Αφηρημένο

όγκων υποξία με την απορυθμισμένη έκφραση του παράγοντα υποξίας επαγωγής (HIF) και βιολογικές συνέπειες της οδηγεί σε κακή πρόγνωση των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με συμπαγείς όγκους, με αποτέλεσμα την υψηλότερη θνησιμότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κατανόηση της μοριακής σχέσης υποξία με άλλα κυτταρικά χαρακτηριστικά της επιθετικότητας του όγκου θα είναι πολύτιμη για την ανάπτυξη νεότερων στοχευμένη θεραπεία για συμπαγείς όγκους. Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν επίσης ότι η υποξία και HIF οδών σηματοδότησης συμβάλλει στην απόκτηση των λειτουργιών επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), τη συντήρηση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (CSC), και επίσης διατηρεί το φαύλο κύκλο της φλεγμονής, τα οποία συμβάλλουν στην ακτινοβολία θεραπεία και αντίσταση χημειοθεραπεία. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί με τους οποίους υποξία /HIF οδηγούν αυτά τα γεγονότα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Εδώ, έχουμε δείξει ότι η υποξία οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του VEGF, IL-6, και γονίδια δείκτες CSC όπως Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2, και επίσης αύξησε την έκφραση του miR-21, ένα ογκογόνο miRNA, στον καρκίνο του προστάτη (PCA) κύτταρα (PC-3 και LNCaP). Η θεραπεία των κυττάρων προστάτη με CDF, μία νέα κουρκουμίνη προερχόμενο συνθετικό ανάλογο έδειξε προηγουμένως αντικαρκινική δραστικότητα

in vivo

, ανέστειλε τις παραγωγές του VEGF και IL-6, και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του Nanog, Oct4 , ΕΖΗ2 mRNA, καθώς και miR-21 κάτω από υποξικές συνθήκες. Επιπλέον, η θεραπεία CDF των κυττάρων προστάτη οδήγησε σε μειωμένη κυτταρική μετανάστευση κάτω από υποξικές συνθήκες. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αντικαρκινική δράση του CDF είναι εν μέρει προκαλούνται μέσω απορρύθμισης των οδών υποξικών όγκων, και έτσι θα μπορούσε να γίνει CDF χρήσιμες για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Bao Β, Ahmad Α, Kong D, Ali S, Azmi AS, Li Υ, et al. (2012) υποξία Induced Επιθετικότητα Πυρήνων καρκίνου του προστάτη συνδέεται με την απορρύθμιση της έκφρασής του VEGF, IL-6 και miRNAs που εξασθενούν από ΚΔΔ. PLoS ONE 7 (8): e43726. doi: 10.1371 /journal.pone.0043726

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13, Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 23 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 του Αυγούστου του 2012

Copyright: © Bao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστώ Puschelberg και Guido Ιδρύματα για τη γενναιόδωρη οικονομική συνεισφορά τους. Την παροχή στήριξης από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 5R01CA131151, 5R01CA132794 και 1R01CA154321 (FHS), και το Υπουργείο Άμυνας Εξερεύνηση-Υπόθεση Ανάπτυξης Βραβείο PC101482 (ΒΒ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ [1]. Οι περισσότεροι ασθενείς PCa είναι ιάσιμες, αλλά οι ασθενείς συνήθως πεθαίνουν λόγω της αντίστασης φαρμάκου και μεταστατική νόσο. Έτσι, υπάρχει μια απόλυτη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών με την οποία αντίσταση στο φάρμακο και μεταστατικής νόσου θα μπορούσε να ελέγχεται με νέους παράγοντες που μπορούν να βελτιώσουν την έκβαση της θεραπείας. Η υποξία είναι ένα από τα θεμελιώδη βιολογικά φαινόμενα που περίπλοκα συνδέονται με την ανάπτυξη και την επιθετικότητα μιας ποικιλίας στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων PCa. Υποξία επαγόμενου παράγοντες (HIF) να λειτουργεί ως παράγοντας κύριος μεταγραφής, η οποία ρυθμίζει υποξία γονιδίων που αποκρίνονται και έχουν αναγνωρισθεί ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους στην εισβολή όγκου, αντίσταση χημειο-ακτινοβολία, και την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την επιβίωση, την αγγειογένεση και την μετάσταση [2]? [3]. Ως εκ τούτου, η υποξία του όγκου με την απορυθμισμένη έκφραση του HIF και βιολογικών συνέπεια του οδηγεί σε κακή πρόγνωση των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με συμπαγείς όγκους, με αποτέλεσμα την υψηλότερη θνησιμότητα, υποδηλώνοντας ότι η κατανόηση της μοριακής σχέσης της υποξίας με άλλες κυτταρικές λειτουργίες του επιθετικότητας του όγκου θα είναι πολύτιμη για την ανάπτυξη νεότερες στοχευμένη θεραπεία για συμπαγείς όγκους.

