Αφηρημένο

Εισαγωγή

Εμείς περιγράφουμε μία νέα 3D συγκαλλιέργειας μοντέλο χρησιμοποιώντας μη-μικροκυτταρικό κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC), σε συνδυασμό με ινοβλάστες πνεύμονα. Αυτό το μοντέλο επιτρέπει τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων όγκου-στρώματος και εξετάζει τη σημασία της ύπαρξης μιας πιο in vivo σαν μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων.

Μέθοδοι

Αυτοματισμός-συμβατό πολλών φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν κρέμονται πλάκες μικροτιτλοδότησης πτώση για την παραγωγή 3D μονο- και συν-καλλιέργειες. Σε αυτά κρέμεται πέφτει το Α549 δύο NSCLC κυτταρικές γραμμές και Colo699 καλλιεργήθηκαν είτε μόνα τους ή συν-καλλιεργήθηκαν με ινοβλάστες πνεύμονα. Η βιωσιμότητα των σφαιροειδή όγκου επιβεβαιώθηκε μετά από πέντε και δέκα ημερών, χρησιμοποιώντας αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο χρώση για κυτταρομετρία ροής. σχηματισμός ινοβλαστών σφαιροειδές όγκου χαρακτηρίστηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM), ημι-λεπτές τομές, μικροσκόπιο φθορισμού και ανοσοϊστοχημεία (IHC). Εκτός από την συμβατική ιστολογία, πρωτεΐνη έκφραση της Ε-καδερίνης, βιμεντίνη, Ki67, ινονεκτίνη, κυτοκερατίνη 7 και α-λείου μυός ακτίνη (α-SMA) ερευνήθηκε με IHC.

Αποτελέσματα

Κάτω βιωσιμότητα παρατηρήθηκε σε μονοκαλλιέργειες Α549 σε σύγκριση με συν-καλλιέργειες, ενώ Colo699 μονοκαλλιέργειες έδειξε καλύτερη βιωσιμότητα σε σύγκριση με συν-καλλιέργειες. έκφραση Κί67 ποικίλουν σημαντικά μεταξύ μονο- και συν-καλλιέργειες στις δύο κυτταρικές σειρές όγκων. Μια αύξηση του βιμεντίνη και μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης μπορεί να ανιχνευθεί κατά την διάρκεια της καλλιέργειας προτείνοντας μια μετάβαση σε μια πιο μεσεγχυματικά φαινότυπο. Επιπλέον, η κυτταρική σειρά ινοβλαστών παρουσίασαν έκφραση του α-SMA μόνο σε συν-καλλιέργεια με το Α549 γραμμή καρκινικών κυττάρων, υποδεικνύοντας έτσι μια μεσεγχυματικών να μεσεγχυματικά στροφή σε μια ακόμα πιο φαινότυπο μυοϊνοβλάστη.

Συμπέρασμα

Έχουμε αποδείξει ότι η μέθοδος μας είναι ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για τη δημιουργία του σφαιροειδούς όγκου συν-καλλιέργειες. Επιπλέον, αυτά τα σφαιροειδή επιτρέπουν τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων όγκο στρώμα και καλύτερη αντανάκλαση των in vivo συνθήκες των καρκινικών κυττάρων σε μικροπεριβάλλον τους. Η μέθοδός μας κρατά δυνατότητες να συμβάλουν στην ανάπτυξη των αντικαρκινικών παραγόντων και να υποστηρίξει την έρευνα για τους βιοδείκτες

Παράθεση:. Amann Α, Zwierzina Μ, Gamerith G, Bitsche Μ, Huber JM, Vogel GF, et al. (2014) ανάπτυξη ενός καινοτόμου συστήματος 3D Cell Culture να Μελέτη του όγκου – Stroma Αλληλεπιδράσεις με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 9 (3): e92511. doi: 10.1371 /journal.pone.0092511

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 3, Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 24 Φλεβάρη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Μάρτη 2014

Copyright: © 2014 Amann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε μέσω της επιχορήγησης Ph.D της αυστριακής Εταιρείας Αιματολογίας και Ογκολογίας (OeGHO) και περαιτέρω υποστηρίζεται οικονομικά από την Verein für Tumorfoschung. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όσον αφορά Insphero (J. Kelm) και το θυγατρικό στο έργο των συγγραφέων: Αυτό το συγγραφέας συνέβαλε με την πολύχρονη εμπειρία του στον πολιτισμό 3D κυττάρων σε αυτό το άρθρο. Επιπλέον, οι συγγραφείς υποστηρίχθηκαν από την εταιρεία με τη μορφή πλακών καλλιέργειας κυττάρων 3D για τα πειράματά τους. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Λόγω της αυξανόμενης κατανόηση των μηχανισμών που σχετίζονται με τη γένεση του καρκίνου, είμαστε βιώνει μια μετάβαση από τη νόσο να στοχεύσετε προσανατολισμένη θεραπεία. Κατά συνέπεια, το μέλλον του μοριακού στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου έγκειται στον εντοπισμό υποομάδες των ασθενών που ωφελούνται από συγκεκριμένες θεραπείες που χτύπησε ειδικών δομών που εκφράζονται από το κακοήθες κύτταρο. Ένα σημαντικό εμπόδιο για την ανάπτυξη αυτών των εξατομικευμένων θεραπευτικές αγωγές, ωστόσο, είναι η περιορισμένη διαθεσιμότητα πρόβλεψης in vitro μοντέλα. Η κρίσιμη πρόκληση είναι να αναπτύξουμε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων που εκφράζουν με τις συνθήκες vivo και με τον τρόπο αυτό την υποστήριξη της έρευνας, της πρόβλεψης βιοδείκτες που έχουν τη δυνατότητα αύξησης της τιμής των φαρμάκων καρκίνου και τη μείωση των επιτοκίων το μέγεθος, το κόστος και την αποτυχία των κλινικών δοκιμών καλύτερα.

