Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αγγειογένεση μπορεί να παίζει ρόλο στην παθογένεση της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Το CXC (ELR

+) της οικογένειας των χημειοκινών είναι ισχυρά υποστηρικτές του αγγειογενετική απόκριση.

Μέθοδοι

Η έκφραση των μελών της οικογένειας CXC (ELR

+) (

CXCL1-3 /ΟΚΟα-γ

,

CXCL8 /IL-8

,

CXCR1 /2

) εξετάστηκε σε μια σειρά από εκτομή κατεψυγμένα όγκους NSCLC. Επιπλέον, η έκφραση και η επιγενετική ρύθμιση αυτών των χημειοκινών εξετάστηκε σε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά και κυτταρικές σειρές NSCLC.

Αποτελέσματα

Συνολικά, έκφραση των συνδετών χημειοκίνης (

CXCL1, 2

,

8

) και των υποδοχέων τους (

CXCR1 /2

) έχουν κάτω ρυθμίζονται σε δείγματα όγκων συγκριτικά με την κανονική, με την εξαίρεση του

CXCL3

.

CXCL8

και

CXCR1 /2

βρέθηκαν να ρυθμίζονται επιγενετικώς από ιστόνης μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Η ανασυνδυασμένη CXCL8 δεν διέγειρε την ανάπτυξη των κυττάρων, είτε με φυσιολογικό βρογχικών επιθηλιακών ή πλακωδών κυττάρων καρκινώματος (SKMES-1). Ωστόσο, παρατηρήθηκε αύξηση στις 72 ώρες μετά τη θεραπεία σε μια κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος.

Τα συμπεράσματα

CXC (ELR

+) χημειοκινών απορυθμίζεται σε NSCLC. Το υπόλοιπο αυτών των χημειοκινών μπορεί να είναι κρίσιμη στο μικροπεριβάλλον του όγκου και απαιτεί περαιτέρω διευκρίνιση. Μένει να δούμε αν επιγενετικές στόχευση αυτών των οδών είναι μια βιώσιμη θεραπευτική επιλογή στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Baird AM, Gray SG, O’Byrne KJ (2011) Επιγενετική οποίες στηρίζεται ο κανονισμός του CXC ( ELR

+) χημειοκίνες σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (1): e14593. doi: 10.1371 /journal.pone.0014593

Επιμέλεια: Kelvin Yuen Kwong Chan, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 14 Ιουνίου του 2010? Αποδεκτές: 2 Ιανουαρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιανουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Baird et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια απεριόριστη εκπαιδευτική επιχορήγηση από την Pfizer. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η χρηματοδότηση για το έργο αυτό ήταν η παροχή από την Pfizer, με τη μορφή ενός μισθού για την Anne- Marie Baird. Καμία χρηματοδότηση είχε προβλεφθεί για τα αναλώσιμα. Η χρηματοδότηση που παρέχεται ήταν μια επιχορήγηση-in-βοήθειας, και ως εκ τούτου, δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η αγγειογένεση είναι σημαντικές στην ανάπτυξη και την εξάπλωση του καρκίνου και επίσης επηρεάζει φλεγμονώδεις αλλαγές οι οποίες μπορεί να προδιαθέτουν για την ασθένεια [1]. Το CXC (ELR

+) χημειοκίνες επάγουν αγγειογένεση και μπορεί να είναι σημαντική σε καρκίνους που έχουν μια αγγειογόνο φαινότυπο όπως NSCLC [2].

Ο όρος χημειοκίνη αναφέρεται σε μια οικογένεια χαμηλού μοριακού βάρους (8- 10 kDa) χημειοτακτικές κυτοκίνες. Οι χημειοκίνες είναι μικρά επαγώγιμοι κυτοκίνες, οι οποίες είναι χημειο-προσελκυστικά για λευκοκύτταρα. Οι χημειοκίνες έχουν ταξινομηθεί από τη σύνθεση αμινοξέων τους, λειτουργική δραστικότητα και τις ιδιότητες πρόσδεσης υποδοχέα και αποτελείται από τέσσερα επιμέρους οικογένειες ορίζονται σύμφωνα με τα δύο πρώτα από τα τέσσερα διατηρημένα υπολείμματα κυστεΐνης (α) C, (β) CC, (γ) CXC και (δ) CXXXC [3]. Η οικογένεια χημειοκίνης CXC αποτελείται από δύο υποτύπων, ELR

+ και ELR

-, σύμφωνα με ένα συγκεκριμένο Glu-Leu-Arg (ELR) μοτίβο που προηγείται του πρώτου υπολείμματος κυστεΐνης [3]. CXC (ELR

+) προαγωγοί περιέχουν ένα υποθετικό

cis

στοιχείο που αναγνωρίζει NF-κΒ, και ως εκ τούτου μπορεί να προκαλέσει την trans-ενεργοποίηση των CXC χημειοκινών [4].

