Αφηρημένο

Η παραγωγή των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) για την αποικοδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας είναι ένα ζωτικής σημασίας βήμα για την μετάσταση του καρκίνου. Ερευνήσαμε τα αποτελέσματα των ογκοπρωτεϊνών HPV16 (16E6, 16E6 * Ι και 16Ε7), είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό, για την μεταγραφή του 7

MMP

s εμπλέκονται στην αυχενική εισβολής του καρκίνου. Τα επίπεδα του 7

MMPs

αναφερθεί να αυξηθεί σε καρκίνο του τραχήλου προσδιορίστηκαν σε C33A σταθερώς εκφράζουν διαφορετικά ογκοπρωτεΐνες HPV16 χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR και συγκρίθηκε με την ικανότητα εισβολής των κυτταρικών σειρών χρησιμοποιώντας το

in vitro

εισβολή και επούλωσης πληγών δοκιμασίες. Η υπερέκφραση του

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

ανιχνεύθηκε σε HPV16E6E7 κύτταρα που εκφράζουν το οποίο συσχετίζεται με αυξημένη εισβολή των κυττάρων. Συνδυασμός HPV ογκοπρωτεϊνών έδειξε πάντα μεγαλύτερη επιπτώσεις από την ατομική της μορφή. Η αναστολή της κυτταρικής εισβολής με χρήση ειδικού αναστολέα των ΜΜΡ-2, η ΟΑ-Hy, και αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ αντίσωμα επιβεβαίωσε ότι εισβολή σε αυτά τα κύτταρα ήταν εξαρτώμενη τόσο από ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-ΜΤ1 έκφρασης. Η εξάντληση των HPV16E6E7 με shRNA μεσολάβηση πειράματα knock-down οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα έκφρασης ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-ΜΤ1 καθώς και μειωμένη ικανότητα εισβολής η οποία πρότεινε έντονα ειδικές επιδράσεις του HPV ογκοπρωτεϊνών σε αμφότερες τις MMPs και στην κυτταρική εισβολή. μελέτη ανοσοϊστοχημείας σε επεμβατικές καρκίνων του τραχήλου επιβεβαίωσε την ενισχυμένη

in vivo

έκφραση αυτών των δύο ΜΜΡ στα κύτταρα HPV16 μολυσμένα. Επιπλέον, πιθανές θέσεις που απαιτούνται από HPV16E6E7 στο

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

υποστηρικτές ερευνήθηκαν και PEA3 (σε -552 /-540 για

MMP-2

, -303 για

ΜΤ1-ΜΜΡ

) και Sp1 (στο -91 για

MMP-2,

-102 για

ΜΤ1-ΜΜΡ

) θέσεις πρόσδεσης έδειξαν να είναι ουσιώδης για τη διαμεσολάβηση μετενεργοποίηση δραστηριότητά τους. Συμπερασματικά, η μελέτη μας έδειξε ότι HPV16E6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών συνεργάζονται για την προώθηση του τραχήλου της μήτρας εισβολής του καρκίνου από ειδικά προς τα πάνω ρύθμιση

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

μεταγραφή με παρόμοιο τρόπο.

Παράθεση: Kaewprag J, Umnajvijit W, Ngamkham J, Ponglikitmongkol Μ (2013) HPV16 ογκοπρωτεΐνες Προώθηση του τραχήλου της μήτρας Καρκίνος ικανότητα εισβολής από πάνω ρύθμιση Ειδικοί Matrix μεταλλοπρωτεϊνασών. PLoS ONE 8 (8): e71611. doi: 10.1371 /journal.pone.0071611

Επιμέλεια: Νίκος Κ Καραμάνος, Πανεπιστήμιο Πατρών, Ελλάδα |

Ελήφθη: 28 του Φλεβάρη 2013? Δεκτές: 1 Ιουλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 του Αύγ 2013

Copyright: © 2013 Kaewprag et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα εργασία υποστηρίχθηκε από Σχολή Θετικών Επιστημών και του Προγράμματος Ιατρικής μελετητές του Πανεπιστημίου Mahidol, την Ταϊλάνδη και το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας της Ταϊλάνδης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η επίμονη μόλυνση με ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HPVs) είναι η κύρια αιτία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, η οποία είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες της Ταϊλάνδης [1]. HPV16 ανιχνεύεται συχνότερα και αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 50% του τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων καρκίνου παγκοσμίως [2]. Carcinogenesis λόγω HPV16 αποδίδεται στις ιικές ογκοπρωτεΐνες, Ε6 και Ε7, μέσω της αλληλεπίδρασής τους με τον οικοδεσπότη κυτταρικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου με αποτέλεσμα το μετασχηματισμό των κυττάρων και αθανατοποίηση [3]. HPV16E7 (16Ε7) δεσμεύεται με την πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου pRb, η οποία στη συνέχεια υποβάλλεται σε διάσπαση μέσω μιας διαδικασίας πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση [4], ενώ HPV16E6 (16E6) αλληλεπιδρά με και διεγείρει πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμησης της ρ53 [5]. Αμφότερες οι ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 είναι επίσης σε θέση να ρυθμίζουν τη μεταγραφή αρκετών γονιδίων του ξενιστή. Παραδείγματα περιλαμβάνουν το 16E6-εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση της καταλυτικής υπομονάδας της ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (

hTERT

) και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β (

ΤΟΡβ

γονιδίων μέσω ειδικής θέσεις δέσμευσης Sp1 [6], [7 ] και αυξημένη έκφραση του DEK πρωτο-ογκογονιδίου, το οποίο κωδικοποιεί ένα αναστολέα γήρανση, με Ε7 μέσω μίας οδού που εξαρτάται οικογένεια pRb πρωτεΐνη [8]. Εκτός από την παραγωγή πλήρους μήκους Ε6 (16E6F), HPV16 παράγει επίσης μία κολοβωμένη μορφή του Ε6 (16E6 * Ι), το οποίο προωθεί την υποβάθμιση Dlg πρωτεΐνη [9] και διενεργοποίησης του γονιδίου Aldo-κετο αναγωγάσης [10].

