You must be logged into post a comment.
Αφηρημένο
Ιστορικό
transketolase-όπως 1 (TKTL1) προκαλεί υποβάθμιση της γλυκόζης μέσω της αναερόβιας μονοπάτια, ακόμη και σε παρουσία οξυγόνου, ευνοώντας την κακοήθη αερόβια γλυκολυτικό χαρακτηριστικό φαινότυπο των κυττάρων του όγκου. Όπως φαίνεται TKTL1 να είναι μια έγκυρη βιοδείκτης για πρόγνωση του καρκίνου, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να συσχετίζονται έκφραση της με το στάδιο του όγκου, την πιθανότητα επανεμφάνισης του όγκου και της επιβίωσης, σε μια σειρά από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο.
Methodolody /Κύρια Ευρήματα
ιστούς όγκου από 63 ασθενείς με διάγνωση καρκίνου του παχέος εντέρου σε διάφορα στάδια της εξέλιξης αναλύθηκαν για TKTL1 με ανοσοϊστοχημεία. Η χρώση ποσοτικοποιήθηκε με υπολογιστική ανάλυση εικόνας, και αξιολογήθηκαν συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης του ενζύμου, τοπική ανάπτυξη, εμπλοκή των λεμφαδένων και της μετάστασης. Οι υψηλότερες τιμές για την έκφραση TKTL1 ανιχνεύτηκαν στην ομάδα των όγκων σταδίου ΙΙΙ, η οποία έδειξε σημαντικές διαφορές από τις άλλες ομάδες (δοκιμασία Kruskal-Wallis,
P
= 0,000008). Βαθύτερη αναλύσεις των Τ, Ν και Μ ταξινομήσεις αποκάλυψε μια ασθενή συσχέτιση μεταξύ των τοπικών ανάπτυξη όγκου και έκφραση του ενζύμου (Mann-Whitney test,
P
= 0,029), μία σημαντική συσχέτιση του ενζύμου έκφρασης με εμπλοκή των λεμφαδένων ( Mann-Whitney test,
P
= 0,0014) και μια σημαντική μείωση της έκφρασης TKTL1 που σχετίζεται με μετάσταση (Mann-Whitney test,
P
= 0,0004).
Συμπεράσματα /Σημασία
Για τις γνώσεις μας, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τη συσχέτιση μεταξύ μεταβολών στην έκφραση TKTL1 στον πρωτογενή σχηματισμό όγκου και τη μετάσταση. Εδώ αναφέρουμε μειορρύθμιση του ενζύμου έκφρασης όταν εμφανιστεί μετάσταση, και ένας συσχετισμός μεταξύ του ενζύμου και της περιφερειακής εκφράσεως εμπλοκή λεμφαδένων σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Το εύρημα αυτό μπορεί να βελτιώσει την κατανόησή μας για μετάσταση και να οδηγήσει σε νέες και πιο αποτελεσματικές θεραπείες κατά του καρκίνου
Παράθεση:. Diaz-Moralli S, Tarrado-Καστελαρνό M, Alenda C, Castells Α, Cascante Μ (2011) Transketolase- όπως και 1 Έκφραση διαμορφώνεται κατά τη διάρκεια του καρκίνου του παχέος εντέρου εξέλιξη και μετάσταση Σχηματισμός. PLoS ONE 6 (9): e25323. doi: 10.1371 /journal.pone.0025323
Επιμέλεια: Μιχαήλ Lisanti, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής
Ελήφθη: 24 Αυγούστου 2010? Δεκτές: 1 του Σεπτέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 27η Σεπτεμβρίου 2011
Copyright: © 2011 Diaz-Moralli et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται
Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την περιφερειακή αυτόνομη κυβέρνηση της Καταλονίας (Generalitat), μέσω της «Agencia de διοίκηση αλλοτρίων ad’juts Universitaris i de Recerca» (2009 SGR 849 και 2009 SGR 1308), το Ministerio Επιστημών e Innovación-ισπανική κυβέρνηση και Ευρωπαϊκό Ταμείο περιφερειακής Ανάπτυξης (ΕΤΠΑ) «Una manera de Hacer Europa» (SAF2010-19273 και SAF2011-25726), «Instituto de Salud Carlos III» μέσω ISCIII-RTICC (RD06_0020_0046) και CIBEREHD, και «Asociación Española contra el τον καρκίνο» ( «Fundación Científica y Junta de Barcelona «). MC αναγνωρίζει την υποστήριξη που λαμβάνει μέσω του βραβείου «ICREA Academia» για την αριστεία στον τομέα της έρευνας, που χρηματοδοτείται από ICREA ίδρυμα-Generalitat de Catalunya. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου
Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα
Εισαγωγή