Η αγγειογενετική υποδοχέα για CXCL8 και το άλλο CXC (ELR

+) χημειοκίνες είναι CXCR2 [5]. Ο αποκλεισμός αυτού του υποδοχέα οδηγεί σε μείωση της αγγειογένεσης σε παγκρεατικού καρκίνου [6], και μια σημαντική αναστολή της ανάπτυξης ανθρώπινου όγκου μελανώματος και πειραματικές μεταστάσεις πνεύμονα σε CXCR2 – /- ποντίκια, καθώς επίσης και μια μείωση στην αγγειογένεση [7]. Στο περιβάλλον του πνεύμονος, την ανάπτυξη καρκίνου και μεταστατικό δυναμικό ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορες CXCR2 ποντίκι – /- μοντέλα [7], [8]. Ωστόσο, CXCL8 μπορεί να συνδεθεί με CXCR1 και CXCL1 /CXCL8 μπορεί επίσης να δεσμεύσει DARC, αν και δέσμευση σε DARC δεν μετάγει ένα σήμα. Επί του παρόντος, οι μελέτες με DARC προτείνουν ότι δρα «σφουγγάρισμα» επάνω χημειοκίνες και, ως εκ τούτου, μείωση της ικανότητας σηματοδότησης τους. Υπερ-έκφραση του DARC οδηγεί σε αυξημένη ανάπτυξη του όγκου, ωστόσο, αυτό οφειλόταν στην επαγωγή των μεγάλων νεκρωτικές περιοχές εντός του όγκου [9], [10].

υποδοχείς χημειοκινών είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα όγκου, επιτρέποντας τον όγκο για να επωφεληθούν από την πλούσια χημειοκίνης περιβάλλοντα, την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου και αγγείωση. Επιπλέον, οι χημειοκίνες μπορεί να προσλαμβάνει τα μακροφάγα, τα οποία ανιχνεύουν την υποξικό περιβάλλον εντός του όγκου και στη συνέχεια εκκρίνουν προ-αγγειογόνοι παράγοντες [11], [12]. Αρχικά χημειοκίνες πιστεύεται ότι παίζουν μόνο ένα ρόλο στην προσέλκυση ειδικών λευκοκυττάρων σε μια περιοχή του τραυματισμού? παρ ‘όλα αυτά έχει τώρα δείξει ότι εμπλέκονται στην νεοπλασματικό μετασχηματισμό ενός κυττάρου, προαγωγή της αγγειογένεσης, του όγκου κλωνική επέκταση και αλλαγές στην ECM, και ιδίως όργανο μεσολαβούν στην ειδική μεταστάσεις στον καρκίνο [13]. Ειδικά ζεύγη υποδοχέα ρίζας υπαγορεύουν τις μεταστάσεις πρότυπα του μαστού και καρκίνου του πνεύμονα [14]. Στον καρκίνο του μαστού μεταστάσεις στον πνεύμονα, CXCL1 ήταν μέρος ενός γονιδίου υπογραφή που περιλαμβάνεται επίσης VCAM1 και ΜΜΡ1 [15]. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι προέρχεται όγκου CXCL8 ενεργούσε ως προσελκυστικό για κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων για να επιστρέψει στην αρχική του όγκου, οδηγώντας σε μια πιο επιθετική φαινότυπο όγκου [16].

Μια ποικιλία από CXC χημειοκινών έχουν ανιχνευθεί σε νεοπλασματικά ιστούς ως προϊόντα των καρκινικών κυττάρων ή στρωματικών στοιχείων [12]. Για παράδειγμα, ενδοδιηθητικά όγκου φλεγμονωδών κυττάρων ανυψώνει τα επίπεδα CXCL8 σε βρογχοκυψελιδικού κύτταρα, μαζί με δύο υποδοχείς του [17]. Ισχυρές ενδείξεις υποδεικνύουν ότι CXC (ELR

+) χημειοκίνες έχουν ένα ρόλο στην προαγωγή του καρκίνου, καθώς μπορούν να προωθήσουν την ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [18].

Η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου εξαρτάται από την αγγειογένεση και CXCL8 έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ρόλο στην αγγειογενετική και ογκογόνο δυναμικό του. Στον καρκίνο των νεφρικών κυττάρων, τα επίπεδα του CXCL1, CXCL3 και CXCL8 ήταν αυξημένα σε σύγκριση με τους ελέγχους και υποδοχέα αρνητικό (CXCR2 – /-) ποντικούς υπήρξε μια αντίστοιχη μείωση στην ανάπτυξη του όγκου [19]. Μελέτες που χρησιμοποιούν μοντέλα όγκων μελανώματος υποστηρίζουν το ρόλο του CXCL1, CXCL2, και CXCL3 στη διαμεσολάβηση της αγγειογένεσης των όγκων και των επιπέδων των τριών χημειοκινών είναι εντόνως εκφρασμένα σε όγκους μελανώματος. Διαμόλυνση CXCL1-3 σε αθανατοποιημένων μη ογκογόνα κύτταρα τους έδωσε την δυνατότητα να σχηματίζουν όγκους [20], [21]. CXCL8 είναι ένα από τα πιο μελετημένα μέλη της οικογένειας CXC (ELR

+), ιδιαίτερα στον καρκίνο του πνεύμονα. CXCL8 ταυτοποιήθηκε σε μια υπογραφή έκφρασης γονιδίων που ήταν κατηγορηματικό από κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο σταδίου Ι του πνεύμονα [22], ενώ τα επίπεδα του CXCL8 αυξήθηκε σημαντικά σε τόσο κακοήθη πλευριτική συλλογή [23] και NSCLC [24], όπου τα επίπεδα αυξάνουν με στάδιο [25] και να συσχετιστούν με την επιβίωση των ασθενών /υποτροπή [26]

οι χημειοκίνες που βρίσκονται μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου πιστεύεται ότι παίζουν τουλάχιστον πέντε ρόλους στην ανάπτυξη των όγκων και μεταστατικής νόσου.? (Α) λευκοκυττάρων ελέγχου διήθηση, (β) να τροποποιήσει όγκου ανοσοαπόκριση, (γ) ρυθμίζουν την αγγειογένεση, (δ) λειτουργούν ως ανάπτυξη και παράγοντες επιβίωσης, και (ε) κατευθύνουν την κίνηση των ίδιων των καρκινικών κυττάρων [27]. Οι CXC (ELR

+) συνδέτες και υποδοχείς είναι ιδιαίτερα σημαντική στη διαμεσολάβηση συνδέονται NSCLC όγκου αγγειογένεση [28] και όργανο ειδικών μεταστάσεων [13], [14]. συνδετήρες CXCR2 έχουν επίσης ενοχοποιηθεί στην πρόοδο του όγκου NSCLC μέσω σαλιγκάρι, τα υψηλά επίπεδα που συσχετίζονται με μειωμένη επιβίωση [29].

