Αφηρημένο

Σκοπός

Αυτή η μελέτη αξιολόγησε την εμφάνιση και πιθανή κλινική σημασία της εντός του όγκου

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια σε Κινέζους ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC).

Υλικά και Μέθοδοι

Ογδόντα πέντε στάδια ασθενείς IIIa-IV NSCLC που είχαν υποβληθεί σε παρηγορητική χειρουργική εκτομή συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Από αυτούς, 45 ασθενείς μεταφέρονται

EGFR

μεταλλάξεις (ομάδα-Μ) και 40 ασθενείς ήταν άγριου τύπου (ομάδα-W). Κάθε δείγμα όγκου μικροτομή να αποδώσει 28-34 εστίες όγκου και ενδονεοπλασματική

EGFR

μετάλλαξη προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μετουσίωση Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (DHPLC) και Amplification Refractory Mutation System (ARMS).

EGFR

αντιγράψετε αριθμούς μετρήθηκαν με τη χρήση φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH).

Αποτελέσματα

μικροανατομίας απέδωσε 1.431 εστίες όγκου από

EGFR

μεταλλαγμένο ασθενείς (ομάδα -Μ) και 1.238 εστίες από ασθενείς άγριου τύπου (ομάδα-W). Η

EGFR

συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης στην ομάδα-Μ ήταν 80,6% (1.154 /1.431) και 87,1% (1.247 /1.431) χρησιμοποιώντας DHPLC και όπλων, αντίστοιχα. Ένας συνδυασμός

EGFR

-mutated και άγριου τύπου κύτταρα ανιχνεύθηκε σε 32,9% (28/85) των δειγμάτων με DHPLC και 28,2% (24/85) με τα όπλα, υποστηρίζοντας την εμφάνιση εντός του όγκου ετερογένεια. Τριάντα ένας ασθενείς (36,5%) ταυτοποιήθηκαν ως

EGFR

FISH-θετική. Οι ασθενείς που φέρουν εντός του όγκου μεταλλάξεων ετερογένεια κατείχε χαμηλότερη

EGFR

αντιγράψετε αριθμούς από ό, τι εκείνων των όγκων που περιέχονται μεταλλαγμένα κύτταρα μόνο (16,7% έναντι 71,0%,

P

& lt? 0,05). Μεταξύ 26 ασθενών που είχαν λάβει EGFR-ΤΚΙδ, η μέση

EGFR

περιεχόμενο μετάλλαξης ήταν υψηλότερη σε ασθενείς που εμφανίζουν μερική ανταπόκριση (86,1%) ή σταθερή νόσο (48.7%) σε σύγκριση με τους ασθενείς που βιώνουν προοδευτική ασθένεια (6,0%) (

P

= 0,001). Υπάρχουν επίσης έδειξε σχέση μεταξύ επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) και διαφορετικό περιεχόμενο των ομάδων μετάλλαξης του EGFR (καθαρό EGFR φυσικού τύπου, η μετάλλαξη του EGFR με ετερογένεια και καθαρό μεταλλαγμένων EGFR) (

P

= 0,001).

Συμπέρασμα

Περίπου το 30% των ασθενών παρουσίασε εντός του όγκου

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια, που συνοδεύουν με τον αριθμό αντιγράφων σχετικά χαμηλά EGFR.

EGFR

μεταλλαγμένο περιεχόμενο συσχετίστηκε με την ανταπόκριση και την πρόγνωση του EGFR-TKIs

Παράθεση:. Bai Η, Wang Ζ, Wang Υ, Zhuo M, Zhou Q, Duan J, et al. (2013) Ανίχνευση και η κλινική σημασία ενδονεοπλασιακής

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια στην κινεζική ασθενείς με προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (2): e54170. doi: 10.1371 /journal.pone.0054170

Συντάκτης: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 21, Αυγ 2012? Δεκτές: 7 Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Bai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών Διακεκριμένος νέους επιστήμονες [81025012]? και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών Γενική Πρόγραμμα [81172235]? και το Πεκίνο Συστημάτων Υγείας Ακαδημαϊκό Leader [22/02/2011]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιθηλιακά αναστολείς κινάσης υποδοχέα τυροσίνης παράγοντα ανάπτυξης (EGFR-ΤΚΙδ) όπως gefitinib και erlotinib είχε εφαρμοσθεί ευρέως για τη θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Αρκετές αναφορές έχουν προτείνει ότι οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με EGFR-TKIs επιδεικνύουν βελτιωμένη θεραπεία αποτελεσματικότητα και την επιβίωση φορές όταν φέρουν μεταλλάξεις ενεργοποίησης σε

EGFR

[1] – [6]. Ωστόσο, Na et al ανέφεραν ότι οι γυναίκες ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα με ευαίσθητο μετάλλαξη EGFR παρουσιάζονται περισσότερο μετεγχειρητική υποτροπή και βραχύτερη επιβίωση από εκείνους με EGFR φυσικού τύπου [7]. Υπάρχουν επίσης

