Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος του για τους άνδρες στον ανεπτυγμένο κόσμο. Ανδρογόνων οδού του υποδοχέα σηματοδότησης παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι microRNA miR-124 ασκεί μια λειτουργία καταστολής όγκου στον καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ AR και miR-124 είναι ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ των AR και miR-124 έκφρασης. Από τη μια πλευρά, miR-124 ήταν ένα θετικά ρυθμιζόμενο γονίδιο-στόχο του AR, από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του miR-124 ανέστειλε την έκφραση του AR. Επιπλέον, βρήκαμε ότι το miR-124-2 και miR-124-3 υποκινητές υπερμεθυλίωση στο AR-αρνητικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-124 ανέστειλε ποσοστά πολλαπλασιασμό και την ικανότητα εισβολής των κυττάρων προστάτη

in vitro

, και κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος

in vivo

. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ των AR και miR-124 έκφρασης. Η μεθυλίωση του miR-124-2 και miR-124-3 μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτη για AR-αρνητικά κύτταρα PCa, και η υπερέκφραση του miR-124 θα μπορούσε να είναι από πιθανή θεραπευτική αξία για τη θεραπεία του προστάτη.

Citation : Chu Μ, Chang Υ, Guo Υ, Wang Ν, Cui J, Gao WQ (2015) Ο κανονισμός και μεθυλίωση του Ογκοκατασταλτικής MiR-124 από την ανδρογόνων υποδοχέων στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (4): e0116197. doi: 10.1371 /journal.pone.0116197

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 1η Οκτωβρίου 2014? Αποδεκτές: 7η Δεκεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Απριλίου του 2015

Copyright: © 2015 Chu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και υποστήριξη αρχείο πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από τα ταμεία να W.-Q. Gao από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας κινέζικα (2012CB966800? 2013CB945600 και 2012CB967900), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81130038 και 81372189), Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (πρόγραμμα Pujiang), Επιτροπή Σαγκάη Παιδείας Βασικά Πειθαρχία και Ειδικότητα Ιδρύματος (J50208), Key Πειθαρχία και Ειδικότητα Ίδρυμα της Σαγκάης Γραφείο Υγείας και KC Wong θεμέλια, και να M. Chu από τη Σαγκάη Μεταδιδακτορικός Επιστημονικό Πρόγραμμα της Κίνας (12R21415100)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνίζονται υπάρχουν συμφέροντα.

Εισαγωγή

τα microRNAs (mIR) είναι ενδογενείς, μονόκλωνο μικρό μη-κωδικοποίησης RNAs (περίπου 20-22 νουκλεοτίδια) που συνήθως προκαλούν αδρανοποίηση των γονιδίων, μειώνοντας τη σταθερότητα του mRNA και /ή μετάφραση [1]. παρεκκλίνουσα έκφραση τους έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με διάφορους τύπους καρκίνων [2-4]. MiR-124 είναι ένα εξαιρετικά συντηρημένη microRNA που παίζει ρόλο καταστολέα όγκου σε διάφορα είδη καρκίνων [5-9]. Η ώριμη αλληλουχία του miR-124 σε επεξεργασία από τρεις πρόδρομο παραλλαγές ακολουθίες, οι οποίες βρίσκονται σε χρωμοσώματα 8p23.1 (miR-124-1), 8q12.3 (miR-124-2) και 20q13.33 (miR-124- 3), τα οποία όλα περιέχουν CpG νησίδων σε περιοχή προαγωγού τους [9].