Η ανώμαλη επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης είναι ένα συχνό συμβάν σε NSCLC [30], [31] . Στόχευση αυτών των επιγενετικών ρυθμιστικών μηχανισμών σε NSCLC είναι ένα ενεργό περιοχή της φαρμακευτικής έρευνας. Επιδιώξαμε να εξετάσουμε την έκφραση των χημειοκινών CXC (ELR

+) και των υποδοχέων τους σε μια σειρά δειγμάτων πρωτογενούς όγκου NSCLC και σε ένα πρόσθετο πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC και να εξετάσει άμεσα αν επιγενετική παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση αυτών των γονιδίων σε αυτή την ασθένεια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση αυτών των χημειοκινών και των υποδοχέων τους είναι συχνά απορυθμισμένη σε NSCLC, που ρυθμίζονται μέσω άμεσα και σε απ ‘ευθείας από επιγενετικές μηχανισμών (ιστόνης μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και DNA CpG μεθυλίωσης, αντίστοιχα) και μπορεί να είναι καλός υποψήφιος στόχοι για επιγενετικές θεραπεία στη θεραπεία αυτού του καρκίνου.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

το Α549 (αδενοκαρκίνωμα), SKMES-1 (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων), Η460, H647 και Η1299 (μεγάλες καρκίνωμα) και BEAS-2Β (μετασχηματισμένα κανονική bronchoepithelial) κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC (LGC Promochem, Teddington, Ηνωμένο Βασίλειο). HBEC κυτταρικές σειρές [32] ήταν ένα δώρο από τον καθηγητή John D Minna (Hamon Κέντρο Θεραπευτικής Ογκολογίας Έρευνας, UTSoutwestern, Dallas, TX, USA). Όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας αγοράσθηκαν από την Lonza (Walkersville, MD, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στα ακόλουθα μέσα? Α549 – F-12 (Ham) μέσο συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS, πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (500 U /ml) και 2 mM L-γλουταμίνη. BEAS-2Β διατηρήθηκαν επίσης σε F-12 (Ham) μέσο χωρίς την προσθήκη FBS. SKMES-1 – ΕΜΕΜ με την προσθήκη 10% (ν /ν) FBS, πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (500 U /mL), 2 mM Ε-γλουταμίνη και 0,1 Μ μη ουσιώδη αμινοξέα. Όλες οι μεγάλες γραμμές καρκίνωμα διατηρήθηκαν σε RPMI με 10% FBS και πενικιλίνη στρεπτομυκίνη (500 U /mL). HBEC γραμμές διατηρήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσου χωρίς ορό (SFM), με L-γλουταμίνη (GIBCO Invitrogen, Paisley, Σκωτία) και συμπληρωμένο με 2,5 μg ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (rEGF), και το εκχύλισμα υπόφυσης 25 μg βοοειδών (GIBCO Invitrogen) .

δείγματα

Πρωτοβάθμια όγκου

Μια σειρά από 37 δείγματα όγκων (14 αδενοκαρκίνωμα και 23 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα) ελήφθησαν από ασθενείς που παρουσιάζουν πρόωρη ΜΜΚΠ σταδίου στο Νοσοκομείο του Αγίου Ιακώβου, του Δουβλίνου. Συμφωνήθηκε φυσιολογικός ιστός ελήφθη εν παραλλήλω για κάθε ασθενή και τα δείγματα αξιολογήθηκαν από έναν παθολόγο αμέσως μετά τον τεμαχισμό.

Αντιδραστήρια

Τριχοστατίνη Α (TSA) αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA, USA ) και διαλύθηκε σε DMSO σε συγκέντρωση 250 mg /mL. Κυτταρικές καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή για μία περίοδο 16 ωρών, σε μια τελική συγκέντρωση 250 ng /mL.

Φαινυλοβουτυρικό (ΡΒ) (τριβουτυρικό ™) ήταν ένα δώρο από Triple Crown America, Perkasie, ΡΑ, USA. Οι κυτταρικές καλλιέργειες υπέστησαν κατεργασία σε μια τελική συγκέντρωση 10 mM για 16 ώρες.

5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (DAC) αγοράστηκε από την Merck (Darmstadt, Γερμανία) και διαλύθηκε σε μεθανόλη. κυτταρικές καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DAC (τελική συγκέντρωση – 1 μΜ). για 48 ώρες με DAC και τα μέσα ενημέρωσης αντικαθίσταται κάθε 24 ώρες

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CXCL8 αγοράστηκε από PromoKine (Promocell GmbH, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) και να ανασυσταθεί σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό.

SB 225002 αγοράστηκε από την Cayman Chemical (Αηη Arbor, ΜΙ, USA) και διαλύθηκε σε DMSO σε μία συγκέντρωση 2,2 μΜ. Οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για μία ώρα πριν από την προσθήκη του CXCL8, σε συγκέντρωση 0.022 μΜ.

