπεδα (β-ακτίνη), χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:. 5’TTGCCGACAGGATGCAGAAG3 »(προς τα εμπρός) και 5’GCCGATCCACACGGAGTACT3 ‘(αντίστροφο), και τα επίπεδα έκφρασης υπολογίζονται χρησιμοποιώντας Qgene

κηλίδος ανάλυση

ρυθμιστικό RIPA Western χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί ολόκληρο εκχυλίσματα κυτταρικής πρωτεΐνης, η οποία ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Protein Ποσοτικοποίηση EZQ (Invitrogen). πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας προ-cast Mini-PROTEAN TGX Stain-Δωρεάν Τζελ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), και ηλεκτρο-στυπώθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου τη χρήση του συστήματος μεταφοράς Trans-Blot Turbo και Mini Πακέτα PVDF Μεταφορά (Bio-Rad). Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού ή σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος σε ΤΒδ-Τ πριν από την ολονύχτια επώαση με μονοκλωνικά αντι-CDC42 (11A11) (1:1000) (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA). Κουνέλι μονοκλωνικό αντι-GAPDH (γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης) (D16H11) (1:1000) (Cell Technology Σηματοδότηση) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δευτερογενής υπεροξειδάση κοχλιαρίας συζευγμένη με IgG αίγας αντι-κουνελιού (Immunopure, Thermo Scientific, Rockford, IL) χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με το σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (SuperSignal West Pico, Rockford, IL, USA) για να απεικονίσει ταινίες χρησιμοποιώντας το ChemiDoc MP σύστημα απεικόνισης (Bio-Rad). Αποτελέσματα πυκνότητας ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα του GAPDH.

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση της κυτταρικής ανάπτυξης

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του οργάνου xCELLigence RTCA DP (ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 20 000 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός Ε-πλάκα και καλλιεργήθηκαν με κατάλληλες θεραπείες. Εκτός από επιμολύνσεις, θεραπείες περιελάμβαναν επίσης τη χρήση ενός αναστολέα μικρού μορίου της δραστικότητας CDC42, ML141 (Sigma-Aldrich), σε δόση 20 μΜ, ή μάρτυρας DMSO όχημα [25], [26]. Η ανάπτυξη μετρήθηκε κάθε 30 λεπτά επί 48-72 ώρες. Το σύστημα xCELLigence χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη μέτρηση της μετανάστευσης πάνω από 24 ώρες με τη χρήση της CIM-πλάκα 16 με κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού στην κορυφή θάλαμο σε 30 000 ανά φρεάτιο, και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό που χρησιμοποιείται ως προσελκυστικό στον κάτω θάλαμο. Το Σύστημα Incucyte Κινητική απεικόνισης (Έσσεν BioScience, Ann Arbor, MI, USA) χρησιμοποιήθηκε ως πρόσθετο μέτρο πολλαπλασιασμό. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 100 000 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 24 φρεατίων πλάκα, και απεικονίζεται κάθε ώρα επί 48 ώρες, με 9 εικόνες ανά φρεάτιο. Οι εικόνες αντίθεσης φάσης ζωντανής-κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό συρροή χρησιμοποιώντας το λογισμικό Incucyte, και να παράσχει πληροφορίες μορφολογία. Εκτός από την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, τα κύτταρα επίσης σταθεροποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη σε 48 ώρες, και ο κυτταροσκελετός ήταν φθοριζόντως βάφονται με Alexa Fluor 488 Φαλλοϊδίνη (Cell Σηματοδότηση Technology) μέσω της δέσμευσης της φαλλοϊδίνης σε F-ακτίνη, με κύτταρα απεικονίζονται χρησιμοποιώντας ένα Όλυμπος BX63 μικροσκόπιο φθορισμού με 20 × στόχος (Όλυμπος, Κέντρο Valley, PA, USA).