έχει επίσης αναγνωριστεί ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) και επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι φαινοτυπικά κύτταρα που σχετίζονται με τη θεραπευτική αντίσταση και συμβάλλει στην επιθετική ανάπτυξη του όγκου, εισβολή και μετάσταση, και πιστεύεται ότι είναι η αιτία της υποτροπής του όγκου [4]. Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι η υποξία και η οδός του HIF ενίσχυση των φαινοτύπων και τις λειτουργίες των ΚΕΠ και EMT [5] – [9], συμβάλλοντας στην επιθετικότητα του όγκου, η οποία θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε απορύθμιση των microRNAs (miRNAs). Τα miRNAs είναι γνωστό ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους σε ένα ευρύ φάσμα από βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης των κυττάρων, του πολλαπλασιασμού, κυτταρικού θανάτου, του μεταβολισμού και της ομοιόστασης ενέργειας [10]? [11]. Συσσωρευμένα απόδειξη έχει προτείνει ότι miRNAs ενδέχεται να έχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων. Η αλλαγμένη έκφραση του miRNAs έχει συσχετιστεί με την κλινική πρόγνωση του όγκου, αντίσταση σε θεραπεία χημειο-ακτινοβολία, και υποτροπής του όγκου [12] – [14]. Ένας μεγάλος αριθμός των miRNAs έχουν αναφερθεί να ανταποκρίνεται στην υποξία και μονοπάτι HIF σε ένα ευρύ φάσμα κυττάρων και ιστών συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων [15] – [18]. Έχει αναφερθεί ότι προκαλεί υποξία μειωμένη έκφραση του miR-101, ένα δυνητικό αντι-ογκογόνο miRNA, και αυξημένη έκφραση του miR-21 και miR-210, ογκογόνο miRNAs σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [13]? [19]. Έτσι, υποξία μεσολάβηση απορρύθμιση των miRNAs μπορεί να παίζουν σημαντικούς ρόλους στην επιθετικότητα του όγκου που προκαλείται μέσω της ρύθμισης των οδών κυτταρικής σηματοδότησης περιλαμβανομένων οδού HIF. Ως εκ τούτου, η στόχευση αυτών των miRNAs υποξία μεσολάβηση χρήση νέων παραγόντων μπορεί να παρέχει καινοτόμες θεραπευτική στρατηγική για την πρόληψη ή /και θεραπεία του προστάτη.

Εδώ, έχουμε εξετάσει τις επιδράσεις της υποξίας στην κυτταρική μετανάστευση, την εισβολή, την αγγειογένεση, και η έκφραση του VEGF, IL-6, τα γονίδια CSC, και miR-21 και miR-210 σε κύτταρα προστάτη υπό υποξικές συνθήκες. Διερευνήσαμε επίσης τον ρόλο του miR-21 στη ρύθμιση της έκφρασης του VEGF, IL-6, γονίδια δείκτες CSC, και την ένωσή τους με το σχηματισμό των prostaspheres σε κύτταρα προστάτη υπό συνθήκες υποξίας. Επιπλέον, εξετάσαμε τις επιδράσεις ενός νέου κουρκουμίνη προερχόμενο συνθετικό ανάλογο (CDF) που έδειξε δραστικότητα κατά του όγκου με μεγαλύτερη συστηματική και στόχος βιοδιαθεσιμότητας ιστών, στην επιβίωση των κυττάρων, η μετανάστευση, εισβολή, την αγγειογένεση, σχηματισμός prostaspheres, και η έκφραση του HIF-1α, VEGF, IL-6, γονίδια δείκτες CSC, και miRNAs σε κύτταρα προστάτη υπό συνθήκες υποξίας. Βρήκαμε ότι η υποξία οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του VEGF, IL-6, και γονίδια δείκτες CSC όπως Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2, και επίσης αύξησε την έκφραση του miR-21 σε ανθρώπινα κύτταρα PCa. Η επεξεργασία των κυττάρων με CDF ανέστειλε τις παραγωγές του VEGF και IL-6, και τα κάτω ρυθμισμένα την έκφραση του Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2 mRNAs, καθώς και miR-21 σε αυτά τα κύτταρα υπό υποξικές συνθήκες. CDF μειώθηκε επίσης κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων του προστάτη υπό υποξικές συνθήκες. Από τα αποτελέσματα αυτά, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η αντικαρκινική δράση του CDF είναι εν μέρει μεσολάβηση απορρύθμιση των οδών σηματοδότησης υποξικών όγκων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, τα ναρκωτικά και Αντιδραστήρια

Ανθρώπινο προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 και LNCaP κύτταρα διατηρήθηκαν υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας (21% O

2 και 5% CO

2, 37 ° C). Υποξική (1% O

2) και 5% CO

2 συνθήκες δημιουργήθηκαν με έλεγχο των ρυθμών ροής εισόδου του αζώτου και διοξείδιο του άνθρακα, αντίστοιχα στον επωαστήρα καλλιέργειας. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε 10% FBS-RPMI-1640 υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων. CDF συντέθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη εκδόσεις μας [20]? [21].