Σύνολο RNA απομόνωση και ενίσχυση RT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας TRI reagent® ( Molecular Research Center, Montgomery Road, ΟΗ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πριν από την σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA, 10 μg ολικού RNA προ-επεξεργασία με πέψη με RQ1 DNase (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παρήχθη χρησιμοποιώντας Superscript III (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) και ολίγο dT (20) εκκινητές (MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Οι κυτταρικές γραμμές εξετάστηκαν για η έκφραση του

CXCL1-3

,

CXCL8

,

CXCR1 /2

και

βήτα-ακτίνη

με RT-PCR, χρησιμοποιώντας εκκινητές και θερμοκρασίες ανόπτησης περιγράφεται στον πίνακα 1. Οι συνθήκες των κύκλων PCR αποτελούνταν από -95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 35 κύκλους του 1 min στους 94 ° C, 1 λεπτό σε θερμοκρασία γονίδιο ανόπτησης στόχου και 1 λεπτό στους 72 ° C με μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά.

Η

τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και τα προϊόντα σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. ποσοτικοποίηση των προϊόντων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΤΙΝΑ 2.09c (Raytest, Isotopenmeßgeräte GmbH, Straubenhardt, Γερμανία), το λογισμικό πυκνότητας. Η έκφραση mRNA κανονικοποιήθηκε προς

Βήτα-ακτίνη

ελέγχους, και εκφράστηκε ως αναλογία της έκφρασης mRNA στόχου:.

β-ακτίνης

έκφραση

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (Χ- ChIP)

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση πραγματοποιήθηκε ως εξής: Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη (τελική συγκέντρωση 1%), αιωρήθηκε σε SDS ρυθμιστικό λύσης (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους έως ότου το DNA ήταν κατακερματισμένη σε μήκη μεταξύ 200-1000 bp. Δείγματα αυτού του διατμημένου DNA στη συνέχεια ανοσοκαταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας το μονοήμερες ChIP Kit ™ (Diagenode, Liege, Belgium) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για ανοσοκαθίζηση ήταν ως ακολούθως: τηγάνι ακετυλο-ιστόνης Η3 (Millipore Cat # 06-599), τηγάνι ακετύλιο ιστόνης Η4 (Millipore Cat # 06-598), ακετυλο-ιστόνης Η3 (K9 /14ac) (Diagenode Cat # pAb -ACHBHS-044), ακετυλο-ιστόνης Η3 (K9ac) (Diagenode Cat # pAb-ACHAHS-044), ακετυλο φωσφο – ιστόνης Η3 (K9pS10) (Sigma Cat # H0788), δι μεθυλο-ιστόνης Η3 (K9Me2) (Sigma Cat # D5567), δι μεθυλο της ιστόνης Η3 (K4Me2) (Sigma Cat # D5692) και μεθυλο-ιστόνης Η3 (K4Me) (Sigma Cat # M4819). Ένας έλεγχος δεν αντίσωμα συμπεριλήφθηκε για να ελέγξετε για μη ειδική δέσμευση.

Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των περιοχών προαγωγού του

CXCL8

και

CXCR1 /2 από

ChIP σχεδιάστηκαν από το γνωστή 5 ‘UTRs περιέχεται εντός νουκλεοτιδικές αλληλουχίες τους. συνθήκες ποδηλασίας RT-PCR ήταν οι ίδιες με αυτές που περιγράφονται παραπάνω. Οι εκκινητές και θερμοκρασίες ανόπτησης για ChIP παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Η

ELISA

Η συγκέντρωση των CXCL8 μετρήθηκε σε ρυθμισμένα μέσα χρησιμοποιώντας ένα Συστημάτων DuoSet® ELISA Ανάπτυξης (R & amp? συστήματα D , Minneapolis, MN, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με μία εξαίρεση? το διάλυμα υποστρώματος χρησιμοποιήθηκε έγινε σε φωσφορικό κιτρικό ρυθμιστικό (που περιέχει κιτρικό οξύ και ορθοφωσφορικό δινάτριο υδρογόνο δωδεκαϋδρικό, ρΗ 5,0), 10 mg 1, 2-φαινυλενοδιαμίνη διϋδροχλωρική (OPD) και 18 μΐ 1 MH

2O

2 .

CXCL2 προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανάπτυξης ELISA που αγοράστηκαν από Strathmann Biotec (Αμβούργο, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Κινητά δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας α κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA, BrdU (Roche Diagnostics Ltd., Sussex, UK). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 5 × 10

3 /φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων και τηρούνται όλη την νύκτα. Στη συνέχεια, η πλήρης μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με 100 μι PBS. Ορός εξαντλημένο μέσο (0,5% FBS) προστέθηκε μόνο στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, καθώς αυτό μιμείται πιο στενά τις φυσιολογικές συνθήκες. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24, 48 ή 72 ώρες με ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CXCL8 σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.1-100 ng /mL). Μελέτες αναστολής εκτελέστηκαν με προ-κατεργασία των κυττάρων με 0.022 μΜ SB225002 για 1 ώρα πριν από την προσθήκη του CXCL8. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε αναγνώστη πλακός στα 450 nm με μήκος κύματος αναφοράς ρυθμιστεί σε 690 nm και κενό και χωρίς θεραπεία φρεάτια χρησιμοποιούνται για σκοπούς κανονικοποίησης. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ορίστηκαν ως 100%, και οι θεραπείες CXCL8 αξιολογείται σε σχέση με αυτό.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM (τυπικό σφάλμα του μέσου όρου). Η στατιστική ανάλυση έγινε με το INSTAT (λογισμικό Graphpad, La Jolla, CA, USA) χρησιμοποιώντας μια αντιστοιχισμένη μία ουρά Μαθητή

t-test

. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05

Αποτελέσματα

Η έκφραση του

CXCL1-3

,

CXCL8

και

CXCR1 /2

σε πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα δείγματα όγκων

Για να εκτιμηθεί η έκφραση ενός αριθμού CXC (ELR

+) τα μέλη της οικογένειας σε ένα πάνελ κανονικών /όγκου αντίστοιχα δείγματα ασθενών από το στάδιο Ι και ΙΙ οι ασθενείς, RT- διεξήχθη PCR (Σχήμα 1Α), και συνοψίζεται στο Σχήμα 1Β. Πυκνομετρική ανάλυση της RT-PCR αποκάλυψε μια σημαντική μείωση στην έκφραση του