νησίδες CpG είναι γονιδιωματικές περιοχές που περιέχουν υψηλή συχνότητα των CpG θέσεων και τυπικά βρίσκεται κοντά θέσεις έναρξης μεταγραφής [10]. Η μεθυλίωση των CpGs σε αυτές τις περιοχές πιστεύεται ότι οδηγεί σε μεταγραφική αποσιώπηση των κατάντη γονιδίων τους [10]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η μεθυλίωση είναι ένας λόγος για τη χαμηλή έκφραση του miR-124 σε καρκίνο του τραχήλου [9], οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία [5], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [6], και του καρκίνου του παγκρέατος [7]. Ωστόσο, Raynal et al. [11] ανέφεραν ότι το DNA μεθυλίωση δεν μπλοκάρει σταθερά γονιδιακή έκφραση αφού αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης μπορεί να επανενεργοποιήσει την έκφραση του γονιδίου χωρίς να επηρεάσουν την κατάσταση μεθυλίωσης [11]. Αλλά τα πρότυπα της μεθυλίωσης μπορεί να χρησιμεύσει ως επιγενετικών δεικτών για τη μακροπρόθεσμη διατήρηση της γονιδιακής σίγησης [11]. Λόγω της ιδιαιτερότητας και της σταθερότητάς της σε ανθρώπινα δείγματα, τα προφίλ μεθυλίωσης του DNA μπορεί να είναι ως ένα χρήσιμο βιοδείκτη σε προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου [12, 13]. Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA του miR-124 παραλλαγές παρέχουν ένα πολύτιμο βιολογικό δείκτη για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [9], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης [14] και το καρκίνωμα σαφή κυττάρων των νεφρικών κυττάρων [15].

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή κακοήθεια στους ηλικιωμένους άνδρες στον ανεπτυγμένο κόσμο με την αύξηση των ποσοστών στις αναπτυσσόμενες χώρες [16]. Υποδοχέα ανδρογόνου (AR) οδού σηματοδότησης είναι πολύ σημαντικό στον καρκίνο του προστάτη [17], η οποία ρυθμίζει πολλές άλλα γονίδια που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου ή καταστολή του όγκου [18]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι AR συσχετίζεται με την κατάσταση μεθυλίωσης ειδικών microRNAs σε κύτταρα προστάτη [19]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω ρύθμιση και μεθυλίωση του miR-124 είναι ακόμα ασαφής.

Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να μελετήσει τον μηχανισμό ρύθμισης του miR-124, η κατάσταση μεθυλίωσης του miR-124 και η αντινεοπλασματική λειτουργία του miR-124 στα κύτταρα του προστάτη. Τα αποτελέσματα του πειράματος μας αποκάλυψε ότι η σηματοδότηση AR προωθείται έκφραση miR124, ενώ miR124 κατασταλεί η έκφραση AR. Υπήρξε μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ miR124 και της έκφρασης AR. Επιπλέον, η ανάλυση μεθυλίωσης του DNA έδειξε ότι οι υψηλές μεθυλίωση miR124-2 και miR-124-3 συνέβη σε AR-αρνητικά κύτταρα PCa, υποδηλώνοντας ότι αυτό το φαινότυπο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για AR-αρνητικά κύτταρα PCa. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-124 έδειξε αντικαρκινική δραστικότητα

in vitro

και

in vivo

, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή θεραπευτική αξία του miR-124 για τη θεραπεία της ΣΕΣΣ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές καλλιέργειες και θεραπεία διυδροτεστοστερόνη

LNCaP, PC-3 κυτταρικές γραμμές 22Rv1, DU145 και ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). C4-2 κύτταρα, μια υποσειρά των κυττάρων LNCaP, ελήφθησαν από UroCore (Oklahoma City, ΟΚ, USA). PC3 /κύτταρα AR είναι τα PC3 κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά το γονίδιο AR άγριου τύπου [20]? PC3 /neo κύτταρα είναι μια κυτταρική γραμμή ελέγχου. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σύμφωνα με τον κατασκευαστή και τα πρωτόκολλα παρόχων. Για διυδροτεστοστερόνη (DHT, Sigma-Aldrich Co., St Louis, ΜΟ, USA) κατεργασία, το μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA) αντικαταστάθηκε από 10% ορό απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα βόειου μόσχου (Bioind , Israel) όταν τα κύτταρα LNCaP ήταν 60% -70% συρροή και, στη συνέχεια 0, 5 και 10 ηΜ DHT προστέθηκαν αντίστοιχα και τα κύτταρα περαιτέρω καλλιεργήθηκαν για 12 ώρες.