ο ρόλος των πρωτεϊνών του ιού στις εισβολής όγκου παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σε μια μελέτη που αποδεικνύει στην κυτταρική σειρά ηπατώματος η ικανότητα του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) X πρωτεΐνης να επάγει την έκφραση του μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας ΜΜΡ-2 και ΜΤ1-ΜΜΡ (ΜΜΡ-14), μέσω ενός Cox 2-εξαρτώμενος μηχανισμός [11]. MMPs ανήκουν σε μια οικογένεια πρωτεασών ψευδαργύρου υπεύθυνα για αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας που απαιτείται για τη μετανάστευση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [12]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει σύνδεση μεταξύ της παρουσίας των MMPs και HPV σε καρκίνο του τραχήλου [13], [14]. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης ενός αριθμού των ΜΜΡ (ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-7, ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-10, ΜΜΡ-11, ΜΜΡ-12, ΜΜΡ-13, ΜΤ1-ΜΜΡ και ΜΜΡ -15) έχουν αναφερθεί σε επεμβατικές καρκινώματα του τραχήλου σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς [15] – [17]. Ωστόσο, ένας συσχετισμός μεταξύ του HPV ογκοπρωτεΐνες και MMP τύπους παραμένει αμφιλεγόμενη. Smola-Ες

et al

. έδειξαν ότι τα κερατινοκύτταρα τα οποία μετασχηματίστηκαν από HPV16 και HPV8 επαγόμενη έκφραση του ΜΤ1-ΜΜΡ [14]. Σε μια πιο πρόσφατη μελέτη, η αυξημένη έκφραση HPV16E7 δείχθηκε να συνδέσει με μια αύξηση σε pro-9-ΜΜΡ δραστικότητα σε οργανοτυπική καλλιέργεια κερατινοκυττάρων ωστόσο, HPV16E6 /Ε7 δεν είχε επίδραση στην ΜΜΡ-2, -9 και ΜΤ1-ΜΜΡ επίπεδα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ακροποσθίας [18]. Παρά το γεγονός ότι έχει παρατηρηθεί η υπερέκφραση του διάφορους τύπους ΜΜΡ σε καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας, αυξήθηκε μόνο επίπεδα ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αποδείχθηκε ότι συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς [16]. Επιπλέον, μια σχέση μεταξύ

ΜΜΡ-2

επίπεδα mRNA και διεισδυτικότητα του καρκίνου του τραχήλου έχει αποδειχθεί [19]. Η ενεργοποίηση των δύο ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-ΜΤ1 βρέθηκε σε πλακώδη καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας [16] και την παραγωγή της δραστικής μορφής της ΜΜΡ-2 δείχθηκε να απαιτούν ενεργοποίηση από ΜΤ1-ΜΜΡ [20]. Η απαίτηση αυτή υποστηρίζεται από την απόδειξη ότι ΜΤ1-ΜΜΡ είναι ικανή διάσπασης ΜΜΡ-2 για να σχηματιστεί ένα προ-ΜΜΡ-2 /ΜΤ1-ΜΜΡ σύμπλοκο /ΤΙΜΡ-2, το οποίο ενισχύει τη συγκέντρωση του δραστικού ΜΜΡ-2 στην αιχμή του εισβάλλοντας καρκινικά κύτταρα [21]. Αν και ένας αριθμός των MMPs έχουν επικαλυπτόμενες δραστικότητα σε μια παρόμοια ομάδα υποστρωμάτων, ρύθμιση των επιπέδων έκφρασής τους φαίνεται να ρυθμίζεται ανεξάρτητα.

MMP-2

εκφράζεται συστατικά σε πολλούς τύπους κυττάρων, ενώ οι κυτοκίνες ρυθμίζουν

MMP-9

μεταγραφής [22] και τον κανονισμό του

ΜΤ1-ΜΜΡ

(συστατική ή επαγόμενη ) παραμένει ασαφής [14].

στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε την ικανότητα των ογκοπρωτεϊνών από HPV16 υψηλού κινδύνου και HPV18 σε μεταγραφικά ρύθμιση 7 τύπους του

MMP

s

(MMP- 1, -2, -7, -9, -10, -11

και

ΜΤ1-ΜΜΡ)

και να συσχετίζονται έκφραση ΜΜΡ με κυτταρική εισβολή σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα που ελήφθησαν από βιοψίες καρκίνου του τραχήλου επεμβατική στάδιο. Έχουμε σκεφτεί ότι HPV ογκοπρωτεΐνες υψηλού κινδύνου απορυθμίζεται συγκεκριμένων τύπων των ΜΜΡ σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα στο μεταγραφικό επίπεδο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Δείγματα ανθρώπινου ιστού που χρησιμοποιείται σε Η μελέτη αυτή ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς ή τους συγγενείς τους. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου, Ταϊλάνδη (ΕΚ 236/2011).

πλασμίδιο κατασκευάζει και σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών γραμμών

HeLa, SiHa, Caski (ευγενική παραχώρηση από την P . Chambon, IGBMC, Γαλλία) και C33A (ATCC: ΗΤΒ-31) του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές και μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά εμβρυϊκού νεφρού 293Τ (ευγενώς από τον Ρ Angeletti, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Lincoln, ΗΠΑ) διατηρήθηκαν στους 37 ° C κάτω από μια ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη κοκτέιλ (GIBCO, Invitrogen). HPV16 ογκογονιδίου cDNAs, δηλαδή, 16E6 (που περιέχει τόσο 16E6 * I και 16E6F), 16E6 * Ι, 16Ε7, 16E6E7 (τόσο 16E6 και 16Ε7) και 16E6 * IE7 (τόσο 16E6 * I και 16Ε7) παρασκευάσθηκαν από κύτταρα SiHa και cDNA του HPV18E6E7 (τόσο 18E6 και 18E7) ​​παρασκευάσθηκαν από κύτταρα HeLa. Όλα τα cDNA εισήχθησαν εντός του φορέα pcDNA3, και τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά C33A HPV πρωτεΐνες παράχθηκαν και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Δύο σύντομες φουρκέτα (sh) κατασκευάσματα RNA (shE6A και shE6B) που περιέχει συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάζονται για φίμωση HPV16E6 mRNA [23] και μη-στόχευση αρνητικός έλεγχος shRNA (shCtrl) κλωνοποιήθηκαν εντός pSUPER.retro.puro (OligoEngine). κατασκευάσματα υποστηρικτής δημιουργήθηκαν με ενίσχυση DNA αλληλουχίες -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 και -211 /+ 40 του