κασπάσης προσδιορισμούς απόπτωσης

Η απόπτωση μετρήθηκε σε 24 ώρες, χρησιμοποιώντας ένα κασπάσης-glo 3/7 δοκιμασία ( Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με την φωταύγειας σήμα ανάλογο προς κασπάσης-3/7 δράση. Η Incucyte παρέχεται επίσης ένα πρόσθετο μέτρο σε πραγματικό χρόνο? η CellPlayer Caspase 3/7 αντιδραστηρίου (Έσσεν BioScience) προστέθηκε στα κύτταρα σε τελική συγκέντρωση 5 μΜ, και σε πραγματικό χρόνο εικόνες φθορισμού λήφθηκαν κάθε ώρα πάνω από 24 ώρες. Αυτές οι εικόνες χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό καταμέτρηση φθορισμού των κυττάρων, με τη χρήση του λογισμικού Μετρώντας v2.0 Analysis IncuCyte αντικειμένου. Η απόπτωση ελέγχθηκε μετά από επιμόλυνση με miRNA μιμείται, με ή χωρίς πρόσθετη επεξεργασία με το προ-αποπτωτικό παράγοντα βουτυρικό νάτριο (Sigma-Aldrich), σε 2,5 mM για 24 ώρες.

Η κυτταρομετρία ροής

Cells συλλέχθηκαν με θρυψίνη 48 h μετά την επιμόλυνση, πλύθηκαν με PBS, και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη με 20 λεπτά επώαση επί πάγου. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS μετά επαναιωρήθηκαν σε 0,2% Triton Χ σε 1% BSA σε διάλυμα PBS και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε 1% διάλυμα πλύσεως σαπωνίνη με PBS, μετά επαναιωρήθηκαν σε PBS /ιωδιούχο προπίδιο /ΚΝάση Α και επωάστηκαν για 30 λεπτά, που ακολουθείται με ανάλυση FACS χρησιμοποιώντας ένα BD FACSCanto II Κυτταρόμετρο Ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) με PI φίλτρο 680/40.

miRNA πρόβλεψη στόχο

Προβλεπόμενη γονιδίων στόχων miR-18a ελήφθησαν με τη χρήση miRwalk, η οποία συγκεντρώνει δεδομένα από πολλαπλά προγράμματα πρόβλεψης (DIANAmT, Miranda, miRDB, miRWalk, PICTAR5 , ΠΙΤΑ, RNA22 και Targetscan) [27]. Γονίδια που είναι κοινές στα τρία ή περισσότερα προγράμματα πρόβλεψης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Ingenuity Ανάλυση Pathway (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) για να ταυτοποιηθούν γονίδια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, και εκφράζεται σε ορθοκολικό κύτταρα.

Το πλασμίδιο κατασκευάσματα

Το

CDC42

3’UTR (NM_001791.3) ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5’CTCTCCAGAGCCCTTTCTGC3 »(προς τα εμπρός) και 5’CAAAGAATTGAGACATGAGAAAGC3» (reverse), χρησιμοποιώντας το

PFU

DNA πολυμεράση (Promega) και ολίγο άΤ cDNA. Το 3’UTR κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega) και, στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα psiCHECK-2 (Promega) χρησιμοποιώντας τα

NotI

θέσεις περιορισμού, και προσδιορίστηκε η αλληλουχία. psiCHECK-2 περιέχει λουσιφεράση της Renilla ως πρωταρχικό γονίδιο αναφοράς, και Firefly λουσιφεράσης ως ενδο-πλασμίδιο διαμόλυνση ομαλοποίηση ανταποκριτή. Η

CDC42

3’UTR κλωνοποιήθηκε μέσα στην περιοχή πολλαπλής κλωνοποίησης που βρίσκεται κατάντη του μεταφραστικού κωδικονίου στοπ Renilla, με πρόσδεση του miRNA στην 3’UTR προβλέπεται να οδηγήσει σε διάσπαση και την επακόλουθη αποικοδόμηση του μεταγραφήματος σύντηξης mRNA. Μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της δραστηριότητας των miRNAs.

Μεταλλαξιογένεση

Ιστότοπος κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το QuikChange Lightning Ιστοσελίδα-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Καλιφόρνια, ΗΠΑ ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, να διαγράψετε θέσεις δέσμευσης ακολουθία σπόρων miR-18a στο

CDC42

3’ΙΙΤΡ. Εκκινητές για την πρώτη θέση στόχο του

CDC42

3’ΙΙΤΡ (θέση 822-844 του NM_001791.3) ήταν: 5’CACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGTGAAATGCACCAAATGAATTGAGTT3 »(προς τα εμπρός) και 5’AACTCAATTCATTTGGTGCATTTCACAATACTTTTCTTCATTTATCAGTG3» (αναστροφή). Εκκινητές για τη δεύτερη θέση στόχο του

CDC42

3’ΙΙΤΡ (θέση 1295-1317 του NM_001791.3) ήταν: 5’AAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCCCAAACCTAATTCTTGTAGATG3 »(προς τα εμπρός) και 5’CATCTACAAGAATTAGGTTTGGGGGAAAGATTACCTCAACATTTTT3» (αναστροφή). Τα πλασμίδια που παρασκευάζονται με μόνο την πρώτη θέση μεταλλαχθεί, μόνο η δεύτερη θέση μεταλλαγμένο, ή και οι δύο θέσεις μεταλλαχθεί.