EGFR

-mutated NSCLC ασθενείς που εμφανίζουν κακή απαντήσεις σε EGFR-TKIs ή θα ξαναρχίσουν μετά από μια περίοδο ελέγχου της νόσου, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχουν πρόσθετοι παράγοντες που μεσολαβούν την απόκριση σε EGFR-TKIs. Δευτερογενής μετάλλαξη (Τ790Μ) στο εξόνιο 20 του

EGFR

καθώς και άλλα γενετικά aberrances των συγγενικών EGFR παράκαμψης και κατάντη οδούς, όπως,

C-ΜΕΤ

ενίσχυση [8] – [10] ,

IGF-1 R

μετάλλαξη [11] είχαν ταυτοποιηθεί σε σχέση με αντοχή φαρμάκου TKIs. Ωστόσο, περίπου το 30% των μηχανισμών αντίστασης των ασθενών παραμένουν ασαφείς. Πρόσφατα, εντός του όγκου ετερογένεια των

EGFR

μεταλλάξεις έχει συγκεντρώσει την προσοχή ως πιθανή πηγή της αποτυχίας της θεραπείας και φαρμακευτικής αντοχής σε EGFR-TKIs [12], [13].

Ογκογένεση του καρκίνου του πνεύμονα είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία με την οποία το μονοκλωνικό τα καρκινικά κύτταρα γίνονται σταδιακά ετερογενή λόγω κλωνική εξέλιξη και τη γενετική /επιγενετικό αστάθεια. Παρά το γεγονός ότι όλα τα κακοήθη κύτταρα που πιστεύεται ότι προέρχονται από ένα κοινό πρόδρομο κύτταρο, απέκτησε γενετική αστάθεια οδηγεί σε επόμενες γενιές που εκφράζουν μοναδικά χαρακτηριστικά, όπως ενεργοποιημένα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια [14]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες που περιλαμβάνουν εντός του όγκου γενετική ετερογένεια έχουν δημιουργήσει αντιφατικές αποτελέσματα. Gerlinger et al (2012) [15] ανέφεραν σημαντική εντός του όγκου ετερογένεια σε σχέση με σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια του οδηγού και των επιβατών, η οποία μπορεί να ενισχύσει προσαρμογή του όγκου και θεραπευτική αποτυχία μέσω Δαρβινική επιλογή. Snuderl et al (2011) [16] ανέφεραν σταθερή συνύπαρξη ετερογενών κλώνοι που έχουν διαφορετικές ενίσχυση της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα (

EGFR, ΚΟΑ

, και

PDGFRA

) εντός του ίδιου όγκου. Ως γονίδιο οδηγό,

EGFR

προτάθηκε να συνδέεται με ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs όταν μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό εκτίθενται εντός του όγκου ετερογένεια. πρόσφατη μελέτη μας (2012) [17] αναφέρεται επίσης ότι

EGFR

μετάλλαξη μετατόπιση που απορρέουν από chemotherpy μπορεί να σχετίζεται με την ετερογένεια των εντός του όγκου

EGFR

μετάλλαξη και σε διαφορετικά επίπεδα χημειοευαισθησία των μεταλλαγμένων και άγριου Τύπος κύτταρα, αντίθετα, Yatabe et al (2011) [18] ανέφεραν ότι το

EGFR

ετερογένεια εμφανίστηκαν εξαιρετικά σπάνια σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι η ανομοιογένεια που παρατηρείται σε προηγούμενες μελέτες ήταν ένα κατασκεύασμα που προκύπτει είτε από ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο-ειδική ανισορροπία και ετερογενή

EGFR

ενίσχυση ή από μια διαφορά στο

EGFR

ευαισθησία ανίχνευσης μετάλλαξης σε διάφορες μεθόδους.

με βάση τα ανόμοια αποτελέσματα των προηγουμένως σειριακές μελέτες σχετικά εντός του όγκου ετερογένεια, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης με ανάλυση πολλαπλών εστιακών μικροδιατομής χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους (DHPLC vs ΟΠΛΑ), διερευνήσει τη σύνδεση της εντός του όγκου ετερογένειας με

EGFR

αριθμός αντιτύπων και imfluence των

EGFR

περιεχόμενα μετάλλαξη με την ανταπόκριση της θεραπείας EGFR-ΤΚΙ για τους ασθενείς με τοπικά προχωρημένο ή NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα

Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από μια τράπεζα ιστών στο Τμήμα Θωρακικής Ιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, το οποίο ιδρύθηκε τον Ιούνιο του 1999 και έχουν στην κατοχή περίπου 1900 ασθενείς με δείγματα ιστών που είχε ο γονότυπος για

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης χρησιμοποιώντας μεθόδους ρουτίνας (DHPLC). Έχουμε επιλέξει ασθενείς από τράπεζα ιστών σύμφωνα με τα ακόλουθα κριτήρια: 1) επιβεβαιώθηκε ιστολογικά Stage IIIA-IV NSCLC (έκθεση παθολογία)? 2) είχε λάβει παρηγορητική λειτουργική εκτομή? 3) θα μπορούσε να παρέχει επαρκή δείγματα πρωτογενούς ιστού για μικροδιατομής και μοριακή ανάλυση. Τα αποκλειστικά κριτήρια περιλαμβάνονται: 1) είχε ιστούς αλλά ήταν μεταστατικό δείγματα site? 2) η περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου ήταν πολύ χαμηλή για να ανάλυση. Οι παρηγορητική επιχειρησιακές εκτομές ορίστηκαν ως η λειτουργία που εκτελείται στους ασθενείς με προχωρημένο NSCLC οι οποίοι είχαν μικρή ενδο-πνευμονικά οζίδια, μοναχικά μετάσταση σε ενιαίο όργανο ή προεγχειρητική αγνώστων μεταστατική νόσο.