ανάπτυξη του όγκου που προκαλείται από μια διαδοχική συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών αλλαγών που οδηγούν κυττάρων μέσω μιας διαδικασίας πολλών σταδίων που καθιστά τα υγιή κύτταρα κακοήθους [1] – [4]. Καθ ‘όλη αυτή τη διαδικασία, οι μεταβολές που ευνοούν το σχηματισμό των πρωτογενών όγκων συνήθως διαφέρουν από τις προσαρμογές που απαιτούνται για την προηγμένη καρκινογένεση [5] – [7]. Carcinogenesis έναρξη οφείλεται στην απελευθέρωση των ανασταλτικών αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας ανάπτυξη και τη συσσώρευση περαιτέρω γενετικές αλλοιώσεις που οδηγεί στην ενεργοποίηση του πρωτο-ογκογονιδίων και αναστολή των γονιδίων καταστολής όγκων [7], [8]. Μετά από αυτά τα πρώιμα γεγονότα, κακοήθη μετασχηματισμό εξελίσσεται, διέπεται από μια διαδικασία δαρβινικής επιλογής κατά την οποία φαινοτύπους, αντί γονότυπους, έχουν επιλεγεί. Αυτό δίνει καρκινικά κύτταρα ένα πλεονέκτημα έναντι των μη-μετασχηματισμένων κυττάρων. Αυτή η επιλογή των φαινοτύπων, ανεξάρτητα από τις σχετικές γονότυπων, είναι η βάση για την υψηλή γενετική ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων, δεδομένου ότι οι διαφορετικές (epi) γενετικών μηχανισμών μπορεί να συγκλίνουν σε παρόμοιες φαινοτύπους [7], [9]. Ένα από τα κύρια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων είναι η αερόβια γλυκόλυση σχετίζεται με αυξημένα, αλλά αναποτελεσματική, ΑΤΡ παραγωγής, καθώς και υψηλή παραγωγή NADPH και οξέων (H
+) όπως γαλακτικό [10]. Αυτό το φαινόμενο, γνωστό ως «φαινόμενο Warburg», περιγράφηκε από τον Otto Warburg το 1924 [11]. Αποτελεί τη βάση για τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (ΡΕΤ), μια τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση μεταβολών στην κατανάλωση της γλυκόζης σε ασθενείς με καρκίνο. Το υψηλό γλυκολυτικό ποσοστό δεν δικαιολογείται από ενεργητική απαιτήσεις, δεδομένου ότι πάνω από το 80% της σύνθεσης του ΑΤΡ στα κύτταρα του όγκου συμβαίνει μέσω οξειδωτική φωσφορυλίωση, και μόνο περίπου το 17% γίνεται μέσω της οδού Embden-Meyerhof (EMP). Αυτές οι αναλογίες είναι παρόμοια με εκείνα που βρέθηκαν σε μη καρκινικά κύτταρα [12]. Από την άλλη πλευρά, ο σχηματισμός NADPH είναι σημαντικό για τον μεταβολισμό των κυττάρων του όγκου, δεδομένου ότι τους προστατεύει από το οξειδωτικό στρες και παρέχει καύσιμο για την αύξηση του δείκτη χαρακτηριστική σύνθεση λιπαρών οξέων των καρκινικών κυττάρων. Τέλος, γαλακτικό παραγωγή και μικροπεριβάλλον οξίνιση δώσει καρκινικά κύτταρα ένα πλεονέκτημα έναντι των υγιών κυττάρων, ενισχύοντας διεισδυτικότητα και τη μετάσταση [7] τους, [13] – [16]. Παραδόξως, οξίνιση του περιβάλλοντος είναι ανεξάρτητος ΕΜΡ, αφού στα κύτταρα γλυκόλυση-διαταραγμένη αυτό το φαινόμενο είναι ακόμη παρατηρήσιμα [17], [18].
Εκτός από αερόβια γλυκόλυση, το μονοπάτι φωσφορικής πεντόζης (ΡΡΡ) σημαντικό για το μεταβολισμό του όγκου, δεδομένου ότι πάνω από το 85% της ριβόζης απαραίτητο για τη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων σε κύτταρα όγκου δημιουργείται, άμεσα ή έμμεσα, από την μη-οξειδωτικές αντιδράσεις κλάδο του ΡΡΡ [19]. Ως εκ τούτου, η ΡΡΡ βρίσκεται στη βάση της ρύθμισης του μεταβολισμού του όγκου. G6PDH και TKT, οι οποίες ελέγχουν το μονοπάτι, είναι αρκετή για να εξηγήσει τις βασικές μεταβολικές λειτουργίες που αποκτήθηκαν από τα καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια του μετασχηματισμού τους. Μέσω του ΡΡΡ, τα κύτταρα όχι μόνο τη σύνθεση των προδρόμων νουκλεϊκών οξέων απαραίτητο να διατηρηθεί η επιταχυνόμενη χαρακτηριστικό ρυθμό πολλαπλασιασμού στον καρκίνο. G6PDH ρυθμίζει τη ροή του οξειδωτικού κλάδου μέσω του οποίου NADPH συντίθεται και CO
2 απελευθερώνεται, οδηγώντας σε αύξηση της οξύτητας με μήτρα καρβονικής ανυδράσης. Η θειαμίνη-εξαρτώμενο ένζυμο ΤΚΤ δείχνει τον υψηλότερο συντελεστή έλεγχο της μη-οξειδωτικής υποκατάστημα της οδού, αποκαλύπτοντας βασικό ρόλο της στην ρύθμιση του ΡΡΡ [20], [21]. ΤΚΤ έχει υποτεθεί να συνδέσει το ΡΡΡ και το ΕΜΡ σε καρκινικά κύτταρα, επιτρέποντας στο οξυγόνο-ανεξάρτητο αποικοδόμηση της γλυκόζης [22]. Από την άλλη πλευρά, ο ρόλος του στον μεταβολισμό ΤΚΤ καρκινικών κυττάρων έχει υπογραμμιστεί από εκθέσεις σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων μετά από αγωγή με ειδικούς αναστολείς TKT, τόσο
in vitro
και
in vivo
[21] – [30]. Επιπλέον, όταν TKT ενεργοποιείται με την προσθήκη του συμπαράγοντα, θειαμίνη, ανάπτυξη όγκου διεγείρεται [31].
