Αφηρημένο

Σκύλοι με φυσικά καρκίνο αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό μεγάλο ζωικό μοντέλο για την ανάπτυξη φαρμάκων και τη δοκιμή νέων ανοσοθεραπεία. Ωστόσο, κακώς ορίζεται ανοσοφαινότυπους του σκύλου λευκοκύτταρα έχουν περιορίσει τη μελέτη της ανοσολογίας όγκων σε σκύλους. Η συσσώρευση που προέρχονται μυελοειδούς κατασταλτικών κυττάρων (MDSCs) είναι γνωστό ότι είναι ένα βασικό μηχανισμό ανοσοκαταστολής σε ποντίκια που φέρουν όγκο και σε ανθρώπους ασθενείς. Επιδιώξαμε να εντοπίσει MDSCs στο αίμα των σκύλων με καρκίνο. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από σκύλους με προχωρημένο ή πρώιμο καρκίνο στάδιο και από ίδιας ηλικίας υγιή δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και μικροσκοπία. Καταπιεστικό λειτουργία ελέγχθηκε σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων και επεξεργασία κυτοκίνης Τ. Ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό δυνητικών μηχανισμών που ευθύνονται για ανοσοκαταστολή. PBMCs από τα σκυλιά με προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των CD11b

+ CD14

-MHCII

– κυττάρων σε σύγκριση με τους σκύλους διαγνωστεί με πρώιμο στάδιο μη μεταστατικών όγκων και υγιή σκυλιά. Αυτά CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα αποτελούν υποπληθυσμό των ενεργοποιημένων κοκκιοκυττάρων που συν-καθαριστεί με PBMCs, οθόνη πολυμορφοπύρηνα κοκκιοκύτταρα μορφολογία, και να επιδείξει μια ισχυρή ικανότητα να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και IFN-γ σε Τ κύτταρα από φυσιολογικούς και φέροντες όγκο δότες. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν σήμα κατατεθέν κατασταλτικός παράγοντες της ανθρώπινης MDSC συμπεριλαμβανομένων ARG1, iNOS2, ΤΟΡ-β και IL-10. Συνοπτικά τα δεδομένα μας δείχνουν ότι MDSCs συσσωρεύονται στο αίμα των σκύλων με προχωρημένο καρκίνο και μπορεί να μετρηθεί με τη χρήση αυτού του ανοσοφαινότυπο τρεις-δείκτη, επιτρέποντας έτσι προοπτικές μελέτες που μπορούν να παρακολουθούν MDSC επιβάρυνση

Παράθεση:. Goulart MR, Pluhar GE , Ohlfest JR (2012) Προσδιορισμός των Μυελογενής Προέρχεται κατασταλτικών κυττάρων σε σκύλους με φυσικώς απαντώμενα Καρκίνο. PLoS ONE 7 (3): e33274. doi: 10.1371 /journal.pone.0033274

Επιμέλεια: Σοφία Ν Καραγιάννης, King College του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 28 Οκτ 2011? Αποδεκτές: 10 του Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2012 |

Copyright: © 2012 Goulart et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις με τον Δρ Ohlfest από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (ΝΙΗ R21-NS055738), και την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (RSG-09-189-01-LIB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος είναι η πρώτη αιτία θανάτου σε ενήλικες σκύλους στις Ηνωμένες Πολιτείες, την Αυστραλία, την Ιαπωνία και την Ευρώπη και θεωρείται το μεγαλύτερο υγειονομικής περίθαλψης ανησυχία των ιδιοκτητών κατοικίδιων ζώων. Περίπου τέσσερα εκατομμύρια σκύλοι έχουν διαγνωστεί με καρκίνο κάθε χρόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Φυσικά συμβαίνουν malignances σε σκύλους έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά με καρκίνους του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένων παρόμοια βιολογία του όγκου, της γενετικής, τα ποσοστά εμφάνισης, ιστολογική εμφάνιση, και την ανταπόκριση στις συμβατικές θεραπείες (αναθεωρηθούν [2]). Οι όγκοι σε σκύλους πρόοδος σχετικά ταχύτερα από ό, τι την ίδια ασθένεια σε ανθρώπους, επιτρέποντας ζητήματα που σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα της θεραπείας (εξέλιξη και επιβίωση) που πρέπει να αντιμετωπιστούν ταχύτερα σε σκύλους. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα του μοντέλου σκύλου είναι η δυνατότητα να δοκιμάσει πειραματικά θεραπευτικά σε δόσεις ανθρώπινη κλίμακα στη ρύθμιση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου, η οποία είναι δύσκολο να γίνει με ουσιαστικό τρόπο σε μικρά τρωκτικά που έχουν σχετικά ταχεία κινητική ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, επειδή το πρότυπο φροντίδας για πιο κυνικός όγκοι είναι ελάχιστα ιδρύθηκε, υπάρχει πολύ μεγαλύτερη ευελιξία στο σχεδιασμό της μελέτης σε σύγκριση με κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους. Συλλογικά αυτά τα χαρακτηριστικά κάνουν το σκυλί μια εξαιρετική πλατφόρμα για Translational Medicine.