Κυττάρων Δοκιμασία Επιβίωσης

Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της CDF στην επιβίωση των κυττάρων σε ανθρώπινα κύτταρα προστάτη υπό υποξικές συνθήκες, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανθρώπινη προστάτη (PC-3 και LNCaP) κύτταρα. 3000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο των πλακών 96-φρεατίων και επωάστηκαν σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας (21% O

2 και 5% CO

2) όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις του CDF (0,5 μΜ) και επωάστηκαν για 8 ώρες κάτω από υποξικές συνθήκες που ακολουθείται από 16 ώρες κάτω από νορμοξικές συνθήκες κάθε μέρα. Μετά από 3 ημέρες θεραπείας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την πρότυπη δοκιμασία ΜΤΤ, όπως περιγράφεται σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [22]? [23]. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τέσσερα αντίγραφα και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

κλωνογονική δοκιμασία

κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση του CDF στην κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων προστάτη υπό υποξικές συνθήκες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],22]. Εν συντομία, 5 χ 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια έξι-φρεατίων και μετά 3 ημέρες έκθεσης σε 0,5 μΜ CDF (8 h υποξικού κατάσταση και 16 ώρες από ορθοξικές κατάσταση κάθε μέρα), τα κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη, και 1.000 μονά βιώσιμα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 100-mm τρυβλία Petri. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 έως 12 ημέρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2/5% O

2/90% N

2 θερμοκοιτίδα. Οι αποικίες βάφτηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες, πλύθηκε με νερό, και μετρήθηκαν. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Εισβολή Δοκιμασία

Το

in vitro

δοκιμασία εισβολής των κυττάρων προστάτη διεξήχθη υπό συνθήκες υποξίας, χρησιμοποιώντας Costar Transwell 24 -σε πλάκες με πολυανθρακικό μεμβράνη (Corning Incorporated, Coming, ΝΥ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, 4 × 10

4 των καρκινικών κυττάρων (PC-3 και LNCaP) εκτίθενται σε 3 ημέρες επώασης υπό ορθοξικές ή υποξικές κατάσταση σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο των προ-επικαλυμμένες πλάκες Transwell Matrigel. Οι κάτω φρεάτια του συστήματος γέμισαν με πλήρες μέσο. Μετά από 20 ώρες επώασης είτε με την απουσία ή παρουσία του CDF (0,5 μΜ), τα εισέβαλαν καρκινικά κύτταρα βάφτηκαν με 4 μg /mL καλσεΐνης-ΑΜ (Invitrogen) σε διάλυμα PBS στους 37 ° C για 1 ώρα, μετά την κατασκευαστή εγχειρίδιο. Οι φωτογραφίες πάρθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Επούλωση Δοκιμασία

Για να εξεταστεί η επίδραση της CDF στην κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων του προστάτη υπό υποξικές συνθήκες, πραγματοποιήσαμε επούλωσης τραύματος δοκιμασία , όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, όταν τα κύτταρα PC-3 έγινε 90-95% συρρέοντα, το τραύμα που δημιουργείται από το ξύσιμο της επιφάνειας των πλακών με ένα ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε απουσία και παρουσία του CDF (0,5 μΜ) και καλλιεργήθηκαν κάτω από υποξικές συνθήκες για 4 ώρες, που ακολουθείται από 16 ώρες από ορθοξικές συνθήκες, και έπειτα φωτογραφήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse TS100, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] . Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Tube Σχηματίζοντας Δοκιμασία

Για να εξεταστεί η επίδραση του ΚΔΔ επί της αγγειογένεσης

in vitro

σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα κάτω υποξική κατάσταση, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]? [26]. Εν συντομία, 3 χ 10

4 κουνέλι αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο της Matrigel-προ-επικαλυμμένες 96-βοθρίων πλάκα σε 100 μι 10% μέσου FBS-DMEM, και εκτέθηκαν σε νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 4 h επώασης στους 37 ° C, που ακολουθείται από 16 ώρες από ορθοξικές συνθήκες. Η φωτογραφία ελήφθη στις 4 ώρες και 20 ώρες, αντίστοιχα. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Η έκφραση του VEGF και IL-6

ELISA διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση του CDF επί υποξία προκαλούμενη έκφραση του VEGF και IL-6 σε κύτταρα PCa. Τα μέσα καλλιέργειας από κύτταρα προστάτη υπό υποξικές ή ορθοξικές συνθήκες για 16 ώρες συλλέχθηκαν για τη μέτρηση του VEGF και IL-6 με τη χρήση κιτ προσδιορισμού ELISA (R &? D Systems), σύμφωνα με το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Σφαίρα Δοκιμασία Σχηματισμού