Τέλος, 85 ασθενείς πληρούνται τα παραπάνω κριτήρια και συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη η οποία περιείχε 45 δείγματα πληκτρολογήσει ως

EGFR

μεταλλαγμένο (ομάδα-Μ) και 40

EGFR

δείγμα άγριου τύπου (ομάδα-W). Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για ανάλυση βιοδείκτη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Θεσμικών στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο.

μικροανατομίας και DNA εξόρυξη

Όλα τα δείγματα είχαν αξιολογηθεί για

EGFR

μετάλλαξη από DHPLC τακτικά και ταξινομήθηκαν σε 40 άγριου τύπου και 45 δείγματα μεταλλαγμένου τύπου. Από κάθε φορμόλη-Σταθερή εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) μπλοκ, ένα 15-μm πάχους τομή χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε).

Για να εξασφαλιστεί τα δείγματα που αναλύθηκαν είχαν περιεχόμενα του όγκου πάνω από το 90% , ένα πρωτόκολλο ρουτίνας στην ομάδα μας: Πρώτον, στο όριο του όγκου στο τμήμα συντάχθηκε από δύο ανεξάρτητους παθολόγους υπό μικροσκοπία και την αποβολή των μη κακοηθών ιστών, το συντομότερο δυνατό. Δεύτερον, μικρές εστίες (περίπου 0,1 cm2 μέγεθος) εντός της περιοχής του όγκου μικροτομή χρήση Laser μικροανατομίας System (LMC, Leica Wetzler, Γερμανία) και να διαβεβαιώσω κάθε εστίες περιέχουν περισσότερα από 90 κύτταρα% του όγκου.

Το DNA που εξάγεται από κλάσματα του μικροτομή δειγμάτων χρησιμοποιώντας FFPE DNA Extraction Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (ωμέγα). δείγματα DNA εξετάστηκαν ως προς την καθαρότητα και τη συγκέντρωση χρησιμοποιώντας ένα κιτ Nano Drop (Thermo Scientific) και αραιώθηκαν σε συγκέντρωση εργασίας 10 ng /μl.

ανάλυση μετάλλαξης EGFR με DHPLC και ARMS

Η

EGFR

μεταλλάξεων καταστάσεις της γονιδιωματικής δείγματα DNA που προέρχεται από microdissections όγκου προσδιορίστηκαν με την εφαρμογή τόσο DHPLC και τα χέρια σε κάθε δείγμα. DHPLC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], και τα χέρια διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα DxS

EGFR

Mutation Test Kit, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Amoy Diagnostics Co., LTD, Κίνα). Ποσοτική (qPCR) αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός Mx3000P Real-Time QPCR System (Stratagene, Agilent Technologies, USA).

Semiquantitation της ετερογένειας μετάλλαξης του EGFR

Μια ημιποσοτική ανάλυση DHPLC του

EGFR

αφθονία διεξήχθη με υπολογισμό της αναλογίας των υψών κορυφής μεταξύ του μεταλλαγμένου (Μ) και τα προϊόντα άγριου τύπου (W) (αναλογία, Μ /W). Η ανάλυση DHPLC περιορίστηκε σε μεταλλάξεις στο εξόνιο 19, διότι Μ και W κορυφές διαχωρίζονται πλήρως, αλλά επικαλύπτονται στο εξόνιο 21 ανίχνευση μεταλλάξεων.

αντίγραφο EGFR

ανίχνευσης αριθμό

EGFR

αντιγράψετε αριθμοί προσδιορίστηκαν με φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) χύμα ιστό με τη χρήση ανιχνευτών DNA dual-χρώμα (Πεκίνο GP ιατρικό Tec., LTD, Κίνα). δείγματα όγκων κατατάσσονται σε έξι κατηγορίες επί τη βάσει των αποτελεσμάτων FISH σύμφωνα με τα κριτήρια του Cappuzzo [20]. Κυτταρογενετική πρότυπα ταξινομήθηκαν ως FISH-αρνητικά, εφόσον δεν εμφανίζεται ή χαμηλή γονιδιωματικής κέρδος (

δηλαδή

, ≤4 αντίγραφα του

EGFR

στο & gt?. 40% των κυττάρων). Τα δείγματα ταξινομήθηκαν ως FISH-θετικά εάν παρουσίασαν ένα υψηλό επίπεδο πολυσωμία (≥4 αντίγραφα του

EGFR

σε ≥40% των κυττάρων) ή αν εμφανίζονται ενίσχυση γονιδίου, που ορίζεται ως η παρουσία σφιχτό

EGFR

συστάδες γονιδίων και αναλογία

EGFR

/χρωμόσωμα 7 κεντρομερές του 2 ή περισσότερο ανά κύτταρο ή 15 ή περισσότερα αντίγραφα του

EGFR

ανά κύτταρο σε τουλάχιστον 10% των κυττάρων που αναλύθηκαν .