Pet σκυλιά με τον καρκίνο γίνονται γρήγορα ένα σημαντικό εργαλείο που χρησιμοποιείται στην ανάπτυξη φαρμάκων. Ένα από τα καλύτερα παραδείγματα αυτού είναι η πρόσφατη παράλληλη ανάπτυξη των SU11654, ένας αναστολέας της τυροσινικής κινάσης πολλαπλών-στόχων, και του sunitinib malate (SU11248). Και τα δύο φάρμακα είναι ισχυροί αναστολείς της PDGFR, VEGFR, ΚΙΤ και FLT3. Μελέτες σε σκύλους με διάφορους συμπαγείς όγκους αποκάλυψαν ότι η συγκέντρωση του SU11654, την κατάστασης μεταλλάξεων του ΚΙΤ πλάσμα, και η αναστολή της φωσφορυλίωσης ΚΙΤ ήταν έντονα προβλεπτική της κλινικής αποτελεσματικότητας. Βέλτιστη παραμέτρους δόσης και την τοξικότητα ιδρύθηκαν σε σκύλους, καθώς και. Αυτές οι πρωτοποριακές μελέτες διευκόλυνε σημαντικά την περαιτέρω ανάπτυξη ολόκληρης αυτής της κατηγορίας φαρμάκων, κυρίως την έγκριση του sunitinib malate από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία του νεφροκυτταρικού καρκινώματος (RCC) και στρωματικών όγκων του γαστρεντερικού κυττάρων, τα οποία περιέχουν συχνά παρόμοιες KIT μεταλλάξεις [3]. Αργότερα αναγνωρίστηκε ότι το sunitinib μειώνει σημαντικά MDSCs και αποκαθιστά την λειτουργία των Τ κυττάρων σε ασθενείς με ανθρώπινο RCC [4], μια παρατήρηση που δεν θα μπορούσαν να έχουν γίνει σε σκύλους κατά τη στιγμή λόγω της περιορισμένης αντιδραστηρίων σκύλου και κακώς που ορίζονται δείκτες για κυνικός λευκοκύτταρα. Εμείς, και άλλοι, δοκιμάζουν νέες θεραπείες του ανοσοποιητικού που βασίζεται σε σκύλους με διάφορες κακοήθειες, αλλά η ανοσολογική παρακολούθηση σε αυτές τις μελέτες έχει ανατραπεί από το ίδιο πρόβλημα. Για να τεθεί το πεδίο σε μια προοπτική, μια επιφάνεια ανοσοφαινότυπο για κυνικός φυσικών φονικών κυττάρων δεν έχει ορισθεί, τα αλληλόμορφα MHC είναι ελάχιστα κατανοητές, και πολλοί από τους δείκτες που χρησιμοποιούνται βασίζονται σε εγκάρσια-αντιδρώντα αντισώματα σύμφωνα με την οποία η ειδικότητα πρέπει να δοκιμαστεί εμπειρικά. Είναι ζωτικής σημασίας ότι οι νέες αντιδραστήρια αναπτυχθεί και ότι οι ανοσοφαινότυπους όλων των μεγάλων σκύλων υποσύνολα λευκοκυττάρων προσδιορίζεται. Για τον καθορισμό αυτό το βασικό θεμέλιο θα επιτρέψει μοναδικές ιδέες που πρέπει να γίνουν ως νέα φάρμακα μικρών μορίων και η ανοσοθεραπεία δοκιμάζονται σε σκύλους ως προοίμιο για ανθρώπινες δοκιμές.

Η συσσώρευση MDSCs σε ποντίκια και ανθρώπους που φέρουν όγκο με τον καρκίνο είναι γνωστό να αποτελεί βασικό μηχανισμό διαφυγής όγκου από το ανοσοποιητικό επιτήρησης [5], [6], [7]. MDSCs περιλαμβάνουν ένα φαινοτυπικά ετερογενή πληθυσμό μυελοειδών κυττάρων σε πρώιμα στάδια της διαφοροποιήσεως που επεκτείνουν στον καρκίνο και πολλές άλλες παθολογικές καταστάσεις, και έχουν ισχυρή ικανότητα να καταστέλλουν τη λειτουργία των Τ κυττάρων, ειδικά Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τελεστές κυτοκίνης παραγωγή [6], [8] . MDSCs μπορεί να διαιρεθεί σε μονοκυτταρικά και κοκκιοκυτταρικής υποτύπους. Μία πηγή διαμάχης σε αυτόν τον τομέα είναι ότι MDSC ετερογένεια έχει κάνει συγκρίσεις μεταξύ των ασθενών με καρκίνο και τα μοντέλα ποντικών όγκου αμφισβήτηση (βλέπε αναφορά [9] για την εξαιρετική προοπτική). Οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους MDSCs αναστέλλουν τη λειτουργία των Τ κυττάρων είναι υπό διερεύνηση. Μελέτες έχουν ενοχοποιηθεί πάνω ρύθμιση της αργινάσης 1 (ARG1), διεγέρσιμης συνθάσης νιτρικού οξειδίου (iNOS2) και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ως σημαντικούς παράγοντες για MDSC ανοσολογική καταστολή [8], [10], [11]. ARG1 μπορεί βαθιά διαταράξει τη λειτουργία των κυττάρων Τ στη θέση του όγκου με εξάντληση L-αργινίνη, προκαλώντας την αντίδραση λιμοκτονία αμινοξέων και την απόπτωση στα λεμφοκύτταρα [7]. Ένας άλλος μηχανισμός του ανοσοκαταστολή είναι χημειοκίνη νίτρωση, η οποία αμβλύνει τελεστή διείσδυση Τ κυττάρων εντός της θέσεως του όγκου [12]. Επιπλέον, MDSC επέκταση συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω της L-σελεκτίνης επί

+ Τ κύτταρα [13] CD4

+ και CD8. Αυτό μειώνει κίνησης των κυττάρων Τ σε δευτερογενή λεμφοειδή όργανα όπου όγκου-αντιδρώντα Τ κύτταρα μπορούν να ασταρωθεί [13]. Λόγω της ικανότητας του MDSCs να ρυθμίζουν προς τα κάτω την ανοσοαπόκριση έναντι όγκων σε ποντικούς και σε ανθρώπους, υποθέσαμε ότι αυτά τα κύτταρα θα παίξουν επίσης σημαντικό ρόλο στην προκαλούμενη από όγκο ανοσοκαταστολής σε σκύλους με καρκίνο. Ως εκ τούτου, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιορίσει τους δείκτες επιφάνειας που χαρακτηρίζουν την ύπαρξη MDSCs σε σκύλους.