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο σε άνδρες και γυναίκες ασθενείς σε όλο τον κόσμο.

Μόνο το 15% -20% αυτών διαγιγνώσκονται σε πρώιμο στάδιο [1] . Η πρόγνωση παραμένει φτωχή με ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών κυμαίνονται από περίπου 60% για το στάδιο Ι σε λιγότερο από 5% για το στάδιο IV όγκους [2].

Οι ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με τοπικά προχωρημένη νόσο απαιτεί θεραπεία πολυτροπικότητα να επιτευχθεί μακροπρόθεσμη -Term διαγραφή ή ακόμη και θεραπεία, ενώ οι ασθενείς με μεταστατική νόσο λαμβάνουν πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με EGFR ή ALK αναστολείς [3] – [5].

Πολυάριθμες άλλες μοριακές παράγοντες στόχοι έχουν ελεγχθεί σε κλινικές δοκιμές, αλλά απέτυχε να δείξει ένα όφελος για τους ασθενείς σχετικά με την επιβίωση χωρίς εξέλιξη και τη συνολική επιβίωση [6]. Αρκετές από αυτές τις δοκιμές με στόχο να καθορίσουν βιοδεικτών σε έναν υποψήφιο ή αναδρομικές τρόπο, αλλά μόνο σε πολύ περιορισμένο αριθμό έχουν εντοπιστεί [7], [8].

δοκιμασίες Μέχρι στιγμής με βάση κύτταρα για να εξερευνήσετε κυτταρική βιολογία και την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου με στόχο την ανάπτυξη των κυττάρων σε δισδιάστατο πλαστικές επιφάνειες ή σε εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων [4]. Η βιολογία των κυττάρων, ωστόσο, να επηρεάζονται βαθιά από μικρο-περιβάλλον τους απαιτούν βάση κύτταρα ανιχνεύσεις που αντικατοπτρίζουν τις επιδράσεις των παραγόντων, όπως η εξωκυττάρια μήτρα (ECM), οι επαφές κυττάρου-κυττάρου, τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας, την κυτταρική πολικότητα και προφίλ οξυγόνο [ ,,,0],5] – [8].

Συμβατικά δύο διαστάσεων συστήματα (2D) καλλιέργειας κυττάρων που καλλιεργούνται σε τεχνητές πλαστικές επιφάνειες έχουν σημαντικούς περιορισμούς. Για παράδειγμα μπορούν να απαιτούν υψηλά μη-φυσιολογικό ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και οι συγκεντρώσεις επανασίτισης αλλάζοντας μέσο κάθε 2-3 ημέρες. Σε αντίθεση με αυτό, 3D τεχνικές αποφεύγουν πλαστικές επιφάνειες επιτρέπουν στα κύτταρα να σχηματίσουν ECM τους και απαιτούν μείωσε σημαντικά τις συγκεντρώσεις FCS. Όχι μόνο η μορφολογία των κυττάρων, αλλά και την ευαισθησία του φαρμάκου των καρκινικών κυττάρων σε 2D συστήματα είναι διαφορετική σε σύγκριση με καλλιέργειες σε 3D κυττάρου [9], [15]. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε πλαστικές επιφάνειες συνήθως εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία σε κυτταροτοξικά φάρμακα, ενώ ενώσεις που στοχεύουν κύτταρο – κύτταρο συμφύσεις, την ωρίμανση των κυττάρων, τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικά συχνά εμφανίζουν μειωμένη αποτελεσματικότητα στην καλλιέργεια 3D κυττάρων. Έτσι, τα μοντέλα 3D κυτταρικής καλλιέργειας αντανακλούν στην αύξηση του όγκου vivo πιο αξιόπιστα και μπορούν να παρέχουν διαβάστε outs για τον έλεγχο των ναρκωτικών καλύτερη [9], [15], [10].

Οι περισσότεροι 3D συστήματα χρησιμοποιούν συσσωματώματα κυττάρων σφαιροειδές και τα συστήματα σκαλωσιάς πολιτισμό . Τα συστήματα αυτά υποστηρίζουν 3D ανάπτυξη των κυττάρων με τεχνητά παραγόμενες εξωκυττάριο ομόλογα (π.χ. κολλαγόνο, matrigel, ικριώματα) διευκολύνοντας την κυτταρική προσκόλληση και συσσώρευση. Άλλα συστήματα χρησιμοποιούν 3D υγρό τεχνολογιών επικάλυψης, πλέγμα ινών που κατασκευάζονται από βιοσυμβατά πολυμερή, στερεά ή πορώδη σφαιρίδια ή εξωκυτταρικές μήτρες και τα υποκατάστατα αυτών και απαιτούν την προσθήκη τεχνητά παραγόμενες συμπληρωμάτων για την επίτευξη καλλιέργειες καλλιέργεια κυττάρων 3D [16] – [19].

Η κρεμαστή τεχνική πτώση είναι μια καθιερωμένη μέθοδο καλλιέργειας κυττάρων για να σχηματίσουν σφαιρικά microtissues από απαθανάτισε και πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές [20] – [22]. Σε αντίθεση με τις περισσότερες τεχνολογίες υγρό επικάλυψης, η μέθοδος κρεμαστή πτώση επιτρέπει την ακριβή έλεγχο της αρχικής σύνθεσης των κυττάρων σε κάθε microtissue [23], [24]. Για να δημιουργήσετε microtissues τύπου συγκαλλιέργειας multi-cell ούτε επιπλέον χρεώσεις ούτε τεχνητά ικριώματα μιμούνται συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (π.χ. κολλαγόνο matrigel) είναι υποχρεωτικά.