Στατιστικά

χ2 τεστ χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της σύνδεσης του περιεχομένου μετάλλαξη με τον αριθμό αντιγράφων. δοκιμασία του McNemar εφαρμόστηκε σε σύγκριση ανισότητας των

EGFR

ετερογένεια μετάλλαξη μεταξύ DHPLC και τα χέρια. Wilcoxon δοκιμή Rank Sum εφαρμόστηκε για τη σύγκριση της μεταλλαγμένης αφθονία μεταξύ των διαφόρων ομάδων μετάλλαξη. Μη παραμετρικά τεστ χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει το περιεχόμενο μετάλλαξης μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Δύο όψεων P τιμών & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Η αξιολόγηση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με Όλοι οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SAS Έκδοση 10.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός των ασθενών

Κατά τη διάρκεια της την περίοδο Οκτώβριος 2005 – Δεκέμβριος 2011, 85 ασθενείς είχαν εγγραφεί σε αυτήν την αναδρομική μελέτη. Η ιστολογική υποτύπους εκάστου δείγματος NSCLC αξιολογήθηκαν με βάση την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (ΠΟΥ) κριτηρίων [21]. Αδενοκαρκίνωμα ήταν η πιο συχνή ιστολογική υποτύπου (63 ασθενείς, 74,1%). σταδιοποίηση του καρκίνου έγινε σύμφωνα με το σύστημα UICC-AJCC-ΤΝΜ (έκδοση 7, 2009) [22]. Προχωρημένη νόσο (φάσεις ΙΙΙΒ – IV) εντοπίστηκε στο 61,2% των εγγεγραμμένων ασθενών. Τα δεδομένα του ασθενούς συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Σαράντα πέντε ασθενείς επιβεβαιώθηκαν να είναι

EGFR

μεταλλαγμένου τύπου (ομάδα-M), συμπεριλαμβανομένων των 25 ασθενών με εξόνιο 19 εξαλείψεις (ομάδα-Μ /Ε19) και 20 ασθενείς με εξόνιο 21 μεταλλάξεις (ομάδα-Μ /Ε21).

η

η ετερογένεια της μετάλλαξης του EGFR ανιχνεύεται από DHPLC και τα χέρια

όγκου μικροδιατομής απέδωσε 2.699 εστίες, συμπεριλαμβανομένων 1.238 εστίες από άγριου τύπου

EGFR

(ομάδα-W) και 1.431 περιπτώσεις ομάδα-M. Η συνολική συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης στην ομάδα-Μ ήταν 80,6% από DHPLC (1154/1431) και 87,1% (1.247 /1.431) από την ΟΠΛΑ. Μεταλλαγμένα συχνότητες ποικίλλουν ευρέως σε όλη επιμέρους όγκους, που κυμαίνονται μεταξύ 5% -100% από DHPLC και 1% -100% από όπλων. Δείγματα Group-M υποδιαιρέθηκαν με περιεκτικότητα μετάλλαξη ως εξής: 1) καθαρό

EGFR

μετάλλαξη (100%) ή δεν μεταλλακτική ετερογένεια ανιχνεύθηκε σε 21 περιπτώσεις με DHPLC (12 Ομάδα-Μ /Ε19, 9 Ομάδα-M /Ε21) και σε 31 περιπτώσεις από ΟΠΛΩΝ (20 ομάδα-M /Ε19, 11 ομάδα-Μ /Ε21)? 2) μέτρια περιεκτικότητα σε μετάλλαξη (≥50%) ή μέτρια επίπεδα ετερογένεια ανιχνεύθηκε σε 16 περιπτώσεις από DHPLC (10 ομάδα-Μ /Ε19, 6 ομάδα-M /Ε21) και σε 9 περιπτώσεις από ΟΠΛΩΝ (2 Ομάδα-Μ /Ε19 , 7 ομάδα-M /Ε21)? και 3) χαμηλή περιεκτικότητα σε μεταλλαγμένα ή ετερογένεια υψηλού επιπέδου (& lt? 50%) ανιχνεύθηκαν σε 8 περιπτώσεις με DHPLC (3 ομάδα-M /E19 και 5 ομάδα-M /Ε21) και σε 5 περιπτώσεις από ΟΠΛΩΝ (3 ομάδα-M /E19 και 2 ομάδα-Μ /Ε21).