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός μελέτης και συλλογής δειγμάτων

Η περιγραφή των όλοι οι σκύλοι σε αυτήν τη μελέτη συνοψίζονται στους πίνακες 1 και 2, με περισσότερες λεπτομέρειες παρέχονται στους πίνακες S1 και S2.

η

Πίνακας S3 είναι μια περίληψη των δειγμάτων προσδιορίστηκαν σε κάθε σχήμα. Τα κλινικά δεδομένα ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία. σκυλιά ελέγχου προσδιορίστηκαν να είναι υγιείς με βάση τη φυσική εξέταση, τις παρατηρήσεις ιδιοκτήτη και πλήρεις εξετάσεις γενική αίματος. Για σκύλους με τον καρκίνο, η διάγνωση και ο όγκος σταδιοποίηση βασίστηκαν σε πλήρη φυσική εξέταση, ιστοπαθολογία των δειγμάτων της βιοψίας του όγκου, το έργο του αίματος και εξειδικευμένες εξετάσεις απεικόνισης, όπως αξονική τομογραφία, υπερηχογράφημα ή ακτινογραφίες, να εκτιμήσει τη θέση και το μέγεθος του όγκου, καθώς και η παρουσία μεταστατικής νόσου. Σκύλοι με μεγάλα, νεκρωτικές ή πολλαπλές μάζες, λυτική ή σοβαρή καταστροφή των οστών (με οστεοσάρκωμα) ή παρουσία μετάστασης, τοποθετήθηκαν σε προχωρημένο στάδιο /μεταστατικό ομάδα. Ζώα που εμφανίζουν μικρές μάζες ή καθόλου μεταστατικά οζίδια τοποθετήθηκαν σε πρώιμο στάδιο μη μεταστατικό ομάδα. Πίνακες S1 και S2 λίστα και λεπτομέρειες σχετικά με οποιαδήποτε θεραπεία που τα σκυλιά με τον καρκίνο είχε λάβει πριν ή κατά τη στιγμή της συλλογής αίματος για τη μελέτη αυτή.

Τα δείγματα αίματος τόσο από τον καρκίνο και υγιείς σκύλους ελέγχου ελήφθησαν ειδικά για αυτή τη μελέτη . Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε σωλήνες με ηπαρίνη από τις Ογκολογίας και την πρακτική της Κοινότητας Υπηρεσίες του Ιατρικού Κέντρου Κτηνιατρικών στο Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήσης. Τα δείγματα που μετά οι ιδιοκτήτες υπέγραψαν το έντυπο συγκατάθεσης του πελάτη. Η Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) μελέτησε και ενέκρινε τη μελέτη με τίτλο «ανοσοφαινότυπου κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων περιφερικού αίματος στα σκυλιά» μέσω καθορισμένων επανεξέταση μέλος με τον κωδικό αριθμό 0912A75493. Εκτός αν δηλώνεται ρητά το αντίθετο, τα κύτταρα αναλύονται για αυτό το χειρόγραφο συν-καθαρίζεται με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) των σκύλων με καρκίνο ή ίδιας ηλικίας υγιή δείγματα αναφοράς που απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Ficoll (Sigma) βαθμιαία φυγοκέντρηση ως ακολούθως. Ηπαρινισμένο περιφερικό αίμα αραιώθηκε 1:03 με στείρο PBS (Invitrogen) και επιστρώθηκε επί Ficoll-Histopaque (Sigma). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 400- χ g για 30 λεπτά. Τα PBMC που συνελέγησαν σε διεπαφή μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και επαναιωρήθηκαν με διάλυμα ψύξης που αποτελείται από 90% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen) 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma) και στη συνέχεια καταψύχθηκε στους -80 ° ΝΤΟ. Τέλος, PBMCs αποψύχθηκαν για 2 λεπτά σε ένα λουτρό ύδατος C 37 ° πριν από τη χρώση και την ανάλυση. Για την ανάλυση των φρέσκων δειγμάτων, PBMCs απομονώθηκαν όπως παραπάνω, επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS, χρωματίστηκαν με αντισώματα και αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής ή FACS όπως υποδεικνύεται.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

δείγματα PBMC απομονώθηκαν από φρέσκο ​​αίμα ή ξεπάγωσαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS. Η μη ειδική σύνδεση αντισώματος δεσμεύεται δια προκατεργασίας των κυττάρων με 10 μg /mL κυνικός γ-σφαιρίνη (Jackson Immunoresearch) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πρώτα επισημάνθηκαν χρησιμοποιώντας έμμεση χρώση με 0.1 μα μη-συζευγμένου αντι-σκύλου ποντικού CD11b αντίσωμα (κλώνος CA16.3E10, Abd Serotec) ή ισότυπου ελέγχου IgG1 (ΝΑΒ Serotec) και 0.5 μg ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας F (ab ‘) 2 αντι -mouse IgG (Abcam) δευτερεύον αντίσωμα σε 4 ° C για 30 λεπτά σε ένα σκοτεινό δωμάτιο. Μετά έμμεση χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και χρωματίστηκαν με 0,3 μg του ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-σκύλου αρουραίου MHCII (κλώνος YKIX334.2, Abd Serotec) και 0,15 μg του διασταυρούμενης αντίδρασης, Alexa fluor 647-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD14 αντίσωμα (κλώνος TÜK4, Abd Serotec) ή ισότυποι έλεγχοι στους 4 ° C για 30 λεπτά σε ένα σκοτεινό δωμάτιο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. κύτταρα αντίσωμα σημασμένο πλύθηκαν δύο φορές και επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό FACS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι με 7-αμινο-ακτινομυκίνη D (7ΑΑϋ, τελική συγκέντρωση 1 μg /mL? Calbiochem) και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε ένα Becton Dickinson Canto τριών λέιζερ κυτταρόμετρο ροής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν περαιτέρω με το λογισμικό FlowJo (Δέντρο Star). πύλες ανάλυση ορίστηκαν με βάση την αρνητική πληθυσμό 7ΑΑΌ. Το ποσοστό των MDSCs υπολογίστηκε με βάση το ποσοστό των CD11b