Η δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση του CDF στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης των κυττάρων CSC προστάτη υπό υποξικές συνθήκες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, εναιωρήματα απλού κυττάρου των κυττάρων προστάτη απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλής φρεάτια προσκολλημένων ενός 6-φρεατίων (Corning, Lowell, ΜΑ) σε 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο σχηματισμού σφαίρα (1:01 DMEM /F12 συμπληρωμένο με Β-27 και Ν-2 (Invitrogen), και εκτέθηκαν σε υποξικές κατάσταση κάθε δεύτερη μέρα. Μετά από 7 ημέρες, οι σφαίρες ονομαστεί ως «prostaspheres» συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (300 χ g για 5 λεπτά) και μετρήθηκαν. Το ποσοστό των σφαίρα ροών κύτταρα υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των prostaspheres με τον αριθμό των σπαρμένων κυττάρων με τη διάμετρο μεγαλύτερη από 50 μmeters. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Δοκιμασία Ανοσοκηλίδωση και Ομοεστιακή Μικροσκοπία

Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα κυττάρων προστάτη απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλές φρεάτια προσκολλημένα του πλακιδίου 6 φρεάτων (Corning, Lowell, ΜΑ) σε 10.000 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο σφαίρα-σχηματισμό, και επωάστηκαν για 24 ώρες και ακολούθησε καλλιέργεια υπό υποξικές συνθήκες κάθε άλλη μέρα, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Μετά από 7 ημέρες θεραπείας φαρμάκου, 3 φρεάτια των prostaspheres σε κάθε ομάδα θεραπείας ομαδοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (300 χ g για 5 λεπτά), πλύθηκε με 1 χ PBS, και μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεϋδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα μονοκλωνικά αντισώματα CD44 και EpCAM (Cell Signaling) χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση δοκιμασία, ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]? [27]. Οι CD44 ή EpCAM επισημαίνονται prostaspheres φωτογραφήθηκαν κάτω από μια Nikon ESLIPSE E800 με 100x μεγέθυνση. Συνεστιακή μικροσκοπία (Leica TCS SP5) διεξήχθη σε MIRL πυρήνα εγκατάσταση, Wayne State University School of Medicine. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Παροδική και Σταθερή Επιμόλυνση του προστάτη κύτταρα με τα cDNA και miRNAs

Οι επιμολύνσεις των cDNA και miRNAs διεξήχθησαν με τη χρήση ExGen 500 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Fermentas, Γερμανία) και DharmaFECT αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Dharmacon), αντίστοιχα, εγχειρίδια εξής κατασκευαστών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Η σταθερή επιμόλυνση των cDNA διεξήχθησαν υπό την επιλογή του μέσου περιέχοντος G418 (Sigma) και επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση Western Blot ανάλυση

Western στύπωμα διεξήχθη για να μετρηθούν τα σχετικά επίπεδα του HIF-1α πρωτεΐνης σε κύτταρα προστάτη υπό συνθήκες υποξίας. Σύνολο κυτταρικά λύματα των κυττάρων που εκτίθενται σε 16 ώρες από υποξικές συνθήκες ελήφθησαν με λύση των κυττάρων σε ρυθμιστικό λύσης πρωτεΐνη που περιέχει 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% SDS, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 2 mM φθοριούχο νάτριο, 2 mM Na

3VO4

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, και 1 × αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche Diagnostics, Germany), και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], και η ένταση του σήματος μετρήθηκε με τη χρήση συστήματος ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Pierce Rockford, IL). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

σε πραγματικό χρόνο (RT) ανάστροφης μεταγραφάσης-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για μέτρηση της έκφρασης των mRNA και miRNAs

Για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA, δύο μικρογραμμάρια των συνολικών RNAs που εξάγονται από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για αντίδραση RT σε 20 μΐ όγκο αντίδρασης χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πράσινο SYBR Δοκιμασία kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για πραγματικού χρόνου PCR αντίδραση, χρησιμοποιώντας ΑΒ StepOnePlus PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ακολουθίες εκκινητές PCR που περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας C

t μέθοδος και ομαλοποιήθηκαν με έκφραση GAPDH σε κάθε δείγμα. Για να προσδιοριστεί η έκφραση των miRNAs στα κύτταρα, το κιτ TaqMan microRNA Δοκιμασία (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα και 5 ng του RNA μεταγράφηκε ανάστροφα όπως περιγράφηκε νωρίτερα [28]. Οι εκκινητές miRNA ελήφθησαν από ΑΒ Systems. Real-time PCR αντιδράσεις στη συνέχεια πραγματοποιούνται σε ένα συνολικό όγκο του μείγματος αντίδρασης 10 μL, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], με τη χρήση StepOnePlus Real Time PCR System (ΑΒ Systems). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας C

t μέθοδος και ομαλοποιήθηκαν με έκφραση RNU48 σε κάθε δείγμα. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