Μεταξύ των 40-W ομάδα περιπτώσεις, 4 περιπτώσεις εμφανίζεται χαμηλή συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης που κυμαίνονται από 5,0% έως 8,0%, όταν μικροδιατομή εστιών του όγκου αναλύθηκαν με DHPLC. Τρεις από αυτές τις περιπτώσεις πραγματοποιείται μια

EGFR

εξόνιο 19 μετάλλαξη, και μία περίπτωση διεξάγεται ένας

EGFR

εξόνιο 21 μετάλλαξη. ΟΠΛΑ επιβεβαίωσε αυτές τις 4 περιπτώσεις και εντοπίστηκαν 6 επιπλέον περιπτώσεις δείχνουν πολύ χαμηλή συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης που κυμαίνονται από 1,0% έως 5,0%. Με το συνδυασμό των περιπτώσεων ομάδα-Μ που μεταφέρουν τόσο άγριου και μεταλλαγμένου τύπου

EGFR

κύτταρα και ο Όμιλος-W περιπτώσεις που περιέχουν μεταλλαγμένα κύτταρα σε χαμηλή συχνότητα, 32,9% (28/85) και 28,2% (24/85 ) των δειγμάτων εντοπίστηκαν να μεταφέρουν εντός του όγκου

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια από DHPLC και όπλων, αντίστοιχα. Διαφορά εντός του όγκου

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια που προσδιορίζονται από τις δύο μεθόδους δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,031, δοκιμασία του McNemar) (Σχήμα 1).

Το διαφορετικό χρώμα της πίτας αντιπροσωπεύουν διαφορετικές ετερογένεια μετάλλαξη του EGFR. Οι άφησε τρία μέρη (lightblue, μοβ και πράσινο) κάθε γράφημα πίτας αντιπροσωπεύουν ποσοστό των περιπτώσεων με ετερογένεια EGFR.

Η

ημι-ποσοτική ανάλυση των εξόνιο 19 μετάλλαξης από DHPLC

Επίσης, μετριέται ημιποσοτικά η

EGFR

μεταλλαγμένο αφθονία από τον υπολογισμό του W μέγιστη αναλογία Μ /ύψος από το γράφημα DHPLC. Εμείς περιορίζεται λόγω ανάλυση στην εξόνιο 19 διαγραφή επειδή η αντίστοιχη Μ και W κορυφές δεν επικαλύπτονται υπό μη μετουσιωμένη συνθήκες (50 ° C) (Σχήμα 2). Το μεσαίο M /W αναλογίες εξόνιο 19 ήταν 2,43 (εύρος 0,40 – 18,15) μεταξύ των δειγμάτων ομάδα-Μ και 0,12 (εύρος, 0,06 – 0,22) μεταξύ των δειγμάτων ομάδα-W (

P

= 0,005). Υπό μερικώς μετουσιωμένη συνθήκες (62,2 ° C), η Μ και W κορυφές που αντιστοιχούν στην υποκατάσταση εξόνιο 21 επικαλύπτονται, αποκλείοντας οποιαδήποτε προσδιορισμός της σχετικής ύψη τους.

Το αριστερό γράφημα έδειξε ανίχνευσης κατάστασης ρουτίνα μετάλλαξης του EGFR από DHPLC και τις αντίστοιχες χύδην ιστού. Το δικαίωμα γράφημα αντιπροσωπεύουν EGFR ετερογένεια μετάλλαξη από μικροδιατομής. Οι δύο παραπάνω πίνακες αντιπροσωπεύουν μεταλλαγμένου EGFR χύμα ιστούς έδειξε καθαρά μετάλλαξης και μετάλλαξης με ετερογένεια από μικροδιατομής, αντίστοιχα. Το παρακάτω δύο πίνακες αντιπροσωπεύουν άγρια ​​EGFR χύμα ιστούς με καθαρό άγριου τύπου EGFR ή αναμειγνύονται με χαμηλή συχνότητα των κυττάρων μετάλλαξης από μικροδιατομής.

Η

αριθμός αντιγράφων EGFR

ανάλυση FISH διεξήχθη σε 85 δείγματα όγκων για τη μέτρηση της

EGFR

αντιγράψετε αριθμούς. Τριάντα μία περιπτώσεις (36,5%) θεωρήθηκαν FISH-θετική. Η ένωση του

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια όπως ανιχνεύεται από όπλων με

EGFR

αριθμού αντιγράφων περιγράφεται παρακάτω. Μεταξύ των 31 ασθενών με 100%

EGFR

-mutated κύτταρα (δεν ετερογένεια), 71,0% (22/31) ταξινομήθηκαν ως FISH-θετική (υψηλή πολυσωμία ή γονίδιο ενίσχυσης). Αντίθετα, η χαμηλή

EGFR

-mutated ομάδα εμφάνισε περίπου 13,3% FISH-θετικότητα (2/15, συμπεριλαμβανομένων 10 χαμηλής συχνότητας περιπτώσεις μεταλλαγμένο σε ομάδα-W και 5 χαμηλής συχνότητας περιπτώσεις μεταλλαγμένο σε ομάδα-Μ) , και η μετριοπαθής

EGFR

-mutated ομάδα εμφανίζεται περίπου 22,2% (2/9) θετικότητα FISH (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 3 και 4) η οποία ήταν παρόμοια με εκείνη που ανιχνεύεται σε 30 ασθενείς με άγριου τύπου

EGFR

από τους οποίους εστίες μικροδιατομής αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΟΠΛΩΝ (5/30, 16,7%,

P

= 0,75).

Το διάφορους

τα περιεχόμενα του EGFR

μετάλλαξη που απεικονίζεται στο μύθο.

η

η αξιολόγηση του γονιδίου EGFR αριθμού αντιγράφων από FISH έγινε με τη χρήση του

EGFR

(πορτοκαλί) /CEP 7 (πράσινο) καθετήρας (Πεκίνο GP ιατρικό Tec., LTD, Κίνα). Πίνακες απεικονίζουν τα δείγματα όγκων που εκπροσωπούν γονιδιακής ενίσχυσης (Α) και δισωμία (Β).