ΜΜΡ-2

υποκινητή και -1277 /+ 187, -425 /+ 187 και -151 /+ 187 του

ΜΤ1-ΜΜΡ

υποκινητής από κύτταρα C33A και εισήχθη στο πλασμίδιο pGL3-Basic (Promega). Οι ακόλουθοι εκκινητές? -1721 /+ 40

MMP-2

πρόσθιο εκκινητή 5 ‘GAGTGCTCGAGGATCAGGCTGAAGGGCCTGG 3’, -1001 /+ 40

MMP-2

πρόσθιο εκκινητή 5 ‘GAGTGCTCGAGGAATTCGTGGAACTGAGGG 3’, -211 /+ 40 MMP -2 προς τα εμπρός εκκινητή 5 ‘GAGTGCTCGAGCGAGAGAGGCAAGTGGGG 3’,

MMP-2

αντίστροφος εκκινητής 5 ‘CCTGAAAGCTTCTGGATGCAGCGGAAACAA 3’, -1277 /+ 187

ΜΤ1-ΜΜΡ

πρόσθιο εκκινητή 5 ‘CACCTCGAGGGAGGCTCCACAGGACCTGAAA 3’, – 425 /+ 187

ΜΤ1-ΜΜΡ

πρόσθιο εκκινητή 5 ‘CCACTCGAGTCCCACACTCTGAGCTCCTCGTT 3’, -151 /+ 187

ΜΤ1-ΜΜΡ

πρόσθιο εκκινητή 5 ‘TTGCTCGAGGGCTAAAACAACCACGTCCCCA 3 »και

ΜΤ1-ΜΜΡ

αντίστροφο εκκινητή 5 ‘CCGGGAAGCTTGGGCACTGTGGGCTCCGC 3’ χρησιμοποιήθηκαν.

αντίστροφης μεταγραφής (RT) -PCR και ποσοτική PCR (qPCR)

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα με το κιτ Illustra ™ RNAspin Mini (GE Healthcare) και χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για τη σύνθεση cDNA που απασχολούν SuperScript®III RNaseH

Kit -RT (Invitrogen). qPCR διεξήχθη με τη χρήση του συστήματος Stratagene Mx3000P qPCR (Agilent Technologies) μαζί με RBC ThermOne® Real-Time Προμίγματα (SYBR Green). Θερμοκυκλώσεως συνθήκες τόσο για qPCR και RT-PCR ήταν ως εξής: 10 λεπτά στους 95 ° C? (40 κύκλοι για RT-PCR), 30 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, 30 sec στους 60 ° C και 30 sec 72 ° C. Προσδιορισμός της υποξανθίνης-γουανίνης (

HPRT

) έκφραση γονιδίων housekeeping συμπεριελήφθη σε κάθε πείραμα για να διορθώσει για τις παραλλαγές στις συγκεντρώσεις πρότυπο. Οι ποσότητες των αμπλικονίων PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Gel Doc 2000 και Ποσότητα Ένα πακέτο λογισμικού (Bio-Rad). Οι ομάδες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για ενίσχυση του HPV16E6 /Ε7,

ΜΜΡ

,

ΤΙΜΡ-2

και εσωτερικού ελέγχου

HPRT

cDNAs έχουν περιγραφεί προηγουμένως [10], [24] , [25]. Σχετική έκφραση παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± S.E.M από τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν.

ζυμογραφία ζελατίνης

δραστικότητα ζελατινάσης της ΜΜΡ-2 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. C33A σταθερώς εκφράζουν διαφορετικά ογκοπρωτεϊνών επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 48 ώρες πριν από την ανάλυση. Αφού συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας ένα Ultra-0,5 φυγοκεντρική συσκευή φίλτρου Amicon® (Millipore), ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης στο εξαντλημένο μέσο από κάθε κυτταρική γραμμή αναμίχθηκε με μη-αναγωγικό ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (2% SDS, 10% γλυκερόλη, 62,5 mM Tris -ΗΟΙ ρΗ 6.8 και 0.01% κυανό βρωμοφαινόλης) και τρέχουν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου που περιείχε 7,5% 1 mg /ml ζελατίνη (Sigma). Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα αναδιατάχθηκε με έκπλυση με 2.5% Triton Χ-100 δύο φορές για 30 λεπτά. Οι σαφείς ζώνες υδρολυμένου υποστρώματος αναπτύχθηκαν με επώαση σε αναπτυσσόμενες ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris-HCl ρΗ 8.0, 10 mM ΟαΟ

2, 1 μΜ ΖηΟΙ

2, 0,02% NaN

3 και 1% Triton Χ -100) στους 37 ° C για 18 ώρες και χρωματίσθηκαν με 0,025% (w /v) Coomassie blue R250 για 1 ώρα. Η ζελατινολυτική δραστικότητα της ΜΜΡ ζωνών ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση (Quantity One πρόγραμμα, σύστημα Gel Doc 2000, Bio-Rad, USA) και παρουσιάζονται ως πολλαπλάσια αύξηση των συνολικών ΜΜΡ-2 (προ-ΜΜΡ-2 (72 kD) και η ενεργός ΜΜΡ-2 (68 κϋ)) σε σύγκριση με τα κύτταρα pcDNA3 ελέγχου στις 48 ώρες.