λουσιφεράσης Δοκιμασία Gene

Για να εξεταστεί η επίδραση της CDF ή ανεπάρκειας miR-21 για τη δραστηριότητα δέσμευσης miR-21 στο 3 ‘ -UTR σε κύτταρα προστάτη υπό υποξικές συνθήκες, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς miR-21-διαμεσολαβούμενη λουσιφεράσης σε κύτταρα PC-3 με τη χρήση φορέα miR-21-διαμεσολαβούμενη γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (Signosis, Sunnyvale, CA), στην οποία miR-21 δέσμευσης στην περιοχή του DNA δεσμευτική κατά τη διάνυσμα γονίδιο της λουσιφεράσης καταστέλλει την δραστικότητα λουσιφεράσης. Εν συντομία, 10

4 PC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο των πλακών 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύχτα στο πρότυπο συνθήκες καλλιέργειας. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με miR-21-κατέστειλε φορέα γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης (Signosis, Sunnyvale, CA) με τη χρήση ExGen 500 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Fermentas, Γερμανία) ή συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα λουσιφεράσης και αντι-miR-21 με τη χρήση DharmaFECT αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Dharmacon) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από ολονύκτια επιμόλυνσης, τα επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με CDF για άλλες 20 ώρες κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας, και εκτέθηκαν σε 4 ώρες από υποξική κατάσταση. Τέλος, τα προϊόντα επιμόλυνσης συλλέχθηκαν για δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης με χρήση του συστήματος προσδιορισμού λουσιφεράσης (Promega), ακολουθώντας το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές ανεξάρτητα.

Στατιστικές Μέθοδοι

Συγκρίσεις αποτέλεσμα της θεραπείας ελέγχθηκαν για σημαντική διαφορά από την αντιστοιχισμένη

t

τεστ. Η στατιστική σημαντικότητα θεωρείται σε

P

τιμή μικρότερη του 0,05.

Αποτελέσματα

Επίδραση του CDF στο τηλέφωνο Επιβίωση και ικανότητας κλωνισμού του προστάτη κυττάρων κάτω από Υποξική Κατάσταση

Τα δεδομένα από ΜΤΤ δοκιμασία δείχνουν ότι CDF αξιοσημείωτα ανέστειλε κύτταρο επιβίωση των PC-3 και LNCaP κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). θεραπεία CDF μειώθηκε επίσης κλωνογονικότητας του PC-3 και LNCaP κύτταρα υπό υποξικές συνθήκες (Εικόνα 1Β). Αυτά τα ευρήματα πρότεινε ότι θα μπορούσε να αναστείλει CDF επιβίωση των κυττάρων και κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων προστάτη υπό συνθήκες υποξίας.

Το πάνελ Α, Β, και Γ αντιπροσωπεύουν τα δεδομένα της επιβίωσης των κυττάρων, κλωνογονικότητας, και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Οι μπάρες στα στοιχεία δείχνουν την τυπική απόκλιση των n = 4.

Η

Επίδραση του CDF για HIF-1α πρωτεΐνη και τις παραγωγές του VEGF και IL-6 σε προστάτη κύτταρα κάτω από Υποξική Κατάσταση

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, η θεραπεία CDF μείωσε το σχετικό επίπεδο του HIF-1α σε PC-3 και LNCaP κύτταρα υπό υποξικές συνθήκες. Τα κύτταρα επωάζονται υπό υποξικές συνθήκες οδήγησαν σε αύξηση της παραγωγής VEGF, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επωάστηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες (Σχήμα 2). θεραπεία CDF μειωθεί αξιοσημείωτα την παραγωγή της υποξίας που επάγεται VEGF σε κύτταρα προστάτη (Σχήμα 2). HIF-1α που υπερεκφράζουν PC-3 κύτταρα έδειξαν αυξημένη παραγωγή VEGF κάτω από υποξικές συνθήκες, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα του PC-3. θεραπεία CDF επίσης ανέστειλε την υποξία προκαλούμενη παραγωγή VEGF σε HIF-1α που υπερεκφράζουν PC-3 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από υποξικές συνθήκες οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή IL-6, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επωάστηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες (Σχήμα 2). θεραπεία CDF μειωθεί αξιοσημείωτα την παραγωγή της υποξίας που επάγεται IL-6 σε κύτταρα προστάτη (Σχήμα 2). CDF μειώθηκε επίσης υποξία προκαλούμενη παραγωγή IL-6 σε HIF-1α που υπερεκφράζουν PC-3 κύτταρα (Σχήμα 2).

Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν από κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από νορμοξικές και υποξικές συνθήκες όπως περιγράφεται υπό τις μεθόδους τμήμα. Οι μετρήσεις του VEGF και IL-6 διεξήχθησαν με ELISA. Οι μπάρες στα στοιχεία δείχνουν την τυπική απόκλιση των n = 3.