Ένα ΤΚΤ και δύο transketolase-όπως γονίδια (TKTL1 και TKTL2) έχουν περιγραφεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα [32 του ]. Αυτό το εύρημα οδήγησε να εξετάσει την έκφραση και των τριών ενζύμων σε καρκινικά κύτταρα και συμπεράνουμε ότι TKTL1 ήταν η μόνη ειδικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε όγκους [33]. Μετέπειτα μελέτες αποκάλυψαν ότι TKTL1 είναι υπεύθυνη για περίπου το 60% ή το 70% της δραστηριότητας transketolase σε ανθρώπινο ηπάτωμα και του παχέος εντέρου-καρκινικά κύτταρα [33] – [35] δείχνει το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει αυτό το ισοένζυμο σε αυτούς τους όγκους. Έχει υποτεθεί ότι θα μπορούσε να δημιουργήσει TKTL1 ακετυλΟοΑ για σύνθεση λιπαρού οξέος, το οποίο θα συνδέει την αναερόβια αποδόμηση της γλυκόζης και της λιπογένεσης [32]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ενζύμου έχει αναφερθεί σε αρκετές κύτταρα και ιστούς όγκων, π.χ. στο παχύ έντερο και ουροθηλίου του καρκίνου [33], [36], γαστρικού καρκίνου [37], διαφόρων γυναικολογικών καρκίνων (ωοθηκών, κοκκιώδη κυτταρική του τραχήλου ωοθηκών και της μήτρας) [38] – [40], του καρκίνου του μαστού [41], [42 ], θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [43] και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [44]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η ειδική αναστολή της έκφρασης TKTL1 με shRNA πυροδοτεί απόπτωση και καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου [35]. Αυτή η συσχέτιση μεταξύ της υπερέκφρασης της TKTL1 και ανάπτυξη όγκου, κακή επιβίωση και την υποτροπή του όγκου, επιπροσθέτως με τη μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω της έκφρασης του ενζύμου που προκαλείται από απομεθυλίωση υποκινητή [45] οδήγησε Smith και συνεργάτες να προτείνει το ένζυμο ως δυνητικό πρωτο-ογκογονιδίου [46 ]. Περαιτέρω, έχει επίσης προταθεί ότι TKTL1 επάγει την κακοήθη αερόβια γλυκολυτικό φαινότυπο με την ενίσχυση της παραγωγής φρουκτόζης-6-φωσφορικής και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής, με αποτέλεσμα αυξημένες ροές προς πυροσταφυλικό και γαλακτικό [16], [46]. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχει ανάγκη για πιο λεπτομερή μελέτη της συσχέτισης του TKTL1 με την εξέλιξη του όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου, για τη διαλεύκανση του ρόλου της στη λεμφαδένες τρυφερότητα και μετάσταση. Επιπλέον, μέχρι σήμερα εικόνα ποσοτικοποίηση του ενζύμου έκφρασης σε ιστούς έχει εκτελεστεί με ημιποσοτική μεθόδους που βασίζονται στην παρατήρηση των εμπειρογνωμόνων και υποκειμενική αξιολόγηση [38], [47] που αποδεικνύουν την ανάγκη βελτίωσης του συστήματος αξιολόγησης που επιτρέπουν την επίτευξη του στόχου αποτελέσματα.
Εδώ παρουσιάζουμε μια νέα μέθοδο ποσοτικοποίησης ανάλυσης εικόνας για την αξιολόγηση των immunostains που μας επιτρέπουν να εξετάσουμε πώς η έκφραση TKTL1 ποικίλλει ανάλογα με το στάδιο εξέλιξης σε μια σειρά ορθοκολικού καρκινώματος. Δείγματα κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες ή τα στάδια της εξέλιξης (Ι έως IV) σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) χειροκίνητη στάσης (έκτη έκδοση), το οποίο λαμβάνει υπόψη την επέκταση διατοιχωματική, συμμετοχή λεμφαδένων και η παρουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων. Οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης TKTL1 και την εξέλιξη του όγκου διερευνηθούν, για να καθορίσει το ρόλο του κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου.
Αποτελέσματα
Ασθενείς
Η έκφραση της TKTL1 αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε 63 ασθενείς με πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο (CRC). Τα δημογραφικά, κλινικά και όγκων που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά που παρατίθενται στον Πίνακα S1 και S2 πίνακα. Μετά από μια μέση περίοδο παρακολούθησης των 49 μηνών, 26 ασθενείς είχαν πεθάνει.
Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της έκφρασης TKTL1
Δημοτικό όγκους επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-TKTL1 έδειξαν σημαντική επισήμανση, ενώ τα δείγματα ελέγχου δεν έδειξε οποιαδήποτε μη ειδική σήμανση (Σχήμα 1 και Σχήμα 2). Levene και Cochrand δοκιμές δεν απέδειξε ότι τα δεδομένα μας ήταν κανονικά κατανεμημένες (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται) έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί μη παραμετρικά τεστ για την εκτίμηση της σημασίας των διαφορών. Με την εφαρμογή Mann-Whitney U ή Kruskal-Wallis τεστ, επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση TKTL1 δεν φύλο ή την ηλικία εξαρτώμενη (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Κλινικο- παθολογικά και ανοσοϊστοχημικές δεδομένα συνοψίζονται στον Πίνακα S1.
Αυτά χρώμα μικροφωτογραφίες αποκαλύπτουν κυτταροπλασματική ανοσοϊστοχημική χρώση (καφέ καταθέσεις) για transketolase-σαν 1 (TKTL1) σε όγκους παχέος εντέρου (αρχική μεγέθυνση χ 200). Στη δεξιά στήλη (Ε-Η) υπάρχουν χρωματίζονται ιστοί σε διαφορετικά στάδια εξέλιξης και στην αριστερή στήλη (Α-Δ) ομόλογο περιοχές αρνητικούς μάρτυρες. Η χρώση για TKTL1 παρατηρείται σε όλα τα θετικά δείγματα, υποδηλώνοντας έκφραση του σε ιστούς όγκων? η υψηλότερη ένταση ανιχνευθεί σε δείγματα σταδίου ΙΙΙ.
Η
Αυτά τα μονοχρωματικά μικροφωτογραφίες αναλύθηκαν με το λογισμικό ImageJ για την ποσοτικοποίηση ανοσοχρώση και την αξιολόγηση της έκφρασης TKTL1 (αρχική μεγέθυνση χ 200). Στη δεξιά στήλη (Ε-Η) υπάρχουν χρωματισμένο ιστούς σε διάφορα στάδια εξέλιξης και στην αριστερή στήλη (Α-Δ) ομόλογες περιοχές σε αρνητικούς μάρτυρες.