In vitro

Invasion Δοκιμασία

In vitro δοκιμασίες

εισβολή διεξήχθησαν σε ένα θάλαμο Transwell επικαλυμμένο στην άνω θάλαμο με 30 μg του Matrigel® (BD Bioscience). Τα κύτταρα (2 χ 10

5) σε μέσο χωρίς ορό σπάρθηκαν πάνω στον άνω θάλαμο και DMEM που περιείχε 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Για δοκιμασίες αναστολής, τα κύτταρα (10

4 για SiHa και 5 × 10

4 για 16E6E7) υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις (0, 2, 5, 10 ή 20 μΜ) του αναστολέα ΜΜΡ-2,

cis

9-δεκαοκτενοϋλίου-Ν-υδροξυλαμίνης? OA-Hy (Calbiochem), ή με 20 μg /ml αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ αντίσωμα (ab78738, Abcam) στον άνω θάλαμο με 1% FBS για SiHa και 2% FBS για 16E6E7 στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από επώαση για 24 ώρες (ή 12 ώρες στους προσδιορισμούς αναστολής) για 16E6E7 και 12 ώρες (ή 7 ώρες στους προσδιορισμούς αναστολής) για SiHa, κυττάρων στον κατώτερο θάλαμο μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. δραστικότητα διήθηση προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που εισέβαλαν σε πέντε τυχαία πεδία και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από χρώση κυττάρων σε σχέση με τους ελέγχους, όχημα ή μη στόχευσης shRNA πλασμιδίου ή μη επεξεργασμένα κύτταρα.

πληγών επούλωση Δοκιμασία

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι τη συρροή και μια τεχνητή πληγή δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας P-200 ρύγχος πιπέτας. DMEM που περιείχε 100 μα Matrigel® (BD Bioscience) προστέθηκε σε κύτταρα και αφήνεται να πολυμεριστεί για 15 λεπτά. Οι αριθμοί των κυττάρων που μεταναστεύουν εντός της περιοχής γρατζουνιστεί μετρήθηκαν σε 0 και 48 ώρες μετά την επώαση και αναφέρονται ως επί τοις εκατό κυττάρων στην γδαρμένο περιοχή σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία Δραστηριότητα

C33A κύτταρα που εκφράζουν HPV16E6E7 επιμολύνθηκαν παροδικά με pGL3-βασικό φορέα λουσιφεράσης κατασκευάσματα που περιέχουν

ΜΜΡ-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

προαγωγούς όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα επιμολυσμένα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για την δραστηριότητα λουσιφεράσης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10].

Ανάλυση Western Blot

κύτταρα C33A που εκφράζουν ογκοπρωτεΐνες HPV16 λύθηκαν σε Αντιδραστήριο Λύσης-Μ, EDTA-free, με πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά από αποκλεισμό με 10% μη λιπαρό ξηρό γάλα σε PBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology στο 1:5,000), ποντικού αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ (ab78738, Abcam στο 1:1,500 ), αντι-ΤΙΜΡ-2 ποντικού (ab1828, Abcam στο 1:1,000) ή ποντικού αντι-GAPDH (SC-166574, Santa Cruz Biotechnology στο 1:2,000) αντισωμάτων σε 4 ° C όλη τη νύκτα και ακολούθησε επώαση με ένα δευτερεύον ΗΡνΡ- συζευγμένο προβάτου αντι-ποντικού IgG (GE Healthcare) (1:3,000) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL Pierce (Thermo Scientific), με GAPDH ως μάρτυρας φόρτωσης. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πυκνομετρία (ένα πρόγραμμα, σύστημα Ποσότητα Gel Doc 2000, Bio-Rad) και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πολλαπλάσια αύξηση των πρωτεϊνών (τόσο θετικών και ώριμες μορφές) σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος μετά από κανονικοποίηση έναντι GAPDH.

φθορισμού Ανοσοϊστοχημεία

Όλα κλινική έρευνα έχει διεξαχθεί σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι και της ορθής κλινικής πρακτικής. τμήματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από 26 επεμβατική τραχηλικά καρκινώματα, τρία τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (μία κάθε ένα από CIN 1, CIN 2 και CIN 3), και ένας αδενομύωση ελήφθησαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI), Ταϊλάνδη. Όλοι οι ιστοί αναλύθηκαν από παθολόγους NCI και να καθίστανται ανώνυμα πριν από την υποβολή της μελέτης. Αντιγόνα ανακτήθηκαν με μικροκύματα των δειγμάτων σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (10 mM Tris βάση ρΗ 9,0, 1 mM EDTA, 0,05% Triton Χ-100) επί 5 λεπτά και η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης ανεστάλη με αγωγή με 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά. Φθορισμού ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με επώαση 4 ° C όλη τη νύκτα με αντι-ΜΜΡ-2 και αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ μονοκλωνικά αντισώματα πρωτογενή ποντικού (42-5D11 και 114-6G6 αντίστοιχα? Chemicon) σε αραίωση 1:100 που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή Alexa Fluro αντίσωμα αντι-ποντικού IgG 647-επισημασμένο κατσίκα (1:400 αραίωση? Invitrogen). Hoechst 33258 (1:1,000 αραίωση? Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την πυρηνική χρώση. Οι τομές τοποθετείται με VECTASHIELD® μέσο αντι-ξεθωριάσματος (Vector Laboratories) και τα σήματα φθορισμού μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο της Olympus FV1000 εξοπλισμένο με λογισμικό ImageJ. MMP-2 και ΜΤ1-ΜΜΡ έκφραση βαθμολογήθηκαν ως θετικά ή αρνητικά μετά την αφαίρεση με την έναρξη ελέγχους χωρίς πρωτοβάθμια επεξεργασία αντίσωμα δίνοντας τον αριθμό των χρωματισμένων κυττάρων των ≥1% ή 0% αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της HPV και HPV ογκοπρωτεϊνών στο

