Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) σημαντικό για μεταγραφικούς γονιδιακή έκφραση εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου στον άνθρωπο. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρει ότι

miR-26a

ήταν υπερ-εκφράζεται σε ανθρώπινα δείγματα EOC και το επίπεδο έκφρασης της εξωκυττάριας

miR-26a

στο πλάσμα μπορεί να διακρίνει τους ασθενείς από υγιείς ελέγχους ΕΓΚ. Η έκτοπη έκφραση του

miR-26a

στον καρκίνο των ωοθηκών (OC) κυττάρων αυξήθηκε πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το σχηματισμό των κλώνων. Αυτή η αύξηση αποτέλεσμα προαγωγής της ανάπτυξης OC κυττάρων που προκαλείται από

miR-26a

αναστολή της posttranscription του ER-α. Επιπλέον, η αναστολή της

miR-26a

κατέστειλε τον σχηματισμό όγκου που δημιουργείται από την έγχυση κυττάρων OC σε γυμνά ποντίκια. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι εκφράζονται ανώμαλα

miR-26a

μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη OC

Παράθεση:. Shen W, Τραγούδι Μ, Liu J, Qiu G, Li Τ, Χου Y, et al. (2014)

MiR-26α

Προωθεί καρκίνου των ωοθηκών διάδοσης και Ογκογένεση. PLoS ONE 9 (1): e86871. doi: 10.1371 /journal.pone.0086871

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17, Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 16 Δεκ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Πρόγραμμα Νο 30571836 από το NNSF (Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών) της Κίνας. Επιπλέον, το έργο που παρουσιάζεται είναι μέρος των έργων με το Project No.L2010681 υποστηρίζεται οικονομικά από Science Foundation του Τμήματος Παιδείας της επαρχία Liaoning της Κίνας, και το Project No.201202259 υποστηρίζεται οικονομικά από την Επιστήμη του Ιδρύματος Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου της επαρχία Liaoning της Κίνας . Συγγραφέας Ελάχιστη τραγούδι συνέβαλε στην πειραματική σύλληψη και το σχεδιασμό, την καθοδήγηση και τη συζήτηση του έργου, έτσι είναι ο συγγραφέας συν-αλληλογραφία του παρόντος εγγράφου. Όλοι οι άλλοι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

OC είναι η πέμπτη πιο συχνή μορφή καρκίνου στις γυναίκες και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο από γυναικολογική κακοήθεια στις δυτικές χώρες [1]. Το 2012, υπάρχουν 22.280 νέες περιπτώσεις και 15.500 θάνατοι από OC στις Ηνωμένες Πολιτείες, σύμφωνα με τις εθνικές στατιστικές καρκίνου. EOC αντιπροσωπεύει το 85% -90% του καρκίνου των ωοθηκών. Δυστυχώς, η συνολική πρόγνωση είναι κακή και τα μοριακά γεγονότα που οδηγούν στην ανάπτυξη αυτής της νόσου είναι ακόμα ελάχιστα γνωστό.

miRNAs αντιπροσωπεύουν μια μεγάλη οικογένεια των ενδογενών RNAs μη κωδικοποιητικής και μετα-μεταγραφικά ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [2]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει κρίσιμες λειτουργίες του miRNAs σε βασικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και κυτταρικού θανάτου [3]. Αλλαγμένη έκφραση ή μετάλλαξη miRNAs έχει αναφερθεί στον καρκίνο, όπως καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο μαστού, λευχαιμία και άλλα καρκινώματα [4]. Στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, υπερ-έκφραση του

ας-7

ανέστειλε την ανάπτυξη τους με τη στόχευση της Ras [5], [6]. Επιπλέον,

miR-21

στοχεύει άμεσα το ογκοκατασταλτικό PTEN στην ηπατοκυτταρικού καρκίνου [7]. Επιπλέον, αρκετές μελέτες έδειξαν ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν είτε ως καταστολείς των όγκων (όπως είναι η περίπτωση για το

miR-15a-miR-16-1

σύμπλεγμα [8]) ή ογκογονίδια (όπως είναι η περίπτωση για

miR-21

[

9

]).