Με βάση την αυτοματοποίηση και υψηλής απόδοσης συμβατό κρέμονται τεχνολογία πτώση ιδρύσαμε ένα οργανοτυπικό μοντέλα συν-καλλιέργειας που αποτελείται από δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC), σε συνδυασμό με ινοβλάστες πνεύμονα. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει όχι μόνο τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων όγκου-στρώματος και αντιπροσωπεύει μια πιο in-vivo όπως 3D μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων του όγκου των ναρκωτικών, αλλά μπορεί επίσης να εφαρμοστεί σε μελλοντικές εκστρατείες ανακάλυψη φαρμάκων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

ο NSCLC κυτταρικές σειρές Α549 και Colo699 (DSMZ, ACC107, ACC196) και η κυτταρική σειρά ινοβλαστών πνεύμονος SV-80 (CLS, 300345) χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματά μας. Για 2D καλλιέργεια, κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σαν μονοστιβάδα σε DMEM χαμηλής γλυκόζης (ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία) συμπληρωμένο με 10% FCS (Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία, Lot 010M3396) και 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη διάλυμα, 2 mM L-γλουταμίνη (ΡΑΑ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 περιέχει ατμόσφαιρα.

καλλιέργεια 3D κυτταρική

Για την παραγωγή του 3D μονο- και συν-καλλιέργειες GravityPLUS ™ microtissue χρησιμοποιήθηκαν σύστημα καλλιέργειας (InSphero AG, Ζυρίχη, Ελβετία). Η πλάκα αποτελείται από ένα πλαίσιο με 8 × 12 καλά ένθετα και ένα περιφερειακό κανάλι γεμάτο με 2-3 ml αποστειρωμένου ύδατος για να παρέχει ένα φράγμα υγρασίας που μειώνει την εξάτμιση του μέσου από τις σταγόνες. Αυτό το πλαίσιο είναι τοποθετημένο σε μια κάτω-δίσκος η οποία είναι γεμάτη με 5 ml 0,2 χ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) (ΡΑΑ) με 0.1% Triton Χ-100 (Sigma), και πάλι για να μειωθεί η εξάτμιση από τα σταγονίδια. Το πηγάδι χωρίζεται σε τρία στοιχεία, (i) η είσοδος στην οποία οι άκρες της πιπέτας τοποθετούνται απευθείας πάνω στην επιφάνεια του πηγαδιού, (ii) το διαμέρισμα καλλιέργεια και (iii) ένα μικροκανάλι που συνδέει την είσοδο και το διαμέρισμα του πολιτισμού. Κάθε καλά είναι με ελατήριο για να αντισταθμίσει τυχόν μικρές αποκλίσεις στα ύψη κορυφή των κεφαλιών πιπέτας 96 φρεατίων.

Αφού τα κύτταρα είχαν αναπτυχθεί συρροής σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας (Falcon) που σπάρθηκαν σε τον απαγχονισμό πέφτει. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και υπέστη πέψη με 1 × Accutase (ΡΑΑ) για δέκα λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, η πέψη διεκόπη και τα κύτταρα πλένονται μια φορά με 20 ml μέσου κυτταρικής καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε 40 σταγόνες μΐ σε διάφορες μετρήσεις κυττάρων (μονοκαλλιέργειες: SV-80 και Α549: 2500 κύτταρα /40 μΙ? Colo699: 1250 κύτταρα /40 μΙ? Συν-καλλιέργειες: κελί καρκίνωμα: ινοβλαστών αναλογία 1:02 /40 μl). Μέσο ανταλλαγή διεξήχθη κάθε τέσσερις ημέρες και τα σφαιροειδή συλλέχθηκαν μετά από πέντε και δέκα ημερών με φόρτωση 100 μΙ PBS (ΡΑΑ) πάνω στα μικροτριχοειδή να καθαρίσουμε τα σφαιροειδή. Η πτώση σταγόνες που περιέχουν τα σφαιροειδή στη συνέχεια συλλέχθηκαν με 96 φρεατίων υ-πυθμένα πλάκα (Falcon) που τοποθετείται κάτω από την πλάκα μικροτριχοειδών.

χρώση CFSE ινοβλαστών.

Για την φθορίζουσα επισήμανση ινοβλαστών το CellTrace ™ CFSE κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Molecular Probes, Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε. Οι ινοβλάστες διαλύθηκαν και ρυθμίστηκαν σε 1 χ 106 σε 1 ml /0,1% αλβουμίνη βόειου ορού PBS (BSA) .CFSE διάλυμα προστέθηκε για να επιτευχθεί μια τελική συγκέντρωση εργασίας 10 μΜ. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, η χρώση σβήστηκε με πέντε όγκους παγωμένου μέσου κυτταρικής καλλιέργειας και επωάστηκαν για 5 λεπτά σε πάγο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο καλλιέργειας κυττάρων. Τα επισημασμένα ινοβλάστες τώρα σπάρθηκαν ως συν-καλλιέργειες με κύτταρα καρκινώματος, όπως περιγράφεται στην ενότητα κυτταρικής καλλιέργειας 3D.

κυτταρομετρία ροής

Οκτώ microtissues, συλλέχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων μεταφέρθηκαν σε 5 ml σωλήνες FACS (Falcon) και πλύθηκε μία φορά με 2 ml PBS. Στη συνέχεια, microtissues διαλύθηκαν σε εναιώρημα απλού κυττάρου με την προσθήκη 300 μΙ Accumax (Miltenyi Biotech) ανά microtissue επώαση αυτών για 20 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από δέκα λεπτά microtissues αναμίχθηκαν και με πιπέτα πάνω και κάτω για να ληφθεί ένα διάλυμα ομοιογενής. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε μετά από 20 λεπτά επώασης. Τώρα, η πέψη σταμάτησε με 2 ml μέσου πλήρης κυτταρικής καλλιέργειας, στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 300 g για δέκα λεπτά και πλύθηκε δύο φορές με 0,5% BSA /PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 4 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) διάλυμα χρώσης και 4 μΙ αννεξίνης V APC. Η χρώση πραγματοποιήθηκε σε 100 μΐ ρυθμιστικό δέσμευσης αννεξίνης που λαμβάνονται από τη αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (Becton Dickinson) για 15 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα αναλύθηκαν σε BD FACS Calibur αμέσως. Κάθε μέτρηση των δεδομένων έγινε μέχρι οκτώ συγκεντρωμένα microtissues, επαναλαμβάνοντας την όλη διαδικασία ανεξάρτητα τρεις φορές.