ΜΜΡ

Έκφραση και εισβολή ικανότητα

εισβολή ικανότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που φιλοξενούν γονιδιώματος HPV (SiHa με HPV16, HPV16 Caski με και HeLa με HPV18) συγκρίθηκαν με C33A και 293Τ κύτταρα HPV-αρνητικό. Όλα τα HPV-θετικές κυτταρικές σειρές που εμφανίζεται σαφώς την ικανότητα να εισβάλλουν, ενώ διεισδυτικότητα του HPV-αρνητικές κυτταρικές γραμμές ήταν ελάχιστη (Εικ. 1Α). Υψηλότερες ικανότητα εισβολής παρετηρήθη με SiHa (5000 κύτταρα) και HeLa (11,000 κύτταρα) σε σύγκριση με τα κύτταρα Caski (2500 κύτταρα) (Σχ. 1Α). Τα επίπεδα έκφρασης μετράται χρησιμοποιώντας qPCR του 7

ΜΜΡ

s (

ΜΜΡ-1, -2, -7, -9, -10, -11

και

ΜΤ1-ΜΜΡ)

σε αυτές τις πέντε κυτταρικές σειρές έδειξαν συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του HPV και την αύξηση του

MMP

μεταγραφές μόνο του

MMP-2

,

-7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

(Εικ. 1Β). Προς τα πάνω ρύθμιση

ΜΜΡ-2

έκφραση ήταν ιδιαίτερα ανιχνεύθηκε σε δύο HPV 16 και HPV 18-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με HPV-αρνητικά κύτταρα, με την υψηλότερη δραστικότητα σε HPV 18-θετικά κύτταρα HeLa.

ΜΜΡ-7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

επίπεδα μεταγραφής αυξήθηκαν σημαντικά σε HPV16-θετικά SiHa και Caski κύτταρα, αλλά μόνο ελαφρώς αυξημένα σε κύτταρα HeLa (Σχ. 1Β). Ωστόσο, δεν υπήρχαν ανύψωση του

ΜΜΡ-10

και

-11

μεταγραφές σε οποιεσδήποτε HPV-θετικά κύτταρα (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του

MMP-2

,

-7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

είναι πιο πιθανό να συμβεί σε κύτταρα που φέρουν τον HPV, ιδιαίτερα HPV16.

(Α) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της εισβολής χρησιμοποιώντας μετανάστευσης μέσω φίλτρων επικαλυμμένα με Matrigel για HPV θετικά (SiHa, Caski και HeLa) και αρνητικό (C33A και 293Τ) κύτταρα που παρουσιάζουν ως αριθμοί της εισβολής κυττάρων. (Β) Σχετική έκφραση

MMP-1

,

-2

,

-7

,

-9

,

-10

,

-11

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

μετριέται σε κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας qPCR. Δεδομένα ομαλοποιήθηκε με C33A. *:

σ

-τιμή & lt? 0,05 σε σχέση με C33A. (C) Σχετική έκφραση

MMP-2, -7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

στα κύτταρα C33A σταθερώς εκφράζουν διαφορετικές HPV16 (

16E6, 16E6F, 16E6 * Ι, 16Ε7, 16E6E7

,

16E6 * IE7

), HPV18

(18E6E7)

και χαμηλού κινδύνου HPV6

(6E6)

ογκοπρωτεΐνες, όπως μετράται με qPCR και κανονικοποιούνται σε pcDNA3. *

σ

-τιμή & lt? 0,05 σε σύγκριση με pcDNA3 κύτταρα που εκφράζουν. (D) Το επίπεδο του HPV μεταγραφές σε σύγκριση με τον μάρτυρα, HPRT, σε κάθε κυτταρική σειρά όπως φαίνεται από RT-PCR. (Ε) δραστηριότητα αποικοδόμησης P53 του 16E6, 16Ε7 και 16E6E7 συγκρίθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ υψηλή έκφραση του

MMP-2, -7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

και HPV ογκοπρωτεΐνες, qPCR χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της

MMP

επίπεδα μεταγραφής στα κύτταρα C33A που εκφράζουν σταθερά 16E6, 16E6F, 16E6 * Ι, 16Ε7, 16E6E7, 16E6 * IE7, 18E6E7 και (χαμηλού κινδύνου) HPV6E6. 16E6F, 16E6 * I και 16Ε7 ήταν σε θέση να επάγει μια αύξηση σε ποσοστό

ΜΜΡ-2

,

ΜΤ1-ΜΜΡ

αλλά όχι

ΜΜΡ-7

μεταγραφές, σε σύγκριση με pcDNA3- επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 1 C). κύτταρα C33A εκφράζουν 16E6 * Μου έδειξε τη χαμηλότερη

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

μεταγραφές μεταξύ των ογκοπρωτεΐνες HPV16 δοκιμαστεί. Σε κύτταρα που εκφράζουν 16E6F και 16E6 * Ι (δηλαδή 16E6-κύτταρα που εκφράζουν) ή 16E6 * Ι και 16Ε7 (δηλαδή 16E6 * IE7 εκφράζουν κύτταρα) ή 16E6F, 16E6 * I και 16Ε7 (δηλαδή 16E6E7-κύτταρα που εκφράζουν) υπήρξαν σημαντικές αυξήσεις στην

MMP

s μεταγραφές, ιδιαίτερα εκείνων των

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

(Εικ. 1Γ). Ωστόσο, στα κύτταρα που εκφράζουν C33A 18E6E7, τα επίπεδα μεταγραφής του

ΜΜΡ-2

,

ΜΜΡ-7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

δεν ήταν διαφορετικές από εκείνες στις pcDNA3 εκφράζοντα κύτταρα, και όπως αναμενόταν, δεν υπήρξαν αλλαγές του