Γονιδίωμα-ευρύ προφίλ έκφρασης των miRNAs έδειξε

miR-26a

απορρύθμισης σε διάφορους καρκίνους [10]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι

miR-26a

υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ΕΓΚ. Έχουμε αποδείξει ότι η αναστολή της

miR-26a

μειωμένο πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων EOC, και κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων EOC σε γυμνά ποντίκια. Επιπλέον, ΕΡα ήταν κάτω-ρυθμίζονται από

miR-26a

στα κύτταρα του ΕΓΚ. Επιπλέον, βρήκαμε ότι εξωκυττάριο

επίπεδα miR-26a

στο πλάσμα μπορεί να διακρίνει τους ασθενείς από υγιείς ελέγχους ΕΓΚ. Η μελέτη μας δείχνει ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση

miR-26a

είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του ανθρώπινου ΕΓΚ και τη μέτρηση των κυκλοφορούντων

miR-26a

μπορεί να είναι μια καλή προσέγγιση για την ΕΓΚ διάγνωση.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Κλινικά δείγματα (συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων ιστού και πλάσματος) συλλέχθηκαν από ασθενείς εγγεγραμμένοι στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου (Shenyang, Κίνα). πληροφοριών των ασθενών που συνοψίζεται στον Πίνακα 1, Πίνακα S1 και S2 πίνακα.

Η

Υλικά |

Το αντίσωμα έναντι ΕΡα ήταν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA), το αντίσωμα έναντι της α τουμπουλίνης από την Sigma (St Louis, ΜΟ, USA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν από τη Sigma. Anti-miR-26a και ανοησία των αντι-miR ήταν από GenePharma (Σαγκάη, PR China). Cel-miR-39 μιμείται ήταν από σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου (Σαγκάη, PR China).

Ομαηίαύνβ RT-PCR

(qRT-PCR, Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης)

Ολικό RNA απομονώθηκε από κλινικά δείγματα ή κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) μεταγραφεί αντίστροφα σε cDNA, σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση [11]. Απομόνωση του RNA από το πλάσμα και τον ποσοτικό προσδιορισμό των miRNA διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο [12]. Εν συντομία, 25 fmol του Cel-miR-39 μιμείται προστέθηκε σε 400 ul πλάσμα. Real-time PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο PCR κύριο μείγμα (Takara, Otus, Shiga, Japan). Ενίσχυση και ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Cel-miR-39 ελήφθη ως γονίδιο αναφοράς για δείγματα πλάσματος. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα S3.

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές OC, SKOV-3, ES2 (Cellbank, Σαγκάη, PR China) διατηρήθηκαν σε 5α McCoy συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

Κατασκευή Φορέα

πλήρους μήκους ανθρώπινο

miR-26a

ενισχύθηκε από το ανθρώπινο γενωμικό DNA και κλωνοποιήθηκε εντός του pcDNA3.1 σε θέσεις ΚρηΙ και XhoI σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση [13] και [14]. Το ανθρώπινο άγριου τύπου ΕΚα παρήχθη με PCR από cDNA και τα PCR προϊόντα εισήχθησαν εντός pcDNA3.1 όπως περιγράφεται στο [15].

Cell Growth Δοκιμασία

Η κυτταρική ανάπτυξη εκτιμήθηκε με προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με

miR-26a

ή αντι-ΜΙΚ

26α

χρησιμοποιώντας FuGene HD (Roche, Indianapolis, ΙΝ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από καλλιέργεια επί 24 ώρες τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια αρχική πυκνότητα 1 × 10

5 ανά 35 μμ-πιάτο. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν στους υποδεικνυόμενους χρόνους και οι αριθμοί μετρήθηκαν με τη χρήση του COULTERTM (Beckman, Fullerton, CA, USA).