Η

Επίδραση του ΚΔΔ την αγγειογένεση

in vitro

σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα κάτω από Υποξική Κατάσταση

Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι υποξικές συνθήκες αύξησε την ικανότητα σχηματισμού σωλήνα των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων σε 4 ώρες και 20 ώρες επωάσεων, αντίστοιχα, σε σύγκριση με νορμοξικό κατάσταση. θεραπεία CDF ανέστειλε την υποξία προκαλούμενη σχηματισμός σωλήνα σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 3Α). Για να διευκρινιστεί εάν ή όχι CDF μεσολάβηση μορίων ή η ίδια CDF συμβάλλει στην αναστολή του σχηματισμού σωλήνα, συλλέξαμε μη-CDF-αγωγή (έλεγχος) και CDF επεξεργασμένο media κατάσταση από τα καρκινικά κύτταρα και διεξήχθη η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα υπό ορθοξικές κατάσταση. Βρήκαμε ότι τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα επωάστηκαν με συνθήκη ελέγχου των μέσων ενημέρωσης είχαν αυξημένο σχηματισμό σωλήνα στους 4 ώρες και 20 ώρες, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με CDF-προ-αγωγή κατάσταση του μέσου. Η προσθήκη του CDF στο μέσο όρο ελέγχου ανέστειλε σημαντικά το σχηματισμό σωλήνα, σε σύγκριση με τα κύτταρα επωάζονται στους media κατάσταση ελέγχου και CDF-προ-επεξεργασία μέσων κατάσταση (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ίδια CDF συμβάλλει στην αναστολή του σχηματισμού σωλήνα

Το πάνελ Α & amp?. Β, C & amp? D, και Ε αντιπροσωπεύουν τα δεδομένα της αγγειογένεσης

in vitro

, κυτταρική μετανάστευση, και εισβολή. Όπως περιγράφεται στο τμήμα Μεθόδων, η αγγειογένεση

in vitro

αξιολογήθηκε με την δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα? κυτταρική μετανάστευση αξιολογήθηκε με τραύματος δοκιμασία επούλωσης? εισβολή αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία εισβολή θάλαμο.

Η

Επίδραση της CDF στη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

in vitro

σε προστάτη κύτταρα κάτω από Υποξική Κατάσταση

Η υποξία-εκτεθειμένες PC- 3 κύτταρα είχαν αυξημένη ικανότητα επούλωσης τραύματος, σε σύγκριση με τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 3C). επεξεργασία CDF ανέστειλε την πληγή την ικανότητα των κυττάρων του προστάτη υπό συνθήκες υποξική (Σχήμα 3C και D) επούλωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, υπερ-έκφραση του HIF-1α αύξησε την πληγή ικανότητα των PC-3 κύτταρα που εκτέθηκαν σε 16 ώρες από υποξική κατάσταση επούλωσης. θεραπεία CDF ανέστειλε την ικανότητα επούλωσης πληγών και στις δύο PC-3 κύτταρα HIF-1α-υπερεκφράζουν υπό υποξικές συνθήκες (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχονται πειστικά στοιχεία που δείχνουν ότι θα μπορούσε να αναστείλει CDF υποξία προκαλούμενη κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων προστάτη, ακόμη και σε HIF-1α-over-κύτταρα που εκφράζουν PCa. Η

in vitro δοκιμασία

εισβολή δείχνει ότι και οι δύο PC-3 και LNCaP κύτταρα εκτίθενται σε υποξικά όρο είχε αυξημένη ικανότητα εισβολής, σε σύγκριση με εκείνα τα κύτταρα που εκτίθενται σε νορμοξικό κατάσταση (Σχήμα 3Ε). επεξεργασία CDF ανέστειλε την ικανότητα της υποξίας που προκαλείται από την εισβολή των κυττάρων του προστάτη.

Επίδραση του CDF στο Gene Expression της CSC Δείκτες και miRNA έκφραση σε προστάτη κύτταρα κάτω από Υποξική Κατάσταση

Τα δεδομένα από πραγματικό χρόνο προσδιορισμό RT-PCR υποδεικνύει ότι η υποξία προκαλούμενη τα σχετικά επίπεδα του Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2 mRNAs, καθώς και miR-21 και miR-210 σε κύτταρα PC-3 και LNCaP ενώ CDF μείωσε τα επίπεδα του Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2 mRNAs καθώς και miR-21 και miR-210 στα κύτταρα του προστάτη υπό υποξικές συνθήκες (Σχήμα 4).

Real time RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Οι μπάρες στα στοιχεία δείχνουν την τυπική απόκλιση των n = 3.