ΜΜΡ

μεταγραφές σε HPV6E6 χαμηλού κινδύνου που εκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν pcDNA3. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι ογκοπρωτεΐνες HPV16, αλλά όχι HPV18 ενισχύσουν ειδικά την έκφραση του

ΜΜΡ-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

, αλλά όχι από

ΜΜΡ-7

. Τα επίπεδα του HPV16 ογκογονιδίου μεταγραφές σε κύτταρα C33A, όπως φαίνεται με RT-PCR στο Σχ. 1D έδειξε ότι

MMP

επαγωγής δραστηριότητα σχετίζεται περισσότερο με τους τύπους, αλλά δεν δοσολογία του HPV ογκοπρωτεϊνών. Οι λειτουργικές δραστηριότητες του HPV ογκοπρωτεϊνών σε αποικοδόμησης πρωτεΐνες ρ53 επίσης καταδειχθεί σε 16E6, 16Ε7 και 16E6E7 εκφράζουν κύτταρα (Σχ. 1Ε).

επιθετικότητα ζελατινάση Δραστηριότητα και ΜΜΡ έκφραση σε C33A κύτταρα που εκφράζουν HPV16 ογκοπρωτεϊνών

Είμαστε αποφασισμένοι περαιτέρω εάν οι αυξήσεις στο

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

μεταγραφές μεταφράζεται σε αυξημένη ικανότητα εισβολής των HPV16-ογκογονιδίου κύτταρα που εκφράζουν αξιοποιώντας τόσο

in vitro

εισβολή ( Σχ. 2Α) και δοκιμασίες επούλωσης τραύματος (Εικ. 2Β). HPV16 ογκοπρωτεΐνη εκφράζουν C33A ήταν περισσότερο διεισδυτικά σε αμφότερες τις δοκιμασίες από HPV6E6 ελέγχου που εκφράζουν και pcDNA3-επιμολυσμένα C33A, με κύτταρα που εκφράζουν ένα συνδυασμό E6F, Ε6 * I και Ε7 (16E6E7) που έχει την υψηλότερη εισβολή ικανότητα (Σχ. 2Α και Β). Καθώς αυτά τα κύτταρα έχουν αυξηθεί

ΜΜΡ-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

μεταγραφές, υποβλήθηκαν σε ζυμογραφία ζελατίνης χρησιμοποιώντας ίσα ποσότητα των πρωτεϊνών (30 μα) για να προσδιοριστεί εάν αυξημένα δραστικότητα ΜΜΡ ήταν παρούσα. Μέσο από όλα τα κύτταρα C33A έδειξε την παρουσία ενός ζελατινάσης, που αντιστοιχεί σε προ-ΜΜΡ-2 (~72 kD) και ΜΜΡ-2 (~62 kD) [14], με πιο έντονη ΜΜΡ-2 ζώνες υπάρχουν σε κύτταρα που εκφράζουν 16E6, 16E6 * IE7 και 16E6E7 (Σχ. 2C). Τα κύτταρα που περιέχουν HPV6E6 χαμηλού κινδύνου έδειξε παρόμοια δραστικότητα ζελατινάσης με το pcDNA3 ελέγχου που περιέχει κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η μπάντα λύσης ζελατίνης σε zymographies ζελατίνη έχει εξακριβωθεί με την προσθήκη 5 mM EDTA δινατρίου, ενός αναστολέα ζελατινάσης, μέσα στην αντίδραση και τρέχει πάνω σε ένα ξεχωριστό πήγμα. Εξαφάνιση των αναμενόμενων ζυμογραφική ζώνες επιβεβαίωσε δραστικότητα ζελατινάσης των εν λόγω ζωνών λύσης (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι η συνδυασμένη παρουσία 16E6 * Ι και 16E6F στο 16E6 ενισχύει την ενεργό MMP-2 επίπεδα σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν 16E6F ή 16E6 * Έχω μόνο (Εικ. 2Α, 2Β, 2Γ), γεγονός που υποδηλώνει ένα προσθετικό αποτέλεσμα μεταξύ των δύο μορφών του Ε6 στην τόνωση

MMP-2

έκφρασης και ως εκ τούτου την προώθηση της κυτταρικής εισβολής. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΜΤ1-ΜΜΡ στα κύτταρα αυτά προσδιορίστηκαν επίσης με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο ΜΤ1-ΜΜΡ αντίσωμα με GAPDH ως ένας έλεγχος. Η πολλαπλάσια αύξηση της έκφρασης ΜΤ1-ΜΜΡ υπολογίστηκε από το σύνολο των ΜΤ1-ΜΜΡ (προ-ΜΤ1-ΜΜΡ και ΜΤ1-ΜΜΡ) με το φορέα ελέγχου ορίζεται ως 1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, όλα τα κύτταρα που περιέχουν πρωτεΐνες HPV16 εκφράζεται τόσο προ- (~66 kD) και ώριμη ΜΤ1-ΜΜΡ (-57 kD) με τη μεγαλύτερη ένταση συγκροτήματος των προ-ΜΤ1-ΜΜΡ σε 16E6E7 (2.5 ×, συνολικής ΜΤ1-ΜΜΡ) και του ώριμη ΜΤ1-ΜΜΡ σε 16E6 (2.3 ×, συνολικής ΜΤ1-ΜΜΡ), ενώ από τον έλεγχο φορέα έδειξε μόνο το pro-ΜΤ1-ΜΜΡ. Αυτές οι παρατηρήσεις αποκάλυψαν ότι η διεισδυτικότητα του HPV16 ογκοπρωτεΐνης κυττάρων που εκφράζουν συσχετίζεται με δραστικότητα ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-ΜΤ1 έκφραση.