CXCL1

,

CXCL2

(p & lt? 0,01) και το

CXCR1

υποδοχέα (p & lt? 0,05) σε NSCLC δείγματα όγκου σε σύγκριση με την κανονική (σχήμα 1Γ)

Α) Επίπεδα

CXCL1

-.

3

,

CXCL8

και

CXCR1 /2

εξετάστηκαν με RT-PCR σε ένα πάνελ των γραμμών NSCLC (αδενοκαρκίνωμα (n = 14), καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου (n = 23)) δείγματα ασθενών. Αντιπροσωπευτικά εικόνες πάνω και κάτω ρυθμίζονται δείγματα εμφανίζονται.

επίπεδα βήτα ακτίνης

χρησιμοποιήθηκαν για σκοπούς κανονικοποίησης. Β) Μια περίληψη των αλλαγών στην έκφραση των διαφόρων χημειοκινών CXC (ELR

+) και των υποδοχέων τους σε ένα πάνελ κανονικών αντίστοιχα δείγματα όγκου /ασθενή NSCLC. Γ) Σε γενικές γραμμές πυκνότητας αναλύσεις της κανονικής αντίστοιχα δείγματα όγκου /ασθενών με NSCLC. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς σαν μέση ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (n = 37). (Ν – Κανονική, T – όγκου)

Η

Η έκφραση του

CXCL1-3

,

CXCL8

και

CXCR1 /2

σε ένα. πάνελ κανονικών και καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές

Χρησιμοποιώντας RT-PCR, οι χημειοκίνες εξετάσθηκαν σε ένα πάνελ κανονικών και NSCLC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2). Όλες οι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν εξέφρασαν διάφορα επίπεδα

CXCL1-3

και

CXCL8

, με υψηλότερη βασική έκφραση που παρατηρείται στις γραμμές NSCLC. Ωστόσο, εύρωστη έκφραση αμφοτέρων των υποδοχέων (

CXCR1 /2

) ανιχνεύθηκε στους φυσιολογικούς κυτταρικές γραμμές (HBEC3-5).

Ο πίνακας που περιλαμβάνεται Α549 (αδενοκαρκίνωμα), SKMES-1 (πλακώδους καρκίνωμα), κυτταρικές σειρές Η460, H647 και Η1299 (καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου), BEAS-2Β (SV40 μετασχηματισμένα κανονική bronchoepithelial) και HBEC (κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών αθανατοποιημένα απουσία ιικών ογκοπρωτεϊνών).

Βήτα ακτίνης

περιλαμβάνεται για την επικύρωση της αποτελεσματικότητας φόρτωσης. (M – δείκτης DNA μεγέθους, κη – Αρνητικός μάρτυρας RT-PCR).

Η

Η ακετυλίωση των ιστονών εμπλέκεται στη ρύθμιση του

CXCL8

και

CXCR1 /2

έκφραση

Χρησιμοποιώντας τον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi), Τριχοστατίνη Α (TSA), μια επαγωγή

CXCL8

και

CXCR1 /2

τόσο στην κανονική (HBEC4) και ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (Α549 και SKMES-1), με ταυτόχρονη μείωση σε

CXCL1-3

(SKMES-1, ρ & lt? 0,05) παρατηρήθηκε (Σχήμα 3Α). Η επαγωγή του

CXCL8

ήταν σημαντική σε HBEC4 και SKMES-1 (p & lt? 0.05), όπως ήταν η αύξηση του

CXCR1

και

CXCR2

τόσο στο καρκινικό κύτταρο πνεύμονα γραμμές (Α549 – p & lt? 0,05, SKMES-1 – p & lt? 0,01) και

CXCR1

σε HBEC4 (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3Β). Η επανενεργοποίηση της έκφρασης αυτών των υποδοχέων στις κυτταρικές σειρές NSCLC να δείχνουν ότι αυτά τα γονίδια είναι επιγενετικώς ρυθμίζονται σε επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης. Θεραπεία των κυτταρικών γραμμών με ένα επιπλέον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης, φαινυλοβουτυρικό (ΡΒ), οδήγησε επίσης σε μία επανενεργοποίηση

CXCR1 /2

(δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματα είναι HDACi συγκεκριμένες. Επελέγησαν δύο χημειοκινών, CXCL2 και CXCL8, για τον προσδιορισμό της έκφρασης πρωτεΐνης με ELISA. Η εικόνα που παρατηρείται αντικατοπτρίζεται εκείνη που παρατηρήθηκε στο επίπεδο mRNA σε SKMES-1, με μείωση της CXCL2 και αύξηση των CXCL8 με θεραπεία TSA (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3C). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στα επίπεδα πρωτεΐνης σε είτε Α549 ή HBEC4 μεταξύ βασικών και TSA κατεργασμένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) Το αποτέλεσμα της θεραπείας TSA (250 ng /mL για 16 ώρες) για η έκφραση του

CXCL1

–

3

,

CXCL8

και

CXCR1 /2

. Β) Ανάλυση Πυκνότητας έκφρασης σε κατεργασμένα έναντι μη επεξεργασμένα δείγματα όταν εξομαλύνεται σε

βήτα ακτίνης. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς σαν μέση ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (η = 3). Γ) Η θεραπεία με TSA επηρεάζει επίσης την παραγωγή CXCL2 και CXCL8 σε επίπεδο πρωτεΐνης σε κύτταρα SKMES-1. Οι χημειοκίνες ποσοτικοποιήθηκαν σε ρυθμισμένα μέσα απομακρύνθηκαν από την καλλιέργεια μετά την έκθεση σε TSA (250 ng /mL για 16 ώρες). Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς σαν μέση ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (η = 3). (UT – χωρίς θεραπεία, TSA – Τριχοστατίνη Α).