υπολογισμό Όγκος microtissues

Έξι microtissues μονο- και συν-καλλιέργειες αξιολογήθηκαν από μια ανεστραμμένη φως μικροσκόπιο (MOTIC AE31) από την πρώτη μέρα μέχρι το δέκα. Μετά από πέντε, επτά και δέκα ημέρες, δύο διαμέτρων (δ) κάθε microtissue μετρήθηκαν και ο όγκος υπολογίστηκε από τον τύπο V = 4/3 * Π * r

3, όπου r = ½ * √ d1 * d2 [ ,,,0],25]. μέτρηση έντασης επαναλήφθηκε τρεις φορές. Στη συνέχεια, μέση και τυπική απόκλιση υπολογίστηκε και η στατιστική σημαντικότητα δοκιμαστεί με t-test του φοιτητή στο Microsoft Excel.

ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις

Η προετοιμασία των δειγμάτων.

Microtissues ξεπλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια καθορίζονται αμέσως με εμβάπτιση σε ψυχρό 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε PBS, για τέσσερις ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Microtissues στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε PBS και πάλι και ενσωματωμένα σε 2% αγαρόζη (Invitrogen). Η περίσσεια αγαρόζης απομακρύνθηκε με νυστέρι, και οι συστάδες αγαρόζη που περιέχει τις microtissues αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένες αλκοόλες και ενσωματωμένα σε παραφίνη κηρού (Paraplast τακτική, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) Ένα μικροτ Microm ERGO αστεριών Rotary (Microm, Walldorf, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να λάβει διαδοχικές τομές πάχους 4 μm. Ένα τριών έως τέσσερις σειρές παραφινοποιήθηκαν τομές στη συνέχεια τοποθετείται σε ένα οφιοειδή σχέδιο επί SuperFrost Plus διαφάνειες (Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany) και ξηραίνεται όλη τη νύκτα, στη συνέχεια ψήνεται στους 60 ° C για μία ώρα για να προσκολληθούν τα τμήματα σταθερά στις διαφάνειες. Για κυτταρο-αρχιτεκτονικό προσανατολισμό, κάθε δέκατο slide ήταν αιματοξυλίνη /ηωσίνη βάφονται (HE) χρησιμοποιώντας ένα Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer (Histocom Βιέννη, Αυστρία).

αντιοροί.

οικοδεσπότες, αραιώσεις , οι χρόνοι επώασης και πηγές πρωτογενούς αντισωμάτων καθώς και τη θερμότητα που προκαλείται επίτοπο ανάκτησης (hier) παρατίθενται στον πίνακα 1.

η

η ανοσοκυτταροχημεία

η ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε σε τομές πάχους 4 μm από εγκλεισμένο σε παραφίνη microtissues σε Ventana Roche Discovery ανοσοκηλιδωτή (Mannheim, Germany) σύμφωνα με την έρευνα ανακάλυψη τυποποιημένη διαδικασία DAB-MAP. Εάν απαιτείται, ανάκτηση αντιγόνου ξεκίνησε από τη θερμότητα που προκαλείται αποκάλυψη των επιτόπων ενώ οι καλυπτρίδες εμβαπτίζονται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (σύντομη ή πρότυπο για διαφορετικούς χρόνους επώασης) σε ρυθμιστικό EDTA (Cell Conditioning Solution CC1, Ventana). Μετά την επώαση των τομών με τα πρωτογενή αντισώματα (που απαριθμούνται στον Πίνακα 1.) στους 37 ° C, ένα βιοτινυλιωμένο κοκτέιλ ανοσοσφαιρίνη κατσίκας αντι-ποντικού IgG, κατσίκας αντι-ποντικού IgM, IgG κατσίκας αντι-κουνελιού και μπλοκ πρωτεΐνη (Discovery καθολική Αντίσωμα , Ventana) εφαρμόστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανίχνευση επιτεύχθηκε με τη χρήση του κιτ ανίχνευσης DAB-MAP (Ventana) σύμφωνα με τη μέθοδο ανάπτυξης διαμινοβενζιδίνη (DAB). Οι τομές τελικά με αιματοξυλίνη (Ventana) για τέσσερα λεπτά. Στη συνέχεια, τα τμήματα ήταν το χέρι αφυδατωμένα στην υποβαθμισμένη σειρά αλκοόλ, καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο και κάλυμμα γλίστρησε μόνιμα με Entellan (Merck, Darmstadt, Γερμανία).

Ψηφιακές εικόνες των HE- και ανοσοχρωματίστηκε διαφάνειες αποκτήθηκαν στο λογισμικό AxioVision μικροσκόπιο συνδέεται με μια έγχρωμη κάμερα AxioCam ΣΑΔ και ένα Αχίορίαπ 2 μικροσκόπιο (Zeiss, Jena, Germany).

Ki67 θετικότητα προσδιορίστηκε μετρώντας Ki67 θετικών και αρνητικών πυρήνων κυττάρων σε τρεις διαφορετικές σφαιροειδή A540 και Colo699 σε μονο- και συνεργασία πολιτισμών αντιπροσωπευτικά. Στη συνέχεια, το ποσοστό των θετικών κυτταρικών πυρήνων με τον αριθμό ολόκληρων κυττάρων υπολογίστηκε. Η μέση και τυπική απόκλιση και η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

φθορισμού μικροσκόπιο

Microtissues σε μονο- και συν-καλλιέργειες συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Στη συνέχεια, microtissues όγκου μονιμοποιήθηκαν με 4% PFA για δύο ώρες στους 4 ° C και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Τώρα, μπλοκαρίστηκαν με επώαση με PBS που περιέχει 2% BSA (Sigma) /0,3% Triton Χ-100 (Roche) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Microtissues κατόπιν επωάστηκαν 40 λεπτά, με 50 μg /ml phalloidin Atto 633 (Sigma) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, αυτά πλύθηκαν πάλι πέντε φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν πέντε λεπτά, με 1,5 μg /ml ϋΑΡΙ (Invitrogen) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά το πλύσιμο μία φορά με PBS microtissues έφεραν επάνω σε ένα slide αντικείμενο με φθορίζοντα μέσο στερέωσης (Dako Glostrup, Δανία) και αναλύθηκαν σε LSM 510 Meta Ομοεστιακή μικροσκόπιο (Zeiss).