Λουσιφεράσης δοκιμασία

Μετά συν-επιμόλυνση με psiCHECK-2 κατασκευάσματα πλασμιδίου και μιμείται miRNA, λουσιφεράση δραστικότητα μετρήθηκε μετά από 24 ώρες, χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Dual-λουσιφεράσης (Promega), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla κανονικοποιήθηκε προς δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly για το ίδιο πλασμίδιο.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) από τουλάχιστον τρία βιολογικά αντίγραφα, με γραφήματα παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test του Student, με τιμή P & lt?. 0,05 θεωρείται σημαντική

Αποτελέσματα

miR-18a έχει χαμηλότερη συνολική έκφραση σε σύγκριση με τα άλλα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92 σε παχέος κύτταρα

δείγματα Ανθρωπίνων τράπεζας ιστών χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των επιπέδων του miR-18a στο CRC και κανονική του παχέος βλεννογόνο, σε σχέση με τα επίπεδα των άλλων miR-17-92 miRNAs συμπλέγματος. miR-17-92 συμπλέγματος επίπεδα miRNAs ήταν ποσοτικά στις αρχές (Dukes Α) και προηγμένα δείγματα (Dukes C) CRC, και αντίστοιχη κανονική του παχέος βλεννογόνο. miR-17-92 miRNAs ήταν αυξημένα σε δείγματα CRC (Dukes A: miR-17 P = 0,01, miR-18a P = 0,01, miR-19a P = 0,005, miR-20a P = 0,002, miR-19b P = 0,009, miR-92a P = 0,07? Dukes C: miR-17 Ρ = 0,0003, miR-18a P = 0.0005, miR-19a P = 0,0009, miR-20a P & lt? 0,0001, miR-19b P = 0,001, miR-92a P = 0,0007) σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό συμφωνημένα, και είχε υψηλότερη έκφραση στα δείγματα Dukes C (Σχήμα 1Α και 1Β). miR-18a είχαν μικρότερη συνολική έκφραση σε σύγκριση με τα άλλα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92, σε αμφότερα τα δείγματα Dukes Α και C, καθώς και στην συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 1Α και 1Β).

(Α) miR -17 έως 92 cluster επίπεδα miRNA στο Dukes Α και παρακείμενο φυσιολογικό δείγματα ιστού (Β) επίπεδα miR-17-92 συμπλέγματος miRNA στο Dukes C και γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστού. Η μέση ± SEM 30 ασθενών παρουσιάζεται και η έκφραση κανονικοποιείται στη RNU6B. * P & lt?. 0.05

Η

miR-18a διαμορφώνει παχέος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και του θανάτου

Η επιμόλυνση των κυττάρων HCT116 CRC με μιμείται miR-18a οδήγησαν σε μείωση του πολλαπλασιασμού σε χρονική περίοδο 48 ωρών , σε σύγκριση με τις μιμητικές επιμολυσμένα κύτταρα NC (Ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 2Α). Μια παρόμοια αντι-πολλαπλασιαστική δράση για miR-18a παρατηρήθηκε σε μια πρόσθετη CRC κυτταρική γραμμή, LIM1215 (Ρ = 0.0009) (Σχήμα 2Β). Η επιμόλυνση των κυττάρων HCT116 με έναν αναστολέα LNA miRNA miR-18a είχαν την αντίθετη επίδραση, με αυξημένο πολλαπλασιασμό σε χρονική περίοδο 48 h σε σύγκριση με το NC αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα (Ρ = 0,03) (Σχήμα 2C). κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με μιμείται miR-18a εμφανίζεται μια μειωμένη ικανότητα να μεταναστεύουν σε μια περίοδο 24 ωρών, σε σύγκριση με τις μιμητικές επιμολυσμένα κύτταρα NC (Ρ = 0,004) (Σχήμα 2D).