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με

miR-26a

σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες σε συγκέντρωση 2.5 × 10

3 κύτταρα, και μετρήθηκαν μετά από 48 ώρες χρησιμοποιώντας δοκιμασία WST-1 (Boster, Wuhan, PR China), πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

συνολικά 500 κύτταρα επιμολυσμένα με

miR-26a

ή κενό φορέα (Ctrl) σπάρθηκαν σε δίσκους 35 χλστ χωριστά εις τριπλούν. Τρεις εβδομάδες αργότερα, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, διαποτισμένη με 20% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα βαμμένα κύτταρα εκλούσθηκαν με 10% παγόμορφο οξικό οξύ και οι τιμές OD595 μετρήθηκαν με φασματοφωτόμετρο ως ο δείκτης του αριθμού των κυττάρων.

Luciferase Assay Reporter

1,5 × 10

5 SKOV3 σταθερό κύτταρα σε δίσκους 35 χλστ συν-επιμολύνθηκαν με pGL3-ΕΚα-WT (1 μg) ή pGL3-ΕΚα-Mut (1 μg) και ρΡΙ_-ΤΚ (1 μg) χρησιμοποιώντας.

αντιδραστήριο επιμόλυνσης Fugene * HD (Roche, Diagnostics Corp., Indianapolis, ΙΝ) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega) και ομαλοποιήθηκε ως προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla.

Western Blotting

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-8% PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Amersham, Buckinghamshire, UK) και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα και δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με το σύστημα Amersham ECL και σαρώνεται. πυκνότητες τους προσδιορίστηκαν από ImageQuant 5.2 του λογισμικού (Amersham).

In vivo Ογκογένεση

κύτταρα SKOV3 επιμολυσμένα με

miR-26a

ή αντι-ΜΙΚ

26α

χωριστά. Κάθε γυμνός ποντικός εγχύθηκε υποδόρια με 2 χ 10

6 επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3. Τριάντα ή τριάντα-πέντε ημέρες μετά την ένεση οι ποντικοί θανατώθηκαν και ελήφθησαν οι όγκοι. Η μακρύτερη και τη μικρότερη διάμετρο του όγκου σημειώθηκε ως D1 και D2. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση: V = d1 × d2 × d2 /2. Το βάρος του όγκου μετρήθηκε στη συνέχεια.

Στατιστικά

Πολλαπλές συγκρίσεις αξιολογήθηκαν με SPSS στατιστικού λογισμικού για στατιστική ανάλυση. Wilcoxon τεστ και Krusikal Wallis H δοκιμή χρησιμοποιήθηκαν στη στατιστική ανάλυση των δειγμάτων των ασθενών. Άλλες συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων για στατιστική σημασία διεξήχθησαν με t-test και ανάλυση του Student διακύμανσης (ANOVA). Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντική διαφορά στο * Ρ & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Ηθική Δήλωση

Η έρευνα καλύπτει όλες τις απαιτήσεις για την ηθική του πειράματος. Κλινικά δείγματα συλλέχθηκαν με τη συγκατάθεση των ασθενών και υγιών εθελοντών και έγκριση της Ιατρικής Έρευνας Επιτροπής Δεοντολογίας του Πρώτου συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου.

Αποτελέσματα

αυξημένη έκφραση του miR-26a σε δείγματα και Plasma ανθρώπων ΕΓΚ

έχει παρατηρηθεί ότι το επίπεδο έκφρασης του

miR-26a

μειώθηκε ή αυξήθηκε σε ανθρώπινες κακοήθειες, όπως το καρκίνωμα του μαστού [16], το ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα [17], [18], και το γλοιοβλάστωμα [19] , υποδεικνύοντας ένα πολύπλοκο ρόλο του

miR-26a

στην εξέλιξη των κακοηθειών. Για να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο του