Η
παραλλαγές TKTL1 σύμφωνα με το στάδιο του όγκου
Η έκφραση της TKTL1 κυμαίνονταν: 1,8 έως 26,4 au (Μέση, 13,3 ± 7,9) σε όγκους σταδίου Ι, 4,0 – 37,3 Α.υ. (Μέση, 20,8 ± 9,9) στη φάση II, 17,3 έως 50,0 Α.υ. (Μέση, 32,9 ± 11,5) στη φάση III και 3,7 έως 41,3 Α.υ. (Μέση, 13,7 ± 8,7) στη φάση IV (Σχήμα 3Α). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η έκφραση της TKTL1 στο στάδιο ΙΙΙ όγκους ήταν υψηλότερη από ό, τι σε οποιοδήποτε άλλο στάδιο (τεστ Kruskal-Wallis,
P
= 0,00003, Εικόνα 3Β). Ωστόσο, ένα δείγμα (id. # 7118) έδειξε μία αφύσικα υψηλά τιμή (41,3) σε σύγκριση με το υπόλοιπο των δειγμάτων της ομάδας αυτής. Q-τεστ του Dixon προσδιόρισε την τιμή αυτή ως μια ακραία τιμή με ένα επίπεδο εμπιστοσύνης 99,9% και, ως εκ τούτου, αποκλείστηκε από την ανάλυση. Μετά τον αποκλεισμό του δείγματος αυτού, η έκφραση TKTL1 στην IV όγκους σταδίου κυμαίνεται 3,7 έως 20,8 Α.υ. (Μέση, 12,0 ± 5,1) και η έκφραση των TKTL1 στο στάδιο ΙΙΙ όγκους γίνει ακόμη πιο διαφορετικά (δοκιμή Kruskal-Wallis,
P
= 0,000008).
Αυτά τα γραφήματα δείχνουν την έκφραση του transketolase- όπως 1 (TKTL1) στους ιστούς CRC αναλύεται, χωρίζονται σε ομάδες ανάλογα με το στάδιο της εξέλιξης. (Α) Το κάθε σημείο αντιστοιχεί σε ένα δείγμα. Στην ομάδα στάδιο IV ο σταυρός αντιπροσωπεύει μια ακραία τιμή. Οι μέσοι όροι που χαρακτηρίζεται από μία οριζόντια μαύρη γραμμή σε κάθε ομάδα. (Β) Το οικόπεδο box-και-μουστακιού δείχνει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων. Η ακραία της IV ομάδα στάδιο αντιπροσωπεύεται από ένα μαύρο τετράγωνο. Ομάδα σταδίου III είναι σημαντικά διαφορετική από το υπόλοιπο των ομάδων (τεστ Kruskall-Wallis,
P
= 0,000008).
Η
έκφραση TKTL1 στο στάδιο ΙΙΙ όγκους ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε οποιοδήποτε άλλο στάδιο εξέλιξης. Επιπλέον, όταν εξετάζονται χωριστά, σχεδόν σε κάθε επιμέρους στάδιο έδειξαν σημαντικά διαφορετικές τιμές για την έκφραση TKTL1 τόσο από το προηγούμενο και το επόμενο στάδιο: το στάδιο Ι έδειξε μια τάση να είναι χαμηλότερο από το στάδιο ΙΙ (Mann-Whitney U test,
P
= 0.06). Έκφραση του ενζύμου σε όγκους σταδίου ΙΙ ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στο στάδιο ΙΙΙ όγκους (Mann-Whitney test,
P
= 0,02) και το στάδιο αξίες III ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες του σταδίου IV (Mann-Whitney U test,
P
= 0,000003).
Συσχέτιση μεταξύ παρουσία μακρινό έκφρασης μετάσταση και TKTL1 όγκου
Μια ισχυρή μείωση στην πρωτογενή έκφραση TKTL1 όγκου παρατηρήθηκε σε ασθενείς που παρουσιάζονται με μακρινή μετάσταση. Πράγματι, τα δείγματα από ασθενείς χωρίς μεταστάσεις (Μ0) εμφάνισαν οι τιμές έκφρασης μεταξύ 1,8 και 50,0 Α.υ. (Μέση 23,5 ± 12,4), ενώ οι τιμές για τα δείγματα από ασθενείς που ανέπτυξαν μακρινή μετάσταση (Μ1) κυμαινόταν από 3,7 να 20,8 Α.υ. (Μέση τιμή 12,0 ± 5,1) (Mann-Whitney U test,
P
-τιμή = 0,0004) (Εικόνα 4Α). Λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορές μεταξύ M0 (μη μεταστατικό) και M1 (μεταστατικό) όγκους, πραγματοποιήσαμε τις ακόλουθες συγκρίσεις μόνο για τα δείγματα από την ομάδα M0.
Αυτά τα ιστογράμματα απεικονίζουν τη συσχέτιση μεταξύ transketolase-όπως 1 ( TKTL1) έκφρασης και του όγκου τιμές κατάταξης. (Α) Tumor έκφραση TKTL1 σε ασθενείς οι οποίοι δεν παρουσιάζουν με μακρινή μετάσταση (M0) είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι η έκφραση σε ασθενείς που είχαν αναπτύξει μετάσταση (Μ1) (Mann-Whitney U test,
P
= 0,0004) . (Β) Σε ασθενείς που δεν είχαν αναπτύξει μετάσταση, έκφραση TKTL1 τείνει να είναι χαμηλότερη σε όγκους πρώιμο στάδιο σε σχέση με διατοιχωματική εισβολή (T1-2) από ό, τι σε πιο προχωρημένους όγκους (T3-4) (
P
= 0,029, Mann-Whitney test U). (Γ) λεμφαδένων εισβολή συσχετίζεται με μια αύξηση στην έκφραση TKTL1 στον πρωτογενή όγκο (Mann-Whitney U,
P
= 0,0014).