μετρήσεις δείκτη κυττάρων χρησιμοποιώντας το xCELLigence RTCA μέσο DP. (Α) Διάδοση των NC και miR-18a μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 πάνω από 48 ώρες. (Β) Πολλαπλασιασμός των NC και miR-18a μιμούνται επιμολυσμένα LIM1215 κυττάρων πάνω από 48 ώρες. (Γ) Διάδοση των NC και αναστολέα miR-18a επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 πάνω από 48 ώρες. (Δ) Η μετανάστευση των NC και miR-18a μιμούνται επιμολυσμένα HCT116 κύτταρα πάνω από 24 ώρες. Η μέση ± SEM της 6ης κυτταρικής καλλιέργειας των επαναλήψεων δείχνεται για το καθένα. * P & lt?. 0.05

Η

Η επιμόλυνση με μιμείται miR-18a εμφανίστηκε επίσης να αλλάξει τη μορφολογία των κυττάρων. Σε πραγματικό χρόνο εικόνων που λαμβάνονται επί 48 ώρες αποκάλυψε ότι τα κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με μιμείται miR-18a ήταν πιο στρογγυλεμένο και λιγότερο προσκολλημένα, με μειωμένο επίπεδο της συμβολής (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3Α και 3Β). Εκτός του miR-19a και b μιμείται αντιστραφεί σε μεγάλο βαθμό αυτό το αποτέλεσμα. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-19a και b εκτός από miR-18a ήταν πιο κοντά στην εμφάνιση με τα επιμολυσμένα κύτταρα μιμούνται NC, με μια πιο εκτεταμένη μορφολογία, εκτός από παρόμοια επίπεδα συρροή επί 48 ώρες (Ρ = 0,20)? επίπεδα συρροή αυξήθηκαν σημαντικά σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με miR-18a μιμούνται μόνο (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3Α και 3Β). Ανάλυση ανοσοφθορισμού του συστατικού της ακτίνης του κυτταροσκελετού χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 488 Φαλλοϊδίνη τόνισε επίσης την αλλαγμένη μορφολογία των κυττάρων στις miR-18a μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα HCT116, συμπεριλαμβανομένης μιας πιο στρογγυλεμένη εμφάνιση με μειωμένη ενδοκυτταρικής προσκόλλησης (Σχήμα 3C).

εικόνες των κυττάρων σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση του οργάνου Incucyte. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του NC, μιμούνται miR-18a, και miR-18a, 19a και b μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Β) Συμβολή ποσοτικά από πραγματικό χρόνο εικόνες του NC, miR-18a μιμούνται, και miR-18a, 19a και β μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα στις 48 ώρες. Η μέση ± SEM της 6ης κυτταρικής καλλιέργειας των επαναλήψεων δείχνεται. * P & lt? 0,05. (C) Εκπρόσωπος εικόνες (20 ×) της Alexa Fluor 488 Φαλλοϊδίνη φθορίζουσα χρώση του κυτταροσκελετού της ακτίνης των μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα NC και miR-18a σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Η

Για τη μέτρηση της απόπτωσης, ένα κασπάσης δοκιμασία 3/7 τελικού σημείου διεξήχθη 24 ώρες μετά την διαμόλυνση των κυττάρων HCT116. Η επιμόλυνση με μιμείται miR-18a αυξημένη απόπτωση σε σύγκριση με NC μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα (Ρ = 0,04), ενώ συν-επιμόλυνσης με miR-19a και b μιμείται μειωμένη απόπτωση σε σύγκριση με μόνη μιμείται miR-18α, σε ένα επίπεδο παρόμοιο με το NC μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα (Ρ = 0,16) (Σχήμα 4Α). Η επιμόλυνση με miR-19a και b μιμείται μόνο δεν είχε καμία επίδραση επί της απόπτωσης. Προσθήκη μιμείται miR-18a ενίσχυσε επίσης τη δράση ενός γνωστού προ-αποπτωτικό παράγοντα. HDAC αναστολείς, όπως βουτυρικό, έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι επάγουν απόπτωση σε κύτταρα CRC [28] – [30]. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με μιμείται miR-18a σε συνδυασμό με 2.5 mM βουτυρικό αγωγή είχαν υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης στις 24 ώρες σε σύγκριση με τις μιμητικές επιμολυσμένα κύτταρα NC επίσης σε επεξεργασία με βουτυρικό (Ρ = 0,001) (Σχήμα 4Α). Και πάλι, η επιμόλυνση του miR-19a και b μιμείται με τις μιμείται miR-18a μειωθεί αυτό το αποτέλεσμα, σε σύγκριση με μόνο στα μιμείται miR-18a (Ρ = 0,03), αν και η απόπτωση ήταν ακόμη υψηλότερη απ ‘ότι με τις μιμείται NC (Ρ = 0,03) ( Σχήμα 4Α). Η επίδραση του miR-18a επί της απόπτωσης μελετήθηκε περαιτέρω σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιώντας το σύστημα Incucyte και ένα φθορίζον δοκιμασία caspase 3/7 για τη λήψη εικόνων από κύτταρα που υφίστανται απόπτωση. Όταν μετρήθηκαν ποσοτικά οι εικόνες HCT116 κυττάρων που λαμβάνονται 24 ώρες μετά την αγωγή βουτυρικό, υπήρχαν σημαντικά περισσότερο φθορίζοντα κύτταρα με το miR-18a μιμούνται την επιμόλυνση σε σύγκριση με NC μιμούνται την επιμόλυνση, σε κύτταρα χωρίς φαρμακευτική αγωγή (Ρ & lt? 0.001), και σε κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με 2.5 mM βουτυρικού (Ρ & lt? 0.001) (Σχήματα 4Β και 4D). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στα κύτταρα LIM 1215, με διαφορές στην μέτρηση φθορισμού των κυττάρων μεταξύ του μιμητικού miR-18a και NC μιμούνται την επιμόλυνση φθάνοντας σημασία 48 ώρες μετά τη θεραπεία βουτυρικό (Ρ = 0.03 σε κύτταρα χωρίς φαρμακευτική αγωγή? Ρ = 0.02 σε κύτταρα κατεργασμένα με 2,5 mM βουτυρικό) (Σχήμα 4C).