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM)

microtissues όγκου μονιμοποιήθηκαν με 2.5% γλουταραλδεϋδη (Biochemika Fluka) σε 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό (ρΗ 7.4). Μετά από μια σύντομη πλύση σε PBS, που ακολουθείται από μετα-στερέωσης για μία ώρα με 1% υδατικό τετροξείδιο του οσμίου (ReagentPlus? Sigma-Aldrich), δείγματα ήταν σταδιακά αφυδατώνεται με αιθανόλη. Μετά από ξήρανση (CPD 030, Bal-Tec), microtissues τοποθετήθηκαν σε στελέχη αλουμινίου με διπλής όψης κολλητική ταινία, διασκόρπισης επικαλυμμένα με 10-nm χρυσό /παλλάδιο (Au /Pd) (Bal-Tec) και εξετάστηκαν με έναν εκπομπής πεδίου ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (Gemini 982? Zeiss, Γκέτινγκεν, Γερμανία).

Ημι-λεπτές τομές

όγκου microtissues υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρότυπο τεχνική για μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης. Microtissues σταθεροποιήθηκαν σε στερεωτικό Karnovsky του (2,5% γλουταραλδεΰδη και 2% παραφορμαλδεϋδη σε 0,1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού) όλη τη νύχτα και στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές (10 λεπτά η κάθε μία) σε 0.1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού, που ακολουθείται από στερέωση με 1% τετροξείδιο του οσμίου σε 0,05 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού στους 4 ° C για 1 ώρα. Υπερβολική τετραοξειδίου οσμίου απομακρύνθηκε με έκπλυση των microtissues τρεις φορές (10 λεπτά η κάθε μία) σε 0.1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού. Microtissues στη συνέχεια αφυδατώθηκαν με αιθανόλη (2 χ 70% αιθανόλη κάθε 30 λεπτά, 2 χ 96% αιθανόλη κάθε 30 λεπτά, 2 χ 100% αιθανόλη κάθε 30 λεπτά) και ακετόνη (2 χ κάθε 30 λεπτά) πριν από την επώαση σε αραίωση υγρή εποξική ρητίνη (Epon μέσο μείγμα: 20 ml ενσωματώσετε-812, 16 ml DDSA, 8 ml ΝΜΑ και 1,2 ml BDMA? Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Επιστημών, Μόναχο, Γερμανία) και ακετόνης σε αναλογία 30% έως 70% για τρεις ώρες. Οι microtissues είχαν διεισδύσει με ένα μίγμα Εροη και ακετόνης σε ίσα μερίδια σε 4 ° C όλη τη νύχτα σε κλειστά φιαλίδια. Την επόμενη μέρα, το υγρό αντικαταστάθηκε από ένα μίγμα 70% εποξειδική ρητίνη και 30% ακετόνη για τρεις ώρες. Στη συνέχεια, microtissues επωάστηκαν δύο φορές σε 100% Εροη (3 ώρες και στους 4 ° C όλη τη νύχτα). Στη συνέχεια, το καθαρό εποξική ρητίνη άλλαξε, και οι microtissues είχαν διεισδύσει με Εροη σε ένα θάλαμο κενού για 2 ώρες. Microtissues στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μια ενσωμάτωση μούχλα, ετικέτες, και τοποθετήθηκε σε θάλαμο κενού για μία επιπλέον 1 ώρα. Microtissues μεταφέρθηκαν σε ένα θάλαμο επώασης στους 60 ° C για 48 ώρες για να αυξηθεί ο πολυμερισμός της εποξειδικής ρητίνης. τμήματα ενός μικρομέτρου κόπηκαν με μικροτόμο Leica Ultracut, βάφονται με τολουιδίνη μπλε στους 60 ° C, και στη συνέχεια να εξεταστεί χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο.

Αποτελέσματα

σχηματισμό όγκων microtissue

Αρχικά, ερευνήσαμε την διάταξη των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών σε σφαιροειδή κατά τη διάρκεια της περιόδου καλλιέργειας. Για το σκοπό αυτό SEM εικόνες (εικόνα 1) του Α549 και Colo699 μονο- και συν-καλλιέργειες ελήφθησαν μετά από δέκα ημέρες καλλιέργειας. Επιπλέον, Α549 /Colo699 μονο- και συν-καλλιέργειες παρασκευάστηκαν για ημι-λεπτές τομές και χρωματίστηκαν με μπλε τολουϊδίνης (σχήμα 2)

SEM φωτογραφίες τραβήχτηκαν μετά από δέκα ημέρες:. Σπάρθηκαν μονοκαλλιέργειες Α549 και SV80 σε αναλογία 2500 κύτταρα /40 μΙ, ενώ Colo699 μονοκαλλιέργειες καλλιεργήθηκαν σε μορφή 1250 κύτταρα /40 μΙ. Όλα τα συν-καλλιέργειες σπάρθηκαν σε ένα κύτταρο καρκινώματος: ινοβλαστών αναλογία 1:02 /40 μl (Α549 συν-καλλιέργειες: 2500 καρκινικά κύτταρα 5000 ινοβλάστες /Colo699 συν-καλλιέργειες: 1250 καρκινικά κύτταρα 2500 ινοβλάστες). (Α /Β) μονοκαλλιέργειες Α549, (C /D) Α549 συν-καλλιέργειες? (E /F) μονοκαλλιέργειες Colo699, (G /H) Colo699 συν-καλλιέργειες? (/J Ι) μονοκαλλιέργειες SV80. Όλες οι συν-καλλιέργειες εμφανίζεται μια πιο ομοιογενής και πιο στρογγυλεμένο microtissue επιφάνεια σε σύγκριση με μονοκαλλιέργειες.