Η

Κανονισμός του

CXCL8

και

CXCR1 /2

συμβαίνει μέσω της άμεσης αναδιαμόρφωσης χρωματίνης

για να επιβεβαιώσετε ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις για HDACi ήταν λόγω της αυξημένης υπερακετυλίωση της ιστόνης στα υποστηρικτές του

CXCL8

και

CXCR1 /2

γονίδια, θα πραγματοποιηθεί ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (μάρκας) ανάλυση των επιμέρους δικαιούχοι από κύτταρα Α549 που έλαβαν θεραπεία με TSA. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 4, η θεραπεία με τα αποτελέσματα TSA σε αύξηση της ποσότητας του προϊόντος της PCR για

CXCL8

και

CXCR1 /2

υποδεικνύοντας ενισχυμένη υπερακετυλίωση ιστόνης γύρω από τους υποκινητές για τα γονίδια αυτά. Δείχνουμε ότι η λυσίνη 9 και η λυσίνη 14 υπερακετυλιωμένων στην περιοχή αυτή μετά από θεραπεία με TSA. Αυτό το πείραμα σαφώς καταδεικνύει ότι χρωματίνης αναδιαμόρφωση εμπλέκεται άμεσα με την ενεργοποίηση του

CXCL8

(Σχήμα 4Α),

CXCR1

(Σχήμα 4Β) και

CXCR2

(Σχήμα 4C) γονίδιο έκφραση. Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης μια αύξηση στην ιστόνης Η3 λυσίνη 4 τρι-μεθυλίωσης (H3K4me3) στο

υποκινητή CXCR1

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και την φωσφορυλίωση σερίνης 10 (H3K9pS10) στο

CXCL8

υποκινητή. Μια αύξηση στην H3K4 diemethylation (H3K4Me2) ανιχνεύθηκε με ταυτόχρονη μείωση της H3K9 διμεθυλίωση (H3K9Me2) στην περιοχή του υποκινητή. Αυτές οι τροποποιήσεις έχουν συσχετισθεί με την ενεργοποίηση των γονιδίων μεταγραφής και έγκαιρη αντίδραση, αντίστοιχα, και προσθέστε επιπλέον αντοχή στο απόδειξη ότι αυτά τα γονίδια είναι δυναμικά ρυθμίζονται από ιστόνης POS-μεταφραστικές τροποποιήσεις.

Η δοκιμασία ChIP επιδεικνύει ότι η θεραπεία TSA οδηγεί σε μια αύξηση στην ακετυλίωση ιστόνης Η3 και Η4. Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία TSA (250 ng /mL) για μια περίοδο 16 h. Στη συνέχεια, ένας προσδιορισμός ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα? pan ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 (Ac Η3) και H4 (Ac H4), της ιστόνης Η3 ακετυλιωμένη σε λυσίνη 9 και 14 (H3K9 /K14Ac), της ιστόνης Η3 ακετυλιωμένη σε λυσίνη 9 (H3K9Ac), της ιστόνης Η3 ακετυλιωμένη σε λυσίνη 9 και φωσφορυλιωμένη στην σερίνη 10 (H3K9pS10), της ιστόνης Η3 δείκτη dimetylation σε λυσίνη 9 (H3K9Me2), δείκτη dimetylation σε λυσίνη 4 (H3K4Me2) και δείκτη μεθυλίωση σε λυσίνη 4 (H3K4Me). Η κατάσταση της χρωματίνης στην περιοχή του υποκινητή (Α)

CXCL8

, (Β)

CXCR1

και (C)

CXCR2

εμφανίζεται. Input DNA χρησιμεύει ως ένας θετικός έλεγχος που συνιστάται από τον κατασκευαστή (Diagenode). Ένας έλεγχος δεν αντίσωμα συμπεριλήφθηκε για τη δοκιμή για μη ειδική μεταφορά DNA με ιστόνες. (M – σκάλα μέγεθος DNA)

Η

Η μεθυλίωση δεν εμπλέκεται άμεσα στη ρύθμιση της CXC (ELR

+) οικογένεια

Μετά την επεξεργασία των κυττάρων με DNA μεθυλοτρανσφεράσης. αναστολέα (ΕΑΒ), εξετάστηκαν οι επιπτώσεις στην CXC (ELR +) οικογένεια έκφρασης με χρήση RT-PCR (Σχήμα 5). Μια σημαντική μείωση του

CXCL3

(ρ & lt? 0,01) παρατηρήθηκε στο HBEC4 κυτταρική γραμμή και όχι σε οποιαδήποτε κυτταρικές γραμμές NSCLC (Σχήμα 5Β).