(Α) κασπάσης 3/7 φωταύγειας δοκιμασία σε NC, miR-18a μιμούνται, miR-19a και b μιμούνται, και miR-18a, 19a και β μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 στις 24 ώρες μετά την προσθήκη βουτυρικού. Η μέση ± SEM από 3 κυτταρικής καλλιέργειας των επαναλήψεων δείχνεται. * P & lt? 0,05. αντιπροσωπευτικό πραγματικό χρόνο εικόνες φθορισμού των κυττάρων με τη χρήση του οργάνου Incucyte δείχνει απόπτωση σε μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 NC και miR-18a στις 24 ώρες μετά την προσθήκη βουτυρικού (Β και D) Ποσοτικοποίηση και. Η μέση ± SEM από 3 κυτταρικής καλλιέργειας των επαναλήψεων φαίνεται στο Β (Γ) Ποσοτικοποίηση πραγματικό χρόνο εικόνες φθορισμού των κυττάρων με τη χρήση του οργάνου Incucyte δείχνει απόπτωση σε NC και miR-18a μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα LIM1215 στις 48 ώρες μετά την προσθήκη βουτυρικού. Η μέση ± SEM από 3 κυτταρικής καλλιέργειας των επαναλήψεων δείχνεται. (Ε) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του NC, miR-18a μιμούνται, και miR-18a, 19a και b μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 στις 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση? Κάθε γράφημα αντιπροσωπευτικά 3 κυτταρικής καλλιέργειας επαναλήψεις.

Η

Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε 48 ώρες μετά την διαμόλυνση των κυττάρων HCT116, και επίσης έδειξε μια συσσώρευση των κυττάρων που υφίστανται κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση σε ΜΙΚ-18α μιμητικό επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4Ε). Οι μιμείται miR-18a δείχθηκε ότι επάγουν G1 /S φάσης διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Η προσθήκη του miR-19a και b μιμείται οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικό θάνατο και διακοπή του κυτταρικού κύκλου απ ‘ότι με μόνη miR-18a μιμούνται (Σχήμα 4Ε).

Η έκφραση του γονιδίου ελέγχου CDC42 κυτταρικού κύκλου μειώνεται κατά miR-18a και αυξήθηκε κατά miR-19a και b

με βάση τα συμπεράσματα που miR-18a μειώνει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, αλλάζει τη μορφολογία των κυττάρων, αυξάνει την απόπτωση, και προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου, προέβλεψε στόχους miR-18a είχαν εντοπιστεί που εμπλέκονται σε αυτές κυτταρικών διαδικασιών. Μεταξύ miR-18a προβλεπόμενη στόχοι ήταν κύκλου κυτταρικής διαίρεσης 42 (