Η
εμπλοκή TKTL1 στην πρόοδο του όγκου
Όσον αφορά την διατοιχωματική εξέλιξη, όγκοι πρώιμο στάδιο (Τ1 και Τ2) παρουσιάζονται τιμές έκφρασης TKTL1 μεταξύ 1,8 και 45,5 au (Μέση 16,5 ± 12,6), ενώ η έκφραση του ενζύμου σε πιο προχωρημένο πρωτογενή όγκο (Τ3 και Τ4) κυμαίνονταν από 4,0 να 50,0 Α.υ. (Μέση τιμή 25,5 ± 11,8). Τα δεδομένα αυτά δείχνουν μια μικρή αύξηση στην έκφραση TKTL1 όταν τοπικής ανάπτυξης των αυξήσεων του όγκου (Mann-Whitney U test,
P
= 0,029, Εικόνα 4Β).
έκφραση TKTL1 σε δείγματα χωρίς περιφερειακή lymph- συμμετοχή κόμβο (N0) κυμάνθηκε 1,8 έως 37,3 au (Μέση τιμή 18,6 ± 9,8), ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τα άτομα με περιφερειακή συμμετοχή λεμφαδένων (Ν1 και Ν2) κυμάνθηκε 17,3 έως 50,0 Α.υ. (Μέση τιμή 32,9 ± 11,5) (Mann-Whitney U test,
P
= 0,0014) (Σχήμα 4C).
έκφραση TKTL1 και την επιβίωση
Η μονοπαραγοντική ανάλυση Kaplan-Meier έκανε δεν αποκαλύπτουν σημαντική συσχέτιση μεταξύ της χρώσης TKTL1 και την επιβίωση σε δείγματα ιστών CRC (Mantel-Cox test log-rank,
P
= 0,37) (Εικόνα 5Α). Από την άλλη πλευρά, όταν θεωρείται θεραπεία διαφορές προκύπτουν. Τα στοιχεία μας αποκαλύπτουν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TKTL1 και την επιβίωση σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με 5-fluoroacyl (δοκιμασία log-rank Mantel-Cox,
P
= 0,017) (Εικόνα 5Β), η συσχέτιση αυτή δεν παρατηρήθηκε στους ασθενείς που δεν (Mantel-Cox test log-rank,
P
= 0,993) (Εικόνα 5C).
(Α) κατά Kaplan-Meier οικόπεδο συσχετίζοντας έκφραση TKTL1 και την επιβίωση σε ασθενείς με μη μεταστατικό CRC. (Β) κατά Kaplan-Meier οικόπεδο συσχετίζοντας έκφραση TKTL1 και την επιβίωση σε ασθενείς άνευ αγωγής. (C) Kaplan-Meier οικόπεδο συσχετίζοντας έκφραση TKTL1 και την επιβίωση σε ασθενείς με CRC που έλαβαν θεραπεία με 5-fluoroacyl. Συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει τα άτομα με έκφραση TKTL1 κάτω από τη μέση τιμή, και διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει εκείνους που με την έκφραση TKTL1 πάνω από τη μέση τιμή για κάθε ομάδα.
Η
ανοσοχρώση μέθοδο ποσοτικοποίησης Επικύρωση της ανάλυσης εικόνας με βάση
για την επικύρωση της μεθόδου ποσοτικοποίησης ανάλυσης εικόνας, 5 δείγματα που ανήκουν στο στάδιο Ι, ΙΙ και ΙΙΙ της εξέλιξης, και με διαφορετικό επίπεδο έκφρασης TKTL1 αναλύθηκαν με western blot. Ανοσοσήμανση TKTL1 και ακτίνης ως έλεγχος φόρτωσης έδειξαν μια σαφή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης TKTL1 καθορίζεται από κηλίδα western και immunohystochemical ανάλυση (Σχήμα 6).
πρωτεΐνης TKTL1 και ακτίνης αναλύθηκαν με western blot με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων. TKTL1 /Πράξη αντιπροσωπεύει την ποσοτική ανάλυση των TKTL1 διορθώνεται με ακτίνη. TKTL1 IHC είναι οι αξίες έκφραση TKTL1 καθορίζεται από immunohystochemical ανάλυση. Όλα τα 5 παχέος εντέρου δείγμα καρκίνου ομογενοποιημένων αναλυθεί δείχνουν παρόμοιες τιμές έκφρασης για TKTL1 και στις δύο αναλύσεις.
Η
Συζήτηση
Η έκφραση της TKTL1 έχει ανιχνευθεί και να συσχετιστεί με διάφορα είδη καρκίνου μέχρι στιγμής . Οι περισσότεροι από τους συγγραφείς αναφέρουν αυτών των συσχετισμών ακολουθήσουν ένα πρωτόκολλο ανάλογο με εκείνο που περιγράφεται στο τρέχον έγγραφο, χρησιμοποιώντας το ίδιο αντίσωμα και κιτ για την ανοσολογική χρώση. Ωστόσο, μέχρι σήμερα η αξιολόγηση της ανοσοχρώση ήταν ανακριβής, δεδομένου ότι έχει πραγματοποιηθεί εφαρμογή ενός ημι-ποσοτικό σύστημα που βασίζεται στην εκχώρηση των βαθμολογιών από παρατηρητές. Το σημερινό χειρόγραφο περιγράφει μια νέα και πιο αντικειμενικό σύστημα για να ποσοτικοποιηθεί η βαφή μέσω υπολογιστικής ανάλυσης εικόνας. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την απόκτηση ποσοτικών δεδομένων από immunohystochemical χρώση οδηγεί σε μια πιο ακριβή αξιολόγηση του ενζύμου έκφρασης. Ως εκ τούτου, η αναφερόμενη μέθοδος αποκαλύπτεται ως ένα πολύ ισχυρό εργαλείο για immunohystochemical ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών που προσφέρει αντικειμενικά αριθμητικά δεδομένα, αντί της αυθαίρετης σκορ.