επούλωσης (Α)

In vitro

εισβολή και (Β) πληγή δοκιμασίες για C33A κύτταρα που εκφράζουν διαφορετικές ογκοπρωτεϊνών HPV16. (Γ) Ένα αντιπροσωπευτικό ζελατίνη ζυμογραφική γέλη που δείχνει δραστικότητα ΜΜΡ-2 κανονικοποιήθηκαν με ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φόρτωσης (30 μg). Λωρίδες που αντιστοιχούν στον ζελατινολυτική δραστηριότητα του ΜΜΡ-2 ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση και σύγκριση με εκείνα που λαμβάνονται από pcDNA3 ελέγχου που εκφράζουν κύτταρα. (Δ) Ανάλυση Western blot των ΜΤ1-ΜΜΡ χρησιμοποιώντας αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ αντίσωμα (ab78738) σε 1:1,500 αραίωση με ΟΑΡϋΗ ως έλεγχος φόρτωσης. *

σ

-τιμή & lt? 0,05, **

σ

-τιμή & lt?. 0.01

Η

Επίδραση στην εισβολής HPV16E6 Knock-down κύτταρα

Για να επιβεβαιώσετε ότι ογκοπρωτεΐνες HPV16 προκαλέσει ρύθμιση προς τα άνω του

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

έκφρασης, ογκογονίδια Ε6 σε HPV16-θετικά κύτταρα SiHa χτυπήθηκαν κάτω με δύο τα siRNAs (shE6A και shE6B) που στοχεύουν διαφορετικές θέσεις του mRNA 16E6 [23]. Χρησιμοποιώντας RT-PCR, τα επίπεδα του HPV16E6F, 16E6 * μεταγραφές Ι και 16Ε7 σε κύτταρα SiHa δείχθηκαν να μειωθεί κατά περίπου 50% μετά από επιμόλυνση με shE6A, ενώ μόνο μια μείωση 10-30% ανιχνεύθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με shE6B (Σχ. 3Α). Μόνο

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

αλλά όχι

MMP-7

μεταγραφές μειώθηκαν σε Ε6 κύτταρα knock-down SiHa (Σχ. 3Β). Όταν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (20 μg) από το ρυθμισμένο μέσο αναλύθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης, παρατηρήθηκε ότι η δραστικότητα ΜΜΡ-2 σε shE6A-επιμολυσμένα κύτταρα μειώθηκε σε σύγκριση με pSUPER και shCtrl επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3C). προϊόντα κυτταρικής λύσης (30 μg πρωτεΐνης καθένα) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδες Western για την εκτίμηση των επιπέδων ΜΤ1-ΜΜΡ με GAPDH ως μάρτυρες, αποκάλυψε ελαφρές μειώσεις (-30% και -40% μείωση στην shE6A και shE6B αντίστοιχα) των επιπέδων ΜΤ1-ΜΜΡ και στις δύο κλεμμένα κάτω κυττάρων σε σύγκριση με τους ελέγχους shCtrl (Σχ. 3D). Είναι ενδιαφέρον ότι, ΜΤ1-ΜΜΡ πρωτεΐνες ανιχνεύθηκε σε κύτταρα SiHa ήταν κυρίως την ώριμη ΜΤ1-ΜΜΡ (57 kD). Συνεπής με αυτά τα ευρήματα, και οι δύο shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα, ιδιαίτερα shE6A, είχε μειωθεί σημαντικά διεισδυτικότητα (-48%) και την ικανότητα επούλωσης πληγών (-50%), σε σύγκριση με τα κύτταρα shCtrl (Σχ. 3Ε). Έτσι, εκτομή του HPV16E6 /Ε7 ογκοπρωτεΐνες μειώνει δραστικότητα ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-ΜΤ1 έκφραση και τέλος διεισδυτικότητα του HPV16-θετικών κυττάρων SiHa.

(Α) RT-PCR του

16E6F, 16E6 * I

και

16Ε7

μεταγραφές ρυθμίζεται σύμφωνα με τον έλεγχο,

HPRT

. κύτταρα SiHa επιμολυσμένα με μη στόχευση shCtrl και ελέγχου του οχήματος pSUPER χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. shE6A και shE6B είναι δύο διαφορετικές Τα siRNAs που χρησιμοποιούνται σε πειράματα knock-down. (Β) qPCR του

ΜΜΡ-2

,

-7

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

μεταγραφές και (C) ΜΜΡ-2 δραστικότητα, όπως προσδιορίστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης, με ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (20 μg), σε shRNA επιμολυσμένα κύτταρα. (D) πρωτεΐνη ΜΤ1-ΜΜΡ σε γκρέμισε κύτταρα ως προσδιοριστεί με ανάλυση κηλίδος Western με ΟΑΡϋΗ ως έλεγχος φόρτωσης. ικανότητα (Ε) Εισβολή των κυττάρων SiHa επιμολυσμένα με διαφορετικές Τα siRNAs, όπως καθορίζεται από το

in vitro

εισβολή και επούλωση των πληγών δοκιμασίες. Σχετική φορές του κυττάρου εισβολής με μη επεξεργασμένα κύτταρα οριστεί ως 1 έχει αναφερθεί. *