miR-26a

στην ανάπτυξη EOC, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση του

miR-26a

σε δείγματα και πλάσματος στην EOC από SYBR-πράσινο στέλεχος-βρόχο qRT-PCR [20]. Εξετάσαμε την έκφραση του

miR-26a

σε 26 δείγματα όγκων και 19 φυσιολογικές ωοθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, τα επίπεδα έκφρασης του

miR-26a

σε δείγματα όγκων ήταν πολύ υψηλότερες από εκείνες φυσιολογικά δείγματα ωοθήκη. Παρομοίως, οι συγκεντρώσεις των

miR-26a

ήταν υψηλότερα σε πλάσμα από ασθενείς EOC (n = 17) σε σχέση με το εν λόγω από υγιείς ελέγχους (η = 13) (Σχήμα 1Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα μας παρέχουν αρχικές ενδείξεις ότι

miR-26a

μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου ΕΓΚ.

(Α) Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του

ΜΙΚ 26α

σε δείγματα EOC ομαλοποιηθεί με εκείνες των 18 ετών rRNA από qRT-PCR. Τα δεδομένα για κάθε κουκκίδα ήταν μέση τιμή ενός δείγματος επαναλαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (κανονικό, η = 19? Όγκων, η = 26). ** P & lt? 0.01 vs Κανονική. (Β) Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του πλάσματος

miR-26a από

qRT-PCR. Τα δεδομένα για κάθε κουκκίδα ήταν μέση τιμή ενός δείγματος επαναλαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (κανονικό, η = 13? Όγκου, n = 17).

Η

υπερεκφράζουν miR-26a προωθούνται EOC Growth κυττάρων και να αναστέλλει miR-26a Καταστολής ΕΓΚ Πολλαπλασιασμός κυττάρων

επόμενο εξέτασε κατά πόσον

miR-26a

επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων του ΕΓΚ χρησιμοποιώντας κύτταρα SKOV3 και ES2 ως πρότυπα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η ικανότητα ανάπτυξης των κυττάρων SKOV3 και ES2 αυξήθηκε με υπερ-έκφραση του

miR-26a

. Αντιθέτως, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με αντι-miR-26a αξιοσημείωτα μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με ανοησίες (Σχήμα 2Β). WST-1 δοκιμασία έδειξε παρόμοια αποτελέσματα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

miR-26a

επηρεάζονται πράγματι την ανάπτυξη των κυττάρων του ΕΓΚ.

Οι καμπύλες ανάπτυξης των SKOV3 (Α) ή ES2 κύτταρα (Β) επιμολυσμένα με

miR-26a

( αριστερός πίνακας) ή αντι-miR-26a (δεξί πάνελ). Οι αριθμοί των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν προς εκείνες 0 hr. Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.01 vs κενό φορέα (Ctrl) ή αρνητικό έλεγχο (NC). πολλαπλασιασμό (C) Cell επιμολυσμένα με

miR-26a

μετρήθηκε με μία δοκιμασία WST-1. Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν. ** P & lt? 0.01 vs κενό φορέα (Ctrl) (Δ) Ποσοτικοποίηση των αποικιών που σχηματίζεται από το πλήκτρο Ctrl ή

miR-26a

επιμολυσμένα κύτταρα. Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** P & lt?. 0.01 vs Ctrl

Η

Η έννοια δοκιμάστηκε περαιτέρω σε δοκιμασία σχηματισμού κλωνική. Ο αριθμός και το μέγεθος των αποικιών που σχηματίστηκαν σημαντικά αυξημένη σε

miR-26a

επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2D). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

miR-26a

ήταν πράγματι εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανάπτυξης των κυττάρων του ΕΓΚ.