Τα αποτελέσματά μας παρέχουν αποδείξεις ότι η έκφραση TKTL1 στην πρωτοβάθμια καρκίνο του παχέος εντέρου συσχετίζεται έντονα με την εξέλιξη του όγκου . Η ικανότητα να αποικοδομεί τη γλυκόζη κάτω από αναερόβιες συνθήκες είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου, ειδικά καθώς ο πρωτογενής όγκος διαστέλλεται και τα εσωτερικά κύτταρα μεταφέρονται μακριά από τη βασική μεμβράνη και την παροχή οξυγόνου τους. Σε αυτήν την κατάσταση, TKTL1 υπερέκφραση απονέμει πλεονέκτημα σε κακοήθη κύτταρα και τους επιτρέπει να μεγαλώνουν γρηγορότερα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκφραση TKTL1 συσχετίζεται έντονα με την τοπική εξέλιξη (Τ) και των περιφερειακών λεμφαδένων στοργή (Ν). Αυτή είναι η πρώτη φορά που ο συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης TKTL1 και Ν ταξινόμηση έχει αναφερθεί σε CRC. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η συσχέτιση είναι ισχυρότερη από εκείνη μεταξύ της έκφρασης TKTL1 και Τ ταξινόμησης (Σχήμα 4Β και C), γεγονός που δείχνει ότι η επίδραση του ενζύμου αυξάνει καθώς ο όγκος εξελίσσεται. Αυτή η συμπεριφορά είναι σύμφωνη με το εύρημα ότι η υπερέκφραση του TKTL1 ευνοεί την αναερόβια μεταβολισμού της γλυκόζης, την αύξηση της παραγωγής του γαλακτικού οξέος και επάγει την οξίνιση περιβάλλον που ενισχύει την τοπική διεισδυτικότητα. Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα μας δεν αποκαλύπτουν καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ της χρώσης TKTL1 όγκου και της επιβίωσης των ασθενών, η μονοπαραγοντική ανάλυση Kaplan-Meier απεικονίζονται στο Σχήμα 5Α, θα έχουν την τάση να δείχνουν ότι ένα μεγαλύτερο δείγμα ενδέχεται να φανερώσει σημαντική συσχέτιση. Επιπλέον, αν και ο αριθμός των δειγμάτων είναι μικρή, συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης TKTL1 και την επιβίωση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία φαίνεται σαφές. Η παρατηρούμενη συσχέτιση υποδεικνύουν ότι η 5-fluoroacyl μπορεί να είναι αποτελεσματικό στη θεραπεία όγκων με υψηλά επίπεδα TKTL1, εκείνοι με ένα υψηλό ποσοστό της τοπικής εξέλιξης (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, η χημειοθεραπεία δεν έδειξε καμία επίδραση στην επιβίωση των ασθενών με όγκους που περιέχουν χαμηλά επίπεδα του ενζύμου, τα πιο μεταστατικό όνες (Σχήμα 5C). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα TKTL1 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης του όγκου σε χημειοθεραπεία.
Η τρέχουσα μελέτη δείχνει επίσης ένα άλλο ενδιαφέρον εύρημα, την εξαιρετικά σημαντική μείωση της έκφρασης TKTL1 παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση των μη μεταστατικό ασθενείς (M0) με μεταστατικό όνες (Μ1). Αυτή η προς τα κάτω ρύθμιση του ενζύμου όταν συμβαίνει μετάσταση, όπως η συσχέτιση με την περιφερειακή εμπλοκή λεμφαδένων, δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως. Αυτή είναι η πρώτη φορά που η έκφραση του TKTL1 έχει συσχετιστεί με σταδιοποίηση του όγκου και σχηματισμού μετάστασης σε CRC. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόμοια συμπεριφορά έχει περιγραφεί στη συχνότητα εμφάνισης του μεταλλαγμένου
ras
σε CRC: η συχνότητα εμφάνισης της μετάλλαξης αυξάνεται από ~ 7% στις αρχές αδένωμα να -55% σε ενδιάμεσα, και σε -60% στα τέλη καρκινώματα, αλλά μειώνεται στο -45% σε διηθητικά καρκινώματα, υποδεικνύοντας μια συνέπειες αυτής της μετάλλαξης στο κελί επιθετικότητα, αλλά όχι σε μετάσταση κυττάρων [7], [48].
Η ρύθμιση της έκφρασης TKTL1 στα καρκινικά κύτταρα είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη, αλλά έχει προταθεί ότι μπορεί να ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση σε υπομεθυλίωση [46]. Ο μηχανισμός που ευθύνεται για την παγκόσμια απομεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα παραμένει άγνωστος, αν και τα μέλη της οικογένειας Ras έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της μεθυλίωσης [49] – [52]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, Ras σηματοδότησης έχει σχέση με υπερμεθυλίωση και αναστολή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Ωστόσο, έχει επίσης συσχετιστεί με απομεθυλίωση σε ορισμένες μελέτες [53] – [56]. Εδώ προτείνουμε ένα νέο ρόλο για Ras σηματοδότησης στο μετασχηματισμό των όγκων, που αποτελείται από την ενεργοποίηση με υπομεθυλίωση διαφορετικών ογκογονιδίων, συμπεριλαμβανομένων TKTL1 σε CRC.