Η

Ημι-λεπτές τομές (1 μm φέτες) του Α549 /Colo699 μονο- και συν-καλλιέργειες μετά από δέκα ημέρες από την καλλιέργεια χρωματισμένο με τολουιδίνη. Bar σε όλες τις φωτογραφίες: 20 μm. Κύτταρα Α549 σχηματίζουν τραχιά σφαιροειδή που μοιάζει με μια περισσότερο πολυστρωματικού ιστού και παρουσιάζουν μία τραχιά επιφάνεια. Colo699 μονοκαλλιέργειες αποκαλύπτουν μια σφαιροειδή δομή με μια χαλαρή επιφάνεια. Όταν οι ινοβλάστες προστίθενται δύο κυτταρικές σειρές χτίσει ένα πιο συμπαγές microtissue με ένα κανονικό επιφάνεια.

Η

Όπως φαίνεται στο SEM εικόνες και ημίλεπτες τομές, κύτταρα Α549 σχηματίζουν τραχιά σφαιροειδή που μοιάζει με μια περισσότερο πολυστρωματικού ιστού και εμφανίζουν μια τραχιά επιφάνεια. Μετά από πέντε ημέρες microtissues δεν είχε σχηματιστεί πλήρως και πήρε εύκολα διαταράσσεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας συγκομιδής. Σε αντίθεση, όταν χρησιμοποιούνται σε συν-καλλιέργεια αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν σφιχτά σφαιροειδή με λείες επιφάνειες. Σε τμήματα ημίλεπτες ινοβλάστες μπορεί να ανιχνευθεί ως κύτταρα τα οποία έχουν μια επίπεδη μορφολογία διατεταγμένο κυρίως κοντά στην επιφάνεια των microtissues.

Κατά τη διάρκεια της μονοκαλλιέργειες Colo699 καλλιέργειας αποκαλύπτουν μία σφαιροειδή δομή με μια χαλαρή επιφάνεια. Όταν προστίθενται οι ινοβλάστες αυτά τα σφαιροειδή οικοδομήσουμε μια πιο συμπαγή σφαιροειδή με μια κανονική επιφάνεια. Όπως όλα τα κύτταρα είχαν την ίδια μορφολογία, όμως, τα καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες δεν μπορούσαν να διακριθούν σε ημίλεπτες τομές.

Σε αντίθεση με τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου, ινοβλάστες SV80 σχηματίζουν μικρές σφιχτό αναζητούν σφαιροειδή με λεία επιφάνεια όταν καλλιεργηθεί μόνος .

Όπως όλοι οι συν-καλλιέργειες έδειξαν μια πιο ομοιογενή επιφάνεια με ένα σφιχτό αρχιτεκτονική, αποφασίσαμε να εξετάσει αν και αυτό εξαρτάται από την παραγωγή της ECM των κυττάρων. Στο σχήμα 3 έχουμε αποδείξει ότι τα κύτταρα που παράγουν SV80 σημαντικά φιμπρονεκτίνης όταν καλλιεργηθεί από μόνοι τους, ενώ και οι δύο μονοκαλλιέργειες καρκινικού κυττάρου ήταν εντελώς αρνητικά για ινονεκτίνη. Σε Colo699 συν-καλλιέργειες ECM ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλη την microtissue. Ωστόσο, σε Α549 συν-καλλιέργειες φιμπρονεκτίνη εκκρίθηκε κυρίως από κύτταρα που δημιουργήθηκαν το δακτύλιο σαν δομή γύρω από τον εσωτερικό πυρήνα της microtissue.

Ινονεκτίνης επιδείχθηκε σε microtissues μετά από δέκα ημέρες. (Bar στο Α549 /SV80 μονοκαλλιέργειες: 50 μm, μπαρ σε όλα τα άλλα microtissues: 100 μm)? Έκκριση ινονεκτίνης θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε microtissues περιέχει ινοβλάστες, ενώ σε όλες τις μονοκαλλιέργειες των καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να ανιχνευθεί καμία έκκριση ινονεκτίνης.

Η

καμπύλης ανάπτυξης και της σταθερότητας των microtissues όγκου

Τρεις microtissues μονο . – και συν-καλλιέργειες αξιολογήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο και μετά από πέντε, επτά και δέκα ημερών microtissue υπολογίστηκαν όγκοι (Σχήμα 4Α)

Α: όγκοι Microtissue υπολογίστηκαν από τον τύπο V = 4/3 * π * R3, όπου r = ½ * √ d1 * d2. Οι μέσες όγκοι εμφανίζονται σε μm3 με τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις τους. Β: μέση και τυπική απόκλιση των Κί67 θετικότητας υπολογίσθηκε μετρώντας Κί67 πυρήνων θετικών και αρνητικών κυττάρων στις φέτες τριών διαφορετικών σφαιροειδή αντιπροσωπευτικό τρόπο. Στη συνέχεια, το ποσοστό των θετικών κυτταρικών πυρήνων σε ολόκληρο Cumber κυττάρου υπολογίστηκε. Συν-καλλιέργεια των δύο κυτταρικές σειρές όγκου με ένα κυτταρική γραμμή ινωδοβλάστου οδήγησε σε σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω (ρ & lt? 0,05). Έκφρασης Κί67 σε όλες microtissues

Η

Δεν ήταν δυνατόν να υπολογιστεί όγκους σφαιροειδές microtissues Α549 επειδή σε μονοκαλλιέργειες τα κύτταρα αυτά δεν σχηματίζουν στρογγυλό ή ελλειψοειδές σχήμα σφαιροειδή. Το ίδιο πρόβλημα εξελίχθηκε με τις συν-καλλιέργειες Α549 που μόνο άρχισαν να σχηματίζονται γύρω από μετρήσιμη σφαιροειδή μετά από πέντε ημέρες. Ως εκ τούτου, ο υπολογισμός πρώτος όγκος Α549 συν-καλλιέργειας έγινε κατά την ημέρα επτά, όπου ένας όγκος 63 μm

3 μετρήθηκε. Κατά τη διάρκεια των τριών ημερών ο όγκος αυτής της συγκαλλιέργειας αυξήθηκε σε 81 μm

3.