+ CD14

-MHCII

– κυττάρων εντός του συνολικού πληθυσμού ζωντανή PBMC. Σε ένα πείραμα (Εικόνα S1), αντι-ποντικού συζευγμένο με ΡΕ CD11b (κλώνος Μ1 /70 eBioscience) και αντι-ποντικού ΑΡΟ-συζευγμένο Gr-1 (κλώνος RB6-8C5 eBioscience) αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την επαλήθευση διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με το σκύλο κυττάρων.

απομόνωση MDSCs, PMNs και Τ κύτταρα

για λειτουργικές δοκιμασίες, RT-PCR και ανάλυση της κυτταρικής μορφολογίας, φρέσκο ​​δείγματα αίματος από έναν σκύλο που φέρει όγκο χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των CD11b

+ CD14

-MHCII

– ή CD11b

+ CD14

+ MHCII

– κυττάρων, όπως αναφέρεται, χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα κυττάρων BD FACSAria. Για την απομόνωση των Τ κυττάρων, PBMCs απομονώθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως από φρέσκα δείγματα αίματος από υγιείς σκύλους και χρωματίστηκαν με 0,3 μg του ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-σκύλου ποντικού CD3 (κλώνος CA17.2A12, Abd Serotec), 0,15 μα Ειρηνικού μπλε-συζευγμένο ποντικού αντι-σκύλου CD4 (κλώνος YKIX302.9, ABD Serotec) και 0,15 μg του Alexa700-συζευγμένο αντι-σκύλου CD8 ποντικού (κλώνος YCATE55.9, Abd Serotec) αντισώματα. λευκοκύτταρα πολυμορφοπύρηνα (ΡΜΝ) καθαρίστηκαν από το κυτταρικό σφαιρίδιο μίας βαθμίδας Ficoll από δείγματα αίματος υγιών σκυλιών, μετά την απομάκρυνση του PBMCs (στην κορυφή της βαθμίδας) και ερυθροκύτταρα με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RBC (eBioscience).

Ex Vivo

διάδοσης

Ανάλυση της ανασταλτικής δράσης MDSC στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ μετρήθηκε με

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης στο DNA. Εν συντομία, PBMCs από τις υποδεικνυόμενες σκυλιά σπάρθηκαν σε U-bottom 96 φρεατίων πλάκες (5 × 10

4cells /φρεάτιο) σε μέσο που αποτελείται από RPMI 1640 που περιέχει L-αργινίνη (150 μΜ) (Invitrogen) συμπληρωμένο με πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) και 10% απενεργοποιημένο με θερμότητα βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen) στους 37 ° C, σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. CD11b

+ CD14

-MHCII

– ή CD11b

+ CD14

+ MHCII

– κύτταρα από ένα σκυλί με καρκίνο είχαν ταξινομηθεί και να προστεθούν στον καρκίνο (αυτόλογα) ή υγιή PBMCs ανταπόκρισης Οπως αναφερεται. Κονκαναβαλίνη Α (5 μg /ml) (Sigma) και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-2 (10 IU /ml) (R &? Συστήματα D) χρησιμοποιήθηκαν για να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. Μη διεγερμένα PBMCs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. PBMCs ή PMNs συν-καλλιεργήθηκαν με υγιή PBMCs για τον έλεγχο για την επίδραση της απλής προσθήκης επιπλέον κύτταρα με την δοκιμασία καταστολής όπως υποδεικνύεται. Πλάκες καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες, στη συνέχεια δονήθηκαν με 1 μθΐ

3Η-θυμιδίνης (Amersham Pharmacia Biotech) για 18 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε φίλτρα γυάλινων ινών (Perkin Elmer), πλένεται, ξηραίνεται, και μετρήθηκαν. Πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις μετρήθηκαν με

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης εντός του DNA χρησιμοποιώντας ένα Matrix 96 Direct Beta Counter (Packard). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

Αναλύσεις

IFN-γ

FACS-απομονωθεί CD11b

+ CD14

-MHCII

-. Κύτταρα από ένα σκυλί καρκίνο συν-καλλιεργήθηκαν με PBMCs απομονώνονται από έναν υγιή σκύλο χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο όπως η δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Μετά από 72 ώρες επώασης τα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Quantikine κυνικός ΙΡΝ-γ κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (R &? Συστήματα D). Τα δείγματα αναλύθηκαν χρωματομετρικά, εις τριπλούν, χρησιμοποιώντας ένα Microplate Reader Synergy2 (Biotek) και αναλύθηκαν με μικροπλάκας συλλογή και ανάλυση δεδομένων Λογισμικό Gen5 (Biotek).

Cytospin

FACS-απομονωθεί CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα βάφονται χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη χρώση Giemsa (Diff-Quick, Astral Diagnostics Inc) για την αξιολόγηση των κυττάρων μορφολογία και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα DME μικροσκόπιο (Leica) σε 63 × μεγέθυνση εξουσία. Εικόνες αποκτήθηκαν με μια φωτογραφική μηχανή EC3 (Leica).