Ειδικότερα, έχουν Ras υπεροικογένειας μέλη έχουν ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση της αερόβιας γλυκόλυσης με αυξάνοντας την πρόσληψη γλυκόζης και /φρουκτόζης-2,6-διφωσφορικά 3 (PFKFB3) έκφραση 6-φωσφοφρουκτο-2-κινάση [57] – [59]. PFKFB3 δραστηριότητα προκαλεί την συσσώρευση της φρουκτόζης-2,6-bisphosfate (F26bP) και την επακόλουθη ρύθμιση προς τα άνω του 6-φωσφοφρουκτο-1-κινάση (PFK-1) δραστηριότητα, η οποία οδηγεί τελικά σε αυξημένα παραγωγή γαλακτικού. Το μεταβολικό υπόστρωμα για PFKFB3 και PFK-1 αντιδράσεις, οι οποίες είναι απαραίτητες για την παραγωγή γαλακτικού, είναι φρουκτόζη-6-φωσφορική (F6P), ένα από τα προϊόντα του TKTL1. Επιπλέον, TKTL1 υπερέκφραση ευνοεί ορθοξικές σταθεροποίηση της κακοήθειας που προάγουν παράγοντα μεταγραφής προκαλείται από υποξαιμία παράγοντα-1α (HIF-1α) [16] και την προς τα πάνω ρύθμιση των κατάντη γλυκολυτικά ένζυμα όπως μεταφορέα γλυκόζης 1 (GLUT1) και PFKFB3 [16], [ ,,,0],60]. Όπως έχουμε δει, TKTL1 παίζει σημαντικό ρόλο σε πυροσταφυλικό και παραγωγή γαλακτικού μέσω τελικών προϊόντων, φρουκτόζη-6-φωσφορική και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής της. Επομένως, δεδομένου ότι πυροσταφυλικό και γαλακτικό ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από υποξαιμία και αδρανοποιούν αποσύνθεση HIF-1α [61], [62], TKTL1 υπερέκφραση μπορεί να διεγείρει τη συσσώρευση του HIF-1α σε ένα υποξικό-ανεξάρτητο τρόπο και να προωθήσει την έκφραση του HIF-1 -regulated γονίδια που εμπλέκονται σε γλυκολυτικά μεταβολισμό, την αγγειογένεση και την επιβίωση των κυττάρων.
εν ολίγοις, κατά τη διάρκεια καρκινογένεση έναρξη, οι μεταλλάξεις στα μέλη Ras θα μπορούσε να συσσωρεύονται και οδηγούν σε απομεθυλίωση TKTL1 προαγωγό και την ενεργοποίηση της έκφρασης του. Το φαινόμενο αυτό θα μπορούσε να επιλεγεί επειδή δραστηριότητα TKTL1 θα επιτρέπουν μετασχηματισμένα κύτταρα να καταναλώνουν γλυκόζη σε απουσία οξυγόνου, παράγουν γαλακτικό και οξίνιση μικροπεριβάλλον τους, ενισχύοντας έτσι τη διεισδυτικότητα της. TKTL1 μπορεί επίσης να οδηγήσει σε υποξικές ανεξάρτητη σταθεροποίηση HIF-1α και την επακόλουθη υπερέκφραση διαφόρων γλυκολυτικών και αγγειογόνων γονίδια, παρέχοντας το κατάλληλο περιβάλλον για την εξέλιξη του όγκου. Όσον αφορά το σχηματισμό μετάστασης δύο πιθανοί μηχανισμοί θα μπορούσαν να εξηγήσουν παρατηρούμενα δεδομένα: i) TKTL1 υπερέκφραση όχι μόνο να οδηγήσει σε εξέλιξη του όγκου, αλλά επίσης θα μπορούσε να επιτρέψει το σχηματισμό μετάστασης, και όταν είναι εγκατεστημένος μετάσταση, TKTL1 δεν είναι πλέον απαραίτητη, και όπως η συχνότητα εμφάνισης του μεταλλαγμένου
ras
, μειώνεται. ii) TKTL1 είναι απαραίτητη για την εξέλιξη του όγκου in situ και τοπικές εισβολής, αλλά οι όγκοι που δεν υπερεκφράζουν το ένζυμο είναι ανίκανα να αναπτύσσονται σε τοπικό περιβάλλον και επάγουν την μεταστατική συμπεριφορά ως στρατηγική επιβίωσης όγκου μέσω ενός δαρβινική διαδικασία επιλογής.
Αυτή η έκθεση ρίχνει φως στο ρόλο της TKTL1 στην πρόοδο του όγκου, και στοχεύει να είναι το πρώτο βήμα προς μια νέα προσέγγιση στη μελέτη της θεραπείας μετάστασης και καρκίνου.
Υλικά και Μέθοδοι
ηθική Δήλωση
έγκρισης δεοντολογίας για τη μελέτη λήφθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας στο Νοσοκομείο κλινική της Βαρκελώνης, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και όλους κλινικές έρευνες έχουν διεξαχθεί σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη της Ελσίνκι.
ασθενείς
στην παρούσα μελέτη, συμπεριλήφθηκαν 46 άνδρες και 17 γυναίκες (70 ± 11 ετών) με ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) που υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση μεταξύ Νοεμβρίου 2000 και Οκτωβρίου 2001. Σύμφωνα με ΤΝΜ ταξινόμηση του παχέος εντέρου και του ορθού καρκίνου του αμερικανικού μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC), 9 ασθενείς παρουσιάζονται με σταδίου Ι όγκους, 21 με τη φάση ΙΙ, 16 με σταδίου ΙΙΙ και 17 με το στάδιο IV.
Όλοι οι ασθενείς προσλήφθηκαν στο τμήμα Γαστρεντερολογίας στην Κλινική της Βαρκελώνης, και ήταν μέρος του έργου EPICOLON, μια προοπτική, πολυκεντρική, σε εθνικό επίπεδο, βασισμένη στον πληθυσμό μελέτη είχε ως στόχο τον καθορισμό της συχνότητας και των χαρακτηριστικών των κληρονομικών και οικογενειακές του παχέος μορφές καρκίνου σε Ισπανία [63]. Σε αυτό το έργο, όλοι οι νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς CRC σε κάθε συμμετέχοντα κέντρο κατά τη διάρκεια ενός έτους συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη.