ΕΡα ήταν ενός γονιδίου στόχου του miR-26a στην EOC κύτταρα

Στη συνέχεια, διερευνώνται οι μηχανισμοί με τους οποίους

miR-26a

προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΕΓΚ. Σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, η έκφραση του

miR-26a

ήταν υψηλότερη στις γυναίκες παρά στους άνδρες [21]. Επιπλέον,

miR-26a

ρυθμίζονται ανάπτυξη των κυττάρων του ήπατος όγκου με τη στόχευση ΕΡα [22]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η δραστηριότητα της λουσιφεράσης του pGL3-ΕΚα-WT σε SKOV3-stable1 κύτταρα (S1) ήταν πολύ χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα ελέγχου. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της pGL3-Ετα-Μουτ διασώθηκε στα κύτταρα Stable1. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον

miR-26a

θα μπορούσε να ρυθμίσει την ενδογενή έκφραση ΕΡα στα κύτταρα του ΕΓΚ. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, τα ενδογενή επίπεδα ΕΚα mRNA (Σχήμα 3Β) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικόνα 3C) ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με

miR-26a

.

(Α) Σταθερό 1 κύτταρα (S1) επιμολύνθηκαν με pGL3 ΕΚα-WT-(WT) φορέα ανταποκριτή ή pGL3-ΕΚα-Mut (MUT). Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** P & lt? 0.01 vs κύτταρα ελέγχου (Ctrl). (Β) Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των ΕΚα σε Stable1 (S1), Stable2 (S2) και τα κύτταρα ελέγχου (Ctrl) προσδιορίστηκαν και κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH mRNA. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.01 vs Ctrl. (C) Ανάλυση Western blot-του συνολικού κυτταρολυμάτων εξάγεται από υποδεικνύεται σταθερή κύτταρα χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Δεδομένα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και ποσοτικοποίηση κανονικοποιηθεί με τον Πίν. Τουμπουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. (Δ) Οι καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων S1, S2 και το πλήκτρο Ctrl. Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.01 vs Ctrl. (Ε) Η υπερέκφραση του ΕΚα μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων S1 μετά την επιμόλυνση. αριθμούς κυττάρων ομαλοποιήθηκαν στα κύτταρα Ctrl. Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν.

Η

MiR-26α Ελεγχόμενη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω του ΕΓΚ ΕΡα

Δεδομένου ότι

miR-26a

συμμετείχε στον πολλαπλασιασμό κυττάρων ΕΓΚ και ΕΡα ήταν ένας στόχος της

miR-26a

, είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν η υπερέκφραση της Ετα θα μπορούσε να διασώσει την προώθηση του πολλαπλασιασμού από

miR-26a

στα κύτταρα του ΕΓΚ. Επιπλέον, σταθερή έκφραση του

miR-26a

σε δύο κλώνους κυττάρων SKOV3 (S1 ή S2) αύξησε την ανάπτυξη των κυττάρων περίπου 1.58 ή 1.37 φορές, αντίστοιχα (Σχήμα 3D). QRT-PCR ανάλυση έδειξε ότι

miR-26a

επίπεδο έκφρασης ήταν σημαντικά αυξημένη σε S1 και S2 κύτταρα (Σχήμα S1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε, ενώ η αύξηση των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με S1 ΕΚα, δεν ήταν διαφορετική από εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

miR-26a

ελεγχόμενο πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΕΓΚ μέσω της ρύθμισης της έκφρασης Ετα.

MiR-26α προώθησε την ανάπτυξη των όγκων σε άτριχα ποντίκια

Για την παροχή άμεσης αποδεικτικά στοιχεία που

miR-26a

ήταν υπεύθυνος για την ανάπτυξη του ΕΓΚ, τα κύτταρα SKOV3 επιμολυσμένα είτε με

miR-26a

ή αντι-miR-26a είχαν εγχέεται στο πλευρό των άτριχων ποντικών όπως περιγράφεται. Μια εβδομάδα μετά την εμφύτευση, ξενομόσχευμα όγκων θα μπορούσε να θεωρηθεί. Μετά από τριάντα ή τριάντα-πέντε ημέρες, όλοι οι γυμνοί ποντικοί θανατώθηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Κατά τη μακροσκοπική παρατήρηση, υποδείχθηκαν οι διαφορές στο μέγεθος του όγκου και ο όγκος μεταξύ των δύο ομάδων. Ο όγκος του όγκου που παράγεται από κενό φορέα ήταν 0,435 ± 0,042 (cm