εξαγωγή RNA και RT-PCR

Το RNA που εξάγεται από FACS-απομονωθεί CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα ή υγιή PMNs σκύλο, χρησιμοποιώντας ένα RNAeasy συν Mini kit (QIAGEN) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις RNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ΝΔ (100) φασματοφωτόμετρο (Nanodrop). Για την ανίχνευση της έκφρασης του ARG1 και iNOS2 ένζυμα, ειδικά για το γονίδιο εκκινητές σχεδιάστηκαν με βάση την κυνικός ARG1 και αλληλουχία iNOS2? αλληλουχίες εκκινητή για γονιδιακή καθαριότητας σχεδιάστηκαν από κυνόδοντα γονίδιο της β-ακτίνης χρησιμοποιώντας Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Για την ανίχνευση των κυτοκινών IL-10 και ΤΟΡ-β, εκκινητή αλληλουχίες των IL-10 και ΤΟΡ-β ελήφθησαν από δημοσιευμένες πηγές [14]. Ο αλγόριθμος BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) χρησιμοποιήθηκε για να διασφαλίσει εκκινητή ειδικότητα προς το γονίδιο-στόχο. Πρώτου κλώνου cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κιτ QuantiTect αντίστροφη μεταγραφή (QIAGEN). Η αντίδραση δύο σταδίων PCR διεξήχθη σε ένα 12,5-μΙ όγκου που περιέχει 2 χ SYBR πράσινο κύριο μείγμα (Quanta Biosciences), 0.675U GoTaq Polymerase, 2 ηΜ MgCl

2 (Promega), 0,2 mM dNTPs (Stratagene), 0,2 μΜ από κάθε ζεύγος εκκινητών και 50 ng του εκμαγείου cDNA. Οι συνθήκες αντίδρασης αποτελούνταν από την αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 2 λεπτά, στη συνέχεια κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 s, ανασύνδεση στους 60 ° C για 45 s, επιμήκυνση στους 72 ° C για 45 s και τελική επιμήκυνση στους 72 ° C για 5 λεπτά σε ένα DNA Thermal Cycler Engine (Bio-Rad). Η βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης για κάθε ζεύγος εκκινητών ιδρύθηκε πριν από τη μελέτη (βλέπε αλληλουχίες εκκινητή στον πίνακα S4). Τα προϊόντα PCR διέτρεξαν επί πηκτωμάτων αγαρόζης 2% που περιέχει βρωμιούχο 0,5 μl /ml αιθίδιο και απεικονίστηκε υπό 590 nm υπεριώδες φως σε ένα σταθμό εικόνα Eagle Eye II (Stratagene). Οι αρνητικές συγκριτικές αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας RNA το οποίο δεν είχε υποβληθεί σε αντίστροφη μεταγραφή PCR.

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο, δύο ουρών του Student

t test

. Όλες οι δοκιμές έγιναν με Prism 4 λογισμικό (Graph Pad Software, Inc.). Ρ τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Σκύλοι με προχωρημένο καρκίνο έχουν αυξημένα επίπεδα της κοκκιοκυτταρικής CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα. ότι συν-καθαριστεί με PBMCs

δείγματα περιφερικού αίματος από 45 σκύλους διαγνωστεί με καρκίνο και 18 υγιή σκυλιά ελέγχου συλλέχθηκαν (πίνακες 1 και 2). Όλα τα σκυλιά με τον καρκίνο υποβλήθηκαν σε κλινική σταδιοποίηση της νόσου τους εκτελώντας πλήρη φυσική εξέταση, το έργο του αίματος, της απεικόνισης για την αξιολόγηση τοποθεσία του όγκου και το μέγεθος και οι μεταστάσεις, και ιστοπαθολογική διάγνωση γίνεται από διαγνωστικές αναρρόφηση ή βιοψία του όγκου. Μεταξύ των 45 σκύλων διαγνωστεί με καρκίνο, 30 σκύλοι είχαν ταξινομηθεί ως έχουν προχωρημένη ή μεταστατική νόσο και 15 σκυλιά είχαν ταξινομηθεί ως πρώιμο στάδιο /μη μεταστατικό ή χαμηλής ποιότητας νόσου με βάση την κλινική σταδιοποίηση. Κάθε ομάδα υποδιαιρέθηκε περαιτέρω σύμφωνα με ιστολογική διάγνωση σε σαρκώματα, καρκινώματα ή όγκους των μαστοκυττάρων (λεπτομερώς στους πίνακες S1 και S2). Τα ποσοστά των θεωρούμενων MDSCs σε σκύλους με καρκίνο και υγιείς σκύλους αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. PBMCs από τα σκυλιά με προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο του έδειξε μια αξιοσημείωτη αύξηση του CD11b

+ CD14

-MHCII

– κλάσμα των κυττάρων, η οποία αντιπροσώπευε την πλειονότητα των κυττάρων στην πύλη ζωντανών κυττάρων, σε σύγκριση με τα σκυλιά διαγνωστεί με πρώιμο στάδιο μη-μεταστατικών όγκων ή υγιείς μάρτυρες σκύλος (Εικ. 1Α). Αυτό το υποσύνολο των κυττάρων παρουσίασαν πολυμορφοπύρηνα κοκκιοκυτταρική μορφολογία σε ετερογενή στάδια της ανάπτυξης (Εικ. 1Β), το οποίο μοιάζει με ένα κοκκιοκυτταρική υποσύνολο MDSCs προσδιορίζονται σε ποντικούς [15] και στον άνθρωπο [16].