Η

Η ετερογένεια από ιστολογικό τύπο και το στάδιο

Το αδενοκαρκίνωμα ήταν η πιο συχνή ιστολογική μοτίβο που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη (74,1 % των ατόμων)? αυτό ήταν αναμενόμενο σε μια κατά κύριο λόγο χειρουργική σειρά. Η θετικότητα των

EGFR

μετάλλαξη στο αδενοκαρκίνωμα, όπως επιβεβαιώνεται από την ανάλυση μικροδιατομής, ήταν 91,8%. Η αναλογία Μ /W ήταν 2,57 (εύρος 0,13 – 18,15). Σε σύγκριση, το

συχνότητα EGFR

μετάλλαξης ήταν χαμηλότερη μεταξύ άλλων ιστολογικών μοτίβα (70,9%), και μόνο 3 περιπτώσεις πραγματοποιείται η

EGFR

19 μετάλλαξη με αναλογία /W M 1.53. Με βάση το σύστημα σταδιοποίησης των όγκων UICC-AJCC-ΤΝΜ, 50 όγκοι ταξινομούνται ως φάσεων ΙΙΙΑ και ΙΙΙΒ (τοπικά προχωρημένους) και 35 ήταν σταδίου IV (για προχωρημένους). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη μετάλλαξη θετικό ρυθμό και αφθονία ανάμεσα τοπικά προχωρημένο και προχωρημένα στάδια NSCLC (ποσοστό, 87,7% έναντι 86,3%,

P

= 0,875? αναλογία Μ /W, 2.12 έναντι 2.86,

P

= 0,662).

Επιπτώσεις του EGFR μεταλλάξεων ετερογένεια στην απόκριση σε EGFR-TKIs

Μεταξύ 85 περιπτώσεις, 26 ασθενείς έλαβαν EGFR-TKIs ως πρώτης γραμμής ή πολυ- θεραπείες γραμμή. 9 ασθενείς παρουσίασαν μερική απόκριση (PR), 7 είχαν σταθερή νόσο (SD), και 10 έμπειρους προοδευτική νόσο (PD). Σύμφωνα με ARMS αποτελέσματα, η μέση περιεκτικότητα σε μεταλλαγμένο ήταν 86,1% (247/287) στην ομάδα PR, 48,7% (110/226) στην ομάδα SD, και 6,0% (19/317) στην ομάδα PD, και με μια σημαντική διαφορά (

P

= 0,001).

Έχουμε χωριστεί 26 ασθενείς σε τρεις υποομάδες σύμφωνα με την μετάλλαξη του EGFR ετερογενή κατάσταση, η οποία ήταν «καθαρή EGFR φυσικού τύπου», «μετάλλαξη του EGFR με ετερογένεια» και «καθαρό μεταλλαγμένων EGFR». Η PFS ήταν 3,01 μήνες (95% CI 0,51 – 5,52), 11,35 μήνες (95% CI 6,37 – 15,21) και 16,21 μήνες (95% CI 8,21 – 25,19) για τις τρεις ομάδες, αντίστοιχα (P = 0,001).

Συζήτηση

η ενδονεοπλασματική

EGFR

ομοιογένεια μετάλλαξη έχει από καιρό θεωρηθεί σε καρκίνους του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός ενός ασθενούς

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης ερμηνεύτηκε με τη χρήση ποιοτικών μεθόδων. Ωστόσο, μόνο ένα μικρό ποσοστό των ασθενών που φέρουν

EGFR

μεταλλάξεις ανταποκριθεί σε EGFR-TKIs, υποδηλώνοντας ότι πρόσθετοι παράγοντες πέρα ​​από μετάλλαξη του EGFR να συμβάλει στην αντιμετώπιση των ναρκωτικών του ασθενούς. Εκτός από διάφορες σχετικές βιοδείκτες (

π.χ.

., Κ-ras, Τ790Μ, c-met), εντός του όγκου

EGFR

μεταλλάξεων ετερογένεια έχει προταθεί ως υποψήφιος μεσολαβητής της αντίστασης σε EGFR- ΤΚΙ θεραπεία, αν και η ύπαρξη τέτοιων ετερογένεια έχει αμφισβητηθεί [15] – [17]. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε σημαντική εντός του όγκου μεταλλάξεων ετερογένεια χρησιμοποιώντας τόσο DHPLC και τα χέρια μεθόδους.