3, P & lt? 0.01), ότι στο

miR-26a

ομάδα ήταν 0,829 ± 0,172 (cm

3, P & lt? 0,01) (Εικόνα 4Α), ότι στην ομάδα αρνητικού ελέγχου ήταν 0,941 ± 0,163 (cm

3, P & lt? 0.01), και ότι σε αντι-miR-26a ήταν 0,248 ± 0,05 (cm

3, P & lt? 0,01) ( Σχήμα 4Β). Το μέσο βάρος του όγκου που παράγεται από κενό φορέα ήταν 0,433 ± 0,07, ενώ το μέσο βάρος του όγκου που παράγεται από το

miR-26a

ήταν 0,821 ± 0,02 (γραμμάριο, P & lt? 0,01). Το μέσο βάρος του όγκου που παράγεται από ανοησίες ήταν 1.062 ± 0.169, ενώ το μέσο βάρος του όγκου που παράγεται από αντι-miR-26a ήταν 0,473 ± 0,05 (γραμμάριο, P & lt? 0,01), αντίστοιχα. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι

miR-26a

ήταν κρίσιμη για την ανάπτυξη του ΕΓΚ

in vivo

.

σχηματισμό όγκων που παράγεται από τα κύτταρα SKOV3. (Α) επιμολυσμένα με το

miR-26a

ή αντι-miR-26a (Β) Γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως με 2 χ 10

6 επιμολυσμένων κυττάρων. Αντιπροσωπευτικές εικόνες, μέτρηση του τελικού όγκου και το βάρος των όγκων που σχηματίζονται. Τα μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν και υπολογίστηκαν στο Υλικά και μέθοδοι. Τα δεδομένα ήταν μέσες ± Τ.Α. 4-6 ποντίκια. ** P & lt?. 0.01 vs άδειο φορέα ή ανοησία

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δείξει ότι το επίπεδο έκφρασης του

miR-26a

ήταν σημαντικά αυξημένη σε ανθρώπινα δείγματα EOC, και με βάση το αίμα

miR-26a

επίπεδο μπορεί να διακρίνει τους ασθενείς από υγιείς ελέγχους ΕΓΚ. Τα αποτελέσματά μας εμφανίζεται, επίσης, ότι το επίπεδο έκφρασης του

miR-26a

επηρεάζεται ανάπτυξη των κυττάρων του ΕΓΚ σε καλλιέργεια. Επιπλέον, ΕΡα ήταν ένας στόχος για

miR-26a

στα κύτταρα του ΕΓΚ. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης του

miR-26a

επηρεάζονται σχηματισμό όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με μια ιδέα που

miR-26a

είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του ανθρώπινου ΕΓΚ.

Τα microRNAs είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την αντίδραση στο στρες [23]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν μία άμεση σχέση μεταξύ miRNAs και ανθρώπινους καρκίνους [4], [24], [25], [26]. MiRNAs μπορεί να είναι ογκογόνο miRNA (oncomirs) ή ογκοκατασταλτικό σχετικές με τον καρκίνο. Όπως παρουσιάζεται προηγουμένως, η απώλεια των ογκογόνων

miR-21

, ενεργώντας για την καταστολή της έκφρασης RhoB, συνδέεται με υψόμετρο RhoB σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και μαστού καρκινικά κύτταρα [13]. Η σημασία των άλλων miRNAs, όπως