PBMCs από υγιείς σκύλους και σκυλιά με τον καρκίνο βάφτηκαν για την μυελοειδή δείκτη CD11b, CD14 μονοκυτταρική δείκτη και MHC II. (Α) Εκπρόσωπος ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του προς τα εμπρός και την πλευρά διασποράς και περιφραγμένο CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα από τους σκύλους με προχωρημένο ή μεταστατικό όγκους σε σύγκριση με τους σκύλους με πρώιμο στάδιο μη μεταστατικών όγκων και υγιή ελέγχου σκυλιά. Οικόπεδα είναι αντιπροσωπευτικά του σκύλου με προχωρημένο μεταστατικό αιμαγγειοσαρκώματος (κορυφή), το πρώιμο στάδιο της ουροδόχου κύστης καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (μέση) και ένα υγιές σκυλί. (Β) FACS ταξινομημένο CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα βάφτηκαν με Diff-Quick για την αξιολόγηση μορφολογία των κυττάρων. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των πολυμορφοπύρηνων κοκκιοκυττάρων μορφολογία του CD11b

+ CD14

-MHCII

– κυττάρων εμφανίζεται σε 63 × μεγέθυνση

Η

Σκύλοι με προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο είχαν σημαντικά μεγαλύτερη. κλάσμα των θεωρούμενων MDSCs (36.04 ± 2.542, μέσος όρος ± SEM) σε σύγκριση με τους σκύλους με πρώιμο στάδιο μη μεταστατικών όγκων (9,40 ± 0,953, μέση ± SEM) και υγιείς σκύλους ελέγχου (10,24 ± 1,412, μέση ± SEM) (Σχ. 2Α). Επιπλέον, αυτή η αύξηση στο CD11b

+ CD14

-MHCII

– κλάσμα δεν φαίνεται να περιορίζεται σε ένα συγκεκριμένο τύπο όγκου. Οι διαφορές ήταν στατιστικώς σημαντικές σε σκύλους με σαρκώματα, καρκινώματα, και μαστοκυττάρων όγκους σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Εικ. 2Β). Αντίθετα, το ποσοστό των CD11b

+ MHCII

– κύτταρα που δεν εκφράζουν το CD14 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ κάθε ομάδας. Ως εκ τούτου, η συχνότητα των CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα που συν-καθαρίσει PBMCs συσχετίζεται με φορτίο όγκου. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με παλαιότερα δημοσιευμένα στοιχεία σχετικά με τα επίπεδα MDSC και το φορτίο του όγκου σε ποντίκια και ανθρώπους [17], [18].

(Α) Ανάλυση του μέσου όρου CD11

+ CD14

-MHCII

– συχνότητα πληθυσμού σε σκύλους με προχωρημένο στάδιο ή μεταστατικούς όγκους (n = 30) σε σύγκριση με το πρώιμο στάδιο μη-μεταστατικούς όγκους (n = 15) και τους σκύλους ελέγχου (n = 18). Υπήρχε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των CD11b

+ CD14

-MHCII

– κυττάρων σε σκύλους με προχωρημένο καρκίνο έναντι πρώιμο στάδιο μη μεταστατικών όγκων και υγιείς σκύλους (36.04% έναντι 9,40% and10.24%, . αντίστοιχα Β) Μέση CD11b

+ CD14

-MHCII

– Η συχνότητα του πληθυσμού στα μεγάλα υποτύπων καρκίνου: προχωρημένο στάδιο ή μεταστατικού σαρκώματα (n = 18), το πρώιμο στάδιο μη μεταστατικό σαρκώματα (n = 6) , προχωρημένο στάδιο ή μεταστατικού καρκινώματα (n = 7) πρώιμο στάδιο μη μεταστατικό καρκίνωμα (n = 7), προχωρημένο στάδιο ή μεταστατικών όγκων των μαστοκυττάρων (n = 5) και πρώιμο στάδιο μη-μεταστατικών όγκων των μαστοκυττάρων (n = 2) σε σύγκριση με τα σκυλιά ελέγχου (n = 18). Σημαντικά αυξημένα ποσοστά εντοπίστηκαν σε όλες τις προηγμένες όγκους υποτύπους σε σχέση με πρώιμους όγκους στάδιο και υγιή σκυλιά. Ποσοστά των CD11b

+ CD14

+ MHCII

– κύτταρα δεν ήταν σημαντική μεταξύ των ομάδων (* υποδηλώνει Ρ & lt? 0.001). Η μέση τιμή ± SEM φαίνονται

Η

CD11b

+ CD14

-MHCII

-. Τα κύτταρα λειτουργικά ορίζεται ως MDSCs

Για να ελέγξετε αν το CD 11 b

+ CD14

-MHCII

– υποσύνολο ήταν σε θέση να αναστέλλουν τη λειτουργία των Τ-λεμφοκυττάρων, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων συν-πολιτισμού. Καθαρισμένο CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα από τρεις διαφορετικούς υποτύπους του καρκίνου του συν-καλλιεργήθηκαν με αυτόλογα ή υγιή PBMCs ανταπόκρισης. Σε όλες τις περιπτώσεις, CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα παρουσίασαν ισχυρή ικανότητα να καταστέλλουν πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα πολλαπλασιαστικής καταστολής αποδεικνύεται χρησιμοποιώντας δείγματα από ένα σκύλο με αμυγδαλικά ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (Εικ. 3Α) και το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη (Σχ. 3Β). Προκειμένου να προσδιοριστεί αν η καταστολή ήταν ένα τεχνούργημα της χρήσης ανταποκρίθηκαν από σκύλους που φέρουν όγκο, προσδιορίσαμε για πολλαπλασιαστικές καταστολή χρησιμοποιώντας συνήθη ανταποκρίθηκαν. Η προσθήκη του CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα, αλλά δεν είναι φυσιολογικό PMNs, εξασθενημένη τον πολλαπλασιασμό των PBMCs από υγιείς σκύλους (Σχήμα 3C.). Επιπλέον, η ποσότητα της έκκρισης ΙΡΝ-γ αξιολογήθηκε στο ρυθμισμένο μέσο από αυτές τις συν-καλλιέργειες, αποκαλύπτοντας ότι CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικά PMNs, κατέστειλε την έκκριση IFN -γ (Σχήμα 3D).