Colo699 μονοκαλλιέργειες εμφανίζεται μια συνεχή αύξηση του όγκου από 43 μm

3 έως στ 83 μm

3. Σε αντίθεση, Colo699 συν-καλλιέργειες έδειξαν όγκο των 74 μm

3 μετά από πέντε ημέρες, με τη μείωση του όγκου έως 39 μm

3.

Σε μονοκαλλιέργειες SV80 μια σταθερή όγκος των 33 μm

3 μετά από πέντε ημέρες έως 27 μm

3 μετά από δέκα ημέρες θα μπορούσε να παρατηρηθεί.

Τέλος, οι όγκοι microtissue συγκρίθηκαν μεταξύ τους με t-test του μαθητή. Μετά από δέκα ημέρες σημαντική αύξηση του όγκου θα μπορούσε να μετρηθεί σε Α549 συν-καλλιέργειες και μονοκαλλιέργειες Colo699 σε σύγκριση με είτε μονοκαλλιέργειες SV80 ή Colo699 συν-καλλιέργειες. Από την άλλη πλευρά, μετά από πέντε ημέρες, ο όγκος του Colo699 συν-καλλιέργειες είχαν σημαντικά υψηλότερο σε σύγκριση με Colo699 και μονοκαλλιέργειες SV80 (Σχήμα 4Α).

Για να διερευνηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, ένα APC αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ ) FACS δοκιμασία ιδρύθηκε. κύτταρα SV80 επωάζονται με CFSE πριν τη σπορά, έτσι βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και των ινοβλαστών θα μπορούσε να μετρηθεί ανεξάρτητα από τις διακρίσεις στον FACS αναλύσεις. Microtissues συλλέχθηκαν, πέψη με Accumax και επωάστηκαν με ΡΙ και αννεξίνης V APC. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα σύστημα BD FACS Calibur. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο της βιωσιμότητας των κυττάρων του 24 διαφορετικές microtissues μετράται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Για στατιστική αξιολόγηση t-test του φοιτητή χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα 5).

Οι ινοβλάστες επωάστηκαν με CFSE πριν αρχικώς σπορά τους μαζί με κύτταρα όγκου στο κρέμονται σταγόνες. Η απόπτωση μετρήθηκε είτε μετά από πέντε ή δέκα ημέρες. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο της βιωσιμότητας των κυττάρων, της 24ης σφαιροειδή και αντίστοιχη τυπική απόκλιση τους, που μετρήθηκαν σε δύο διαφορετικές εκτελέσεις (Σημαντικές διαφορές σημειώνονται με *, ρ & lt? 0,05). Dot κηλίδες αντιπροσωπεύουν το FACS αναλύσεις ένας γύρος που περιέχουν κύτταρα Α549 σε συν-καλλιέργεια με ινοβλάστες SV80 μετά από δέκα ημέρες καλλιέργειας. Α: Ειδικά βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε μονο-και συν-καλλιέργειες εμφανίζονται. Β: βιωσιμότητα της μοναχικής ινοβλαστών σε μονο-και συν-καλλιέργειες εμφανίζονται. C: Εμφανίζεται η κατανομή μεταξύ των ινοβλαστών και καρκινικών κυττάρων μετά από πέντε και δέκα ημέρες. D: Όλη η βιωσιμότητα microtissue εμφανίζεται μετά από πέντε και δέκα ημερών

Η

μονοκαλλιέργειες Α549 εμφανίζεται το 77% των βιώσιμων κυττάρων μετά από πέντε ημέρες, με ελάχιστη αύξηση της βιωσιμότητας μετά από δέκα ημέρες για να 79%.. Συν-καλλιέργειες με ινοβλάστες παρουσίασαν σημαντική αύξηση της βιωσιμότητας από 60% μετά από πέντε ημέρες σε 79% μετά από δέκα ημέρες. κύτταρα Colo699 εμφανίζεται το 93% των βιώσιμων κυττάρων μετά από πέντε ημέρες, χωρίς μείωση στην βιωσιμότητα σε 92% μετά από δέκα ημέρες. Στην συν-καλλιέργειες 82% των βιώσιμων κυττάρων επέμεινε μετά από πέντε ημέρες και το 76% μετά από δέκα ημέρες. Όταν βιωσιμότητα των κυττάρων SV80 αναλύθηκε, δείχθηκε μια μικρή αύξηση από 65% μετά από πέντε ημέρες σε 67% μετά από δέκα ημέρες. Ωστόσο, μια σημαντική μείωση της βιωσιμότητας από Colo699 μονοκαλλιέργειες σε Colo699 συν-καλλιέργειες θα μπορούσαν να παρατηρηθούν (σχήμα 5D).

Ως επόμενο βήμα, η βιωσιμότητα των δύο διαφορετικών κλασμάτων, τα καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες αναλύθηκαν από διακρίσεις τους με κυτταρομετρία ροής. Α549 καρκινικών κυττάρων σε συν-καλλιέργειες παρέμειναν βιώσιμα σε όλο το επώαση με βιωσιμότητα 74% μετά από πέντε ημέρες και το 71% μετά από δέκα ημέρες. Σε Colo699 συν-καλλιέργειες μπορεί να παρατηρηθεί μια αύξηση στην βιωσιμότητα από 78% μετά από πέντε έως 89% μετά από δέκα ημέρες, που δείχνει μια σημαντικά καλύτερη βιωσιμότητα σε σύγκριση με Α549 συν-καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα μετά από δέκα ημέρες (Σχήμα 5Α).