CXCL8

έκφραση ήταν σημαντικά προκλήθηκε σε δύο από τις τρεις κυτταρικές γραμμές (HBEC4 /SKMES-1 – p & lt? 0,05, Σχήμα 5Β). Οι δύο υποδοχείς

CXCR1

και

CXCR2

σημαντικά επάγεται από DAC σε HBEC4 (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 5Α, Β). ΕΑΒ αποδείξει την ικανότητά τους να επανενεργοποιήσει

CXCR1

αλλά όχι

CXCR2

έκφραση σε SKMES-1 (p & lt? 0,01) (Εικόνα 5Α, Β). DAC θα μπορούσε να προκαλέσει

CXCR2

αλλά όχι

CXCR1

το Α549 (p & lt? 0,05) (Εικόνα 5Α, Β). Ενώ αυτό τα δεδομένα θα προτείνουν ότι το DNA CpG μεθυλίωση εμπλέκεται με την ρύθμιση της έκφρασης των υποδοχέων CXC και CXCL8, μια αναζήτηση της βιβλιοθήκης γονιδιώματος UCSC (https://genome.ucsc.edu/) αποκάλυψε ένα αραιό αριθμό υπολειμμάτων CpG στο οι περιοχές προαγωγού αυτών των τριών γονιδίων. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε μια αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης αυτής της οικογένειας ίσως οφείλεται σε μια δευτερεύουσα επίδραση που προκαλείται από θεραπεία DAC, όπως η αυξητική ρύθμιση συγκεκριμένων παραγόντων μεταγραφής.

Α) Η επίδραση της 5-αζα- 2’δεοξυκυτιδίνη (ΕΑΒ) θεραπεία για την έκφραση

CXCL1

–

3

,

CXCL8

και

CXCR1 /2

. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 μΜ DAC για 48 ώρες με μέσο και φάρμακο αντικαθίσταται κάθε 24 ώρες. αλλαγές Έκφραση μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR με β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για σκοπούς ποσοτικοποίησης. Β) Ανάλυση Πυκνότητας έκφρασης σε κατεργασμένα έναντι μη επεξεργασμένα δείγματα όταν εξομαλύνεται σε

βήτα ακτίνης. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς σαν μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. (N = 3). (ΕΑΒ – 5-αζα-2’deoxycitidine)

Η

Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός των SKMES-1 μειώνεται με την παρουσία του ανασυνδυασμένου CXCL8, ενώ αυξήθηκε το Α549

Όταν αντιμετωπίζεται με διάφορα. Οι συγκεντρώσεις του ανασυνδυασμένου CXCL8 (0.1-100 ng /mL) για μια περίοδο 24-72 h, υπήρχε μια τάση για μείωση του πολλαπλασιασμού στην κυτταρική γραμμή HBEC σε σχέση με μη επεξεργασμένο έλεγχο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). θεραπεία CXCL8 (100 ng /mL και 10 ng /mL) προκάλεσε μια αύξηση στον πολλαπλασιασμό του Α549 κυτταρική γραμμή (ρ & lt? 0.01-100 ng /mL, ρ & lt? 0.05-10 ng /mL) σε μόνο 72 ώρες μετά την αγωγή (Εικόνα 6Α). Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία σε SKMES-1 (Σχήμα 6Β) σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (ρ & lt? 0,01, 100 ng /mL και 10 ng /mL? Ρ & lt? 0,05 1 ng /mL και 10 ng /mL), αλλά όχι σε οποιοδήποτε άλλο χρονικό σημείο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να προσδιοριστεί εάν η πολλαπλασιαστική επίδραση στις δύο αυτές κυτταρικές γραμμές ήταν ειδικά λόγω της θεραπείας CXCL8, μια προσέγγιση CXCR2 εξουδετέρωσης αναλήφθηκε. Οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε αγωγή με SB 225002 σε προγενέστερα δημοσιευθείσες IC

50 αξίας 22 ηΜ [33] για μία ώρα πριν από την προσθήκη του CXCL8 στα 100 ng /mL για 72 ώρες (Α549) και 24 ώρες (SKMES-1 ) (Σχήμα 6C). Ο αποκλεισμός του υποδοχέα CXCR2 αναιρεί την πολλαπλασιαστική επίδραση τόσο Α549 και κυτταρικές γραμμές SKMES-1 σε σύγκριση με τη θεραπεία CXCL8 μόνη της.

πολλαπλασιασμός Α) Cell εξετάσθηκε με ανίχνευση BrdU εξής 24-72 θεραπεία h με CXCL8 σε Α549 ( 72 ώρες μετά την αγωγή) και κυτταρικές γραμμές SKMES-1 (24 ώρες μετά τη θεραπεία). Μόνο ο χρόνος σημεία με σημαντική δεδομένα εμφανίζονται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου (UT), η οποία ορίστηκε σε 100% και εκφράζεται ως μέση ± SEM. (N = 3) (ε ρ & lt? 0,01 – CXCL8 θεραπεία

vs

UT, ψ ρ & lt?.. 0.05 – CXCL8 θεραπεία

vs

UT) Β) Οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έναν εκλεκτικό CXCR2 ανταγωνιστή (0.022μM) για 1 ώρα πριν από την προσθήκη του CXCL8 και καλλιεργήθηκαν για περίοδο 24 (SKMES-1) ή 72 ώρες (Α549). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου (UT), η οποία ορίστηκε σε 100% και εκφράζεται ως μέση ± SEM. (N = 3).

Η

Συζήτηση

Η οικογένεια χημειοκινών CXC (ELR

+), ένας ισχυρός pro-αγγειογενετική οικογένεια, βρέθηκε να ρυθμίζεται επιγενετικώς τόσο NSCLC και φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές στο επίπεδο τόσο των ιστονών μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις.

