Αφηρημένο

Ιστορικό

Ενεργοποίηση σωματικές μεταλλάξεις στο

επιδερμικού αυξητικού

υποδοχέα του παράγοντα (

EGFR

) προσδίδουν μοναδικά χαρακτηριστικά βιολογικό σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC), αλλά τα μεταγραφικά μεσολαβητές του EGFR σε αυτήν την υποομάδα NSCLC δεν έχουν πλήρως καθορισθεί.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

Εδώ χρησιμοποιήσαμε γενετικές και φαρμακολογικές προσεγγίσεις για τη διαλεύκανση των transcriptomes των κυτταρικών σειρών NSCLC. Εμείς μεταγραφικά προφίλ ένα πάνελ

EGFR

μεταλλαγμένου και -wild-κυτταρικό τύπο NSCLC γραμμές καλλιεργούνται παρουσία ή απουσία ενός αναστολέα τυροσίνης κινάσης του EGFR. Ιεραρχική ανάλυση αποκάλυψε ότι οι κυτταρικές σειρές διαχωρίζονται βάσει του

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων (μεταλλαγμένο έναντι άγριου τύπου), και τις υπογραφές έκφραση ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση εποπτευόμενης που διακρίνονται τις κυτταρικές γραμμές με βάση κατάστασης μεταλλάξεων (τύπου άγρια έναντι μεταλλαγμένου) και το είδος της μετάλλαξης (L858R έναντι Δ746-750). Χρησιμοποιώντας ένα

EGFR

μετάλλαξη συγκεκριμένη υπογραφή της έκφρασης ως ανιχνευτή, που εξορύσσεται τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των δύο ανεξάρτητες ομάδες ασθενών με NSCLC και βρήκε την υπογραφή σε ένα υποσύνολο. Τυροσίνης EGFR θεραπεία αναστολέα κινάσης ρυθμίζεται η έκφραση πολλαπλών γονιδίων, και φαρμακολογική αναστολή των πρωτεϊνικών προϊόντων δύο από αυτές (

PTGS2

και

EphA2

) ανέστειλε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε διευκρινιστεί γονίδια που δεν είχαν προηγουμένως συνδέονται με

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC, δύο εκ των οποίων ενίσχυσε την κλωνογενοποιήσεως από αυτά κύτταρα, διακρίνοντας αυτές μεσολαβητών από άλλους δειχθεί προηγουμένως να διατηρηθεί επιβίωση κυττάρου. Τα ευρήματα αυτά έχουν πιθανή κλινική σημασία δεδομένης της διαθεσιμότητας των φαρμακολογικών εργαλείων για την αναστολή των πρωτεϊνικών προϊόντων των γονιδίων αυτών

Παράθεση:. Choi K, Creighton CJ, Stivers D, Fujimoto Ν, Κυπβ JM (2007) μεταγραφικού προφίλ των Μη -μικρό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα με Ενεργοποίηση

EGFR

Σωματικές μεταλλάξεις. PLoS ONE 2 (11): E1226. doi: 10.1371 /journal.pone.0001226

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Janet Κέλσο, Ινστιτούτο Max Planck για την Εξελικτική Ανθρωπολογία, Γερμανία

Ελήφθη: 6η Σεπτεμβρίου, 2007? Δεκτές: 1 Νοεμβρίου του 2007? Δημοσιεύθηκε: 21 του Νοεμβρίου, 2007

Copyright: © 2007 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγεί Ρ50 CA70907, Ρ30 CA125123, και R01 CA117965

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Θεραπεία με υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ) οδηγεί σε ταχεία και παρατεταμένη συρρίκνωση του όγκου σε ένα υποσύνολο των ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [1] – [3]. Τα καρκινικά κύτταρα σε αυτούς τους ασθενείς έχουν σωματικές μεταλλάξεις εις το

EGFR

κινάσης που ενεργοποιούν ιδιοσυστατικά EGFR [1] – [3]. Οι μεταλλάξεις ενεργοποίησης προσδιορίζονται μέχρι στιγμής σύμπλεγμα στην περιοχή που κωδικοποιεί το πεδίο κινάσης (εξόνια 18-21) και είναι συχνότερα είτε Δ746-750 μεταλλάξεις διαγραφής ή L858R σημείο [1] – [3]. μοντέλα ποντικών κατασκευάστηκε για τη διερεύνηση της ογκογένεσης των μεταλλαγμένων

EGFR

αναπτύξει επεμβατικές αδενοκαρκινώματα πνεύμονα που υποχωρούν μετά από θεραπεία με EGFR TKIs [4? 5]. Αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν κακοήθεις ιδιότητες μετά από επιμόλυνση με μεταλλαγμένο

EGFR

[6]. Η θεραπεία με EGFR TKIs επάγει απόπτωση αυτών

EGFR

-επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα NSCLC με σωματικές μεταλλάξεις στο

EGFR

[7? 8]. Έτσι, τα στοιχεία από την ανθρώπινη, ποντικού, και κυτταρικών μοντέλων δείχνει ότι μεταλλαγμένα

EGFR

είναι ογκογόνο και παρέχει την εξάρτηση από EGFR για την επιβίωση των κυττάρων NSCLC.

Η ισχύς των μεταλλαγμένων

EGFR

ως ογκογονίδιο συνοδεύεται από αποδεικτικά στοιχεία ότι οι βιοχημικές ιδιότητες διαφέρουν σημαντικά από αυτές του φυσικού τύπου EGFR. Το πεδίο κινάσης EGFR είναι συστατικώς ενεργοποιείται από τις σωματικές μεταλλάξεις, και εμφανίζει αυξημένη σύνδεση και ευαισθησία στο EGFR TKIs [9] – [11].

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC τυπικά εκφράζουν υψηλά επίπεδα του EGFR και ErbB2 διμερούς συνεργάτες του και ErbB3 και πολλαπλούς συνδετήρες ErbB, τα οποία ενισχύουν EGFR εξαρτώμενη σηματοδότηση [8]. Πολλαπλές οδών σηματοδότησης είναι ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα σε αυτά τα κύτταρα, μερικά από τα οποία έχουν δειχθεί ότι προάγουν την κυτταρική επιβίωση. Για παράδειγμα, ο EGFR σχηματίζει ένα ετεροδιμερές σύμπλοκο με ErbB3, το οποίο συνδέεται με και ενεργοποιεί άμεσα φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση και διατηρεί την επιβίωση των κυττάρων μέσω μηχανισμών ΑΚΤ-εξαρτώμενη [12]. Τα άλλα σήματα προ-επιβίωσης με τη μεσολάβηση της Src κινάσες της οικογένειας, τα οποία είναι μόνιμα ενεργοποιημένη στο

EGFR κύτταρα

μεταλλαγμένου NSCLC [13? 14].

Σε αντίθεση με τις προόδους στην αποσαφήνιση μεσολαβητές κυτταρική επιβίωση, λιγότερο έχει σημειωθεί πρόοδος στην κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους μεταλλαγμένο

EGFR

παρέχει άλλες νεοπλασματικές ιδιότητες, όπως είναι η ικανότητα να μεταναστεύουν, εισβάλει, πολλαπλασιάζονται σε αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο τρόπο, και την προώθηση της αγγειογένεσης. Εδώ επιδιώξαμε να προσδιοριστούν οι μεσολαβητές με την υποβολή ερωτημάτων στη transcriptomes ενός πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC που έχουν χαρακτηριστεί για την παρουσία του

EGFR

μεταλλάξεις. Βρήκαμε ένα μεταγραφικό προφίλ των κυττάρων

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC που περιελάμβανε τα γονίδια που δεν έχουν προηγουμένως ήταν γνωστό ότι είναι EGFR-εξαρτώμενη. Αν και το φάσμα των κυτταρικών λειτουργιών αποδίδονται σε αυτά τα γονίδια είναι ευρεία, πολλοί από αυτούς συνδέονται μέσω γνωστών ή προβλεπόμενη δίκτυα αλληλεπίδραση πρωτεΐνης. Εν κατακλείδι, η μεταγραφική προφίλ που προσδιορίζονται στο

κύτταρα EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC μας ενημέρωσε σχετικά με βιολογικές διεργασίες και πιθανούς θεραπευτικούς στόχους που θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική σε ασθενείς με αυτή τη νόσο.

Αποτελέσματα

Μεταγραφική ανάλυση του NSCLC κυτταρικές γραμμές

Χρησιμοποιήσαμε ένα πάνελ οκτώ κυτταρικές σειρές NSCLC (Πίνακας 1) που είχε χαρακτηριστεί για την παρουσία ή απουσία των σωματικών

EGFR

μεταλλάξεις (πέντε κυτταρικές γραμμές με τέτοιες μεταλλάξεις και τρεις χωρίς) και

Ras

μεταλλάξεις (δύο κυτταρικές σειρές με τέτοιες μεταλλάξεις και έξι χωρίς). Από τις πέντε

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές, τρεις είχαν εξόνιο 19 μεταλλάξεις διαγραφής (Δ746-750) (HCC827, HCC2279, H4006), ένας είχε ένα σημείο εξόνιο 21 μετάλλαξη (L858R) (H3255) και μία είχε L858R σε συνδυασμό με το ρυθμιστή μετάλλαξη Τ790Μ που προσδίδει αντίσταση σε EGFR ΤΚΙδ (H1975). Από τις τρεις

EGFR

κυτταρικές σειρές -wild τύπου, ένας είχε μια σωματική μετάλλαξη στο

N-ras

(Η1299), και ένας είχε ένα

K-ras

μετάλλαξη (Η460). RNA εκχυλίστηκε και παρασκευάζεται από κύτταρα μετά είχαν καλλιεργηθεί για 2 ώρες στους 70% συρροή υπό την παρουσία ή απουσία του gefitinib EGFR ΤΚΙ (1,0 μΜ). Αυτή η διάρκεια της αγωγής ΤΚΙ επιλέχθηκε για τον προσδιορισμό των νωρίτερο μεταγραφικά γεγονότα που επάγεται από την αναστολή EGFR και να ελαχιστοποιηθεί η ανίχνευση των αλλαγών έκφρασης γονιδίου λόγω απόπτωσης. Το RNA υποβλήθηκε σε Affymetrix προφίλ γονιδιακής έκφρασης, και τα προφίλ εξετάστηκαν για τις διαφορές στη γονιδιακή έκφραση κατά την έναρξη και μετά τη θεραπεία ΤΚΙ.

Η

Θα εξεταστεί πρώτο

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων ως ταξινομητής των μεταγραφικών προφίλ. Ιεραρχική ανάλυση αποκάλυψε ομαδοποίηση των κυτταρικών σειρών με βάση κατάστασης μεταλλάξεων? η

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές διαχωρίζονται σαφώς από τις κυτταρικές γραμμές -wild-τύπου (Εικ. 1). Ωστόσο, δεν υπήρχε σαφής διαχωρισμός μεταξύ των δύο τύπων των μεταλλάξεων (L858R έναντι Δ746-750) (Σχ. 1). Με εποπτευόμενη ανάλυση με τη χρήση συγκεκριμένων κριτηρίων (τουλάχιστον 2.0-πλάσια αύξηση ή μείωση κατά 50% σε

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές γραμμές σε σχέση με εκείνο του άγριου τύπου,

P

& lt? 0,05) , 194 μοναδικά γονίδια εντοπίστηκαν ότι διακρίνεται η

EGFR-

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές από τις κυτταρικές σειρές -wild τύπου. Αυτά τα γονίδια που παρατίθενται στο S1 File και απεικονίζεται στα συμπλέγματος χάρτη θερμότητας στο Σχ. 2

Μια

. Εξετάσαμε 29 από τα 194 γονίδια με ποσοτική PCR και να επικυρώνεται ότι 19 (68%) από αυτούς που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ

EGFR

κυτταρικές σειρές μεταλλαγμένου και -wild τύπου (S2 File).

δενδρόγραμμα που απεικονίζει την σχετικότητα των προφίλ έκφρασης από κυτταρικές σειρές σε επεξεργασία με (+) ή χωρίς (-) gefitinib. Η παρουσία ή η απουσία του

EGFR

σωματικές μεταλλάξεις και το είδος των μεταλλάξεων, συμπεριλαμβανομένου του σημείου L858R μετάλλαξη (Ρ) ή Δ746-750 μετάλλαξη διαγραφής (D), υποδεικνύονται. WT, άγριου τύπου.

Η

(Α)

Ένα 194-γονιδίου υπογραφή που διακρίνει

EGFR

-wild τύπου (WT) από μεταλλαγμένου κυττάρου NSCLC γραμμές (αγωγή με [+] ή χωρίς [-] gefitinib) είναι ευθυγραμμισμένη με τα προφίλ έκφρασης από το

(Β)

την ομάδα του Michigan (86 ασθενείς) και η ομάδα του Χάρβαρντ (84 ασθενείς) και

( D)

MCF-7 κύτταρα επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα γονίδια. Μια λίστα με τα γονίδια που επικαλύπτονται σε όλες τις τρεις σειρές δεδομένων που αναγράφεται στην ακροδεξιά. (

C

) Οι αριθμοί των ασθενών στις ομάδες του Michigan και του Χάρβαρντ εκδηλώνεται το μεταλλαγμένο

EGFR

πρότυπα έκφρασης (

P

& lt? 0,05, συσχέτισης του Pearson), μαζί με τον αριθμό εκδηλώνεται ένα τυχαίο μοτίβο (SD βασίζεται σε 100 προσομοιώσεις). (

E

) διάγραμμα Venn που απεικονίζει την αλληλεπικάλυψη μεταξύ υπογραφές από τις

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC και

EGFR

-επιμολυσμένα κύτταρα MCF-7.

Η

Αναγνώριση των μεταλλαγμένων

EGFR

Υπογραφή σε ομάδες ασθενών με NSCLC

επόμενο ερώτημα δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων γονιδιακής έκφρασης των δειγμάτων της βιοψίας του όγκου που προέρχεται από δύο ανεξάρτητες ομάδες των ασθενών με NSCLC από το Ηνωμένες Πολιτείες (15, 16) για να καθοριστεί αν ένα υποσύνολο των όγκων εκφράσει αυτή γενετική υπογραφή. Από τα 194 γονίδια, 102 (53%) εκπροσωπείται στην πλατφόρμα προφίλ που χρησιμοποιούνται για την ομάδα του Χάρβαρντ, και 65 (34%) εκπροσωπούνταν στην ομάδα Michigan. Βασίζεται σε μια εκπροσώπηση χάρτη θερμότητας των προτύπων γονιδιακής έκφρασης τους, οι ανθρώπινοι όγκοι του πνεύμονα ήταν ετερογενή σε μοτίβα έκφρασή τους? Ωστόσο, ένα υποσύνολο των όγκων (9 από 84 [11%] στην κοόρτη Harvard και 10 της 86 [12%] στην κοόρτη Michigan) παρουσίασαν ένα πρότυπο έκφρασης παρόμοιο με εκείνο του

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC γονίδιο υπογραφή (Εικ. 2

Β

).

Για να καθορίσει αν οι ομοιότητες που παρατηρούνται με ανάλυση χάρτη θερμότητας έφτασε στατιστική σημασία, παράμετροι δημιουργήθηκαν εκείνη που ορίζεται ομοιότητα ως συσχετισμός μια θετική Pearson του

P

& lt? 0,05 (δύο όψεων) μεταξύ του μεταλλαγμένου

EGFR

μοτίβο υπογραφή και οι αξίες της γονιδιακής έκφρασης του όγκου, λαμβάνοντας υπόψη τόσο τις υπερ- και υπο-εκφρασμένα γονίδια στην υπογραφή. Με τον ορισμό αυτό, οι όγκοι που εκδηλώνεται αυτή η υπογραφή θα ανακεφαλαιώνουν τα πρότυπα της υπερ-και υπο-έκφραση παρατηρήθηκε στα

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές. Η συχνότητα των όγκων εκδηλώνεται η υπογραφή ήταν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,01 για κάθε ομάδα). Βασίζονται σε προσομοιώσεις χρησιμοποιώντας 100 τυχαία επιλεγμένα υπογραφές γονίδιο που παράγεται από κάθε μία από τις ομάδες (Εικ. 2C)

Αν και το

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων των όγκων από αυτές τις ομάδες ασθενών έχει, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχει αναφερθεί,

K-ras

(κωδικόνια 12, 13, ή 61) είναι γνωστό ότι να μεταλλαχθεί σε 29% και 45% των όγκων από τις κοόρτες Harvard και το Μίσιγκαν, αντίστοιχα [15? 16]. Σωματικές μεταλλάξεις στο

EGFR

και

K-ras

αλληλοαναιρούνται σε NSCLC [17], η οποία έχει οδηγήσει τους ερευνητές να υποθέτουν ότι αυτά τα γεγονότα είναι γενετικά περιττές και ότι μια αλλαγή και στα δύο γονίδια δεν προσδίδει ένα επιπλέον πλεονέκτημα όταν συμβαίνουν αυτά τα γεγονότα μαζί στο ίδιο κελί [17]. Εμείς υποτεθεί ότι, εάν αυτά τα σωματικά γεγονότα είναι γενετικά περιττές, στη συνέχεια, έχοντας τις

K-ras

μετάλλαξη θα προσδώσουν το μεταλλαγμένο

EGFR

μεταγραφικό προφίλ. Συνεπής με αυτή την ιδέα, διαπιστώσαμε ότι

K-ras

κατάστασης μεταλλάξεων συσχετιζόμενων, αν και ασθενώς, με το μεταλλαγμένο

EGFR

γονίδιο υπογραφή (Εικ. 2

B, P =

0,07 και

P

= 0.04 στις ομάδες του Χάρβαρντ και του Μίτσιγκαν, αντίστοιχα, από Wilcoxon τεστ rank-sum των προφίλ ομάδα κατά μέσο όρο την έκφραση των γονιδίων που αυξήθηκαν σε ποσοστό

EGFR

μεταλλαγμένου κυττάρου γραμμές).

Mutant

EGFR

υπογραφή Εμπλουτισμένο με EGFR-εξαρτημένων γονίδια

Για να διερευνήσουν κατά πόσον κάποιο από τα γονίδια στο 194-γονιδίου υπογραφή ρυθμίζονταν σε EGFR-εξαρτώμενη τρόπο, έχουμε ερωτηθούν διαθέσιμη στο κοινό βάση δεδομένων των MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού που είχαν σταθερά επιμολυσμένα με ιδιοσυστατικά ενεργή κινάσες (

Raf1

,

ΜΕΚ1

,

ErbB2

) ή με άγριου τύπου

EGFR

, η οποία ενεργοποιείται από τη βραχυχρόνια θεραπεία του ΕΤΠ [18]. Ερευνήσαμε την επικάλυψη μεταξύ των γονιδίων υπογραφές από το

EGFR

-επιμολυσμένα κύτταρα MCF-7 και

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC. Από τα 194 γονίδια στο μεταλλαγμένο

EGFR

υπογραφή, 139 (72%) εκπροσωπείται στην πλατφόρμα προφίλ για τους μορφομετατροπείς κυττάρου MCF-7 (11.079 γονίδια σε όλα εκπροσωπούνται τόσο στα MCF-7 και NSCLC σύνολα δεδομένων ). Η ανάλυση αυτών των 139 γονιδίων αποκάλυψε ότι υποσύνολα των γονιδίων που αυξήθηκαν σε MCF-7 κύτταρα, λόγω της ΜΕΚ, Raf1, ή διαμόλυνση EGFR επικαλύπτονται με εκείνα στο μεταλλαγμένο

EGFR

υπογραφή έκφραση σε κύτταρα NSCLC (Σχ. 2

D

).

Από τα 119 γονίδια που ήταν τόσο εκπροσωπούνται στο MCF-7 σύνολο δεδομένων και αυξήθηκε το

EGFR κύτταρα

μεταλλαγμένου NSCLC, 44 (31%) ήταν αυξήθηκε με

P

& lt? 0.05 στο

EGFR

-επιμολυσμένα κύτταρα MCF-7, το οποίο αντιπροσώπευε μια ιδιαίτερα σημαντική επικάλυψη (

P

& lt? 1E-12, μονόπλευρη ακριβές τεστ του Fisher, Εικ. 2

E

). Με την ευκαιρία, 14 των 119 γονιδίων θα αναμένεται να επικαλύπτονται, υποδεικνύοντας ότι το ποσό της επικάλυψης που παρατηρήσαμε υπερέβαινε τι θα αναμενόταν εάν η

EGFR

-επιμολυσμένα κύτταρα MCF-7 και

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC κύτταρα τίποτα βιολογικά κοινού με το άλλο. Όταν χρησιμοποιείται ένα πιο αυστηρό το σημείο αποκοπής του

P

& lt? 0,01 αντί του

P

& lt? 0,05 να καθορίσουν γονίδια που αυξήθηκαν σε ποσοστό

EGFR

-επιμολυσμένα MCF-7 κύτταρα (576 γονίδια σε όλους), 28 επικαλύπτονται με το μεταλλαγμένο υπογραφή EGFR NSCLC (πιθανότητα αναμένεται επτά γονιδίων,

P & lt?

1E-10, μονόπλευρη ακριβής δοκιμασία του Fisher). Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι, με βάση τα κοινά σημεία με την υπογραφή από τον

EGFR

-επιμολυσμένα MCF-7 κύτταρα, την υπογραφή από το

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC εμπλουτίστηκε για τα γονίδια μεταγραφικά up-ρυθμίζεται από EGFR .

Αναγνώριση

PTGS2

ως ένα γονίδιο που απαιτείται για την αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη

Τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές NSCLC έπεσε σε ένα ευρύ φάσμα των λειτουργικών κατηγοριών (κατηγοριοποιούνται στο γονίδιο Οντολογία Μοριακής Λειτουργίες, www.geneontology.org) (Αρχεία S3 και S4). Οι κατηγορίες με την υψηλότερη εκπροσώπηση ήταν μεταγωγή σήματος, το μεταβολισμό, την ανοσολογική απάντηση, μεταφορά ιόντων και του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό. Γονίδια σε αυτές τις κατηγορίες που εκφράζεται έντονα συμπεριληφθεί αυτά που κωδικοποιούν συνδέτες ErbB (

TGFa, AREG

, και

ereg

), της κυκλοοξυγενάσης-2 (

PTGS2

), συνδέτη ο υποδοχέας CX3CR1 χημειοκινών (

CX3CL1)

, ενδοκυτταρική και διαμεμβρανική κινάσες (

TRIB2, ΚΟΑ, MYLK, STK39, ACVR1, TAOK3 και IFIH1

), φωσφατάσες πρωτεϊνών (

PTPN22, DUSP10 , PPAP2B, PTPRR,

και

PTPRE

), ένα λιπίδιο φωσφατάση (

SGPP2

), μόρια προσκόλλησης (

CEACAM6, ITGAV, PCDH7,

και

THBS1

), και πρωτεΐνες σύνδεσης ιόντος ασβεστίου (

S100A14

και

S100A16

).

Για να εξεταστεί κατά πόσον αυτά τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, τα οποία έχουν διαφορετικές λειτουργίες βιολογικών, ήταν μέρος του ένα ή περισσότερα δίκτυα μεταγωγής σήματος, αναλύσαμε τις θέσεις τους εντός γνωστή ή προβλεπόμενη παγκόσμια δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης (interactomes) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού HiMAP (https://www.himap.org/index.jsp). Οι Interactomes προσδιορίζονται από την προσέγγιση αυτή οργανώνεται σε μια σειρά από σπονδυλωτές δομές χαρακτηρίζονται από το κεντρικά τοποθετημένο κόμβους (που ονομάζεται hubs) που έχουν πολλαπλές συνδέσεις με άλλες πρωτεΐνες [19]. Αν και αυτή η προσέγγιση είναι καθαρά διερευνητικό και δεν έχει καμία στατιστική βάρος, τα ευρήματα δείχνουν ότι μαγιά κεντρικότητα σε interactome πρωτεΐνη προβλέπει βιολογική σημασία μιας πρωτεΐνης [20].

Από τις 194 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, 118 είχαν σχολιασμένο Gene οντολογία, εκ των οποίων 102 είχαν συμπεριληφθεί στο πρόγραμμα λογισμικού HiMAP (19). Από αυτά τα 102 γονίδια, 52 χαρτογραφείται σε ένα ενιαίο δίκτυο (Εικ. 3). Οι κόμβοι του δικτύου με τα υψηλότερα ποσοστά των συνδέσμων (≥ 10) περιλαμβάνεται

CD44, ΚΟΑ, IRS1, GRB10, ITGA2, PTGS2 και THBS1,

τα οποία ήταν ιδιαίτερα εκφράζονται σε

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC, υποδεικνύοντας ότι ορισμένα από τα διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ήταν σε κεντρικό θέσεις αυτού του δικτύου σηματοδοσίας.

Θεωρητική πρωτεΐνης-πρωτεΐνης φυσική και λειτουργική αλληλεπίδραση χάρτη (interactome) συντάχθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό HiMAP. Τα γονίδια από την υπογραφή αναγράφεται στο κόκκινο.

Η

Υπό το φως της κεντρικότητας του

PTGS2

γονίδιο στο δίκτυο interactome και τη γνωστή σημασία της κυκλοοξυγενάσης-2 γονιδίου προϊόντος της (COX -2) στην επιβίωση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων και πιθανή κλινική επίδρασή της, δεδομένης της διαθεσιμότητας των φαρμακολογικών εργαλείων για την αναστολή της ενζυματικής λειτουργίας του [21], επιδιώξαμε να ερευνήσει το ρόλο της στην

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC. Εξετάσαμε κατά πόσο η κυκλοοξυγενάσης-2 αναστολέα celecoxib κατήργησε την ικανότητα αυτών των κυττάρων να πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργειες μονοστιβάδας και να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Χρησιμοποιώντας celecoxib σε χαμηλές δόσεις (0,5 μΜ και 1,0 μΜ) για να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική δράση, σχηματισμό αποικίας σε μαλακό άγαρ μειώθηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 4), ενώ ο πολλαπλασιασμός σε μονοστοιβάδες δεν άλλαξε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποικιών των κυτταρικών σειρών NSCLC (άνω πάνελ) ποσοτικοποιήθηκαν (κάτω πάνελ) μετά από καλλιέργεια τους σε μαλακό άγαρ παρουσία ή απουσία του celecoxib. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

κυτταρικές σειρές με

EGFR

διαγραφές και σημειακές μεταλλάξεις έχουν διακριτές Έκφραση προφίλ

Μεταξύ των ασθενών με

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC, οι διαφορές στη διάρκεια επιβίωση και ανταπόκριση σε EGFR θεραπεία ΤΚΙ έχουν παρατηρηθεί ανάλογα με τον τύπο του

EGFR

σωματική μετάλλαξη (εξόνιο 21 σημειακές μεταλλάξεις έναντι εξόνιο 19 διαγραφές) [22? 23] , γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτοί οι δύο τύποι σωματικών μεταλλάξεων προσδίδουν διακεκριμένες βιολογικές ιδιότητες στα κύτταρα NSCLC. Στήριξη της δυνατότητας αυτής αποτελεί απόδειξη ότι αυτοί οι δύο τύποι των σωματικών μεταλλάξεων προσδίδουν ξεχωριστές βιοχημικές ιδιότητες με EGFR [9] – [11]. Αν και ιεραρχική συσταδοποίηση δεν διαχωρίζουν τους δύο τύπους μεταλλάξεων σε δύο διακριτές υποομάδες (Εικ. 1), υποθέσαμε ότι εποπτευόμενο ανάλυση θα αποκαλύψει μεταγραφική διαφορές μεταξύ των δύο τύπων μεταλλάξεων. Πράγματι, παρατηρήθηκαν σαφείς μεταγραφική διαφορές. Χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα κριτήρια (

P

& lt? 0,01, τουλάχιστον δύο φορές την αλλαγή), εντοπίσαμε ένα 270-γονιδίου υπογραφή στο

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές (η οποία δεν ήταν παρούσα στο

EGFR

κυτταρικές σειρές -wild-τύπου) που διακρίνονται τα δύο είδη των μεταλλάξεων. Αυτά τα γονίδια αναφέρονται στο S5 File και απεικονίζεται στα συμπλέγματος χάρτη θερμότητας στο Σχ. 5. Εξετάσαμε 7 των 270 γονιδίων με ποσοτική PCR και να επικυρώνεται ότι 4 (57%) έχουν διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ των κυτταρικών σειρών με μεταλλάξεις L858R έναντι εκείνων με Δ746-750 μεταλλάξεις (S6 File). Το 270-γονίδιο υπογραφή αναλύθηκε για τον εμπλουτισμό σε συγκεκριμένες γονιδιακές λειτουργίες, όπως ορίζεται από την βάση δεδομένων υπογραφών Gene Ontology. L858R-μεταλλαγμένα κύτταρα εμπλουτίστηκαν για τα γονίδια του κυκλικού ΑΜΡ-εξαρτώμενη πρωτεΐνη κινάσης, πρωτεΐνης φωσφατάσης-2ε-, Ras-οικογένεια RAB3D- μέλος, και φωσφολιπάση-Cβ1 που εξαρτώνται από πορείες, ενώ οι Δ746-750 μεταλλάξεις εμπλουτίστηκαν για τα γονίδια σε οι χημειοκίνης CXC συνδετήρες (2 και 3) -, ιντεγκρίνης α6-, πρωτεΐνες δέσμευσης γουανυλικής (1, 2, και 3) – και ιντερλευκίνη-7 και 10-dependent pathways (S7 File), καταδεικνύοντας ότι οι σειρές γονιδίων που ενεργοποιούνται από το δύο τύποι μετάλλαξης είναι λειτουργικά διακριτές.

194-γονίδιο υπογραφή που υπάρχει στο

EGFR

μεταλλαγμένου EGFR αλλά όχι-άγριου-τύπου κυτταρικές γραμμές διακρίνει L858R (ΡΜ [σημείο μετάλλαξης]) από Δ746- 750 (διαγραφή). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (+) ή χωρίς (-) gefitinib. Μια μερική λίστα των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε δύο ομάδες υποδεικνύεται στα δεξιά.

Η

γονίδια που ρυθμίζονται από τον EGFR ΤΚΙ θεραπεία

Για να προσδιοριστούν οι αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης που προηγήθηκε, και ενδεχομένως συνέβαλαν, οι βιολογικές επιδράσεις της θεραπείας EGFR ΤΚΙ στο

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε βραχυπρόθεσμη αγωγή με gefitinib. Ως αρνητικός έλεγχος σε αυτό το πείραμα, χρησιμοποιήσαμε το ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα H1975, τα οποία έχουν ένα Τ790Μ μετάλλαξη που δεσμεύει σύνδεση με το EGFR ΤΚΙ [17]. Χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα κριτήρια (

P

& lt? 0.05), βρήκαμε ότι 54 γονίδια που ρυθμίζονται από ΤΚΙ αποκλειστικά στα ΤΚΙ-ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (HCC827, H3255, H4006 και) (S8 File), κανένα από τα οποία έχουν , με τις γνώσεις μας, έχει αναφερθεί ότι είναι EGFR-εξαρτώμενη γονίδια. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, εξετάσαμε 14 με ποσοτική PCR και να επικυρώνεται ότι το 10 (71%) έχουν διαφορικά ρυθμίζεται σε ΤΚΙ-ευαίσθητων και ανθεκτικών κυττάρων (S9 File). Γονίδια που αυξήθηκαν σε απάντηση περιλαμβάνονται ΤΚΙ, μεταξύ άλλων, ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου (

CCNG2, CDKN1B, ID2 και KNTC2

) και ένας συνδετήρας για την EphA2 (EFNA1). Γονίδια που μειώθηκε περιλαμβάνουν το

κινάση EphA2

υποδοχέα της τυροσίνης, κυτοκίνες (

LIF, CCL20,

και

IL17B

), παράγοντες μεταγραφής (

FOXD1

και

POU1F1

), και πρωτεΐνες φωσφατάσες (

DUSP4

και

DUSP6

).

αμοιβαίες κανονισμού της EphA2 και EFNA1 είναι EGFR-Εξαρτημένη

Υπό το φως της σημασίας του άξονα EphA στην ογκογένεση [24? 25], ερευνήσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της αγωγής ΤΚΙ στην έκφραση της EphA2, άλλων μελών της οικογένειας EphA, και EFNA1 συνδετήρα αυτών. Ποσοτική PCR και ανάλυση Western επιβεβαίωσε ότι το gefitinib αμοιβαίως ρυθμίζεται η έκφραση της EphA2 και EFNA1 συνδέτη του σε ΤΚΙ ευαίσθητη κυτταρικές γραμμές (HCC827, H4006, H3255 και) αλλά όχι στα ΤΚΙ-ανθεκτικών κυττάρων H1975 (Εικ. 6

A- C

). EphA1, EphA5 και EphA6 δεν άλλαξε με τη θεραπεία gefitinib (Σχήμα 7

Α, Ε, και ΣΤ

.)? EphA4 μειώθηκε μόνο σε ένα υποσύνολο των ΤΚΙ-ευαίσθητων κυττάρων (H4006 αλλά όχι HCC827) (Σχ 7

C

.)? και EphA3 ανεστάλη σε EGFR-ανεξάρτητο τρόπο (υποδεικνύεται από το ΤΚΙ επαγόμενη καταστολή σε H1975 κύτταρα) (Εικ. 7

B

). Για να αξιολογηθεί πληρέστερα αν ήταν EGFR μεσολάβηση η καταστολή της έκφρασης της EphA2, εξετάσαμε την επίδραση της άλλης EGFR ΤΚΙ, erlotinib, και διαπίστωσε ότι πολύ ανέστειλε την έκφραση της EphA2 σε ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα, σε βαθμό παρόμοιο με αυτό του gefitinib (Σχ . 7

F

).

Η ποσοτική ανάλυση PCR

(Α, Β)

και κηλίδωση Western

(C)

της EphA2

(Α , C)

και EFNA1

(Β, C)

σε κυτταρικές σειρές σε αγωγή για 6 ώρες με (+) ή χωρίς (-) gefitinib. Ποσοτικά αποτελέσματα PCR αντιπροσωπεύουν τις μέσω τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και ομαλοποιήθηκαν με βάση την έκφραση του γονιδίου housekeeping L32. Οι αριθμοί κάτω από τις ζώνες είναι τα αποτελέσματα της πυκνομετρική ανάλυση μετά την ομαλοποίηση για τις διαφορές φόρτωση με βάση την ακτίνη.

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6 ώρες με όχημα, 1 μΜ gefitinib (Α-Ε), ή 1 μΜ erlotinib (F). RNA εκχυλίσθηκε και υποβλήθηκε σε ποσοτική PCR. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και κανονικοποιούνται με βάση την έκφραση L32.

Η

EphA2 ενεργοποίηση απαιτείται για Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη

αξιωματική ότι η σηματοδότηση της EphA2 διατηρεί νεοπλασματική χαρακτηριστικά κυττάρων NSCLC και δοκιμάζεται αυτή την υπόθεση με κατεργασία HCC827 κυττάρων με EphA2-Fc, ένα ανασυνδυασμένο πεπτίδιο που περιέχει τον εξωκυτταρικό τομέα EphA2 συντηγμένη με το F

θραύσμα ο της IgG, η οποία εμποδίζει την αλληλεπίδραση της εφρίνης Α συνδετήρων με ενδογενή EphA, αποτελεσματικά κλείδωμα ενεργοποίηση EphA [26]. Σε σχέση με εκείνη των ελέγχων, EphA2-Fc-επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν μειωμένο σχηματισμό αποικίας σε μαλακό άγαρ (Εικ. 8), ενώ ο πολλαπλασιασμός τους σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας δεν άλλαξε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας ότι EphA ήταν απαραίτητη για την αγκύρωση-ανεξάρτητο πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποικιών των NSCLC κυτταρικών σειρών (επάνω) με ποσοτικοποίηση των αποικιών (κάτω) μετά από ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ παρουσία ή απουσία της EphA2-Fc. Τα αποτελέσματα είναι τα μέσα τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Εδώ να αναφέρουμε ότι τα κύτταρα NSCLC με σωματικά

EGFR

μεταλλάξεις έχουν ένα μοναδικό μεταγραφικό προφίλ και ότι κυτταρικές σειρές με τους δύο πιο κοινούς τύπους των

EGFR

μεταλλάξεις έχουν σαφείς μεταγραφική διαφορές. Από την εξόρυξη βάσεων δεδομένων γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας ένα μεταλλαγμένο

EGFR

-ειδικά υπογραφή ως ανιχνευτή, διαπιστώσαμε ότι πολλά από τα γονίδια σε αυτή την υπογραφή έκφρασης ήταν EGFR-εξαρτώμενη, συγκλίνει σε κοινά δίκτυα με βάση τη γνωστή ή προβλεπόμενη πρωτεΐνη interactomes, και εκφράστηκαν σε όγκους από ένα υποσύνολο των ασθενών με NSCLC. Δύο γονίδια διευκρινιστεί,

ΕρίιΑ2

και

PTGS2

, που προώθησε την κλωνογενοποιήσεως του

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC, τα οποία παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον από κλινική άποψη, επειδή μπορεί να να ανασταλεί φαρμακολογικά.

Τα γονίδια εντός του μεταλλαγμένου

EGFR

υπογραφή έκφρασης γονιδίων κωδικοποιούν πρωτεΐνες με ένα διαφορετικό σύνολο των κυτταρικών λειτουργιών. Η επίδραση του EGFR σε αυτό το υπογραφή αποδείχθηκε με επικάλυψη της με εκείνη των κυττάρων που EGFR-επιμολυσμένα MCF-7 και την παρουσία γνωστών μεταγραφικών στόχων EGFR, συμπεριλαμβανομένων των

PTGS2,

οι συνδέτες ErbB

ereg

και

AREG,

και

Met

, ένας υποδοχέας κινάσης τυροσίνης που αναφέρθηκε πρόσφατα να δραστηριοποιείται στο

EGFR κύτταρα

μεταλλαγμένου NSCLC και να προωθήσει την αντίσταση ΤΚΙ σε αυτά τα κύτταρα [ ,,,0],8? 27-29]. Εδώ δείξαμε ότι το γονιδιακό προϊόν του

PTGS2

, της κυκλοοξυγενάσης-2, έχει ένα σημαντικό ρόλο, προωθώντας ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Η υπογραφή αυτή περιείχε πολλά γονίδια που δεν έχουν προηγουμένως γνωστό ότι εκφράζεται υψηλά σε

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC, συμπεριλαμβανομένων

LY96

και

CX3CL1

, τα οποία έχουν γνωστή ανοσορυθμιστική λειτουργίες.

LY96

κωδικοποιεί MD2, ένα βοηθητικό μόριο που απαιτείται για την ενεργοποίηση του ΤοΙΙ υποδοχέα-4, το οποίο προωθεί την επιβίωση των κυττάρων και διεγείρει την έκκριση των ανοσοκατασταλτικών μορίων που προάγουν την διαφυγή του όγκου από το ανοσοποιητικό επιτήρησης [30].

CX3CL1

κωδικοποιεί μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη που ονομάζεται φρακταλκίνη που στρατολογεί CX3CR1 εκφράζουν φυσικοί φονείς και Τ λεμφοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου, προωθώντας έτσι φυσικά φονικά εξαρτώμενη αντικαρκινική αποκρίσεις

in vivo

[31]. Από την άλλη πλευρά, φρακταλκίνη έχει επίσης αποδειχθεί προ-μεταστατικές ιδιότητες βασίζεται σε αποδεικτικά στοιχεία ότι προωθεί τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και ενισχύει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα [32? 33].

Για την ταυτοποίηση γονιδίων που ρυθμίζονται σε ένα EGFR εξαρτώμενο τρόπο, θα αντιμετωπίζονται

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα NSCLC με gefitinib. Δύο από τα γονίδια που προσδιορίζονται από την προσέγγιση αυτή,

ΕρίιΑ2

και συνδέτη

EFNA1

της, ρυθμίζονταν με αμοιβαίο τρόπο. Δυνητικά μεσολάβηση αυτό το αποτέλεσμα του gefitinib, που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση, ένας καθοδικός τελεστής του EGFR, αναστέλλει

EFNA1

έκφραση, ανακουφίζοντας έτσι την EFNA1 επαγόμενη καταστολή του

EphA2

έκφραση [25]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι αλληλεπιδράσεις EphA2 /EFNA1 ήταν απαραίτητα για την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη HCC827 κυττάρων, η οποία επιβεβαιώνει τα ευρήματα από μία προηγούμενη μελέτη αποδεικνύει ότι η v-erbB-εξαρτώμενη κυτταρική εξαλλαγή μετριάζει EphA2 δέσμευσης συνδέτη [25]. Άλλα γονίδια που βρέθηκε να ρυθμίζεται από το gefitinib στην ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα περιλαμβάνουν

CCNG2, CDKN1B, ID2 και KNTC2

, τα οποία είναι συστατικά των ρυθμιστικών μονοπατιών κυτταρικού κύκλου. Δεδομένου ότι άλλαξε η έκφρασή τους πριν από οποιαδήποτε βιοχημικές ενδείξεις της πολλαπλασιαστικής σύλληψης ή απόπτωση, αυτά τα γονίδια μπορεί να είναι μέρος ενός αντι-πολλαπλασιαστική πρόγραμμα σηματοδότησης ενεργοποιούνται από gefitinib. Τέλος, δύο από τα γονίδια που μειώθηκε σε αφθονία με θεραπεία gefitinib (

CEACAM-6

και

DUSP6

) επίσης εντόνως εκφρασμένο σε

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια είναι δυνητικά σημαντικές EGFR μεταγραφική στόχους σε αυτά τα κύτταρα.

συνοπτικά, έχουμε εντοπίσει έναν μεταγραφικό σε κύτταρα NSCLC που διαφωτίζει μεταλλαγμένο

EGFR

επαγόμενη αλλαγές γονιδιακή έκφραση και παρέχει μια βάση για την μεταγραφική οι βιολογικές διαφορές που παρατηρούνται στον NSCLC με τα δύο πιο συχνά εμφανιζόμενων τύπων

EGFR

μεταλλάξεις. Περαιτέρω ανάλυση αυτών των γονιδίων μπορεί να μας ενημερώσει σχετικά με βιολογικές διεργασίες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό ενδοκυτταρική στόχους της δυνητικό θεραπευτικό όφελος για τους ασθενείς με την ασθένεια αυτή.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Gefitinib (Astra Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) και erlotinib (OSI Pharmaceuticals, Melville, Νέα Υόρκη) ήταν δώρα. Αγοράσαμε ένα ανασυνδυασμένο ποντικού EphA2-Fc χίμαιρα (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), πολυκλωνικά αντισώματα που προέρχονται σε κουνέλια κατά της EphA2 και EFNA1 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA), μια υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη αντι-ποντικού και μυρμήγκι Κουνέλι δευτερογενή αντισώματα (Cell Signaling Biotechnology, Beverly, ΜΑ), και ένα αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ).

κυτταρικές Γραμμές

Το κύτταρο NSCLC γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε μέσο RPMI 1640 με υψηλή γλυκόζη (4.5 g /L? GIBCO-BRL, MD), συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, Utah).

Gene Expression Profiling

RNAs απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) και υβριδίστηκαν με Affimetrix U133 + 2,0 μάρκες της γονιδιακής έκφρασης στο Μηχανισμό MD Anderson Cancer Center μικροσυστοιχιών πυρήνα (που υποστηρίζεται εν μέρει από την CA επιχορήγηση # 16672). dChip (https://www.dchip.org) (2005 version) χρησιμοποιήθηκε για να εξαγάγετε τις τιμές έκφρασης για κάθε σετ καθετήρα. ανιχνευτών ελέγχου και σύνολα ανιχνευτών με καταλήξεις «_s_at» και «_x_at» για την ταυτότητά τους εξαιρέθηκαν (επειδή αυτά τα σύνολα ανιχνευτής μπορεί να στοχεύσετε περισσότερες από μία μοναδική ακολουθία), αφήνοντας 39.114 από 54.675 αρχικού σετ καθετήρα για περαιτέρω ανάλυση.

Προσδιορισμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων

Δύο δείγμα

t

δοκιμές (χρησιμοποιώντας δεδομένα μετασχηματίζονται log-) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστούν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ

EGFR

μεταλλαγμένου και NSCLC κυτταρικές σειρές -wild-τύπου και μεταξύ EGFR-επιμολυσμένα και γονικά κύτταρα MCF-7 (

P

τιμές ήταν δύο όψεων). Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της θεραπείας gefitinib, μια αντιστοιχισμένη διαφορά υπολογίστηκε ως το ημερολόγιο

2 (gefitinib αγωγή /αγωγή με όχημα).

GO εμπλουτισμό ανάλυση

Οι λειτουργικές ομάδες γονιδίων, όπως ορίζεται