Μια παρόμοια παρατήρηση έγινε αναφορικά με τη βιωσιμότητα των ινοβλαστών στα microtissues. Όταν συν-καλλιεργείται μαζί με τα καρκινικά κύτταρα Α549, κύτταρα SV80 παρουσίασαν σημαντική αυξητική ρύθμιση της βιωσιμότητας από 46% μετά από πέντε ημέρες σε 71% μετά από δέκα ημέρες. Στα Colo699 συν-καλλιέργειες η βιωσιμότητα αυξήθηκε επίσης, αλλά δεν διαφέρουν σημαντικά μεταξύ του 70% μετά από πέντε έως 83% μετά από δέκα ημέρες. Ταυτόχρονα, θα μπορούσε να εμφανιστεί ένα σημαντικό καλύτερη βιωσιμότητα για ινοβλάστες όταν συν-καλλιεργείται μαζί με κύτταρα Colo699 μετά από πέντε ημέρες, σε σύγκριση με A540 συν-καλλιέργειες (σχήμα 5Β).

Επιπλέον, η αναλογία μεταξύ ινοβλαστών και καρκινικών κυττάρων σε συν-καλλιέργειες αναλύθηκε μετά από πέντε και δέκα ημέρες. Όταν συν-καλλιέργειες αναπτύχθηκαν στην κρέμονται πτώση, τα καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες πάντοτε σπάρθηκαν σε αναλογία 1:02 (2500 καρκινικά κύτταρα /5000 ινοβλαστών). Μετά από πέντε ημέρες σε αμφότερες τις συν-καλλιέργειες μπορεί να παρατηρηθεί μια σχεδόν ομοιόμορφη κατανομή μεταξύ ινοβλάστες και καρκινικά κύτταρα, που κυμαίνονται από 43% ινοβλάστες σε κύτταρα όγκου 57% στα Α549 συν-καλλιέργειες και 49% σε 51% στις Colo699 συν-καλλιέργειες. Ωστόσο, θα μπορούσε να εμφανιστεί Μετά από δέκα ημέρες σημαντικά περισσότερο καρκινικά κύτταρα από ινοβλάστες και στα δύο συν-καλλιέργειες. Σε Α549 συν-καλλιέργειες, 19% και Colo699 συν-καλλιέργειες 14% όλων των κυττάρων ταυτοποιήθηκαν ως ινοβλάστες (Σχήμα 5C).

οργάνωση κυττάρων και πρωτεϊνών πρότυπο έκφρασης

Μετά από επώαση Α549 και κύτταρα Colo699 μόνο του ή σε συν-καλλιέργεια με ινοβλάστες για πέντε και δέκα ημέρες, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν (εικόνα 5-7 /πίνακα 2). Βιμεντίνης επιλέχθηκε ως μια πρωτεΐνη που δείχνει μια μετατόπιση σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά σε επιθηλιακά κύτταρα. α-SMA έκφραση υποδηλώνει μια ακόμη πιο μεσεγχυματικά φαινότυπο των ινοβλαστών και αντανακλά μια μεσεγχυματικών να μεσεγχυματικά μετάβασης. Ε-καδερίνη, ένα επιθηλιακό πρωτεΐνη κυτταρικής πρόσφυσης επιλέχθηκε ως δείκτης για προσκολλημένα κύτταρα και Ki67 ως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και δείκτη ενεργοποίησης. Τρεις διαφορετικές σφαιροειδή αναλύθηκαν για κάθε χρώση των πρωτεϊνών και διαδοχικές φέτες ένα σφαιροειδές παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά εδώ (εικόνα 7-9)

μονοκαλλιέργειες (Α) Colo699 μετά από δέκα ημέρες.? (Β) Colo699 συν-καλλιέργειες μετά από δέκα ημέρες? ΫΑΡΙ (μπλε) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των κυτταρικών πυρήνων, φαλλοειδίνη Atto 633 (κόκκινο) για την ένδειξη F-ακτίνη και CFSE (πράσινο) ως κυτταροπλασματική χρώση για ινοβλάστες (Bar σε Α /Β: 50 μm). Οι ινοβλάστες μπορούν ακόμη να ανιχνευθεί σε microtissues μετά από πέντε ημέρες από την συγκαλλιέργεια με Colo699

Η

IHC φέτες Α549 σε μονο- και συν-καλλιέργειες μετά από πέντε και δέκα ημέρες (Bar στην AD:. 100 μm, μπαρ στην Εισαγωγή: 25 μm)? η αύξηση της βιμεντίνης και μια ταυτόχρονη μείωση στις Ε-καδχερίνη εμφανίζεται σε συν-καλλιέργειες. Επίσης εντοπίστηκε μια ρύθμιση προς τα άνω της έκφρασης Κί67 σε συν-καλλιέργειες

Η

IHC φέτες Colo699 σε μονο- και συν-καλλιέργειες μετά από πέντε και δέκα ημέρες (Bar στο A /C:. 50 μm, μπαρ στο B /D: 100 μm, μπαρ στο Insert: 25 μm)? Σε σύγκριση με τις μονοκαλλιέργειες Colo699 συν-καλλιέργειες σχηματίζονται πολύ μικρότερα σφαιροειδή. Ωστόσο, θετικές αντιδράσεις χρώση για Ε-καδερίνη και βιμεντίνη είναι συγκρίσιμες με τις μονοκαλλιέργειες στην περίοδο δέκα ημερών. Μετά από δέκα ημέρες, επειδή δεν υπάρχει διαφορά στον τρόπο διεξαγωγής χρώσης μεταξύ πέντε και δέκα ημερών ανιχνεύθηκε. Microtissues ήταν απολύτως θετικά για βιμεντίνη και Ki67, ενώ δεν παρατηρήθηκε έκφραση Ε-καδχερίνη και α-SMA

Η

IHC φέτες SV80 σε μονοκαλλιέργειες μετά από δέκα ημέρες (μπαρ σε μία: 100 μm).?