Ένα από τα διαμάχες για ενδοογκική ετερογένεια των

EGFR

μετάλλαξη είναι κατά πόσον η ετερογένεια αποδίδει χρησιμοποιώντας ένα χαμηλό ευαίσθητα μέθοδος ανίχνευσης, ειδικά όταν μεταλλαχθεί σήμα είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης. Να αποκλειστεί το ενδεχόμενο, θα χρησιμοποιηθούν δύο μέθοδοι δοκιμών, DHPLC και τα όπλα, για να αξιολογηθεί η

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης στο μικροτομή εντός του όγκου εστίες. ΟΠΛΑ θεωρείται ως ένα υψηλής ευαισθησίας δοκιμασία για

EGFR

ανίχνευση μεταλλάξεων. Ενώ η μέθοδος DHPLC δεν έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για

EGFR

ανάλυση μετάλλαξης, ωστόσο, είναι η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα έχει αποδειχθεί σε άλλες μελέτες μας και (όριο ανίχνευσης 3% -10%) [19], [23] – [26]. Τα αποτελέσματα έδειξαν το μέρος των δειγμάτων από τοπικά προχωρημένο και προχωρημένο NSCLC παρουσίασε τη συνύπαρξη των

EGFR

μεταλλαγμένων και άγριου τύπου κύτταρα, ανεξάρτητα από το DHPLC ή τα όπλα που χρησιμοποιούνται, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εντός του όγκου

EGFR

μεταλλαγμένα ετερογένεια υπήρχε πράγματι και δεν προέρχονται από την προκατάληψη των μεθόδων ανίχνευσης ή χαμηλής ενδοογκική μεταλλαγμένο συχνότητες.

για να χαρακτηριστεί καλύτερα εντός του όγκου ετερογένεια των

EGFR

, εμείς μικροτομή χύμα ιστό του όγκου για την απόκτηση 28-34 εστίες ανά όγκο και ανέλυσε κάθε εστίασης για

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης χρησιμοποιώντας ποιοτικές και ημι-ποσοτικές μεθόδους. Οι περισσότερες από τις εστίες μικροδιατομής ταυτοποιήθηκαν ως

EGFR

μεταλλαγμένου τύπου με

EGFR

περιεχόμενα μετάλλαξη που κυμαίνεται από 1% έως 100%. Θεωρητικές και πειραματικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα καρκινικά κύτταρα του ίδιου γονότυπου εντοπίσει συνεχόμενα [27]. Η ανάλυση ενός μικρού δείγματος αποκόπηκε από καρκινικό ιστό και πιθανόν να έδειχνε γενετικά ταυτόσημα πληθυσμός των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, η ανάλυση μας

EGFR

καταστάσεις μετάλλαξη από τα πολυάριθμα εντός του όγκου εστίες αναφέρεται ετερογένεια. Αποκλείσαμε μη κακοήθεις θέσεις με μικροσκοπική οπτικοποίηση και κάθε microsampled δείγμα ήταν διασταυρώθηκαν για να επιβεβαιωθεί ότι το ποσοστό του ιστού του όγκου ήταν τουλάχιστον 90%, εξασφαλίζοντας ότι μικροδιατομή περιοχές που δεν είχαν μολυνθεί από μη καρκινικά κύτταρα. Έτσι, τα στοιχεία μας επιβεβαιώνουν την ύπαρξη εντός του όγκου

EGFR

μετάλλαξης ετερογένεια.

Yatabe et al. (2011) [17] ανέφερε ότι ετερογενείς κατανομές των

EGFR

μεταλλάξεις στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα ήταν εξαιρετικά σπάνια. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι η ετερογένεια του όγκου αναφέρθηκε από τους άλλους ήταν στην πραγματικότητα μια pseudoheterogeneity που προκύπτει από ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο-ειδική ανισορροπία (MASI) ή από ετερογενή

EGFR

ενίσχυσης. Αρκετές μελέτες υποστήριξαν την εμφάνιση MASI σε καρκινικά κύτταρα EGFR-μεταλλαγμένο, και αυτό το φαινόμενο σχετίζεται με αυξημένη μεταλλαγμένο αλληλόμορφο μεταγραφική δραστηριότητα [28] – [30].

EGFR

μεταλλάξεις, κέρδη αριθμού αντιγράφων γονιδίου, και MASI συμβαίνουν μαζί σε κύτταρα όγκου φαίνεται να συνεργούν για να πραγματοποιηθεί μια πιο κακοήθη φαινότυπο από αυτές τις αλλοιώσεις ατομικά [28] – [30]. Παρατηρήσαμε μια υπερυψωμένη

EGFR

αντιγράψετε τον αριθμό των ασθενών με καθαρό

EGFR

μεταλλάξεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υψηλή συχνότητα

EGFR

μεταλλάξεις συμβαίνουν συχνά με ένα υπερυψωμένο

EGFR

αριθμό αντιγράφων (MASI). Ωστόσο, σε ασθενείς που εμφανίζουν εντός του όγκου ετερογένεια,

EGFR

αριθμού αντιγράφων ήταν χαμηλότερη από ό, τι σε ασθενείς με καθαρό

EGFR

μεταλλαγμένων όγκων. Η πιθανή εξηγήσει είναι ότι ετερογενής όγκοι περιείχαν όχι μόνο

EGFR

μεταλλαγμένα κύτταρα αλλά επίσης και τα κύτταρα άγριου τύπου, και επιλεκτική ενίσχυση μεταλλαγμένων αλληλίων θα μπορούσε να αραιωθεί με αλληλόμορφα άγριου τύπου, η οποία οδήγησε σε μια σχετικά χαμηλή

EGFR

αριθμό αντιγράφων.