Η

Επίδραση του CDF ή αντι-miR-21 στο CSC Αυτο-ανανέωση Χωρητικότητα και Cell Surface δείκτες CD44 και EpCAM στα ανθρώπινα προστάτη κύτταρα κάτω από Υποξική Κατάσταση

Τα δεδομένα από την δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα δείχνουν ότι το αντι-miR-21 μείωσε τον σχηματισμό prostaspheres από PC-3 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-21 μπορεί να παίζει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ικανότητας αυτο-ανανέωση του CSC κυττάρων που μοιάζουν PCa. θεραπεία CDF decesased επίσης το σχηματισμό prostaspheres κυττάρων προστάτη υπό υποξικές συνθήκες (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε συνεστιακή μικροσκοπία απεικόνισης για την αξιολόγηση της έκφρασης του CD44 και EpCAM στα σχηματισμού σφαίρας κύτταρα PC-3 κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αντι-miR-21 μείωσε την έκφραση του CD44 και EpCAM σε PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας κάτω από συνθήκες υποξικά, σύμφωνη με την αντιμετώπιση CDF (Σχήμα 5Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η CDF μείωσε το σχηματισμό prostaspheres και την έκφραση των CD44 και EpCAM εν μέρει διαμεσολαβείται από τη στόχευση της έκφρασης του miR-21.

Το πάνελ Α και Β αντιπροσωπεύουν τα δεδομένα του σχηματισμού των prostaspheres, τα έκφραση του CD44 και EpCAM, και η παραγωγή του VEGF και IL-6 στο CSC κύτταρα που μοιάζουν με σφαίρα σχηματισμού των κυττάρων του προστάτη, αντίστοιχα. Η δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα διεξήχθη για να εξετάσει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ΚΕΠ των κυττάρων προστάτη, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη για να μετρηθεί η έκφραση του CSC δεικτών επιφανείας CD44 και ΕρΟΑΜ στα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας που προέρχονται από κύτταρα του προστάτη, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Οι μπάρες στα στοιχεία δείχνουν την τυπική απόκλιση των n = 3.

Η

Επίδραση του CDF ή αντι-miR-21 σε VEGF και IL-6 παραγωγή στον τομέα που σχηματίζουν κύτταρα PC-3 κυττάρων υπό υποξική κατάσταση

Εξετάσαμε την επίδραση της CDF για VEGF και IL-6 παραγωγές στον τομέα που σχηματίζουν τα κύτταρα PC-3 κύτταρα υπό υποξικές συνθήκες με δοκιμασία ELISA. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC-3 σχηματισμού σφαίρας παρήγαγε μία μεγαλύτερη ποσότητα VEGF κάτω από υποξικές συνθήκες, σε σύγκριση με τη γονική PC-3 κύτταρα του (3172 pg /ml /10

4 PC 3-κύτταρα σχηματισμού σφαίρας vs 3192 pg /mL /10

6 κύτταρα PC-3? Σχήμα 2 και 5C), υποδεικνύοντας ότι οι PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας μπορεί να προάγουν την αγγειογένεση με up-ρύθμιση της έκφρασης της παραγωγής VEGF. Βρήκαμε επίσης ότι η θεραπεία CDF μειώθηκε υποξία προκαλούμενη παραγωγή VEGF σε PC 3-κύτταρα σχηματισμού σφαίρας, σύμφωνα με τα αποτελέσματα από το PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας με αναστολή υπό όρους του miR-21. Επιπλέον, βρήκαμε ότι είναι παρόμοια με την παραγωγή VEGF, τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας παρήγαγε ένα αξιοσημείωτα υψηλότερο ποσό της υποξίας που επάγεται IL-6, σε σύγκριση με γονικά κύτταρα του (129,3 pg /ml /10

4 PC-3 σχηματισμού σφαίρας κύτταρα vs 457,6 pg /ml /10

6 κύτταρα PC-3? Σχήμα 2 και 5C). θεραπεία CDF ή ανεπάρκεια όρους του miR-21 με αναστολέα /siRNA του μείωσε την παραγωγή της υποξίας που επάγεται IL-6 από τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας (Σχήμα 5C). Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον ή όχι CDF θεραπεία ή ανεπάρκεια miR-21 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίου του HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, δείκτες EpCAM, και EMT σε PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας κάτω από υποξικές συνθήκες. Βρήκαμε ότι η υπό όρους καταστολή του miR-21 είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στα σχετικά επίπεδα mRNA του HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, δείκτες EpCAM, και μεσεγχυματικά του φαινοτύπου ΕΜΤ όπως ZEB1, βιμεντίνη και Twist, και αύξησε τα σχετικά επίπεδα mRNA των επιθηλιακών δείκτη Ε-καδερίνης σε PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας κάτω από υποξικές συνθήκες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρομοίως, CDF μείωσε τα επίπεδα mRNA του HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, και δείκτες μεσεγχυματικών ZEB1, ZEB2, βιμεντίνη, και Twist σε PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας κάτω από υποξικές συνθήκες. Ωστόσο, CDF μείωσε επίσης το γονίδιο έκφραση Ε-καδερίνης σε κύτταρα σχηματισμού σφαίρας PC-3 υπό συνθήκη υποξική (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επίδραση του CDF στην έκφραση των miRNAs σε PC-3 σχηματισμού σφαίρας κύτταρα κάτω υποξική κατάσταση