Μετά την χειρουργική εκτομή, οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε τυπική θεραπευτική και μέτρα παρακολούθησης σύμφωνα με τις συνιστώμενες κατευθυντήριες γραμμές. Πράγματι, μετεγχειρητική επικουρική θεραπεία με 5-φθοροουρακίλη και λευκοβορίνη ρουτίνας χορηγείται σε ασθενείς με σταδίου II και III όγκων, και η θεραπεία ακτινοβολίας ενδείκνυται σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού. Μετεγχειρητική επιτήρηση αποτελείται από το ιατρικό ιστορικό, φυσική εξέταση και εργαστηριακές μελέτες, συμπεριλαμβανομένων καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο του ορού (CEA) επίπεδα κάθε τρεις μήνες, κοιλιακό υπερηχογράφημα ή αξονική τομογραφία κάθε έξι μήνες και ακτινογραφία θώρακος και το συνολικό κολονοσκόπηση μία φορά το χρόνο. Επιπλέον, όλοι οι υποτροπές όγκου ανιχνευθεί κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης ήταν ιστολογικά επιβεβαιωμένη.
Η ανοσοϊστοχημική χρώση
Αμέσως μετά τη χειρουργική εκτομή, όγκοι καταψύχθηκαν και διατηρούνται σε υγρό άζωτο. Για την πραγματοποίηση της χρώσης, οι τομές CRC ελήφθησαν χρησιμοποιώντας vibrotom περικοπές, ήταν αφυδατωμένο να αποτραπεί η υποβάθμιση και διατηρήθηκε σε εργαστηριακές συνθήκες περιβάλλοντος μέχρι τη χρήση.
παχέος δειγμάτων καρκίνου κόπηκαν σε τομές των 2 έως 5 μm, τοποθετήθηκαν σε πλακίδια και σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη. Τα πλακίδια ενυδατώνονται με ξέπλυμα τους σε μειούμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης. Για αντιγόνο αποκάλυψη δείγματα θερμάνθηκαν στους 65 ° C περίπου. σε 10 mM ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0) για 5 λεπτά. Μετά το ξέπλυμα σε απεσταγμένο H
2O, η αναστολή της ενδογενούς υπεροξειδάσης εκτελέστηκε με επώαση 10 λεπτών με 3% Η
2O
2. Τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 3% BSA σε PBS για 15 λεπτά για να εμποδίσει μη ειδική χρώση. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-TKTL1 αντίσωμα (κλώνος JFC12T10) περιγράφηκε προηγουμένως από τους Coy [32] σε συγκέντρωση 4 μg mL
-1 για 60 λεπτά σε υγροποιημένο θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένη αντι-ποντικού ανοσοσφαιρίνες (Βιοτινυλιωμένη Link, LSAB + -kit, DakoCytomation, Hamburg, Germany) για 25 λεπτά και, μετά από ένα νέο πλύσιμο με PBS, κατεργάστηκαν με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (Στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ , LSAB + -kit, DakoCytomation, Αμβούργο, Γερμανία) για 25 λεπτά περισσότερο. Τέλος τα δείγματα επωάστηκαν με 3-3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB + Chromogen, DakoCytomation, Αμβούργο, Γερμανία) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να ληφθεί η χρώση.
έκφραση TKTL1 αξιολογήθηκε με ανάλυση εικόνας χρησιμοποιώντας ένα LEICA DM 4000 Β μικροσκόπιο (Leica Microsystems, Γερμανία), ένα μονοχρωματικό IEEE-1394 CFW-1312M κάμερα (Scion Corporation, Frederik, MD, USA) και το δημόσιο τομέα ΝΙΗ Imaging ImageJ πρόγραμμα λογισμικού, που διατίθεται μέσω του Διαδικτύου από το URL: http: //rsbweb .nih.gov /θ /. Η ένταση μετρήθηκε ως «σχετική ένταση /περιοχής» και ποσοτικοποιείται με παρεμβολή σε μια καμπύλη βαθμονόμησης σχεδιάζεται χρησιμοποιώντας μία κλίμακα του γκρι. Για κάθε δείγμα 3 ή 4 εικόνες από διαφορετικές περιοχές συνελήφθησαν και τη χρώση μιας ζώνης ομολόγου ενός αρνητικού μάρτυρα, επωάστηκαν με 3% BSA σε PBS χωρίς αντίσωμα αντι-TKTL1, αφαιρέθηκε. Οι τιμές παρουσιάζονται ως «σχετική αξία × 1000″ αυθαίρετες μονάδες (Α.υ.). Αυτό το είδος της πληροφορικής ποσοτικοποίηση της χρώσης απαιτεί 8-bit μονοχρωματικές εικόνες (Εικόνα 2) και ποσοτικοποιεί γκρι ένταση μέσα σε μια κλίμακα βαθμονόμησης [64], [65] δίνοντας μια αξιολόγηση της έκφρασης TKTL1 που επιτρέπει πολύ πιο αντικειμενικές συγκρίσεις μεταξύ των δειγμάτων από ταξινομήσεων από αυθαίρετη σκορ.
πρωτεΐνη Εξόρυξη
η ολική πρωτεΐνη καθαρίστηκε 6-19 mg κατεψυγμένων χειρουργικά δείγματα. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους στους 4 ° C με έναν ανιχνευτή τιτάνιο σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM HEPES ρΗ 7,5, 10% (ν /ν) γλυκερόλη, 0,4 Μ NaCl, 0,4% (ν /ν) Triton Χ-100, 10 mM EGTA, 5 mM EDTA, 25 mM NaF, 25 mM Na β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM DTT, αναστολείς πρωτεάσης 1 ×, 0.4 mM Pefabloc SC και 20 μg /ml πεπστατίνη. Μετά τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν ηχητική επεξεργασία στους 4 ° C και 16.000 RCF επί 20 λεπτά.
You must be logged into post a comment.