πλασμίδια, λεντοϊού παραγωγή και μόλυνση

Μια αλληλουχία 21-μερές (5-GGTGTCACTATGGAGCTCTCA-3) σχεδιάστηκε για να δημιουργήσει το φορέα λεντοϊού του AR βραχείας φουρκέτας RNA (shRNA) [21], και η κατασκευή φορέα, λεντοϊού παραγωγή και μόλυνση έγιναν σύμφωνα με τις προηγούμενες περιγραφή [19] . Η φορέα λεντοϊού Plenti-CMV-miR-124 κατασκευάστηκε για να υπερεκφράζουν σταθερά ώριμη ακολουθία του miR-124. Ο φορέας της Plenti CMV /ΝΑ Puro άδειο (Addgene πλασμίδιο # 17482 [22]) αγοράστηκε από Addgene. Η γενωμική τμήμα του miR-124 -2 ακολουθίες ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές miR-124-2-F: CCTGGATCCGCTGTAAATGGCATGGAGATAT και miR-124-2-R: GCGTCTAGAGCGGCTGTAATGGAAAAGTAG? και υποκλωνοποιήθηκε σε BamH1 και Xbal θέσεις του Plenti CMV /ΤΟ Puro κενό φορέα [23]. Φακοϊού παραγωγή και μεταγωγή έγιναν σύμφωνα με μια προηγούμενη μέθοδο [23].

Real-Time PCR

Συνολικά εξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Plus Mini RNAs (Qiagen, Valencia, CA, USA) από διάφορα κύτταρα του προστάτη. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (Takara, Dalian, Κίνα) και το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σχετική ποσότητες miR-124 (χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασίες, Applied Biosystems) και AR (χρησιμοποιώντας την SYBR Green Realtime PCR Master Mix, ΤΟΥΟΒΟ, Osaka, Japan) πραγματοποιήθηκαν με ένα 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Η γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκε από την ενδογενή RNU44 ελέγχου (MIR-124) ή β-ακτίνης (AR). Οι τιμές Ct υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: AR εμπρός CCAGGGACCATGTTTTGCC, αντίστροφη CGAAGACGACAAGATGGACAA? β-ακτίνης προς τα εμπρός CATGTACGTTGCTATCCAGGC, αντίστροφη CTCCTTAATGTCACGCACGAT.

όξινο θειώδες νάτριο τροποποίηση και αλληλούχιση

Η κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε miR-124 παραλλαγές προσδιορίστηκε με όξινο θειώδες αλληλουχίας PCR (BSP), μετά θειώδους μετατροπή των κυττάρων χρησιμοποιώντας την μεθυλίωση απευθείας κιτ ΕΖ DNA (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) ακολουθώντας καθιερωμένα πρωτόκολλα. BSP εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό v1.0 Methyl Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (Πίνακας 1). Τα προϊόντα PCR συνδέθηκαν εντός του pMD19-T Απλή διάνυσμα (Takara Βιοτεχνολογία Co, Ltd, Dalian, Κίνα). Αποικίες (n = 10) επιλέχθηκαν ανά κυτταρική σειρά του προστάτη και η αλληλουχία από τη Σαγκάη Shenggong Biotech (Σαγκάη, Κίνα).

Η

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια καταμέτρηση των κυττάρων σετ (CCK-8? Dojindo, Κουμαμότο, Ιαπωνία) δοκιμασία. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με 5.000 κύτταρα ανά φρεάτιο και εξετάστηκαν στις 48, 72, 96 ώρες μετά την επίστρωση (n = 12). CCK-8 (10 μL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (BioTek, USA) σε μήκη κύματος 450 nm.

δοκιμασίες Μετανάστευση

Πλάκες Costar Transwell Μετανάστευσης με μέγεθος 8 μm πόρου (# 3422, Corning, USA) ήταν μεταχειρισμένος. Ο άνω θάλαμος σπάρθηκαν με 1 χ 10

5 κυττάρων σε μέσα χωρίς ορό και 20% FBS χρησιμοποιήθηκε ως προσελκυστικό στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, τα ένθετα καλλιέργειας απομακρύνθηκε και πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) αρκετές φορές για να απαλλαγούμε από μη συνδεδεμένα κύτταρα. Όλα τα υπόλοιπα κύτταρα επί της άνω πλευράς ξύστηκαν με ένα βαμβάκι. Κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά του ενθέματος μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν με PBS δύο φορές, και χρωματίστηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Για κάθε ένθετο, 5 τυχαία επιλεγμένες περιοχές του φίλτρου μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Κάθε ένα από το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

In vivo

δοκιμασίες ξενομόσχευμα

ηλικίας έξι εβδομάδων αρσενικούς BALB /C γυμνά ποντίκια (SLAC, Σαγκάη, Κίνα) ομαδοποιήθηκαν τυχαίως και υποδόρια ένεση με 4χ 10

6 LNCaP-ελέγχου ή LNCaP miR-124-κύτταρα αναμιγνύονται με έναν ίσο όγκο matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA). Κάθε ομάδα είχε τουλάχιστον πέντε ποντίκια. Οι όγκοι μετρήθηκαν με παχύμετρο κάθε 10 ημέρες από 2 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό και ο όγκος υπολογίστηκε ως π μήκος /6 × × πλάτος

2. Ξενομοσχεύματος όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν κατά τη θυσία για 34 ημέρα ένεσης των κυττάρων του όγκου. Όλα τα πειράματα του ποντικιού εγκρίθηκαν από την επιτροπή Renji νοσοκομείο ζώων φροντίδα και χρήση.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το SPSS 13.0 λογισμικά (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA) και Prism GraphPad 5 (GraphPad Software, La Jolla, Καλιφόρνια., USA). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test του Student. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές πιθανότητας μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

Μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ των miR-124 και την έκφραση AR

Για να προσδιορίσετε αν AR ρυθμίζει την έκφραση του miR-124 στην κυτταρικές σειρές προστάτη, AR υπερέκφραση και πειράματα knockdown AR διεξήχθησαν σε κύτταρα PC3 (vs. PC3 /AR) και κύτταρα LNCaP (έναντι LNCaP-SH-AR), αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, ενώ η υπερέκφραση του AR σε κύτταρα PC3 ενισχυμένο επίπεδο έκφρασης του miR-124 (Εικ. 1Α), knockdown του AR σε κύτταρα LNCaP μείωσε το επίπεδο έκφρασης του miR-124 (Εικ. 1Β). Επιπλέον, εξετάσαμε αν miR-124 είναι ένα ανδρογόνων ανταποκρίνεται microRNA. LNCaP κύτταρα, που αποκρίνονται στο ανδρογόνο κύτταρα PCa, απλώθηκαν σε ανδρογόνα μέσο ελεύθερο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DHT για 0 ​​ηΜ, 1 ηΜ και 10 ηΜ, αντίστοιχα. Μετά από 12 ώρα, τα RNAs εκχυλίσθηκαν και σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύθηκε. Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν μια αύξηση για την έκφραση ανέρχεται επίπεδα miR-124 γονιδίου σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με DHT (10 ηΜ) θεραπεία (Εικ. 1 C). Παραπάνω αποτελέσματα που υποδηλώνει ότι η AR είναι στενά συσχετίζεται θετικά με την έκφραση του miR-124. Ωστόσο, δεν είναι σαφές αν υπάρχει επίδραση ανάδρασης μεταξύ miR-124 και AR. Για τη μελέτη αυτή η πιθανότητα, LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό ελέγχου (κύτταρα LNCaP-έλεγχος) ή Plenti-CMV-mir-124 φακοϊό (LNCaP-miR-124 κύτταρα) που εκφράζει υψηλά επίπεδα του miR-124 (Σχ. 1D). Το επίπεδο έκφρασης του AR στη συνέχεια αναλύθηκε με qRT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, η υπερέκφραση του miR-124 ανέστειλε σημαντικά την στάθμη AR mRNA, το οποίο είναι συνεπές με μία προηγούμενη μελέτη ανέφεραν ότι η θεραπεία με miR-124 οδήγησε σε μείωση του AR πρωτεΐνης σε κύτταρα LNCaP [8]. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα πρότεινε μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ των miR-124 και την έκφραση AR (Σχήμα 1F.)

(Α) PC3 /κύτταρα AR είναι μια σταθερή γραμμή κυττάρων που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη AR cDNA.? Τα PC3 /neo κύτταρα που χρησιμοποιούνται ως έλεγχος. (Β) LNCaP κύτταρα-sh-AR είναι AR-knockdown κυττάρων, στην οποία τα κύτταρα LNCaP μολύνθηκαν με lentivious AR shRNA? Τα κύτταρα LNCaP-sh-ελέγχου που χρησιμοποιείται ως μάρτυρας. (C) 0 ηΜ, 1 ηΜ και 10 ηΜ DHT προστέθηκαν σε κύτταρα LNCaP και καλλιεργήθηκαν για 12 ώρα. (D) κύτταρα LNCaP μολύνθηκαν με φακοϊό ελέγχου (κύτταρα LNCaP-έλεγχος) ή Plenti-CMV-mir-124 φακοϊό (LNCaP-miR-124 κύτταρα). Σχετική έκφραση του miR-124 στα κύτταρα LNCaP καθορίστηκε με qRT-PCR και να διορθωθεί σε επίπεδα RUN44. Τιμές σημαίνουν fold-αλλαγές ρυθμίζεται σύμφωνα με (Α) PC3 neo κύτταρα /? (Β) των κυττάρων LNCaP-sh-AR? (C) κύτταρα LNCaP (0 ηΜ DHT) και (D) κύτταρα LNCaP-ελέγχου. (Ε) σχετική έκφραση AR προσδιορίστηκε με qRT-PCR και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνη. Τιμές σημαίνουν fold-αλλαγές ομαλοποιηθεί στα κύτταρα LNCaP-ελέγχου. (F) Ένα σχηματικό διάγραμμα της οδού που περιγράφεται στη μελέτη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα, καθένα από τα οποία έγιναν εις τριπλούν

Η

ανάλυση μεθυλίωσης του miR-124 σε κύτταρα προστάτη

Η ώριμη miR-124 περιέχει 3 πρόωρο παραλλαγές: miR-124-1, miR-124-2 και miR-124-3 (20q13.33). Bisulfite αλληλούχισης PCR (BSP) και αλληλούχιση του γονιδίου διεξήχθησαν για να αναλύσει τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA του καθενός από τα miR-124 παραλλαγές. Αυτές οι αναλύσεις έδειξαν ότι οι δραστηριότητες μεθυλίωση του miR-124-2 και miR-124-3 ήταν υψηλότερα σε AR-αρνητικά κύτταρα προστάτη (85% -96%, 80% -88%? Αντίστοιχα) σε σχέση με AR-θετικά κύτταρα προστάτη (0 % -50%, 1% -3%? αντιστοίχως) (Σχήμα 2).. Ωστόσο, και στις δύο AR-αρνητικών και AR-θετικών κυττάρων PCa, η περιοχή υποκινητή του miR-124-1 μεθυλιώθηκε σε περιορισμένο μόνο βαθμό (2% -38%, Εικ. 2). Επιπλέον, miR-124-1 μεθυλίωση δεν ήταν σημαντικά υψηλότερη από την AR-θετικών κυττάρων στις AR-αρνητικά κύτταρα PCa (DU145, PC3), εκτός για τα κύτταρα DU145 στα οποία η μεθυλίωση ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι AR-θετικά κύτταρα (22RV1, C4 -2 και LNCaP? p & lt?. 0.05)

Σχηματική σύνοψη των CpG θέσεων στο miR-124-1, miR-124-2 και miR-124-3 περιοχές υποκινητή. (Α) Ανάλυση μεθυλίωσης έγινε σε 10 κλώνοι από κάθε κυτταρική γραμμή. Κάθε σειρά από κύκλους αντιπροσωπεύει ένα μονό κλώνο, και κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει ένα μονό DNA μεθυλιωμένο ή απομεθυλιώνεται τοποθεσία. (Β) Τα ποσοστά μεθυλίωσης 10 κλώνοι από κάθε μία από τις κυτταρικές γραμμές που συνοψίζονται στο γράφημα μπαρ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SEM. Οι αστερίσκοι δηλώνουν Ρ & lt? 0,05, διπλό αστερίσκοι δηλώνουν Ρ & lt?. 0.001

Η

MiR-124 υπερέκφραση καταστέλλει κύτταρα LNCaP πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και ξενομοσχεύματος όγκους ανάπτυξη

Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι το miR-124 θεατρικά έργα ένα ρόλο ως καταστολέας των όγκων [5-9], έτσι θελήσαμε να ερευνητή αν η υπερέκφραση του miR-124 θα μπορούσε να αναστείλει προστάτη πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Για να απαντηθεί το ερώτημα αυτό, κύτταρα LNCaP-ελέγχου και LNCaP-miR-124 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και εξετάσθηκαν στις 48, 72, 96 ώρες μετά την αρχική επένδυση (n = 12). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με την απορρόφηση (οπτική πυκνότητα, OD) 450 nm μήκη κύματος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-124 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP στα 48, 72 και 96 ώρες, αντίστοιχα (Σχ. 3Α).

(Α) LNCaP κύτταρα-ελέγχου και LNCaP miR-124-κύτταρα ήταν καλλιεργήθηκαν σε 96 φρεάτια και εξετάστηκαν στις 48, 72, 96 ώρες χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK8. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την αξία της OD. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SEM (n = 12). Τα δεδομένα Group (Β) και των αντιπροσωπευτικών εικόνων (C, D) απεικονίζεται. (Β) Αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων ανά πεδίο των κυττάρων LNCaP-ελέγχου και LNCaP-miR-124 κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά μικροφωτογραφίες που απεικονίζουν μετανάστευση των κυττάρων LNCaP-ελέγχου (C) και LNCaP-miR-124 κύτταρα (D). Πέντε γυμνοί ποντικοί ανά ομάδα έλαβαν υποδόρια ένεση με 4×10

6 LNCaP κύτταρα ελέγχου ή LNCaP-miR-124 κύτταρα. (Ε) Ο όγκος του ξενομοσχεύματος όγκοι μετρήθηκαν κάθε 10 ημέρες από 2 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. (F) βάρη των όγκων μετρήθηκαν κατά την στιγμή της θυσίας επί 34 ημέρα μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. (G) Οι όγκοι αποκόπηκαν κατά τη στιγμή της θυσίας επί 34 ημέρα ένεσης των κυττάρων μετά τη όγκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM. Οι αστερίσκοι δηλώνουν Ρ & lt? 0,05, διπλό αστερίσκοι δηλώνουν Ρ & lt?. 0.001

Η

Επιπλέον, έχουμε καθορίσει αν η υπερέκφραση του miR-124 καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση προστάτη, οι θάλαμοι Transwell χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η μεταναστευτική επίδραση της LNCaP- κύτταρα ελέγχου και LNCaP-miR-124 κύτταρα. Οι δοκιμασίες transwell έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-124 κατέστειλε σημαντικά την μετανάστευση των κυττάρων LNCaP (Σχ. 3Β, C, D). Η παρατήρηση ότι το miR-124 αναστέλλει κύτταρα LNCaP πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση μας ώθησε να καθορίσει αν miR-124 υπερέκφραση μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων όγκου των κυττάρων LNCaP

in vivo

. Για να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό, αρσενικά γυμνά ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως με LNCaP κύτταρα ελέγχου ή LNCaP-miR-124 κύτταρα. Βρήκαμε ότι και οι δύο ομάδες ποντικών έδειξαν ψηλαφητών όγκων ξενομοσχεύματος επί 14 ημέρα μετά τον εμβολιασμό. Ωστόσο, το μέγεθος των όγκων ήταν σημαντικά μικρότερες σε LNCaP-miR-124 ξενομοσχεύματα σε σύγκριση με τα ξενομοσχεύματα LNCaP ελέγχου μετά από 24 ημέρες (Σχ. 3Ε, G). Επιπλέον, βρήκαμε ότι το βάρος των όγκων ήταν σημαντικά ελαφρύτερο σε LNCaP-miR-124 ξενομοσχεύματα σε σύγκριση με τα ξενομοσχεύματα LNCaP ελέγχου κατά τη στιγμή της θυσίας επί 34 ημέρες (Σχ. 3F, G). Συλλογικά, η υπερέκφραση του miR-124 όχι μόνο ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των LNCaP κυττάρων και μετανάστευση

in vitro

αλλά επίσης κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος

in vivo

.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, έχουμε παρουσιάσει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το miR-124 είναι ένα ανδρογόνων /AR ανταποκρίνεται γονιδίου και υπερέκφραση του miR-124 αναστέλλει την έκφραση AR και καταστέλλει προστάτη πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και ξενομοσχεύματος όγκου ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ των AR και miR-124 έκφρασης, και miR-124 μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο για την PCA.

