Αφηρημένο

Ιστορικό

TM4SF1 υπερεκφράζεται στο αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (PDAC) και επηρεάζει την ανάπτυξη αυτού του καρκίνου. Επίσης, η αντίσταση σε πολλά φάρμακα (MDR) συνδέεται γενικά με χημειοαντίσταση όγκων σε καρκίνο του παγκρέατος. Ωστόσο, ο συσχετισμός μεταξύ TM4SF1 και MDR παραμένει άγνωστη. Η έρευνα αυτή έχει ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση της TM4SF1 για αντίσταση γεμσιταβίνης σε PDAC και να διερευνήσει την πιθανή μοριακό μηχανισμό μεταξύ TM4SF1 και MDR.

Μέθοδοι

Η έκφραση της TM4SF1 αξιολογήθηκε σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές και ανθρώπινη παγκρεατική επιθηλιακά αγωγού (HPDE) κυτταρικές γραμμές με ποσοτική RT-PCR. TM4SF1 siRNA επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο επιμόλυνσης Hiperfect να γκρεμίζω TM4SF1. Τα μεταγραφήματα αναλύθηκαν με ποσοτική RT-PCR, RT-PCR και κηλίδωση Western για περαιτέρω μελέτη. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και την απόπτωση λήφθηκαν για τη διερεύνηση της ευαισθησίας σε γεμσιταβίνη παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων μετά την φίμωση TM4SF1

in vitro

. Αποδείξαμε ότι κύτταρο σηματοδότηση του TM4SF1 μεσολάβηση χημειοαντίσταση σε καρκινικά κύτταρα με την αξιολόγηση της έκφρασης της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) γονιδίων χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR.

In vivo

, χρησιμοποιήσαμε ορθοτοπικό μοντέλα παγκρεατικού όγκου να διερευνηθεί το αποτέλεσμα του πολλαπλασιασμού μετά την φίμωση TM4SF1 από ένα φακοϊό μεσολάβηση shRNA σε MIA κυτταρικές σειρές PaCa-2.

Αποτελέσματα

Η έκφραση mRNA του TM4SF1 ήταν υψηλότερη σε επτά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές από ό, τι σε κυτταρικές σειρές HPDE. Σε τρεις κυτταρικές γραμμές γεμσιταβίνη ευαίσθητα (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86), η έκφραση του TM4SF1 ήταν χαμηλότερη από ότι σε τέσσερις κυτταρικές σειρές γεμσιταβίνη ανθεκτικές (ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1, Hs766T, AsPC- 1). Αξιολογήσαμε ότι TM4SF1 ήταν ένας υποθετικός στόχος για αντίσταση gemcitabine σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1, ερευνήσαμε ότι TM4SF1 φίμωση πολλαπλασιασμός προσβεβλημένο κύτταρο και αύξησε τα ποσοστά κυτταρικής απόπτωσης που διαμεσολαβείται από κατεργασία με γεμσιταβίνη σε σύγκριση με κύτταρα τα οποία υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρνητικό έλεγχο. Αυτή η αντίσταση συσχετίστηκε με την έκφραση των γονιδίων αντοχής πολυφαρμάκου συμπεριλαμβανομένων ABCB1 και ABCC1.

In vivo

, αποσιώπηση των TM4SF1 σε ΜΙΑ κυτταρικές σειρές PaCa-2 αύξησε την αποτελεσματικότητα της θεραπείας γεμσιταβίνης που βασίζονται σε ορθοτοπική μοντέλα παγκρεατικού όγκου αξιολογήθηκε με τη χρήση μη επεμβατικής απεικόνισης βιοφωταυγείς.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι TM4SF1 είναι ένα αντιγόνο μεμβράνης επιφάνειας που εκφράζεται υψηλά σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και αυξάνει τη χημειοαντίσταση να gemcitabine. Έτσι, TM4SF1 μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο στόχο να ξεπεραστεί η χημειοαντίσταση του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Cao J, Yang J, Ramachandran V, Arumugam Τ, Ντενγκ D, Li Ζ, et al. (2015) TM4SF1 Προωθεί Γεμσιταβίνη Αντίσταση καρκίνο του παγκρέατος

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 10 (12): e0144969. doi: 10.1371 /journal.pone.0144969

Συντάκτης: James Freeman, Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστημών Υγείας Ctr, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 26 Αυγούστου, 2015? Αποδεκτές: 25, Νοεμβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Δεκ 2015

Copyright: © 2015 Cao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το ΝΙΗ-DK05207 (σε CD Logsdon), Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης Πυρήνας CA016672 επιχορήγησης (σε UT MD Anderson Cancer Κέντρο), το Lockton Κληροδότημα (σε CD Logsdon), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, 81301826 (σε Jia Cao)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η πιο επιθετική ανθρώπινη κακοήθεια με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας [1]. Το μέσο ποσοστό 5ετούς επιβίωσης των ασθενών που διαγιγνώσκονται με PDAC είναι 7,1% και η μέση διάρκεια επιβίωσης είναι μικρότερη από 6 μήνες [2, 3]. Από στερείται της πρώιμης ειδικά συμπτώματα, η πλειοψηφία των ασθενών διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια. Η χημειοθεραπεία με τη χρήση gemcitabine θεωρείται ως θεραπεία πρώτης γραμμής για τοπικά προχωρημένο και μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος να παρατείνει το χρόνο επιβίωσης και βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών [4]. Ωστόσο, το υψηλό ποσοστό της αντίστασης σε γεμσιταβίνη μειώνει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου [5]. Έτσι, η αποτελεσματική χημειοθεραπευτική μέθοδοι εξακολουθούν να χρειάζονται επειγόντως να βελτιώσουν την έκβαση αυτού του καρκίνου.

Η πολυανθεκτικότητα (MDR) χαρακτηρίζεται από διασταυρούμενη ανθεκτικότητα σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα με τις περιοχές-στόχους [6]. Τα κύριους μηχανισμούς της γεμσιταβίνης χημειοαντίσταση σχετίζονται με την πρόσληψη του φαρμάκου, το μεταβολισμό και τη δράση [4]. Ένας από τους κοινούς λόγους να οδηγήσουν σε MDR σε καρκινικά κύτταρα είναι μέσω υπερεκφράζουν τον τριφωσφορική αδενίνη (ΑΤΡ) -σύνδεση κασέτας (ABC) μεταφορείς. Αυτές οι μεταφορείς να συμβάλει στην MDR μέσω επαγωγής της αντιαποπτωτικών μηχανήματα, αυξάνοντας την ενδοκυτταρική εκροής φαρμάκου και μείωση των συγκεντρώσεων του φαρμάκου [7]. Πρόσφατα, μελέτες έχουν δείξει ότι η γεμσιταβίνη αντίσταση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα συνδέεται με την έκφραση του MDR [8,9]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να αναστέλλουν αυτές τις μεταφορείς για την αποκατάσταση της ευαισθησίας σε χημειοθεραπευτικούς αντίσταση στον καρκίνο του παγκρέατος.

TM4SF1 είναι ένα μέλος της οικογένειας των τεσσάρων διαμεμβρανικών επικρατειών με μια τοπολογία τετρασπανίνη και ομολογία αλληλουχίας με IL-ΤΜΡ, TM4SF5, L6D, OCTM4 και TCCE518. Τα επίπεδα έκφρασης του TM4SF1 αυξήθηκε σε διάφορα επιθηλιακά καρκινώματα του ανθρώπου συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του μαστού, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του προστάτη και νεφρικών καρκινωμάτων [10-12]. Παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της αγγειογένεσης των όγκων, την κινητικότητα, τη μετανάστευση και εισβολή [13, 14]. Είναι σημαντικό ότι, πρόσφατα μελέτη έχει δείξει ότι TM4SF1 στόχευση αντισώματος Drug Conjugates αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικό μέσο έναντι καρκινικών κυττάρων και την αγγείωση του όγκου [15]. Έτσι, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο TM4SF1-υπερεκφράζουν τα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που αφορούν στην αντίσταση γεμσιταβίνη και να οριοθετηθούν το μηχανισμό.

Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν TM4SF1 θα μπορούσε να προσδώσει τον καρκίνο του παγκρέατος με την ικανότητα να γεμσιταβίνης resistance.We διαπιστώθηκε ότι ήταν ιδιαίτερα TM4SF1 εκφράζεται σε γεμσιταβίνης-αντίσταση παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Φίμωση της TM4SF1 αύξησε την γεμσιταβίνη ευαισθησία στη χημειοθεραπεία κυττάρων και μείωσε την έκφραση της ABCB1 και ABCC1

in vitro

.

In vivo

, κύτταρα που στερούνται TM4SF1 είχε μειωθεί παγκρέατος ανάπτυξη του όγκου και την αύξηση της ανταπόκρισης σε θεραπείες με γεμσιταβίνη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TM4SF1 θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω ως πιθανός στόχος για παγκρέατος θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Φάρμακα και Αντιδραστήρια

Η γεμσιταμπίνη αγοράστηκε από την Eli Lilly and Co (Indianapolis, ΙΝ). Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA), εκτός εάν ορίζεται παρακάτω.

Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Οι ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές HS766T, MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, BxPC-3, L3.6PL και SU.86.86 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). BxPC-3 και AsPC-1 κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται σε περιβάλλον RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου σε επωαστήρα 37 ° σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2, ενώ όλες οι άλλες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle που μέσο, ​​Human παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα πόρου (HPDE) [16] από τον Dr. Tsao (University of Toronto) καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού. Οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από ΑΤΟΟ και επικυρώνονται από μικρή διαδοχική επανάληψη προφίλ και περάστηκαν στο εργαστήριο μας για λιγότερα από 6 μήνες μετά την παραλαβή ή την ανάνηψη.

Ποσοτική πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και HPDE, και η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Το RNA χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική μεταγραφής πολυμεράσης ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης αντίστροφης. Real-time αλυσίδα μεταγραφή-αντίδραση πολυμεράσης ποσοτική αντίστροφη διεξήχθη με SYBR πράσινο ως το tag χρησιμοποιώντας ένα iCycler. (Bio-Rad) .Sequence από τους εκκινητές είναι διαθέσιμη κατόπιν αιτήματος

Αντίστροφη μεταγραφή PCR ανάλυση

PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια PCR Kit (Promega) με το ακόλουθο πρόγραμμα ενίσχυσης:. Προ- μετουσίωση για 3 λεπτά στους 94 ° C, μετουσίωση επί 30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, ανόπτηση για 30 sec στους 60 ° C, επέκταση επί 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C, και ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 72 ° C για 10 λεπτά. PCR διεξήχθη για 30 κύκλους. Μετά από PCR, 5 μΙ PCR προϊόντων έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% και κατέστησαν ορατά με σχετική πυκνομετρία pixel.

Παροδική διαμόλυνση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2, και τα κύτταρα PANC-1 απλώθηκαν σε πιάτα 100 mm και παροδικά επιμολυσμένα με τον έλεγχο μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA [siControl]) και TM4SF1 siRNA (siTM4SF1) σε τελικές συγκεντρώσεις 10 nmol /L με αντιδραστήριο Hiperfect διαμόλυνσης (QIAGEN). Η αλληλουχία siRNA που στοχεύει TM4SF1 ήταν AAGGACCACTATGTCTTGATT. mRNAs απομονώθηκαν από AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κύτταρα για την ποσοτική RT-PCR μετά από 48 ώρες.

κηλίδωση Western ανάλυση

Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται με RIPA ρυθμιστικό συμπληρωμένο με 1% PMSF επί 30 λεπτά. Κάθε εκχύλισμα που περιέχει πρωτεΐνη 50μg διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα για 3 ώρες, στη συνέχεια επωάζονται με κουνελιού αντι-TM4SF1 (Abcam, αραίωση 1: 1000) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένο αντίσωμα IgG αίγας αντι-κουνελιού για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με χρήση του ECL (Millipore) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για την οπτικοποίηση των εικόνων.

ανάπτυξη σταθερών βραχείας φουρκέτας RNA-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν

Η σίγαση του TM4SF1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γραμμές επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας βραδέος μόλυνση. Λεντοϊών φορείς πλασμιδίου που περιέχουν-ελέγχου και TM4SF1 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA? Open Biosystems) συν-επιμολύνθηκαν με φορείς συσκευασίας και το φακοϊό παρήχθη σε κύτταρα 293Τ μέσω διαμόλυνσης ασβεστίου όπως περιγράφεται προηγουμένως [17] .TM4SF1 shRNA που περιέχουν φορείς τιτλοποιήθηκαν, και ΜΙΑ PaCa-2 μολύνθηκε με 25 μL του ιικού υπερκειμένου /ανά χιλιοστόλιτρο μέσου αναμιγνύεται με πολυβρένιο (μέσο 4 μg /mL). Τα κύτταρα στη συνέχεια επιλέγονται ανάλογα με την αντοχή τους σε πουρομυκίνη (1-3 μg /mL). Σταθερό παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά αναπτύχθηκε στη συνέχεια.

Διάδοση δοκιμασία

Εμείς που χρησιμοποιούνται δοκιμασία MTS για να εξετάσει τα αποτελέσματα της γεμσιταβίνης μετά την φίμωση TM4SF1 στον πολλαπλασιασμό των AsPC-1, Mia PaCa-2 και PANC -1 κυτταρικές γραμμές. Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε μία πλάκα 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο siRNA ή siTM4SF1. 24h μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 1500 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη για 48h, 15μL του διαλύματος MTS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. αριθμοί κυττάρων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την φωτομετρική ανάγνωση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18,19].

μελέτη απόπτωση χρησιμοποιώντας ανάλυση ταξινόμησης κυττάρων φθορισμού που ενεργοποιείται

in vitro

Η

Σε προηγούμενη μελέτη βρήκαμε τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 ήταν ανθεκτικά σε γεμσιταβίνη

in vitro

[19]. Τυπική χρώση ιωδιούχου προπιδίου των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος με τη μέθοδο της υποτονικής λύσης χρησιμοποιήθηκε για μελέτες απόπτωσης με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS). AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κύτταρα παροδικώς επιμολυσμένα με siControl ή siTM4SF1 για 24 ώρες σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων. Η απόπτωση προκλήθηκε σε κύτταρα με κατεργασία τους με γεμσιταβίνη (1, 5 ή 10 μmol /L) για 48 ή 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη, σταθεροποιήθηκαν με 70% ψυχρή αιθανόλη, αναμίχθηκε με 500 μι ενός υποτονικού διαλύματος (0,1% κιτρικό νάτριο, 0,1% Triton Χ-100, 20 μg /ml RNase, και 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου) , επωάστηκαν για 30 λεπτά και αναλύθηκαν μέσω κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα σύστημα EPICS-ΧΟ (Beckman Coulter). Κύτταρα που υφίστανται απόπτωση λόγω του κατακερματισμού του DNA εντοπίστηκαν καθώς ο πληθυσμός των κυττάρων με περιεχόμενο υπο-G1 DNA.

Ζώα και μελέτη της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

Η

Αυτή η μελέτη διεξήχθη από αυστηρά σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Η χρήση των ποντικών εγκρίθηκε από Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση του Κέντρου MD Anderson Cancer.

κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 τροποποιήθηκαν ώστε να εκφράζουν σταθερά ένα γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας μέσω λεντοϊού επιμόλυνσης [20]. Το ογκογόνο ικανότητα του TM4SF1 shRNA-σιγήσει κύτταρα συγκρίθηκε με εκείνη του ελέγχου shRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων που σχηματίστηκαν σε 5-εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών ηυ /ηυ. 28 γυμνά ποντίκια ηυ /ηυ χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (ομάδα 1, shCtrl? Ομάδα 2, shCtrl + GEM? Ομάδα 3, shTM4SF1? Ομάδα 4, shTM4SF1 + GEM). Όλα τα ζώα δόθηκαν στείρα τροφή και σε αυτόκαυστο νερό σε καθημερινή σκοτεινό κύκλο φωτός /12-ωρών 12 ωρών. κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 επιμολύνθηκαν σταθερώς με shTM4SF1 ή τον έλεγχο shRNA. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια αυξήθηκε σε 80% συρροή και συλλέχθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν μία φορά σε PBS, και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 5 × 10

6 κύτταρα /ml. εναιωρήματα κυττάρων (50 μΙ έκαστο) εγχύθηκαν μέσα στα παγκρέατα επτά ποντικοί ανά ομάδα δοκιμής. Μετά από μία εβδομάδα, οι ποντικοί υπέστησαν αγωγή με ή χωρίς γεμσιταβίνη (100 mg /kg σωματικού βάρους). Η ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγειας και η επιβίωση των ζώων καταγράφηκε. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν κάθε εβδομάδα για οποιαδήποτε συμπτώματα και σημεία. Μετά από 7 εβδομάδες δύο ποντικοί είχαν τα σημάδια της δύσπνοιας και μη φυσιολογική κίνηση και ένας από τους όγκους ξεπεράστηκε 15% μάζας σώματος. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν σε αναισθησία με ισοφλουράνιο ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση και το πάγκρεας κάθε ποντικιού αφαιρέθηκε. Επίσης, οι όγκοι ζυγίστηκαν.

Η απεικόνιση βιοφωταύγειας διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κρυογονικά ψυχόμενο σύστημα απεικόνισης σε συνδυασμό με έναν υπολογιστή απόκτησης δεδομένων εκτελεί το πρόγραμμα λογισμικού Living εικόνας (Xenogen). Πριν από την απεικόνιση, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν σε ένα ακρυλικό θάλαμο με 1.5% ισοφλουράνης μίγμα /αέρα και εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά με 15 mg κάλιο άλας /mL λουσιφερίνης σε PBS σε μια συγκέντρωση 150 mg /kg σωματικού βάρους. εικόνες ζώων ψηφιακή graysclae αποκτήθηκαν, η οποία ακολουθήθηκε από την απόκτηση και την επικάλυψη μιας εικόνας ψευδοχρωμάτων που αντιπροσωπεύει τη χωρική κατανομή των φωτονίων ανιχνεύεται αναδυόμενες από την ενεργό λουσιφεράσης σε κάθε ζώο. ένταση του σήματος ήταν ποσοτικοποιηθεί ως το άθροισμα όλων των εντοπιστεί φωτόνια εντός της περιοχής ενδιαφέροντος ανά δευτερόλεπτο.

μελέτης πολλαπλασιασμός των κυττάρων χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων

in vivo

Η

Ανάλυση παγκρεατικής πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων στον ιστό του όγκου διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα διαθέσιμο στο εμπόριο πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) κιτ (Jackson ImmunoResearch) όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [21]. Παραφίνη-embedded τμήματα του ιστού του όγκου σε επεξεργασία με και χωρίς gemcitabine αναλύθηκαν για πολλαπλασιασμό. Ανοσοϊστοχημική λεκέδες από τα τμήματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus. Εικόνες από τις ενότητες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παγωμένο κάμερα σύζευξης φορτίου συσκευή (Photometrics) και το έξυπνο πρόγραμμα λογισμικού Capture (Digital Scientific). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των γεγονότων πολλαπλασιασμό, τα αποτελέσματα χρώσης αξιολογήθηκαν από μία παθολογική επιστήμονας (Δρ Henry Wang).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα

in vitro

πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και διεξάγεται τρεις ή περισσότερες φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο από ανεξάρτητα πειράματα (± τυπικό σφάλμα [SE]). Στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Kruskal-Wallis ή δίπλευρη unpaired Student t-test, Dunnett πολλαπλής σύγκρισης τεστ και Mann-Whitney U. επίπεδα Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

TM4SF1 εκφράζεται έντονα σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Σε προηγούμενες μελέτες χαρακτηρισμού, η έκφραση mRNA TM4SF1 ανυψώθηκε σε παγκρεατικά όγκους και καρκινικές κυτταρικές γραμμές [22]. Και η μελέτη διαπίστωσε ότι οι τέσσερις κυτταρικές σειρές (BxPC-3, SU86.86, CFPAC-1, L3.6pl) ήταν ευαίσθητη και πέντε κυτταρικές σειρές (PANC-1, Hs766T, ΜΙΑ PaCa-2, AsPC-1, Mpanc96) ήταν ανθεκτικά σε γεμσιταβίνη με βάση 50% αναστολή της ανάπτυξης [19]. Ερευνήσαμε περαιτέρω έκφραση TM4SF1 mRNA σε επτά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές και τα κύτταρα HPDE. Ποσοτική RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι όλα τα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές καρκίνου εκφράζονται από TM4SF1 σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα HPDE. Η έκφραση του mRNA του TM4SF1 σε τέσσερις κυτταρικές σειρές γεμσιταβίνη ευαίσθητα (ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1, Hs766T, AsPC-1) ήταν υψηλότερη από ότι σε τρεις κυτταρικές γραμμές γεμσιταβίνη ανθεκτικές (L3.6pl, BxPC-3, SU86. 86) (Εικόνα 1).

ποσοτική ανάλυση RT-PCR είχε σαν αποτέλεσμα σχετικά με την έκφραση του mRNA σε TM4SF1 lines.TM4SF1 mRNA ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένη σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές από ό, τι στα κύτταρα HPDE. Η έκφραση mRNA του TM4SF1 ήταν χαμηλότερη σε τρεις κυτταρικές γραμμές γεμσιταβίνη ευαίσθητα (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86) από ότι σε τέσσερις κυτταρικές σειρές γεμσιταβίνη ανθεκτικές (ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1, Hs766T, AsPC- 1).

η

TM4SF1 σίγηση ενισχύει την ευαισθησία των gemcitabine

Για να διερευνηθεί ο λειτουργικός ρόλος του TM4SF1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, μπορούμε παροδικά επιμολυσμένα AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2, και PANC-1 κύτταρα με siControl και siTM4SF1 και επιβεβαίωσε αποσιώπηση του TM4SF1 στα κύτταρα χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR, RT-PCR και κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α και S1 Σχήμα) .Για να αξιολογήσει τις επιδράσεις της TM4SF1 στην επιβίωση των κυττάρων και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία, υποβάλλαμε σε αγωγή ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1 και AsPC-1 κύτταρα, όλα εκ των οποίων εκφράζουν υψηλά επίπεδα TM4SF1 εγγενώς, με διάφορες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης παρουσία είτε siControl ή siTM4SF1. MTS αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η ικανότητα πολλαπλασιασμού ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα siTM4SF1 από ότι στα κύτταρα siControl μετά την αγωγή με γεμσιταβίνη (Σχήμα 2Β). Επίσης, αποσιώπηση TM4SF1 αύξησε την αποπτωτική απόκριση σε θεραπεία με γεμσιταβίνη με προηγούμενη συγκέντρωση (1, 5 ή 10 μmοl /L) σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές [19] (Σχήμα 2C).

(Α) Ποσοτική RT- PCR και κηλίδωση Western κατέδειξε την αποσιώπηση του TM4SF1 σε AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών. Οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν παροδικά με siControl ή siTM4SF1, και το mRNA απομονώθηκε από αυτούς μετά από 48 ώρες και η πρωτεΐνη απομονώθηκε μετά από 72 ώρες. (Β) AsPC-1, κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας MTS έδειξε ότι η ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων siTM4SF1 ήταν χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων siControl μετά την αγωγή με γεμσιταβίνη. (Γ) Μετά από 72 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων με το περιεχόμενο DNA υπο-G0 /G1 ταυτοποιήθηκε μέσω FACS. TM4SF1 σίγηση οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων στην αγωγή με gemcitabine, με αποτέλεσμα την αύξηση των ποσοστών της απόπτωσης. (Στήλες, μέσα για τρία πειράματα?. Ράβδοι, τυπική απόκλιση * Ρ & lt?. 0,05 έναντι μάρτυρα).

Η

TM4SF1 ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

Η πολυανθεκτικότητα (MDR) γονίδια συμβάλλουν στην γεμσιταβίνης ευαισθησία σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η ABCB1, ABCC1, ABCC3 και ABCC5 είναι καλά χαρακτηρισμένα γονίδια MDR. Σε AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών, οι εκφράσεις mRNA του ABCB1 και ABCC1 μειώθηκαν σημαντικά μετά την φίμωση TM4SF1 χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR (Σχήμα 3).

Δεδομένα

Ποσοτική RT-PCR δείχνοντας φορές μεταβολές στο επίπεδο του mRNA του ABCB1 και ABCC1 γονιδίων μετά την φίμωση TM4SF1 σε AsPC-1, MIA κυτταρικές σειρές PaCa-2 και PANC-1.

η

TM4SF1 σίγηση αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος σε γεμσιταμπίνη που προκαλείται από την ανάπτυξη

in vivo

η

Για να αναλυθεί περαιτέρω η επίδραση της TM4SF1

in vivo

, εμείς επιμολυσμένα ΜΙΑ PaCa-2 έχουν σχετικά υψηλά επίπεδα ενδογενούς έκφρασης TM4SF1 με shRNA κατασκευάζει να μειώσει σταθερά έκφραση TM4SF1. Επαληθεύσαμε shRNA σίγηση χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western και παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του mRNA TM4SF1 μειώθηκε κατά περισσότερο από 80% με shTM4SF1 # 1 (Σχ 4Α). Στη συνέχεια, αναλύσαμε τα αποτελέσματα του σταθερώς φίμωση TM4SF1 επί παγκρεατικών όγκων αναπτυχθεί σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. Ορθοτοπική όγκοι αναπτύχθηκαν με MIA κύτταρα PaCa-2 που εκφράζουν σταθερά shControl ή shTM4SF1 και παρακολουθήθηκαν με τη χρήση μη επεμβατική απεικόνιση βιοφωταύγειας. Τα κύτταρα που στερούνται TM4SF1 ανέπτυξαν όγκους σε παρόμοια έκταση ως έλεγχοι. Ωστόσο, η θεραπεία γεμσιταβίνη είχε σχεδόν καμία επίδραση επί των shControl επιμολυσμένα ομάδες αυτών των εξαιρετικά γεμσιταβίνης-ανθεκτικά κύτταρα, αλλά μετά την φίμωση TM4SF1 σε αυτά τα κύτταρα, η θεραπεία με βάση το gemcitabine οδήγησε σε αισθητά χαμηλότερο όγκοι του όγκου (Σχήμα 4Β). Υποστήριξη της ευαισθητοποίησης των κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 σε θεραπεία με γεμσιταβίνη με αποσιώπηση του TM4SF1, PCNA ανάλυση (Σχήμα 4C) έδειξε αισθητά χαμηλότερο πολλαπλασιασμό των ιστών με σιγήσει TM4SF1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη από εκείνη όλων των άλλων ιστών (Πίνακας 1).

Ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western έδειξε την αποσιώπηση του TM4SF1 σε ΜΙΑ PaCa-2 σταθερά επιμολυσμένα με shControl ή shTM4SF1. (Β) Οι όγκοι που προκαλούνται από κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζουν σταθερά shControl ή shTM4SF1 και εκφράζουν το γονίδιο λουσιφεράσης που αναπτύχθηκε σε γυμνά ποντίκια. Στο τέλος του πειράματος, τα ζώα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας bioluminescent απεικόνισης. Βάρη όγκων που διεγείρονται από κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζουν σταθερά shRNA με ή χωρίς γεμκιταβίνη (100 mg /kg) της θεραπείας σε γυμνούς βάρη mice.The όγκου (ζ) του shCtrl, shCtrl + GEM, shTM4SF1 και shTM4SF1 + GEM ήταν 0,934 ± 0,132, 0.792 ± 0.101, 0.750 ± 0.149 και 0.398 ± 0.080. TM4SF1 σίγηση με gemcitabine οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα βάρη όγκων σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου (* Ρ & lt? 0,05). (C)

In vivo

πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με PCNA προσδιορισμού σε τομές παραφίνης από shControl και shTM4SF1 ζώα που θεραπεύτηκαν με γεμσιταβίνη. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα σε μεγέθυνση × 200 δείχνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φαίνεται.

Η

Συζήτηση

Τόσο η μετάσταση και χημειοαντίσταση συσχετίστηκαν με μειωμένη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο. Έρευνες ερευνηθεί ότι TM4SF1 ως τετρασπανίνη διασχίζει τη μεμβράνη μπορεί να συνδέεται με το τετρασπανίνη εμπλουτισμένο microdomanin (TERM) επί της μεμβράνης του πλάσματος, παίζουν ρόλους στην οργάνωση της ακεραιότητας των υποδοχέων μεμβράνης, συμπεριλαμβανομένων ιντεγκρίνες να επηρεάσουν την κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση και η μετάσταση. TM4SF1 επίσης βρίσκεται σε ενδοκυτταρικά κυστίδια και είχε ως στόχο έως τα τέλη του ενδοκυτταρικά οργανίδια μέσω μιας βιοσυνθετικής οδού για να επηρεάσουν την κυτταρική κινητικότητα [13, 23]. Η ανοσοθεραπεία L6 αντίσωμα που βασίζεται επιτευχθεί μερική ύφεση σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Αρκετές έρευνες έδειξαν ότι TM4SF1 υπερεκφράστηκε σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του αγγειακού ενδοθηλίου και TM4SF1-αντίσωμα επιλεκτικά στοχεύουν στο αίμα καρκινικά ενδοθηλιακά σκάφος κύτταρα και τα κύτταρα του όγκου με μικρή τοξικότητα. TM4SF1 επηρεάζονται αγγειακή ωρίμανση και αλληλεπιδρά με ιντεγκρίνες να επάγει μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου [24-27]. ομάδα Jaminet του διερευνώνται νέες μεθόδους για την από κοινού αντισώματα όπως 8G4 με κυτταροτοξικά φάρμακα μπορεί να αναμένεται για τη θεραπεία με όγκου και την αγγειογένεση των όγκων [28]. Η προηγούμενη έρευνα αποκάλυψε ότι TM4SF1 συμμετείχε στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος και ανέστειλε κύτταρα μετανάστευση και εισβολή [29, 30]. Ωστόσο, ήταν άγνωστο αν TM4SF1 συνέβαλε στην χημειοαντίσταση της γεμσιταβίνης σε PDAC.

Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στο ρόλο του TM4SF1 σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα παρατηρώντας τις επιδράσεις της αποσιώπησης αυτό το γονίδιο επί του χημειοθεραπευτικού παράγοντα

in vitro

και

in vivo

. Στη μελέτη μας, υπό την προϋπόθεση ότι τα στοιχεία βάσει TM4SF1 ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε παγκρεατικά κυτταρικές γραμμές από ό, τι σε φυσιολογικά παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα (HPDE) και αντοχή γεμσιταβίνη σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να προκύψουν από την έκφραση του TM4SF1. Αποσιώπηση TM4SF1 μείωσε την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τα κύτταρα ενισχυμένη απόπτωση και εν μέρει ανέτρεψε την χημειοαντίσταση της γεμσιταβίνης σε AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών. Προηγούμενη εργασία διερευνήθηκε ότι χημειοαντίσταση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ήταν μέσω ρυθμίζουν τις εκφράσεις των γονιδίων MDR, συμπεριλαμβανομένων ABCB1, ABCC1, ABCC3 και ABCC5 [9]. Έτσι, έχουμε αξιολογηθεί κατά πόσο TM4SF1 που προκαλείται από τις εκφράσεις των γονιδίων MDR να επηρεάσει γεμσιταβίνη ευαισθησία σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Μετά την φίμωση TM4SF1, τις εκφράσεις των δύο μεταφορέων ABC (ABCB1, ABCC1) γονίδια μειώθηκε σημαντικά σε AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2, και τα κύτταρα PANC-1, το οποίο προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία ότι TM4SF1 μπορούν να συσχετιστούν με τα γονίδια MDR να ρυθμίσει την αντίσταση γεμσιταβίνη.