Μεταξύ χύμα όγκοι φιλοξενούν άγριου τύπου

EGFR

, 10, 40 περιπτώσεις εμφάνισαν πολύ μικρότερη συχνότητα των προϊόντων μετάλλαξης (5-8%) μέσω ανάλυσης μικροδιατομής σε σύγκριση με το 45 ασθενείς οι οποίοι φέρουν μετάλλαξη

EGFR

. Αυτή η λεγόμενη «false αρνητικότητα» μετράται από χύμα ιστό θα μπορούσε να οφείλεται στην ανικανότητα του DHPLC να ανιχνεύει μικρές ποσότητες από μεταλλαγμένο DNA όταν τα λίγα μεταλλαγμένα κύτταρα που περιέχονται σε ένα δείγμα. Μπορούμε επίσης ημιποσοτικά προσδιορίζεται μεταλλαγμένο αφθονία με υπολογισμό της αναλογίας των υψών κορυφής (Μ /W) από το γράφημα DHPLC. Σύμφωνα με τα στοιχεία μας, η διάμεση αναλογία M /W κυμαίνονταν από 0,13 έως 18,15 σε

EGFR

της μεταλλαγμένης υποθέσεις και από τα 0,06 έως 0,22 σε περιπτώσεις άγριου τύπου, πράγμα που υποδηλώνει ότι τα καρκινικά κύτταρα σε ιστό όγκου χύμα συνήθως περιέχουν μεταλλαγμένο και μη-μεταλλαγμένες μορφές ταυτόχρονα. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη εφαρμόζοντας την αναλογία Μ /W σε ημι-ποσοτικά καθορίσει

EGFR

κατάσταση μετάλλαξης και συνάγουν εντός του όγκου ετερογένεια.

Μόνο 26 ασθενείς έλαβαν EGFR-TKIs, που περιορίζεται η στατιστική ισχύς αυτού του βραχίονα της μελέτης. Ωστόσο, εντοπίσαμε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό μετάλλαξης σε εστίες από ασθενείς PR και SD σε σύγκριση με ασθενείς με PD. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με διάφορες άλλες μελέτες. Taniguchi et al [31] ανέλυσε τη σχέση μεταξύ των

EGFR

ετερογένεια και η ανταπόκριση σε EGFR-TKIs από μικροδιατομής σε όγκους NSCLC σε πρώιμα στάδια, και ανέφερε ότι οι ασθενείς με μεγαλύτερη

EGFR

συχνότητα μετάλλαξης ήταν πιο ευαίσθητα σε EGFR-TKIs και έδειξε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης χωρίς εξέλιξη από ό, τι οι ασθενείς με χαμηλό

EGFR

ποσοστά μετάλλαξης. Έχουμε σκεφτεί ότι η ταχεία εξέλιξη του όγκου μπορεί να συμβεί σε δείγματα με χαμηλό ποσοστό

EGFR

μεταλλαγμένα κύτταρα, λόγω του γεγονότος ότι η αποπτωτική

EGFR

μεταλλαγμένα κύτταρα ανταποκρίνονται σε EGFR-ΤΚΙ ήταν λιγότεροι από πολλαπλασιαζόμενα μη-μεταλλαγμένα κύτταρα. Με βάση αυτή την κερδοσκοπία, προτείνουμε ότι η εντός του όγκου ετερογένεια μπορεί να είναι ένας σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει στην αντίσταση του EGFR ΤΚΙ. απαντήσεις ασθενής μπορεί από βελτιώνεται με τη χορήγηση ενός συνδυασμού θεραπείας EGFR-ΤΚΙ και άλλα θεραπευτικά ικανή συμψηφισμού μη

EGFR

μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα σε μια ταυτόχρονη ή διαδοχική τρόπο.

Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα έτρεφε σημειώνονται EGFR μεταλλάξεων ετερογένεια. Η πιο σημαντική κλινική σημασία του EGFR μεταλλάξεων ετερογένεια μπορεί να είναι σε θέση να εξηγήσει μηχανισμό αντίστασης του EGFR-ΤΚΙ. Δευτεροβάθμια, εντός του όγκου ετερογένεια της μετάλλαξης του EGFR δείχνουν επίσης ότι μόνο σημείο ή μόνο βιοψία του χρόνου μπορεί να μην είναι η βέλτιστη μέθοδος για τον προσδιορισμό εξατομικευμένη θεραπεία EGFR-ΤΚΙ. Συνδυαστική ιστολογική και γενετικές προσεγγίσεις χρησιμοποιώντας πληροφορίες σχετικά με τα προφίλ επιβίωση και την απάντηση μπορεί να παρέχει καλύτερη συμπεράσματα για την αποτελεσματική πρόληψη των ασθενειών και τη θεραπεία στο μέλλον.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθ Keneng Chen στο Τμήμα Χειρουργικής Θώρακος για την παροχή μερική δείγματα, Dr Ning Wang στο Τμήμα Ακτινολογίας για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης της θεραπείας, ο Δρ Yu Sun στο Τμήμα Παθολογίας για τη συμβολή της στην ανάλυση δείγμα Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο & amp? Ινστιτούτο. Σας ευχαριστούμε καθηγητής Chen Yao (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Clinical Research Institute) και Dr.Guoshuang Feng (Chaoyang District Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων) για στατιστική ανάλυση.