Εξετάσαμε την επίδραση του CDF στο Let-7, miR-21, miR-101 και miR-210 στο PC-3 κύτταρα σχηματισμού σφαίρας κάτω από υποξικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CDF αύξησε τα σχετικά επίπεδα miRNA του ας-7c, d, και miR-101 και μείωσε το σχετικό επίπεδο miR-210 σε κύτταρα PC-3 σχηματισμού σφαίρας κάτω από υποξικές συνθήκες (Σχήμα 6Α). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CDF μπορούσε απορύθμιση της έκφρασης της υποξίας που σχετίζεται miRNAs σε CSC-κύτταρα που μοιάζουν με των κυττάρων του προστάτη.

Το πάνελ Α και Β αντιπροσωπεύουν τα δεδομένα των miRNAs στις CSC κύτταρα που μοιάζουν σχηματισμού σφαίρας που προέρχονται από ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη και λουσιφεράσης δραστηριότητες στα κύτταρα του προστάτη, αντίστοιχα. Η επιμόλυνση των miR-21-διαμεσολαβούμενη διάνυσμα γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης και αντι-miR-21 διεξήχθησαν σε κύτταρα PC-3, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στην ενότητα Μέθοδοι. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με τη χρήση κιτ Promega σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης, μετά το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Οι μπάρες στα στοιχεία δείχνουν την τυπική απόκλιση των n = 3.

Η

Επίδραση του ΚΔΔ Μεταχείρισης ή miR-21 Ανεπάρκεια σε miR-21 δραστικότητα σύνδεσης στο 3′-UTR σε προστάτη κύτταρα κάτω από Υποξική Condition όπως εκτιμάται από Luciferase Assay

Εξετάσαμε την επίδραση της θεραπείας CDF ή ανεπάρκεια miR-21 επί της δραστικότητας πρόσδεσης miR-21 έως 3′-UTR στα κύτταρα προστάτη υπό συνθήκες υποξικές χρησιμοποιώντας προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης miR-21-διαμεσολαβούμενη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, βρήκαμε ότι η υποξία μείωσε την δραστικότητα λουσιφεράσης στα κύτταρα PC-3 που μορφομετατρέπονται με miR-21 μεσολάβηση φορέα λουσιφεράσης, σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα υπό ορθοξικές προϋπόθεση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υποξία αύξησε την δραστικότητα σύνδεσης miR-21, οδηγεί στην ελάττωση της δραστικότητας της λουσιφεράσης. Αντι-miR-21 αύξησε την δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα PC-3 υπό υποξικές συνθήκες, σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα χωρίς θεραπεία, υποδηλώνοντας ότι τα αντι-miR-21 μειωμένη δέσμευση ΜΙΚ-21 DNA, οδηγώντας σε μια αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε PC-3 κύτταρα υπό υποξικές συνθήκες. Ομοίως, η θεραπεία CDF έδειξαν αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα PC-3 υπό υποξικές συνθήκες με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι CDF θα μπορούσε να αναστείλει δέσμευσης miR-21 DNA σε κύτταρα PC-3.

Συζήτηση

Ένας αριθμός επιδημιολογικών και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υποξία και μονοπάτια σηματοδότησης που προκαλείται από υποξία σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών που διαγιγνώσκονται με συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του προστάτη (PCA). Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν επίσης ότι η υποξία αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση, την εισβολή και την αγγειογένεση, οδηγώντας σε όγκο επιθετικό φαινότυπο. Εδώ, επιβεβαιώνουμε ότι η υποξία επάγει κυτταρική μετανάστευση, εισβολή, και αγγειογένεση, και αύξησε την παραγωγή του VEGF σε κύτταρα PCa. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η υποξία επάγει το σχηματισμό prostaspheres σε κύτταρα PCa, συνεπής με αυξημένη έκφραση του CSC δεικτών γονιδίων όπως Nanog, Oct4, ΕΖΗ2, CD44, και EpCAM στα κύτταρα PCa. Έχει αποδειχθεί ότι η υποξία παίζει βασικό ρόλο στη ρύθμιση των χαρακτηριστικών CSC μέσω πρωτεΐνες HIF, και HIF γονίδια κατάντη στόχου όπως Oct4 και Notch-1 [6]? [7]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υποξία μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στη ρύθμιση των χαρακτηριστικών CSC, οδηγώντας σε όγκο επιθετικό φαινότυπο.

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη των όγκων μέσω της ρύθμισης της υποβάθμισης του mRNA ή μετάφραση πρωτεΐνης προκαλούνται μέσω πρόσδεσης τους στην 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’-UTR) των γονιδίων-στόχων. Έχει τεκμηριωθεί ότι miR-21 θεωρείται μία προ-ογκογόνο μόριο, οι οποίες προωθούν την ογκογένεση.