CDC42

), το οποίο είχε προβλεφθεί από πολλαπλά προγράμματα πρόβλεψης στόχου. CDC42 είναι ένα μέλος της οικογένειας των Rho του GTPases, μια υποοικογένεια της υπεροικογένειας Ras των μικρών ΟΤΡασών [31]. Κατά την ενεργοποίηση, CDC42 είναι σε θέση να δεσμεύσει μια ποικιλία πρωτεϊνών τελεστών και κινεί πολυάριθμες οδούς κατάντη σηματοδότησης, περιλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στην κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την επιβίωση και τη μετανάστευση [32] – [37]. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές μεταγραφής του

CDC42

, τα οποία κωδικοποιούν μια κανονική ισομορφή παρόν στους περισσότερους ιστούς (ισομορφή 1), και έναν εγκέφαλο-ειδική ισομορφή (ισομορφή 2). Το 3’UTR των μεταγραφών για την κανονική ισομορφή περιέχει δύο προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης, ενώ ο αναπληρωτής 3’UTR της μεταγραφής για την ισομορφή του εγκεφάλου περιέχει δύο διαφορετικές θέσεις δέσμευσης προέβλεψε miR-18a miR-18a. Για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης σε ορθοκολικό κύτταρα,

CDC42

ισομορφή 1 ερευνήθηκε.

Η επιμόλυνση των κυττάρων HCT116 CRC με μιμείται miR-18a μειωμένα επίπεδα μεταγραφής του

CDC42

σύγκριση με τις μιμητικές επιμολυσμένα κύτταρα NC στις 48 ώρες, όταν εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 5Α). Παραδόξως, συν-διαμόλυνση του miR-19a και b μιμείται μαζί με τα μιμείται miR-18a παράγεται το αντίθετο αποτέλεσμα, με αυξημένη

CDC42

mRNA επίπεδα που ήταν σημαντικά υψηλότερες από αμφότερες τις μιμούνται κύτταρα NC (Ρ = 0,0006) και ΜΙΚ-18α μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα (Ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 5Α). Η επιμόλυνση με έναν αναστολέα miR-18a αυξημένα επίπεδα μεταγραφής του

CDC42

σύγκριση με τα μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα NC στις 48 ώρες, όταν εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Ρ & lt? 0.005). (Εικόνα 5Β)

(Α)

CDC42

επίπεδα mRNA σε NC, miR-18a μιμούνται, και miR-18a, 19a και β μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (β)

CDC42

επίπεδα mRNA σε αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα NC και miR-18a στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η μέση ± SEM της 6ης κυτταρικής καλλιέργειας των επαναλήψεων εμφανίζεται για το καθένα και έκφραση κανονικοποιείται στη ACTB. * P & lt? 0,05. (Γ και Δ) στύπωμα Western των επιπέδων πρωτεΐνης CDC42 σε NC, miR-18a μιμούνται, και miR-18a, 19a και b μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. γράφημα Πυκνότητας παρουσιάζει την μέση ± SEM από 3 κυτταρικής καλλιέργειας επαναλήψεων για κάθε ένα και η έκφραση είναι κανονικοποιημένη σε GAPDH * Ρ & lt?. 0.05

Η

ανάλυση κηλίδας Western έδειξε επίπεδα πρωτεΐνης CDC42 μειώθηκαν επίσης σημαντικά το miR-18a μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα επιμολυσμένα κύτταρα μιμούνται NC, στις 48 ώρες (Ρ = 0,02) (Σχήμα 5C και 5D). Η συν-επιμόλυνση του miR-19a και b μιμείται με τις μιμείται miR-18a αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης σε σύγκριση με μόνη μιμείται miR-18a (Ρ = 0,008), με τα επίπεδα πλησιέστερα προς εκείνη του NC μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα (Ρ & gt? 0,05) (Σχήμα 5C και 5D).

miR-18a στοχεύει άμεσα την 3’UTR της CDC42

Ένα σύστημα προσδιορισμού λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει ότι το miR-18a στοχεύει άμεσα το

CDC42

3 ‘UTR. Dual-λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές είχαν κατασκευαστεί με ένα ανέπαφο

CDC42

3’UTR, ή με

CDC42

3’UTRs μεταλλαγμένο στο πρώτο, δεύτερο ή και τα δύο προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης miR-18a (Σχήμα 6Α). κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με κάθε πλασμίδιο, σε συνδυασμό με το miR-18a ή μιμείται NC, και δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly και Renilla μετρήθηκαν στις 24 ώρες. Μία μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης Renilla κανονικοποιημένη χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της δέσμευσης miR-18a και καταστολή.