CD11b

+ CD14

-MHCII

-. κύτταρα ταξινομήθηκαν από δείγμα περιφερικού αίματος των σκύλων με καρκίνο και στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με αυτόλογα PBMCs (Α , Β) ή υγιή σκύλο PBMCs (C) υπό την παρουσία του μιτογόνου για 72 hs. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα από ένα σύνολο οκτώ σκύλους δείχνονται. Οι γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις μετά την προσθήκη του CD11b

+ CD14

-MHCII

– απομονώθηκε από ένα μόνο σκυλί με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων (3Α), αδενοκαρκίνωμα του προστάτη (3Β) και οστεοσαρκώματος (3C). Μη διεγερμένα PBMCs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος και PBMCs διεγείρονται κατά την απουσία του CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για τον πολλαπλασιασμό. Τα PBMCs επίσης συν-επωάστηκαν με PMNs, για τον έλεγχο για την παρουσία των πρόσθετων κυττάρων (3C, 3D). Πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις μετρήθηκαν με

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης. CPM, μετρά ανά λεπτό. Ποσό της έκκρισης ΙΡΝ-γ στο συν-καλλιέργεια προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυνικός ειδικές ΙΡΝ-γ ELISA δοκιμασία (3D). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η μέση τιμή ± SEM φαίνονται.

Η

MDSCs καταστέλλουν τόσο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα

Για να ανακρίνουν περαιτέρω η άμεση δράση στα Τ λεμφοκύτταρα, καθαρισμένο CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα από ένα σκυλί με οστεοσάρκωμα συν-καλλιεργήθηκαν με καθαρισμένα CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα από ένα υγιή σκύλο για 72 ώρες. Μη διεγερμένα κύτταρα και CD4

+ και CD8

+ κύτταρα συν-επωάστηκαν με υγιή PBMCs χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Όπως ήταν αναμενόμενο, CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό CD8

+ (Εικ. 4Α) και CD4

+ Τ κύτταρα (Εικ. 4Β) ενώ PBMCs από ένα κανονικό σκυλί δεν το έκανε. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά αποδεικνύουν ότι CD11b

+ CD14

-MHCII

-. Κύτταρα είναι όντως λειτουργικά ορίζεται ως κυνικός MDSCs

Facs ταξινομημένο CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα που απομονώθηκαν από έναν σκύλο με οστεοσάρκωμα ή υγιή PBMCs συν-επωάστηκαν με μιτογόνο διεγερμένα

+ και CD8

+ Τ κυττάρων που απομονώνονται από έναν υγιή σκύλο για 72 hs CD4. Δεν διεγερμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις μετρήθηκαν με

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης από πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. CPM, μετρά ανά λεπτό. Η μέση τιμή ± SEM φαίνονται

Η

CD11b

+ CD14

-MHCII

-. Κύτταρα εκφράζουν σήμα κατατεθέν MDSC που προέρχονται ανοσοκατασταλτικών παραγόντων

Έχει αποδειχθεί ότι MDSCs μπορεί να αναστείλει την λειτουργία των Τ κυττάρων από την παραγωγή διαλυτών παραγόντων όπως αργινάσης-1, αντιδραστικά είδη οξυγόνου, το μονοξείδιο του αζώτου και ΤΟΡ-β (8-10). Προκειμένου να εκτιμηθεί κατά πόσον CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα από τους σκύλους με καρκίνο θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιούν αυτούς τους μηχανισμούς για να μεσολαβήσουν καταστολή των Τ κυττάρων, αξιολογήσαμε την έκφραση ARG1 και iNOS2, καθώς και την ανοσοκατασταλτική κυτοκίνες ΤΟΡ-β και IL-10, εντός αυτού του πληθυσμού κυττάρου και από ΡΜΝ απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα υγιών σκύλων. PCR ανάλυση του RNA που εξάγεται από FACS απομονωθεί CD11b

+ CD14

-MHCII

β-κύτταρα επιβεβαίωσε την έκφραση του ARG-1, ένζυμα iNOS2 και ανοσοκατασταλτικές κυτταροκίνες ΤΟΡ-β και IL-10 mRNA (σχ. 5Α) . Σε αντίθεση, η κανονική PMNs σκύλος δεν εκφράζουν ARG1, αν και iNOS, ΤΟΡ-β και IL-10 mRNA ήταν ανιχνεύσιμα (Εικ. 5Β). Επειδή mRNA για ARG-1, iNOS2, ΤΟΡ-β και IL-10 βρέθηκαν όλα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι αυτοί οι παράγοντες θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων και λειτουργία τελεστή. Ωστόσο, δεδομένου ότι ΡΜΝ που απομονώθηκαν από υγιείς σκύλους δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα mRNA ARG-1 ή να διαταράξει τη λειτουργία των κυττάρων Τ, υποδηλώνοντας ότι ARG-1 μπορεί να είναι ένας όγκος που προκαλείται από μηχανισμό που MDSCs θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν για την καταστολή των Τ κυττάρων. . Η διαπίστωση αυτή δεν ήταν απροσδόκητη και έχει τεκμηριωθεί προηγουμένως σε ανθρώπινες μελέτες MDSC [19]