σε ένα πάνελ κανονικών /όγκου αντίστοιχα δείγματα, τα χημειοκίνες και οι υποδοχείς εμφανίζονται καθόλου αλλαγμένη μορφή εκφράσεως μεταξύ αδενοκαρκινώματος και δείγματα πλακώδες καρκίνωμα, με την εξαίρεση του

CXCL3

(μέση τιμή αυξημένα σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και μειωμένη σε αδενοκαρκίνωμα). έχουν υψηλότερα επίπεδα CXCL8 ανακαλυφθεί από IHC σε δείγματα ιστού καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με την κανονική [34], και τα επίπεδα μας δείγματα

CXCL8

mRNA ήταν αυξημένα σε 37,8% (14/37) των δειγμάτων. Αν και οι συνολικές μέσες τιμές πυκνομετρία (αδενοκαρκίνωμα n = 14 και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων n = 23) δείχνουν μια μείωση των χημειοκινών στα δείγματα όγκου (Σχήμα 1 C), αυτό δεν ήταν αλήθεια για κάθε μεμονωμένο δείγμα (Σχήμα 1 Α). Λόγω της ετερογένειας των δειγμάτων, είναι δύσκολο να κάνει ένα οριστικό συμπέρασμα με βάση αυτά τα αποτελέσματα. Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι η έκφραση πολλών από τις χημειοκινών ήταν πιο συχνά βρέθηκε να μειωτικά στους όγκους NSCLC ως εξής

CXCL1

(64,9%, p & lt? 0.01),

CXCL2

( 81,1%, p & lt? 0.01),

CXCL3

(59,5%) (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, τα επίπεδα του

CXCR1

βρέθηκαν επίσης να μειωθεί σημαντικά σε όγκους NSCLC (35,2%, p & lt? 0,05).

Σε ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών NSCLC αγωγή με HDACi υπήρχε μειωθεί σε

CXCL1-3

με ταυτόχρονη αύξηση του

CXCL8

και οι υποδοχείς

CXCR1

και

2

(Εικόνα 3Β). TSA έχει προηγουμένως δειχθεί ότι ρυθμίζουν CXCL8 σε πνεύμονα [35] και κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [36]. Η επανενεργοποίηση αυτών των υποδοχέων στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα καταδεικνύει ότι είναι υπό επιγενετική ρύθμιση στο επίπεδο της τροποποίησης ιστόνης. Η γενική δόγμα που σχετίζεται με HDACi είναι ότι λειτουργούν για να επάγουν έκφραση γονιδίου. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, TSA προκάλεσε τόσο μια ανερχόμενη και κατάντη ρύθμιση των χημειοκινών, ένα αποτέλεσμα βλέπουν οι άλλοι σε άλλες μελέτες. Για παράδειγμα, HDACi έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω γονίδιο όγκου Wilms 1 (Wt1) [37] και EGFR [38]. Περιορισμένη διαθεσιμότητα συγκεκριμένων παραγόντων μεταγραφής μπορεί να οδηγήσει μόνο σε έναν ορισμένο αριθμό ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια. Ως εκ τούτου την ενεργοποίηση του

CXCL8

μπορεί να οδηγήσει στη ρύθμιση κάτω για να

CXCL1-3

, είτε μέσω ενός μοριακός διακόπτης ή μέσω της τιτλοδότησης των μεταγραφικών παραγόντων μακριά από τις περιοχές προαγωγού αυτών των γονιδίων. αποτελέσματα ChIP δείχνουν ότι TSA δρα άμεσα αναδιαμόρφωση της περιοχής του υποκινητή του

CXCL8

και

CXCR1 /2

γονίδια (Σχήμα 4). Αποτελέσματα ChIP μας δείχνουν ότι ιστόνες Η3 και Η4 γίνει υπερακετυλιωμένων σε αυτές τις υποκινητές γονιδίων, που περιλαμβάνουν λυσίνες 9 και 14 της ιστόνης Η3, και λυσίνες 5, 8, 12 και 16 της ιστόνης Η4. Παρατηρούμε μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα των ιστονών H3 λυσίνη 4 διμεθυλίωση (H3K4me2) μετά την ενεργοποίηση της μεταγραφής μέσω HDACi, και επίσης παρατηρούμε μια απώλεια της ιστόνης λυσίνης 4 μονομεθύλωσης (H3K4me), μετά την ενεργοποίηση της CXCL8 /CXCR1 /CXCR2. Σε συμφωνία με την τρέχουσα βιβλιογραφία, παρατηρούμε την παρουσία ενός καταπιεστικού σήμα H3K9Me2 στον υποκινητή ΠΓΕ πριν από την ενεργοποίηση μέσω HDACi, και τα επίπεδα αυτής της μείωσης τροποποίηση των ιστονών μετά την ενεργοποίηση [39], [40]. Αυτά τα αποτελέσματα επαληθεύουν ότι HDACi προκαλεί προκαλεί αναδιαμόρφωσης χρωματίνης μέσω ιστόνης μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις γύρω από την περιοχή του υποκινητή των γονιδίων που εξετάστηκαν δείχνει ότι είναι ενεργό στοιχείο στη ρύθμιση αυτών των χημειοκινών και των υποδοχέων τους.

DNA CpG μεθυλίωση είναι επίσης ένα σημαντικό συστατικό σε επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Υπερμεθυλιωμένο DNA βρίσκεται συχνά στις περιοχές υποκινητή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε καρκίνους, ιδιαίτερα στον καρκίνο του πνεύμονα [30]. Θεραπείες με την DNMTi DAC επανενεργοποιηθεί την έκφραση του

CXCR1

στο Α549 (Σχήμα 5Β) κυτταρική γραμμή και

CXCR2

σε SKMES-1 (Σχήμα 5Β).