σ

-τιμή & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τα κύτταρα shCtrl

Η

Μειωμένη ικανότητα εισβολής από ειδικούς αναστολείς για ΜΜΡ-2 και ΜΤ1-ΜΜΡ

Για να προσδιορίσετε αν η επιλεκτική αναστολή ενδογενούς ΜΜΡ-2 ή ΜΤ1-ΜΜΡ παρεμποδίζουν την ικανότητα εισβολής, κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν C33A τόσο SiHa και 16E6E7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΟΑ-Hy, ένας ειδικός αναστολέας για ΜΜΡ-2, (Σχ. 4Α, 4Β) και αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ, ένα ειδικό αντίσωμα για την καταλυτική περιοχή του ΜΤ1-ΜΜΡ (Σχ. 4C). Τα αποτελέσματά μας σαφώς έδειξαν ότι η θεραπεία της ΟΑ-Hy είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην κυτταρική εισβολή τόσο για 16E6E7 (-70% στα 10 μΜ) (Σχ. 4Α) και SiHa κύτταρα (-65% στα 20 μΜ) (Σχ. 4Β) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παρομοίως, ΜΤ1-ΜΜΡ αναστολή χρησιμοποιώντας το ειδικό αντίσωμα σαφώς μειωμένη διεισδυτικότητα (~ 50%) των δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4C). Τα πειράματά μας επιβεβαίωσαν ότι εισβολή των κυττάρων μολυσμένων με HPV16 εξαρτιόταν από την έκφραση ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-ΜΤ1. Εφόσον έχει γίνει γνωστό ότι ο σχηματισμός ενός /ΤΙΜΡ-2 /προ-ΜΜΡ-2 σύμπλοκο ΜΤ1-ΜΜΡ είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του προ-ΜΜΡ-2 από ΜΤ1-ΜΜΡ στην επιφάνεια του κυττάρου, τα επίπεδα της ΤΙΜΡ-2 έκφραση σε όλα τα HPV16 ογκοπρωτεΐνη κύτταρα που εκφράζουν ερευνήθηκαν επίσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση ΤΙΜΡ-2 βρέθηκε να είναι ελαφρώς αυξημένες τόσο σε mRNA (~ 3 χ) και πρωτεΐνη (~ 2 ×) επίπεδα σε όλα τα κύτταρα σε σύγκριση με την pcDNA3 ελέγχου με την εξαίρεση του HPV6E6 χαμηλού κινδύνου που παρουσίασαν ΤΙΜΡ -2 έκφραση συγκρίσιμη με τον κενό φορέα (Εικ. 4D). Είτε HPV ογκοπρωτεΐνες ενισχυμένη άμεσα την έκφραση του ΤΙΜΡ-2 μένει να καθοριστεί.

(Α) Cell εισβολή, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας το

in vitro

εισβολή και επούλωση τραυμάτων του HPV16E6E7 κυττάρων που εκφράζουν και (Β) SiHa κύτταρα σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του αναστολέα των ΜΜΡ-2, η ΟΑ-Hy. (Γ) Οι ίδιες κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με αντι-ΜΤ1-ΜΜΡ αντίσωμα (20 μg /ml). Σχετική πτυχή του κυττάρου εισβολή με τον έλεγχο του οχήματος pcDNA3 ή μη επεξεργασμένα κύτταρα οριστεί ως 1 στα φ

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με pcDNA3 και *

σ

-τιμή & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα φαίνεται. (D) ΤΙΜΡ-2 πρωτεΐνης (κανονικοποιούνται με ίσα πρωτεΐνη φόρτωση 5 μg) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση στυπώματος Western με ένα αντι-ΤΙΜΡ-2 αντίσωμα (Abcam, 1:1,000 αραίωση) και ΤΙΜΡ-2 μεταγραφές μετρήθηκαν με qPCR (κανονικοποιημένη να HPRT) για HPV16 ογκοπρωτείνης κύτταρα που εκφράζουν.

Η

Η μεταγραφική προς τα πάνω ρύθμιση Δραστηριότητα του HPV16 ογκογονίδια στο

MMP-2

και

ΜΤ1-ΜΜΡ

Ανάδοχος

κατασκευάσματα Ανάδοχος περιέχει 5′-ανάντι ακολουθίες, δηλαδή, -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 και -211 /+ 40 από το

MMP-2

υποκινητή και -1277 /+ 187, -425 /187 και -151 /+ 187 από

ΜΤ1-ΜΜΡ

υποκινητή συγχωνευμένο με το γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης στο πλασμίδιο pGL3-Basic παρήχθησαν. Κάθε κατασκεύασμα στη συνέχεια επιμολύνθηκε σε C33A που εκφράζουν σταθερά HPV16E6E7. Με την παρουσία του HPV16E6E7, λουσιφεράσης δραστηριότητα του ο -1721 /+ 40

ΜΜΡ-2

κατασκεύασμα αποδείχθηκε ότι είναι συγκρίσιμη με εκείνη των -1001 /+ 40 εμφανίζοντας 4,6 και 3,9 φορές μεγαλύτερη έκφραση από εκείνη του κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με τον κενό pGL3-Basic φορέα ή ~ 2-φορές αύξηση και των δύο δραστηριοτήτων προαγωγού σε σχέση με το βασικό επίπεδο σε pcDNA3 που εκφράζουν κύτταρα (Σχ. 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από

ΜΤ1-ΜΜΡ

κατασκευάσματα υποκινητή (Εικ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι αλληλουχίες υπεύθυνη για τη διαμεσολάβηση ογκοπρωτεΐνη δραστηριότητα HPV16 θα πρέπει να βρίσκεται μέσα σε -1001 /+ 40 και -425 /+ 187 περιοχές της

MMP-2

και

ΜΤ1 MMP-

υποστηρικτές, αντίστοιχα. Τόσο περιείχε ΡΕΑ-3 (στο -552 και -540 για

ΜΜΡ-2

και -303 για

ΜΤ1-ΜΜΡ

) και Sp1 (στο -91 για ΜΜΡ-2 και -102 για

ΜΤ1-ΜΜΡ

) θέσεις που υποδηλώνει ότι ογκοπρωτεΐνες HPV16 δεσμευτικός ασκούν δραστηριότητα διενεργοποίησης τους μέσω αυτών των τοποθεσιών με παρόμοιο τρόπο. Η έλλειψη p53 και η απομακρυσμένη PEA-3 sites σε ακολουθίες

MMP-2

υποκινητή και TIE-όπως στη σύνδεση

ΜΤ1-ΜΜΡ

κατασκευάσματα υποκινητή έδειξαν ότι αυτές οι περιοχές δεν ήταν υπεύθυνοι για τη μεσολάβηση του επίδραση του HPV ογκοπρωτεϊνών. Ωστόσο, τα μικρότερα κατασκευάσματα του

MMP-2

υποκινητή (-211 /+ 40) που περιέχει ανά ένα του Sp1, AP2 και PEA-3 θέσεις δέσμευσης και του

ΜΤ1-ΜΜΡ

υποκινητή (