ας-7

,

miR-16

,

miR-126

και

miR-125b

έχει επίσης καταδειχθεί [27]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν προφίλ των μικροσυστοιχιών

miR-26a

απορρύθμισης σε διάφορες καρκίνο [4]. Στον καρκίνο του ήπατος,

miR-26a

προστατεύει φυσιολογικό ιστό του ήπατος από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα φλεγμονή που προάγουν [21], και φαίνεται να ανταγωνίζονται ανθρώπινου καρκίνου του μαστού [16] και ραβδομυοσάρκωμα [28]. Αντιθέτως,

miR-26a

διευκολύνει το σχηματισμό γλοιοβλάστωμα ως ογκογονίδιο [19]. Τα αποτελέσματά μας που λαμβάνονται από το κέρδος-of-λειτουργίας και απώλεια-του-λειτουργία προσεγγίσεις αναφέρεται ότι

miR-26a

προωθείται πολλαπλασιασμό και την αναστολή της

miR-26a

κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΕΓΚ.

Στον καρκίνο των ωοθηκών, η έκφραση ΕΚα έχει μελετηθεί για να συσχετίζονται με chlinico-παθολογικών παραμέτρων και πρόγνωση [29], [30]. Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι δεν αποκάλυψε τυχόν συσχετίσεις με ιστολογικό τύπο των όγκων και βαθμολόγησης των ωοθηκών καρκίνου [30]. μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι οι ασθενείς με καθεστώς θετικής ΕΡα είχαν σημαντική βελτίωση της επιβίωσης χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς την έκφραση [31]. Στα αποτελέσματά μας, η έκφραση

miR-26a

σε δείγματα και πλάσματος στην EOC ήταν πολύ υψηλότερες από αυτές που φυσιολογικά δείγματα ωοθήκης, και

miR-26a

προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΕΓΚ με τη στόχευση Ετα. Αυτό σημαίνει ότι

miR-26a

θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την επιβίωση του καρκίνου των ωοθηκών.

Τα κυκλοφορούντα βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται για την διαγνωστική ασθένεια, να παρακολουθεί θεραπευτικό αποτέλεσμα και να προβλέψει επανάληψη σε κλινικές εφαρμογές. Η ανακάλυψη των κυκλοφορούντων miRNAs σε ασθενείς με καρκίνο υποδηλώνει πιθανή εφαρμογή τους ως ισχυρό βιοδείκτες στη διάγνωση του καρκίνου [32]. Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι σχετίζονται με τον καρκίνο miRNAs μπορούσε σταθερώς ανιχνεύσιμη στο πλάσμα και ορό τα οποία προέρχονται από ιστούς του καρκίνου [4], [33]. Τα αποτελέσματά μας διερευνήσει τη δυνατότητα

miR-26a

εφαρμόζεται ως βιοδείκτη σε κλινικό περιβάλλον μέσα από την εξέταση της έκφρασης του

miR-26a

στο πλάσμα των ασθενών ΕΓΚ.

Εν κατακλείδι , η αναστολή της

miR-26a

μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη EOC στον πολιτισμό και σε άτριχα ποντίκια.

MiR-26α

επηρεάζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΕΓΚ με τη στόχευση Ετα. Μια σημαντική συνέπεια της παρούσας μελέτης είναι ότι

miR-26a

θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση για την ανθρώπινη ΕΓΚ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

MiR-26α

επίπεδο έκφρασης ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα S1 και S2. QRT-PCR προσδιορίζονται τα επίπεδα έκφρασης του

miR-26a

στα κύτταρα S1 και S2. Δεδομένων ήταν μέσος όρος ± S.E. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν. . ** P & lt? 0.01 vs Ctrl

doi: 10.1371 /journal.pone.0086871.s001

(DOC)

Πίνακα S1.

κλινικοπαθολογικοί δεδομένων και

miR-26a

επίπεδο έκφρασης του ελέγχου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

κλινικοπαθολογικοί δεδομένων και

miR-26a

επίπεδο έκφρασης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s003

(DOC)

Πίνακα S3.

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην Ομαηίαύνβ RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0086871.s004

(DOC)