In vivo

, ορθοτοπικό όγκοι αναπτύχθηκαν με κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζουν shControl ή shTM4SF1 στις ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια, τα οποία παρακολουθήθηκαν με τη χρήση μη επεμβατική απεικόνιση βιοφωταύγειας. Βρήκαμε ότι φίμωση TM4SF1 θα μπορούσε να ενισχύσει την ευαισθησία των κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 σε γεμσιταβίνη επαγόμενη ανάπτυξη. Επίσης, η ανάλυση PCNA έδειξε ότι ο πολλαπλασιασμός των ιστών τόσο με σιγήσει TM4SF1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη ήταν χαμηλότερη από εκείνη όλων των άλλων ιστών. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι TM4SF1 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος χημειοαντίσταση για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Εδώ, έχουμε την προϋπόθεση πρώτη απόδειξη ότι TM4SF1 μεσολάβηση αντίσταση γκεμσιταμπίνης μέσω ρύθμισης MDR έκφραση γονιδίων. Μελέτες βρέθηκε ότι τα γονίδια MDR επάγεται καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν χημειοαντίσταση μέσω επηρεάζουν την εκροή των αντικαρκινικών φαρμάκων από κύτταρα και μειώνοντας ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου [31]. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να καταβληθούν περισσότερες προσπάθειες για να ξεπεραστούν MDR και να διερευνήσουν νέες μοριακές θεραπείες, όπως η γονιδιακή θεραπεία. Στον καρκίνο του παγκρέατος, έρευνες έδειξαν ότι η MDR πρωτεΐνες που εκφράζονται συχνά και επηρεάζονται ευαισθησία χημειοθεραπεία και όφελος σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος [32-34]. Μια άλλη έρευνα έδειξε ότι το gefitinib ανέτρεψε την έκφραση του MDR και να αποκατασταθεί χημειοευαισθησία της αντίστασης στην BxPC-3 κυτταρικές σειρές μέσω RAF1 /ERK μονοπάτι σηματοδότησης [35]. MUC1 ήταν δεσμευμένη σε μεμβράνη γλυκοπρωτεΐνη η οποία υπερεκφράζεται σε PDAC να αυξήσει χημειοαντίσταση της γεμσιταβίνης και ετοποσίδης. Στο μηχανισμό, MUC1 επαγόμενη την έκφραση ABCC1 μέσω ΑΚΤ ανεξάρτητο σηματοδότησης και ιδιαίτερα αυτό είχε άμεση σχέση με την περιοχή υποκινητή του γονιδίου ABCC1, υποδεικνύοντας ότι MUC1 μπορεί να δρα ως μεταγραφικός ρυθμιστής [9] .Further ρυθμιστικού μηχανισμού του TM4SF1 και MDR θα μπορούσαν να μελετηθούν στην αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε PDAC.

Επιπλέον, TM4SF5, ένα άλλο μέλος της οικογένειας των τεσσάρων διαμεμβρανικών επικρατειών, παρατηρήθηκε ότι εκφράζεται υψηλά σε ανθρώπινους ιστούς και τα κύτταρα του καρκίνου του ήπατος. Μελέτες στο εν λόγω καρκίνος πρότεινε ότι θα μπορούσε να ενισχύσει TM4SF5 ρ27

έκφραση Kip1 και φωσφορυλίωση και να οδηγήσει σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) να διαμεσολαβεί ογκογένεση, τη μετάσταση και την αντίσταση gefitinib [36-39]. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να κατανοήσουν τις σχέσεις μεταξύ των διαφόρων μελών της οικογένειας τεσσάρων διαμεμβρανικών τομέων.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας περιέγραψαν ότι αποσιώπηση της TM4SF1 ευαισθητοποιημένων καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μέσω ρύθμισης προς τα κάτω ABCB1 και ABCC1 να σκοτώσει από αγωγή με γεμσιταβίνη μπορεί να έχει ιδιαίτερη σημασία μεταφραστικής. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης TM4SF1 μπορεί να είναι κλινικό όφελος σε παγκρεατικά θεραπεία του καρκίνου. Οι μελλοντικές προσπάθειες θα πρέπει να αφιερωθεί στην κατανόηση των μηχανισμών και των οδών που εμπλέκονται στα αποτελέσματα της έκφρασης TM4SF1 για χημειοαντίσταση του καρκίνου του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. RT-PCR αποτελέσματα της ανάλυσης αποδεικνύουν την αποσιώπηση του TM4SF1 σε AsPC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών.

Οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν παροδικά με siControl ή siTM4SF1, και το mRNA απομονώθηκε από αυτούς μετά από 48 ώρες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0144969.s001

(PDF)