RT-PCR ανάλυση του FACS καθαρίζεται CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα ανιχνεύεται έκφραση ARG1 και iNOS2, καθώς ο ΤΟΡ-β και IL-10 ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών. ARG-1 έκφραση δεν ανιχνεύθηκε σε κανονικό ΡΜΝ. CD11b

+ CD14

-MHCII

– κύτταρα απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα του σκύλου με οστεοσάρκωμα και ΡΜΝ απομονώθηκαν από έναν υγιή σκύλο. NRT, πρότυπο RNA απουσία αντίστροφης μεταγραφάσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Το πεδίο της συγκριτικής ογκολογίας δείχνει μεγάλη υπόσχεση να προωθήσει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών για τα σκυλιά και ανθρώπους ασθενείς όσο. Ωστόσο, η σπανιότητα των αντιδραστηρίων και ακαθόριστα ανοσοφαινότυπο του σκύλου λευκοκυττάρων έχει περιοριστεί την ικανότητά μας να κατανοήσουμε την ανοσολογία όγκων σε σκύλους με φυσικά καρκίνο. Τα δεδομένα μας αποδεικνύει την ύπαρξη MDSCs στο περιφερικό αίμα των σκύλων, τα οποία είναι αυξημένα σε όλους τους τύπους προχωρημένου ή μεταστατικού καρκίνου που αναλύθηκαν σε σχέση με το πρώιμο στάδιο μη μεταστατικό καρκίνο και υγιείς μάρτυρες. Με αυτό το βασικό θεμέλιο της γνώσης στη θέση του, θα είναι πλέον δυνατή η παρακολούθηση προοπτικά MDSC επιβάρυνση σε σκύλους που έλαβαν θεραπεία με πειραματικά φάρμακα και η ανοσοθεραπεία. Το CD11b

+ CD14

-MHCII

– κυττάρου πληθυσμό που ορίζεται ως MDSC συν-καθαρίζεται με PBMCs, είχε πολυμορφοπύρηνα κοκκιοκυτταρική μορφολογία, κατέστειλε Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό και λειτουργία τελεστή, εξέφρασε σήμα κατατεθέν κατασταλτική παράγοντες της ανθρώπινης MDSC, και συσχετίζεται θετικά με το φορτίο του όγκου. Αναλύσεις πολλαπλασιασμού αποκάλυψε σχετικά αδύναμη πολλαπλασιασμό σε ΜΚΠΑ από σκύλους που φέρουν όγκο (Σχ. 3Α, Β) σε σύγκριση με την κανονική ανταποκρίθηκαν (Σχ. 3C) σε απουσία εξωγενών MDSC. Αυτό πιθανότατα αντικατοπτρίζει αυξημένα επίπεδα ενδογενούς (μη πειραματικά προστεθεί) MDSCs και ρυθμιστικά Τ κύτταρα στο PBMCs από σκύλους με καρκίνο. Επιπλέον, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ένα δεύτερο υποσύνολο του MDSC που είναι πιο μονοκυτταρική χαρακτήρα εκτιμάται ευρέως σε ποντικού και ανθρώπου ανοσολογίας όγκων. Δεν βρήκαμε κανένα στοιχείο για επιλεκτική επέκταση ενός CD14

+ μονοκύτταρο σαν κύτταρο στο αίμα των σκύλων με καρκίνο. Ωστόσο, CD11b

+ MHCII

– κύτταρα που καθαρίστηκαν από τα σκυλιά με προχωρημένο καρκίνο που ήταν επίσης CD14

+ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων (Εικόνα S2), αποκαλύπτοντας ότι αν και μονοκυτταρική MDSC δεν είναι ένα κυρίαρχο πληθυσμό σκυλιά με τον καρκίνο, είναι πράγματι παρόντα. Αυτό το εύρημα των προτιμησιακών επέκταση της κοκκιοκυτταρικής MDSC δεν είναι εκπληκτικό και είναι σύμφωνη με παρόμοιες μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε μοντέλα ποντικών όγκου [15]. Συνολικά, τα δεδομένα μας είναι συνεπείς με μια παγκόσμια κατάσταση ανοσοκαταστολής σε σκύλους με προχωρημένο καρκίνο που είναι πιθανόν αποδίδεται σε αρκετούς μηχανισμούς.

Η πρακτική παραδοτέο της μελέτης αυτής είναι ένα απλό τρία δείκτη επιφανείας ανοσοφαινότυπο που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την μελλοντικά να παρακολουθούν MDSC επιβάρυνση σε σκύλους. Έχουμε εκτελέσει πιλοτικές μελέτες να ψάξουν για επιπλέον δείκτες. Ειδικά τα προκαταρκτικά αποτελέσματα που αξίζει να σημειωθεί είναι οι εξής. Έχουμε ήταν σε θέση να αποδείξει την επιτυχή χρώση χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινα αντισώματα CD66b. CD66b είναι ένας δείκτης ενεργοποίησης που εκφράζεται σε κάποια ανθρώπινα MDSC [19]. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης για MDSC στο ποντίκι είναι Gr-1, και ένα αντίσωμα έναντι ποντικού Gr-1 αντιδρά σταυρωτά καλά με κύτταρα σκύλου, όπως και η αντι-ποντικού CD11b (Σχήμα S1). Περαιτέρω μελέτες θα απαιτούνται για να καθοριστεί εάν κύτταρα σκύλου που αναγνωρίζονται από Gr-1 και CD11b αντισώματα αντι-ποντικού είναι πράγματι MDSCs.

Ένας πιθανός περιορισμός της μελέτης αυτής ότι πολλά από τα δείγματα που αναλύσαμε καταψύχθηκαν, ο αποψυχθεί πριν από την ανάλυση, η οποία θα μπορούσε να επηρεάσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων.