Αφηρημένο

Ο νεφρός είναι ένα όργανο-στόχος για την τοξικότητα πολλών ξενοβιοτικών και είναι επίσης πολύ ευαίσθητα στην ανάπτυξη των κακοηθών όγκων. Και στις δύο περιπτώσεις,

in vitro

μελέτες παρέχουν διορατικότητα σε κυτταρική βλάβη, και αντιπροσωπεύουν επαρκή μοντέλα για τη μελέτη, είτε οι μηχανισμοί που διέπουν τις τοξικές επιδράσεις των διαφόρων nephrotoxicants ή θεραπευτικές προσεγγίσεις σε καρκίνο του νεφρού. Η ανάπτυξη αποτελεσματικών μεθόδων για τον καθορισμό της ανθρώπινης φυσιολογικών και καρκινικών νεφρικών μοντέλα κύτταρο είναι ως εκ τούτου καθοριστικής σημασίας. Σε αυτή τη μελέτη, μια τεχνικά απλή και γρήγορη πρωτόκολλο για την απομόνωση και καλλιέργεια ανθρώπινων εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα νεφρών από χειρουργικά δείγματα παρουσιάζεται. Όγκου και φυσιολογικών ιστών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση της ίδιας μεθοδολογίας, με βάση μηχανικά αποσυσσωμάτωση του ιστού ακολουθούμενη από ενζυματική χώνευση και καθαρισμό των κυττάρων με διαδοχική κοσκίνισμα. Η συνολική διαδικασία διαρκεί περίπου μία ώρα. Τα προκύπτοντα κυτταρικά παρασκευάσματα έχουν εξαιρετική βιωσιμότητες και απόδοση. Ίδρυση πρωτογενείς καλλιέργειες από όλα τα δείγματα που επιτεύχθηκε με επιτυχία. Η προέλευση των πρωτογενών καλλιεργημένα κύτταρα ιδρύθηκε μέσω μορφολογική αξιολόγηση. Φυσιολογικά κύτταρα καθαρότητα επιβεβαιώθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού και αντίστροφη μεταγραφή-πολυμεράσης ανάλυση αλυσιδωτή αντίδραση για την έκφραση ειδικών δεικτών

Παράθεση:. Valente MJ, Henrique R, Κόστα VL, Jerónimo C, Carvalho F, Bastos ML, κ.ά. . (2011) Μια ταχεία και απλή διαδικασία για τον καθορισμό των Ανθρωπίνων Κανονική και τον καρκίνο των νεφρών πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων από χειρουργικά δείγματα. PLoS ONE 6 (5): e19337. doi: 10.1371 /journal.pone.0019337

Επιμέλεια: Xin-γιουάν Guan, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 23 του Δεκ, 2010? Αποδεκτές: 28 Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 Μαΐου 2011

Copyright: © 2011 Valente et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανθρώπινο εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα (HPTEC) αντιστοιχούν σε ο κύριος τύπος κυττάρου στο ανθρώπινο φλοιώδες σωληνοδιάμεσο και, το σημαντικότερο, με το κύριο στόχο ενός μεγάλου αριθμού των ξενοβιοτικών, από ουσίες κατάχρησης στα αντιβιοτικά, αντινεοπλαστικοί παράγοντες, μέταλλα, και οι μυκοτοξίνες [1] – [5]. Πρωτογενείς καλλιέργειες HPTEC μπορεί να προσφέρει ένα καλά χαρακτηρισμένο

in vitro

μοντέλο, φαινοτυπικά εκπρόσωπος της HPTEC

in vivo

. Αυτό το

in vitro

σύστημα έχει εγκριθεί για την έρευνα σχετικά με τη λειτουργία των κυττάρων των νεφρών, των διαδικασιών μεταφοράς και κυτταρικούς μηχανισμούς βλάβης του εγγύς σωληναρίου από ξενοβιοτικών ουσιών, χωρίς παρεμβολή άλλων παραγόντων που σχετίζονται με

in vivo πειράματα

. Για το σκοπό αυτό, είναι απαραίτητο να επιτευχθεί υψηλού εμπλουτισμού παρασκευάσματα HPTEC από ιστό νεφρού. Αρκετές τεχνικές έχουν περιγραφεί για την απομόνωση και καλλιέργεια του HPTEC. Αυτές οι μέθοδοι έχουν βασιστεί σε χρονοβόρες τεχνικές όπως ισοπυκνικής φυγοκέντρησης με Nycodenz ή Percoll [6] – [9], ή ακόμη και πολύπλοκων πρωτοκόλλων μικροδιατομής με ή χωρίς ενζυματική πέψη [10], [11]. Οι κύριες αδυναμίες αυτές τις μεθοδολογίες περιλαμβάνουν χαμηλές αποδόσεις και εντάσεως εργασίας διαδικασιών.

Εκτός ξενοβιοτικών επαγόμενη τοξικότητα, ο νεφρός είναι επίσης ευαίσθητα στην ανάπτυξη της καλοήθους (π.χ. oncocytoma) ή κακοήθη (π.χ., των νεφρικών κυττάρων καρκίνωμα, RCC) νεοπλάσματα. RCC περιλαμβάνει το 85% της νεφρικής καρκίνων σε ενήλικες, και περισσότερο από 3% των ενήλικων κακοηθειών. Με πάνω από 30.000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο, είναι η έκτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τις ΗΠΑ, που είναι υπεύθυνη για περίπου 12.000 θανάτους ετησίως [12], [13]. Σύμφωνα με ιστολογική εμφάνιση του, RCC μπορεί να χωριστεί σε υποτύπους: συμβατικά ή διαυγές κύτταρο, θηλώδες, χρωμόφοβο, και αταξινόμητο RCC [14], [15]. Clear κύτταρο RCC είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του νεφρού. Είναι προέρχεται από το εγγύς σωληνοειδές επιθήλιο, και αντιπροσωπεύει το 80 με 85% του όγκου των νεφρικών κυττάρων [12], [15]. Papillary RCC είναι η δεύτερη πιο συνήθης υπότυπο του καρκίνου του νεφρού, με επιπολασμό περίπου 10% της νεφρικής κακοήθεις όγκους, και χαρακτηρίζεται από τα καρκινικά κύτταρα τοποθετημένα σε ένα θηλοειδή διαμόρφωση [16], [17]. Χρωμόφοβο είναι μια ασυνήθιστη υπότυπο του RCC, με επιπολασμό περίπου 5% της νεφρικής κακοήθων όγκων. Όπως σαφές κελί RCC, αναπτύσσεται στο νεφρικό φλοιό [18], [19].

RCC αιτιολογία είναι ακόμη αγνώστων στοιχείων, την ανάπτυξη είτε ως σποραδική μορφή, ή με κληρονομική ασθένεια, και ό, τι ο υπότυπος είναι, ότι περιγράφεται ως πολύ ανθεκτική στη συμβατική ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία και την ανοσοθεραπεία αγωγές [12], [15], [20]. Ως εκ τούτου, η ανακάλυψη νέων στρατηγικών για θεραπευτική παρέμβαση παραμένει προτεραιότητα. Από την άποψη αυτή, η κυτταρική καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων νεφρικού όγκου (HRTC) έχει αποδειχθεί ότι είναι επαρκές in vitro μοντέλο για τη μελέτη των θεραπευτικών προσεγγίσεων σε RCC [15], [21] – [23]. Επιπλέον, παράλληλα με μελέτες σε καλλιέργειες κυττάρων του όγκου, είναι απαραίτητο να ελεγχθεί η τοξικότητα των πιθανών θεραπευτικών παραγόντων στα κανονικά ομόλογό κύτταρα. Ως εκ τούτου, είναι ο κύριος στόχος της μελέτης αυτής να παρουσιάσει μια απλή και γρήγορη μέθοδο για τη δημιουργία καλλιεργειών ανθρώπινου νεφρού πρωτοβάθμια, τόσο φυσιολογικό (HPTEC) και όγκων (HRTC), που προέρχονται από το ίδιο όργανο.

Η διαδικασία που παρουσιάζεται εδώ έχει προσαρμοστεί από προηγουμένως καθιερωμένες μεθόδους [6], [9], [24] – [26] και χρησιμοποιείται για την επεξεργασία φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Βασίζεται σε μηχανική αποσυσσωμάτωση του ιστού ακολουθούμενη από ενζυματική χώνευση και καθαρισμό των κυττάρων με διαδοχική κοσκίνισμα. Αυτή η τεχνική επιτρέπει τον διαχωρισμό ενός κυτταρικού κλάσματος που είναι πολύ εμπλουτισμένο σε HPTEC ή HRTC από αντίστοιχα φυσιολογική νεφρική φλοιό και όγκων ιστό του νεφρού, με πολύ υψηλότερη απόδοση και βιωσιμότητα των κυττάρων σε σχέση με άλλα καθιερωμένες διαδικασίες απομόνωσης. Η συνολική διαδικασία είναι τεχνικά απλή, επιτρέποντας την εύκολη εφαρμογή του σε εργαστήρια καλλιέργειας κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Τα ακόλουθα υλικά ελήφθησαν από την GIBCO ™ Invitrogen (Βαρκελώνη, Ισπανία), εκτός εάν δηλώνεται διαφορετικά

μέσο καλλιέργειας κυττάρων:. Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle με θρεπτικό μίγμα F-12 (DMEM /F-12) και GlutaMAX-I ™ συμπληρωμένο με 10% ορό απενεργοποιημένο με θέρμανση εμβρυϊκό ορό (FBS ), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (50 U /mL /50 μg /mL), fungizone (2.5 μg /mL), και ανθρώπινη τρανσφερρίνη (5 μg /mL).

ρυθμισμένο διάλυμα άλατος Hank (HBSS) χωρίς CaCl

2 και MgCl

2

διάλυμα κολλαγενάσης:. διαλύονται 50 mg κολλαγενάσης τύπου 2, 315 U /mg (Worthington, Lakewood, NJ) σε 25 mL μη-συμπληρωμένο μέσο καλλιέργειας και αποστειρώνεται με διήθηση με 0,22 μm φίλτρο. Χρησιμοποιείται φρέσκο ​​

0.05% θρυψίνη-EDTA λύση

Κατάψυξη λύση:.. 90% FBS και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο

δοχείο επώασης:. Αυτόκαυστο 250 mL Pyrex® ποτήρι με μανδύα φιάλη (Vidrolab 2, Gandra, Πορτογαλία) με μαγνητική ράβδο σε αυτό. Η θερμοκρασία του διαλύματος κολλαγενάσης στη δεξαμενή διατηρείται στους 37 ° C με κυκλοφορία θερμού νερού διαμέσου του χιτωνίου της φιάλης

επικαλυμμένων με κολλαγόνο φιάλες (Εικ. 1):. 75-cm

2 πλαστικά καλλιέργεια φιάλες επικαλύφθηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C με 40 μg /mL διάλυμα κολλαγόνου G από βόειο δέρμα μόσχου (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία) σε PBS.

Στείρα σουρωτήρια κυττάρου με κόσκινο μεγέθη των 100, 70, και 40 μm (BD Falcon ™, BD Biosciences, USA).

0,4% μπλε Τρυπάνης διαλύματος (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ).

AccuGENE® 1Χ PBS (Lonza Laboratories, Verviers , Βέλγιο)

ανοσοκυτταροχημική χρώση:.. ποντικού μονοκλωνικό αντι-τηγάνι κυτοκερατίνης αντίσωμα, γίδινο αντι-ποντικού IgG-FITC αντίσωμα, και Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ)

RT-PCR ανάλυση:. RNeasy μίνι κιτ απομόνωσης RNA (Qiagen, USA) και RevertAid ™ H Μείον Πρώτα Stand Synthesis Kit (Fermentas, Δανία)

Η

Ηθική Δήλωση

η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Ινστιτούτο-Πόρτο Επιτροπής Δεοντολογίας της Πορτογαλίας Ογκολογίας. Όλοι οι ασθενείς ερωτήθηκαν έδωσαν γραπτή συγκατάθεση.

Συλλογή Ιστών

δείγματα ιστών ανθρώπινου νεφρού ελήφθησαν από συνολικά 6 ασθενείς (3 άνδρες και 3 γυναίκες) που υποβάλλονται σε ριζική νεφρεκτομή για καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων κατά τη Πορτογαλικά Ογκολογικό Ινστιτούτο-Πόρτο (IPO-Πόρτο). Ασθενής μέση ηλικία ήταν 62 ± 5 ετών. Δείγματα ιστού (περίπου 10 g το καθένα) συλλέχθηκαν από περιοχές μακροσκοπικά προσδιορίζονται ως κανονική (στον φλοιό) ή καρκινικών αμέσως μετά την εξαγωγή του δείγματος, από έναν εμπειρογνώμονα uropathologist. Η φύση των περιοχών αυτών επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια από την ιστοπαθολογική αξιολόγηση των δειγμάτων καθρέφτη. Οι ιστοί τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες διαχωρίστηκαν 50-mL με παγωμένο μέσο καλλιέργειας και στη συνέχεια μεταφέρεται σε ένα εργαστήριο καλλιέργειας κυττάρων επί πάγου.

Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μετέπειτα επεξεργασία ρουτίνα ιστού (στερέωση με φορμαλίνη και εμβάπτιση σε παραφίνη). Η ιστοπαθολογική ανάλυση των τμημάτων για την αξιολόγηση του τύπου του καρκίνου του νεφρού, ταξινόμησης και στάσης πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Παθολογίας, IPO-Πόρτο.

HPTEC και HRTC Απομόνωση πρωτόκολλο

Νεφρική απομόνωση κυττάρων πραγματοποιήθηκε στο 30 λεπτά από τη συλλογή νεφρικό ιστό. Όλες οι επόμενες διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε απαγωγό ροής ιστοκαλλιέργειας, κάτω από στείρες συνθήκες. Για την αποφυγή των κυττάρων διασταυρούμενη μόλυνση, σας προτείνουμε το χειρισμό φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων σε δύο επιμέρους κουκούλες καλλιέργειας ιστού. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν, τότε, οι ακόλουθες κατευθυντήριες γραμμές πρέπει να ενισχυθεί: μόνο ένα χειρουργικό δείγμα θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε μια κουκούλα ιστοκαλλιέργειας κάθε φορά (κατά τη διάρκεια αυτού του χρόνου να κρατήσει το άλλο ιστό σε πάγο σε ένα αποστειρωμένο δοχείο), το κάλυμμα πρέπει να καθαρίζονται πριν από την εισαγωγή των άλλων χειρουργικών δείγμα, και φιάλες ή υποπολλαπλάσια του μέσου θα πρέπει να αφιερωθεί για χρήση μόνο με κανονική ή καρκινικά κύτταρα.

στο ντουλάπι εργαστήριο καλλιέργειας, μεταφορά του ιστού σε μια 60-mm τρυβλίο Petri. Χρησιμοποιώντας λαβίδα και ψαλίδια, τεμαχίσει off (i) του ινώδους κάψουλας και παρακείμενα μυελός από την φλοιώδη ιστό και (ii) οποιαδήποτε λίπος, θρόμβους αίματος και τους συνδετικούς ιστούς από ιστούς όγκων.

Κόψτε το δείγμα του ιστού σε μικρά τεμάχια με νυστέρια.

Μεταφέρετε τα κομμάτια του ιστού σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρησης των 50 ml, ξεπλύνετε τα έντονα με παγωμένο HBSS (περιέχει EGTA που χαλαρώσει διασταυρώσεις των κυττάρων μέσω της δράσης χηλικό ασβέστιο) και μεταγγίζεται το υπερκείμενο. Επαναλάβετε αυτό το τελευταίο βήμα μέχρι το διάλυμα είναι διαυγές αίματος.

Απορρίψτε το υπερκείμενο, μεταφέρετε τα θραύσματα σε ένα καθαρό 60-mm τρυβλίο Petri και λεπτή μασάει τον ιστό σε περίπου 1 mm

3 κομμάτια με νυστέρια.

ανακινήσετε τα μικρά θραύσματα σε 25 ml προθερμασμένο μέσο μη συμπληρώνεται πολιτισμό και να τις συνδυάσουμε με το διάλυμα κολλαγενάσης (/mL τελική συγκέντρωση 1 mg) στο δοχείο επώασης. Επωάστε για 20 λεπτά στους 37 ° C με ήπια ανάδευση.

Περάστε το πέψη ιστός επί του πρώτου κόσκινου (100 μm) σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης των 50 mL. Η ίδια διαδικασία εφαρμόζεται στη συνέχεια με τα ακόλουθα κόσκινα (70 και 40 μm). Κοσκίνισμα με το κόσκινο 100 μm επιτρέπει την απομάκρυνση οποιουδήποτε αχώνευτος ινώδους ιστού, ενώ η λειτουργία των 70 και 40 μm κόσκινα είναι η απομάκρυνση μολυσματικών σωληνοειδή τμήματα και σπειράματα, αντίστοιχα.

Πλένουμε τις κοσκινίζεται κυττάρων με φυγοκέντρηση (400

g

, 5 λεπτά στους 4 ° C), και το ίζημα αναδιαλύεται σε HBSS. Επαναλάβετε τη διαδικασία αυτή δύο ακόμη φορές, και στη συνέχεια το ίζημα αναδιαλύεται κυττάρου σε μέσο καλλιέργειας με συμπληρώματα. Προσδιορίστε τον αριθμό των κυττάρων και τη βιωσιμότητα σε ένα αιμοκυτταρόμετρο Neubauer χρησιμοποιώντας το μπλε τρυπάνης λύση.

Η

Το σχήμα 1 παρουσιάζει μια σχηματική αναπαράσταση της συνολικής διαδικασίας.

Cell Culture πρωτόκολλο

Seed τα απομονωμένα κύτταρα σε επικαλυμμένες με κολλαγόνο 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /cm

2 και επωάστε σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα /5% CO

2 στους 37 ° C. (Σημείωση: Το μέσο RPMI 1640 με τα συμπληρώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά να αυξάνεται HRTC)

Αλλάξτε το μέσο 24 ώρες μετά την αρχική σπορά και σε διαστήματα 48 h μετά

Αφήστε τα κύτταρα να αναπτυχθούν μέχρι. -80% συρροή πριν από την υποκαλλιεργούνται ή κατεψυγμένα.

η

Όταν καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, τα κύτταρα φθάσουν σε συρροή σε περίπου 10-13 ημέρες μετά τη σπορά.

κυττάρων Subculture πρωτόκολλο

Αφαιρέστε το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και πλύνετε την μονοστοιβάδα των κυττάρων με είτε προθερμασμένο HBSS ή PBS και 1 κ.εκ. τρυψίνης-ΕϋΤΑ για την αποδυνάμωση κυτταρική προσκόλληση στην επιφάνεια φιάλες.

Προσθέστε αρκετό διάλυμα θρυψίνη-ΕϋΤΑ για να καλύψει την επιφάνεια της φιάλης και επωάζονται στους 37 ° C για 3 λεπτά. Παρατηρήστε τα κύτταρα κάτω από ένα ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο για να εξασφαλιστεί επαρκής αποκόλληση των κυττάρων.

Τερματισμός δράση θρυψίνη με την προσθήκη 10 mL συμπληρωμένο μέσο ανάπτυξης και επαναιώρηση των αποσπασμένων κυττάρων από επανειλημμένα σιφωνισμό πάνω από την επιφάνεια της φιάλης καλλιέργειας.

Μεταφέρετε τα επαναιωρούνται τα κύτταρα σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης, ξεπλύνετε την φιάλη με το μέσο, ​​και προσθέστε τις ξεπλένονται κύτταρα σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης. Seed το κυτταρικό εναιώρημα σε νέα 75-cm

2 φιάλες σε αναλογία 1:03 υποκουλτούρα.

Η

Υπό αυτές τις συνθήκες, HPTEC πέρα ​​από το πρώτο πέρασμα φθάνουν συρροή σε 3-5 ημέρες, και HRTC σε 7 ημέρες.

τηλέφωνα κρυοσυντήρηση, απόψυξη και το πρωτόκολλο επανεπίστρωσης

Μετά την επεξεργασία με θρυψίνη, μεταφέρετε τα αποκολλημένα κύτταρα σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης και την κατακρήμνιση των κυττάρων με φυγοκέντρηση (400

g

, 5 λεπτά στους 4 ° C).

το ίζημα αναδιαλύεται από κάθε φιάλη σε 3 mL του παγώματος λύση.

Μεταφορά 1 mL κυτταρικού εναιωρήματος σε 2 κρυοφιαλίδια mL και να παγώσει αμέσως στους -80 ° C .

για reseed τα εναιωρήματα, τα κύτταρα γρήγορα αποψυγμένα προσθέτοντας προθερμασμένο συμπληρωμένο μέσο και μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης των 15 ml.

κατακρήμνιση των κυττάρων με φυγοκέντρηση στα 400

g

, για 5 λεπτά.

Το ίζημα επαναιωρείται σε θερμαίνεται μέσο καλλιέργειας και μεταφέρθηκαν σε 75 εκατοστά

2 φιάλες, ένα φιαλίδιο ανά φιάλη.

Η

HPTEC και HRTC είναι επιτυχία κρυοσυντηρημένα τόσο από απομονωμένα κύτταρα και κυτταρικά εναιωρήματα που λαμβάνονται μετά από θρυψινοποίηση, διατηρώντας τη φυσιολογική ανάπτυξη μετά την απόψυξη.

Η μορφολογική αξιολόγηση

μονόφυλλο καλλιέργειες που προέρχονται από όλα τα 12 πρωτοβάθμια απομονώσεις (6 κανονικό, 4 σαφές κύτταρο RCC και 2 χρωμόφοβο RCC) και οι αντίστοιχες πρώτες τρεις διόδους εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτός υπό ένα ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο. Μια απαθανάτισε εγγύς σωληνάριο επιθηλιακά κυτταρική σειρά που προέρχεται από ανθρώπινο νεφρό φυσιολογικό ενήλικα, HK-2 κυτταρική γραμμή (ATCC, CRL-2190), εξετάστηκαν επίσης για σύγκριση.

ανοσοκυτταροχημική χρώση για Cytokeratin

Για να διερεύνηση της επιθηλιακής προέλευσης του που λαμβάνεται φυσιολογικών και καρκινικών νεφρικά κύτταρα, η αντιδραστικότητα προς αντι-κυτοκερατίνης αντίσωμα αξιολογήθηκε σε εναιωρήματα από διόδους 1 έως 3. Δύο αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από φυσιολογικά (HK-2) και του όγκου (Α-498) ανθρώπινου νεφρού χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι

Εν συντομία, HPTEC ή HRTC αναπτύχθηκαν σε περίπου semiconfluence σε πλάκες 24 φρεατίων (αρχική πυκνότητα: 1,0 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο)., πλένεται με αποστειρωμένο PBS, σταθεροποιήθηκαν για 20 λεπτά σε 4%

ρ-

φορμαλδεΰδη, και διαπερατά επί 5 λεπτά εντός 1% Triton Χ-100 διαλύματος. Μετά από αποκλεισμό με λευκωματίνη βόειου ορού 1%, 0,4% Triton Χ-100 και 4% μείγμα αζίδιο νατρίου, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-τηγάνι αντίσωμα κυτοκερατίνης μονοκλωνικό ποντικού (1:100), και στη συνέχεια με κατσίκα αντίσωμα αντι-ποντικού IgG-FITC (1:100) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την έκπλυση με PBS, οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 5 μg /mL Hoechst 33258 για 5 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και πάλι. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon, Eclipse E400). Κατάλληλα αρνητικοί έλεγχοι περιλήφθηκαν να εγγυηθεί θετική αντίδραση αντισωμάτων.

Αντίστροφη Μεταγραφάση-PCR (RT-PCR) Ανάλυση για συγκεκριμένους δείκτες

αιωρήματα (περίπου 3,0 × 10

6 κύτταρα το καθένα) από πρώτο πέρασμα φυσιολογικών κυττάρων από 4 δότες αναλύθηκαν με RT-PCR για να επιβεβαιωθεί η προέλευση και η καθαρότητα των προϊόντων απομόνωσης. Ως εκ τούτου, η έκφραση του mRNA του τρεις χαρακτηριστικές πρωτεϊνών αξιολογήθηκε: ουρομοδουλίνη (άπω σωληνοειδούς κύτταρα), ακουαπορίνη 3 (κύτταρα συλλέκτης αγωγών) και αμινοπεπτιδάση Α (εγγύς σωληνοειδή κύτταρα). Εν συντομία, το RNA εκχυλίζεται από όλα τα δείγματα με RNeasy Mini κιτ απομόνωσης RNA, και οι συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ND-1000 Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). cDNA παρασκευάστηκε από RNA χρησιμοποιώντας το RevertAid ™ Η Minus First Synthesis Stand Kit και στη συνέχεια ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας τους προηγουμένως δημοσιευθείσα εκκινητές αλληλουχιών και των αντίστοιχων συνθηκών ανόπτησης [27]. Γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως το γονίδιο οικοκυρική, ένα μίγμα από νεφρικών κυττάρων ως ο θετικός έλεγχος για όλες τις πρωτεΐνες που αναλύθηκαν, και νερό ως αρνητικός μάρτυρας. προϊόντα RT-PCR φορτώθηκαν σε μη μετουσιωτικά πηκτώματα αγαρόζης 2%, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και έγινε ορατό κάτω από μια συσκευή υπεριώδους.

Αποτελέσματα

Ιστοπαθολογία

Τα HRTC καλλιέργειες που προέρχονται από RCC σαφές κυττάρων (4 περιπτώσεις) ή χρωμόφοβο (2 περιπτώσεις) υποτύπους. Οι σαφείς περιπτώσεις κυττάρων RCC αποτελούνταν από τα κύτταρα στα κυψελιδικά ή κυψελιδικό ρύθμιση, η οποία εμφανίζεται το χαρακτηριστικό οπτικά σαφές κυτταρόπλασμα με διακριτές κυτταρικές μεμβράνες, μεταβλητή πυρηνική μέγεθος και προβολής των πυρηνίσκους (Εικ. 2Α). Οι περιπτώσεις RCC χρωμόφοβο χαρακτηρίστηκαν από μεγάλα κύτταρα, με ελαφρώς ηωσινοφιλική κυτταρόπλασμα, εξέχοντα κυτταρικές μεμβράνες και ακανόνιστου σχήματος πυρήνες (Εικ. 2Β). Και στις δύο περιπτώσεις χρωματίζονται διάχυτα στο κυτταρόπλασμα με κολλοειδή χρώση σιδήρου Hale του.

(Α) Καθαρισμός νεφροκυτταρικό καρκίνωμα των κυττάρων, και (Β) χρωμόφοβο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα.

Η

Χαρακτηριστικά του πρωτογενούς κυττάρου πολιτισμών

Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα κύρια χαρακτηριστικά του κάθε δότη, και τα αντίστοιχα στελέχη. Η μέθοδος παρέχει παρασκευάσματα νεφρικών κυττάρων με εξαιρετική κύτταρο βιωσιμότητες (96,5 ± 1,4% και 89,7 ± 4,1% για το κανονικό και όγκου νεφρικά κύτταρα, αντίστοιχα) και οι αποδόσεις (18,7 ± 6,9 × 10

6 HPTEC /g του φλοιώδους ιστού και 3.1 ± 4,7 × 10

6 HRTC /g των καρκινικών ιστών). Ο χρόνος που δαπανάται, από την αρχική συλλογή των νεφρών δειγμάτων για τη σπορά των στελεχών, πήρε περίπου 1 ώρα.

Η

Η δημιουργία πρωτογενών καλλιεργειών με επιτυχία επιτευχθεί από όλα τα δείγματα δώδεκα ιστού (6 από το κανονικό φλοιό συν 4 από σαφείς κυττάρων RCC και 2 από χρωμόφοβο RCC). Όλα διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για τουλάχιστον τρία περάσματα. Πρωτογενή κύτταρα που απομονώνονται, φυσιολογικό και που προέρχονται από όγκους, έφθασαν σε συρροή εντός περίπου 10 ημερών. Μετά την πρώτη διέλευση, φυσιολογικό νεφρό επιθηλιακά κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη τάση να πολλαπλασιάζονται

in vitro

από τα κύτταρα του όγκου. Όλες οι πρωτογενείς καλλιέργειες (πρώτη και υποκουλτούρες) ήταν απαλλαγμένα από ινοβλαστική υπερανάπτυξη.

Σύμφωνα με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, συρρέουσες πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων φυσιολογική νεφρική έδειξε μια πολύ ομοιογενής μορφολογία. HPTEC σε έκθεμα καλλιέργεια εμφάνιση μωσαϊκού (Εικ. 3Α), χαρακτηριστικό των επιθηλιακών κυττάρων, όπως τα ΗΚ-2 κύτταρα (Σχ. 3Β). Σχηματισμός των τυπικών θόλους (hemicysts) ήταν ορατά όταν οι καλλιέργειες HPTEC γίνει ιδιαίτερα συρροή, ενδεικτικό της διεπιθηλιακό διαλυμένης ουσίας μεταφοράς από τις μονοστιβάδες.

(Α) Δημοτικό HPTEC, (Β) HK-2 κυτταρική σειρά, (C) πρωτοβάθμια σαφές κυττάρων RCC, και (Δ) πρωτογενείς RCC χρωμόφοβο. Μεγέθυνση:. 400x

Η

HRTC ήταν αποτελεσματικά απομονωθεί από σαφείς κυττάρων και χρωμόφοβο RCC και χαρακτηρίζεται από την πεπλατυσμένη πολυγωνικό μορφολογία και την παρουσία των κυστιδίων λιπιδίων στο κυτταρόπλασμα τους. Αυτοί οι υπότυποι του όγκου θα μπορούσε να διακριθεί από τον αριθμό και το μέγεθος των κυστιδίων: σαφής κύτταρα παρουσιάζουν το σύνολο κυτταρόπλασμα καταλαμβάνεται από πολυδιάστατης κυστίδια (Εικ 3C.), Ενώ στα κύτταρα χρωμόφοβο τα κυστίδια εμφανίστηκαν σε μικρότερες ποσότητες και διάσταση, και το κυτταρόπλασμα δεν είναι » κενό «, όπως σε σαφή κυττάρων RCC (Εικ. 3D). Φως μικροσκοπική εμφάνιση των πρωτογενών απομονώσεων (κανονικό και καρκινικό) και τις ακόλουθες τρεις διόδους δεν ήταν αισθητά διαφορετική. Cytokeratin εκφράστηκε σε όλες τις πρωτεύουσες καλλιέργειες RCC (Σχ. 4), από τα οποία συνάγεται επιθηλιακής προέλευσης τους.

Hoechst 33258, χρώση αντι-κυτοκερατίνης αντίσωμα, και συγχωνεύεται εικόνες με διπλή χρώση των πρωτογενών καλλιεργημένων HPTEC, σαφείς κυττάρων και χρωμόφοβο κύτταρα RCC. HK-2 και Α-498 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος της ανθρώπινης φυσιολογικής και επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα νεφρού, αντίστοιχα. Μεγέθυνση:. 200x

Η

Για να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι εγγύς σωληνοειδή κύτταρα σε πρωτογενή καλλιέργεια, έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών-δεικτών αξιολογήθηκε με ανοσοκυτταροχημική χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης κυτοκερατίνης και ανάλυση RT-PCR για ουρομοδουλίνη, ακουαπορίνη 3, και αμινοπεπτιδάση Α Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν κυτοκερατίνη ομοιόμορφα, η οποία ήταν παρόμοια με εκείνη του ΗΚ-2 κύτταρα (Σχ. 4), επιβεβαιώνοντας έτσι τα επιθηλιακά φύση της. Διεξήχθη ανάλυση RT-PCR του HPTEC πρωτογενείς καλλιέργειες από 4 ασθενείς. Όλα τα τέσσερα προϊόντα απομόνωσης που διατηρούνται μοριακές ιδιότητες HPTEC, δείχνοντας υψηλή έκφραση της αμινοπεπτιδάσης Α, η χαρακτηριστική πρωτεΐνη του εγγύς σωληνοειδή κύτταρα (Εικ. 5). Περαιτέρω, τα κύτταρα είχαν πολύ εβδομάδες ή έλειπε η έκφραση του άπω σωληνοειδούς και συλλογή δείκτες αγωγού, ουρομοδουλίνη και ακουαπορίνη 3, αντίστοιχα.

ουρομοδουλίνη (άπω σωληνάριο δείκτης), ακουαπορίνη 3 (συλλογή δείκτης αγωγών), και αμινοπεπτιδάση Α (εγγύς δείκτης σωληνάριο) κατά την πρωτογενή καλλιεργημένα HPTEC προέρχεται από 4 δότες και τα κύτταρα ΗΚ-2. RNA που απομονώνεται από ένα μίγμα νεφρικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και νερό ως αρνητικός έλεγχος. Έκφραση των γλυκεραλδεΰδες-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως ένα γονίδιο σπίτι διατήρησης.

Η

Συζήτηση

Πολλά

in vitro

προετοιμασίες νεφρού έχουν χρησιμοποιηθεί για φυσιολογικές και τοξικολογικές μελέτες, συμπεριλαμβανομένων απομονωμένες διαποτισμένες νεφρών, νεφρική φέτες, τα τμήματα νεφρώνα, κυτταρικές σειρές, και πρωτογενείς καλλιέργειες [28]. Μεταξύ αυτών, κυτταρική καλλιέργεια προσφέρει τα πλεονεκτήματα της διαθεσιμότητας των μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων και η εγκατάσταση για την εκτέλεση πολλαπλών και επαναλαμβανόμενα πειράματα για μεγάλες χρονικές περιόδους. Η χρήση των καθιερωμένων κυτταρικών σειρών για τοξικολογικές μελέτες μπορεί να δημιουργήσει πολλούς περιορισμούς σε σύγκριση με πρωτογενείς καλλιέργειες. Στην πραγματικότητα, η τιμή του τοξικολογικές μελέτες που έχουν διεξαχθεί επί ουσιαστικά μετασχηματισμένα κύτταρα μπορεί να είναι αμφισβητήσιμη. Είναι καλά γνωστό ότι αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές υφίστανται αποδιαφοροποίηση (δηλαδή, η απώλεια της αρχικής ειδικότητας κυττάρου) ως αποτέλεσμα της παρατεταμένης διόδου

in vitro

[29], και έχουν χαρακτηριστικά που δεν υπάρχουν σε ιστό τους καταγωγής λόγω διαιωνοποίηση τους. Ως εκ τούτου, μια αλλοιωμένη κυτταρική απόκριση σε τοξικές ουσίες μπορεί να φανεί. Αντίθετα, πρωτογενείς καλλιέργειες διατηρούν πολλά από τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του αρχικού ιστού, συμπεριλαμβανομένων των κανονικών φυσιολογικών λειτουργιών, και, ως εκ τούτου, μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική για τα μοντέλα ανακάλυψη γονιδίων, την επικύρωση στόχου, έλεγχο των ναρκωτικών, και την ανάπτυξη των βιοδεικτών. Επιπλέον, με τη χρήση πολλαπλών δωρητών για δείγματα ιστού για τη δημιουργία ανεξάρτητων απομονώσεων πρωτογενών κυττάρων επιτρέπει στους ερευνητές να αποδείξουν συνεπείς απαντήσεις μεταξύ των ατόμων.

Αν και αρκετοί συγγραφείς έχουν αναφερθεί στο παρελθόν μεθόδους για την απομόνωση και την κύρια καλλιέργεια του HPTEC [6], [9], [11] και HRTC [12], [14], ευρεία εφαρμογή αυτών των παρασκευασμάτων ανθρώπινου πολιτισμού έχει παρεμποδιστεί από μέτριες αποδόσεις και μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων.

Στη μελέτη αυτή, περιγράφουμε μια βελτιστοποιημένη μέθοδο για τον καθορισμό καλλιέργειες ανθρώπινων πρωτογενείς κυτταρικές τόσο από φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, που συλλέγονται από δείγμα του ασθενούς αμέσως μετά από ριζική νεφρεκτομή διαδικασία. Αξίζει να σημειωθεί είναι ότι η συλλογή του δείγματος, το συντομότερο μετά την εκτομή δυνατό είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τη λήψη κυτταρικών αιωρημάτων με υψηλή βιωσιμότητα, καθώς υπάρχει μια σαφής μείωση στο ποσό της επιτυχία που καλλιεργούνται υλικού οι πλέον τα υπολείμματα ιστού

ex vivo

[ ,,,0],24].

Δεδομένου ότι εγγύς θέση σωληνάρια περιορίζεται αποκλειστικά στο νεφρικό φλοιό, οι καλλιέργειες καθιερώθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα που απομονώνονται από προοδευτική ενζυματική διάσπαση από το απώτατο εξωτερικό φλοιό του φυσιολογικού ανθρώπινου νεφρού. Το άλεσμα του δείγματος σε μικρά κομμάτια επιτρέπει καλή απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων κατά τη διάρκεια της αρχικής στάδια πλύσης και μεγιστοποιεί την ενζυματική πέψη. Κατάλληλη επιλογή του ενζύμου, χρόνος επώασης, τη θερμοκρασία και τη συγκέντρωση για τη βέλτιστη πέψη απαιτούνται για να επιτευχθεί το καλύτερο διαχωρισμό των ιστών χωρίς υπερβολική καταστροφή. πέψη κολλαγενάσης είναι γνωστό ότι είναι λιγότερο επιβλαβή για τα επιθηλιακά κύτταρα από ό, τι είναι πέψη με άλλα ένζυμα (όπως θρυψίνη) και υπό τους όρους που καθορίζονται στο πρωτόκολλο μας δίνει αιωρήματα κυττάρων με υψηλότερες αποδόσεις και βιωσιμότητες από εκείνες που καθορίζονται για τις προηγούμενες διαδικασίες απομόνωσης. Διαδοχική διήθηση κολλαγενάσης χωνέψει μέσα από μια σειρά κόσκινων με μειούμενο μέγεθος των ματιών αφαιρεί σωληνοειδή τμήματα και σπειράματα, και αφήνει υλικό που παράγει έκφυση των επιθηλιακών κυττάρων νεφρικού με ένα εγγύτερο φαινότυπο πιθανότατα λόγω της υψηλής πολλαπλασιαστικού δυναμικού τους. Επιπλέον, η πρώτη αλλαγή μέσου, 24 ώρες μετά την επίστρωση, ελαχιστοποιεί προσκόλληση άλλων μη επιθηλιακά κύτταρα.

Μία διαδικασία θα πρέπει να είναι σχετικά απλή και γρήγορη στην ελαχιστοποίηση των ζημιών μεμβράνη κατά την απομόνωση και τον χρόνο που απαιτείται πριν τα κύτταρα μπορούν να είναι που χρησιμοποιούνται σε πειράματα. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μέθοδο μας όπως δεν περιλαμβάνει χρονοβόρα βήματα όπως φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας Percoll [6], [9], ή σύμπλοκο μικροανατομή [10], [11] ή ανοσομαγνητικά τεχνικές [30]. Η διαδικασία διαρκεί περίπου 1 ώρα για να εκτελέσει, επιτρέποντας έτσι την ταχύτερη δημιουργία πρωτογενών καλλιεργειών κυττάρων σε σύγκριση με τα προηγούμενα HPTEC ή πρωτόκολλα HRTC πολιτισμό.

Η δημιουργία πρωτογενών καλλιεργειών με επιτυχία επιτευχθεί από όλα τα χειρουργικά δείγματα. Ελήφθησαν συνολικά 12 διαφορετικές νεφρικής πρωτογενείς καλλιέργειες. Μεταξύ αυτών των πολιτισμών, 6 ήταν από την κανονική φλοιό, 4 από σαφείς κυττάρων RCC και 2 από χρωμόφοβο RCC. Στη διαδικασία μας, ο όγκος πρωτογενείς καλλιέργειες χρειάζονται περισσότερο χρόνο για να φτάσει το συρροής πέρα ​​από την πρώτη διάσπαση από τις συνήθεις καλλιέργειες φλοιού πρωτοβάθμια. Η κανονική φλοιό πρωτογενείς καλλιέργειες παρουσίασε ένα ομοιογενές μορφολογία, ενώ οι πρωτογενείς καλλιέργειες καρκινικών είχε ένα πιο ετερογενές μορφολογία. Οι συνήθεις καλλιέργειες νεφρικών κυττάρων εμφανίζεται μια επιθηλιακή μορφολογία που ήταν συνεπής με αναφέρθηκε χαρακτηριστικά για HPTEC [9], [24], [25]. Οπτική μικροσκοπική ανάλυση μέχρι και το τρίτο πέρασμα έδειξε ότι αυτό το διαφοροποιημένο μορφολογία δεν μετέβαλε επί υποκαλλιέργεια. Εμείς δεν προσπάθησε να ελέγξει τη διάρκεια ζωής του πρωτογενούς όγκου ή κανονικός καλλιέργειες, επειδή είναι γνωστό ότι μια παραλλαγή του φαινοτύπου λαμβάνει χώρα σε υψηλότερες περάσματα [26], [29], [30]. Το μοτίβο της ανάπτυξης και μορφολογία των κυττάρων ΗΚ-2 δεν διέφερε από εκείνο των πρωτογενών καλλιεργημένων HPTEC, όπως εκτιμάται με μικροσκοπία φωτός. Είναι σημαντικό, η μόλυνση των ινοβλαστών δεν παρατηρήθηκε σε βραχυπρόθεσμες πρωτογενείς καλλιέργειες μας, αλλά μπορεί να είναι ένα πρόβλημα μετά από περισσότερο κύρια καλλιέργεια ή περισσότερες υποκουλτούρες. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, έχει προταθεί ότι στη θέση του L-βαλίνης με D-βαλίνη και L-αργινίνη από την L-ορνιθίνη σε HPTEC μέσο [6] ή η χρήση της αυξητικής-συμπληρωμένο μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό [9].

Η παρουσία ειδικών δεικτών ιδρύθηκε για να χαρακτηρίσει τις HPTEC πρωτογενείς καλλιέργειες. Ειδικότερα, η επιθηλιακή φύση των καλλιεργειών HPTEC επιβεβαιώθηκε με ανοσοκυτταροχημεία με θετική χρώση για κυτοκερατίνη και το εγγύς σωληνοειδές προέλευση με RT-PCR με σαφή έκφραση του εγγύς σωληναρίου βούρτσα σύνορα ένζυμο αμινοπεπτιδάση Α Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα έδειξαν πολύ ασθενή ή απούσα έκφραση του άπω σωληνοειδούς και συλλεκτικού αγωγού δείκτες, ουρομοδουλίνη και ακουαπορίνη 3, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι πρωτογενείς καλλιέργειες HPTEC μας προέρχεται από εγγύς σωληνοειδή κύτταρα, χωρίς σημαντική μόλυνση των κυττάρων από άλλα μέρη του νεφρώνα. Έτσι, η μέθοδος μας επιτρέπει να απομονώσουμε και να αναπτυχθούν εξαιρετικά διαφοροποιημένες πρωτογενείς καλλιέργειες, οι οποίες εκφράζουν συγκεκριμένες εγγύς σωληνοειδή πρωτεΐνες.

Η κυτταρολογική ομοιογένεια HPTEC πρωτογενείς καλλιέργειες μας αξιολογήθηκε με ανοσοκυτταροχημική χρώση για κυτοκερατίνη μέχρι το τρίτο πέρασμα, και όλες οι περιπτώσεις, οι αντιδράσεις ήταν ομοιογενή σε ένταση και είχαν το ίδιο προφίλ.

χαρακτηρισμό κυττάρων πραγματοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει άλλες μελέτες που δείχνουν ότι οι πολιτισμοί HPTEC διατηρούν τα διαφοροποιημένα χαρακτηριστικά της PTC για έως και τρία περάσματα [9], [31] . Αυτή η

in vitro

μοντέλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μελέτες σχετικά με νεφρική βλάβη, συμπεριλαμβανομένων των ξενοβιοτικών που προκαλείται από την τοξικότητα σε HPTEC, ως εκ τούτου εξαλείφοντας την ανάγκη για παρέκταση από καλλιέργειες ζωικών κυττάρων και πιο αντιπροσωπευτική των νεφρικών κυττάρων

in vivo

από καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές νεφρού.

Αξίζει να σημειωθεί είναι ότι αυτά τα νεφρικά κύτταρα του εγγύς σωληναρίου, μπορεί να καλλιεργηθεί σε διαπερατή στηρίγματα φίλτρου μεμβράνης, με αποτέλεσμα σε κύτταρα που μορφολογικά και λειτουργικά καλύτερα αντιπροσωπεύουν τους

in vivo

ομόλογοί. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αυτά τα στηρίγματα μεμβράνης που χρησιμοποιείται για τη μελέτη εγγύς συστήματα μεταφορών, καθώς και η επίδραση των διαφορετικών ξενοβιοτικών τόσο σε κορυφαίων και βασεοπλευρικών πλευρές του εγγύς σωληνοειδούς κυττάρου [32].

Η διαδικασία εφαρμόστηκε επίσης αποτελεσματικά στην απομόνωση HRTC από δύο μορφολογικά και γενετικά διακριτούς υποτύπους του RCC, ήτοι σαφής κυττάρων και χρωμόφοβο RCC. Και οι δύο τύποι αναπτύσσονται από ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα του φλοιού. Ωστόσο, είναι σαφές Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης κυττάρων πιστεύεται ότι προέρχονται από το επιθήλιο των εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια, ενώ χρωμόφοβο Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης φαίνεται να προέρχονται από το φλοιώδες τμήμα του αγωγού συλλογής [33]. Ενώ οι πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικού επιθηλίου κύτταρα του εγγύς προέλευσης παρουσιάσει ένα πολύ ομοιογενές μορφολογία, παρατηρήθηκαν σημαντικές μορφολογικές ετερογένεια μεταξύ των σαφές κυτταροκαλλιέργειες RCC. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν παραλλαγές στο μέγεθος και το σχήμα [34] τους. Τα κύτταρα παρουσιάζονται τα αναμενόμενα ιστολογικά χαρακτηριστικά που περιγράφονται σε προηγούμενες μελέτες [18], [19], [35].

Η μέθοδος αποδείχθηκε ότι είναι τεχνικά απλούστερη, ταχύτερη και με υψηλότερο ποσοστό επιτυχίας για τη δημιουργία του όγκου πρωτογενείς καλλιέργειες από χειρουργικά δείγματα από το καθιερωμένο για τις προηγούμενες διαδικασίες απομόνωσης [12], [14]. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες από καρκίνους RCC είναι χρήσιμα εργαλεία για τη μελέτη των βιοχημικών και μοριακών μεταβολών που σχετίζονται με τη νεοπλαστική κατάσταση. Επιπλέον, η ανάπτυξη της RCC πολιτισμών, μαζί με την αντίστοιχη κανονική τους ομολόγους τους, μπορεί να δώσει ένα πιο ρεαλιστικό μοντέλο για την ανάπτυξη και δοκιμή νέων θεραπευτικών μεθόδων.

Εν κατακλείδι, παρουσιάζουμε μια χρήσιμη και απλή μέθοδος για την επιτυχή καθιέρωση πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από φρέσκο ​​ανθρώπινο φυσιολογικό του φλοιού και του όγκου των ιστών. Συνδυάζει διάφορες τεχνικές που έχουν ήδη περιγραφεί στη βιβλιογραφία, και καταλήγει σε ένα βελτιστοποιημένο μέθοδο απομόνωσης, δίδοντας παρασκευάσματα κυττάρων με εξαιρετική βιωσιμότητα και ανάκτησης.