σηματοδότησης ανδρογόνων /AR είναι πολύ ζωτικής σημασίας για την εμφάνιση και την εξέλιξη της καρκινογένεσης του προστάτη [ ,,,0],24, 25]. Όχι μόνο στεροειδείς ορμόνες, αλλά και τα μη στεροειδή ενώσεις θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν AR σηματοδότηση [26]. Εκτός αυτού, σε «ορμονο-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη», η σηματοδότηση AR μπορεί να ενεργοποιηθεί όλοι το ίδιο [27]. Εν ολίγοις, στη σηματοδότηση των ανδρογόνων /AR, AR παίζει πιο σημαντικό ρόλο από ό, τι ανδρογόνων. Ως εκ τούτου, πρώτον πραγματοποιήσαμε AR υπερέκφραση και νοκ ντάουν πειράματα για να ελέγξει αν σηματοδότηση AR θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση του miR-124. Βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-124 ήταν θετικά για την AR. Δεύτερον, η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με DHT προκάλεσε μια αυξημένη έκφραση του miR-124. Ως εκ τούτου, AR ρυθμίζει θετικά την έκφραση του miR-124. Σημειώνεται ότι τα αποτελέσματα μας δεν είναι συνεπείς με την προηγούμενη έκθεση στην οποία ανδρογόνων αναλογική R1881 χρησιμοποιήθηκε και δεν ρυθμίζουν miR-124 [8]. Μια εξήγηση για αυτήν τη διαφορά μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές μεθόδους έρευνας. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστούν τα αντιφατικά αποτελέσματα.

Η αρνητική αλληλεπίδραση που παρατηρήθηκε μεταξύ miR-124 και η έκφραση AR μπορεί να παίζει ρόλο στην ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη (CRPC). Όπως γνωρίζουμε, θεραπεία στέρησης ανδρογόνων που αφαιρεί κυκλοφορούν ανδρογόνα ή εμποδίζει το AR είναι ένα πρότυπο της θεραπείας φροντίδας για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Παρά την αρχική αποτελεσματική ανταπόκριση στη θεραπεία, σχεδόν όλοι οι ασθενείς αναπόφευκτα αναπτύσσουν σε CRPC. Παρά το γεγονός ότι έχει υπάρξει πολλή έρευνα που γίνεται, ο μηχανισμός είναι ακόμα ασαφής. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν η σηματοδότηση ανδρογόνων /AR μπορεί να επηρεάσει θετικά την έκφραση του miR-124, αλλά ο τελευταίος αναστέλλει την έκφραση του πρώτου. Θεωρούμε ότι σε φυσιολογικό κύτταρο του προστάτη, το AR και miR-124 εκφράσεις βρίσκονται σε ισορροπία, όπως προτείνεται για ότι συμβαίνει μεταξύ πρωτο-ογκογονίδια και καταστολείς όγκων [28]. Εάν η σηματοδότηση AR είναι ενεργοποιημένη, η έκφραση των κατάντη miR-124 θα είναι υψηλή, και αντιστρόφως αναστέλλει τη σηματοδότηση AR. Ωστόσο, η ισορροπία διαταράσσεται σε PCa, δηλαδή, η σηματοδότηση AR μπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω, όταν η έκφραση του miR-124 είναι χαμηλή [8].

Δεδομένου ότι η μεθυλίωση παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου έκφραση, η παρούσα μελέτη έχει διερευνηθεί κατά πόσον η έκφραση του miR-124 συνδέθηκε με την κατάσταση μεθυλίωσης του. Ώριμη αλληλουχία του miR-124 έχει τρεις παραλλαγές πρόδρομος, miR-124-1, miR-124-2 και miR-124-3, το σύνολο των οποίων αναλύθηκαν για την κατάσταση μεθυλίωσης στις μελέτες μας. Εκτός miR-124-1, οι περιοχές υποκινητή των miR-124-2 και miR-124-3 είναι ιδιαίτερα μεθυλιώνονται στο AR-αρνητικά κύτταρα του προστάτη από το AR-θετικά κύτταρα του προστάτη (Εικ. 2). Όταν η έκφραση του miR-124 εξετάζεται σε κύτταρα PCa, δεν φαίνεται η συνοχή με την κατάσταση μεθυλίωσης των κυττάρων προστάτη (S1 Εικ.). Αυτό ασυμφωνίας θα μπορούσε να εξηγηθεί από μια πρόσφατη νέα θεωρία που υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του DNA δεν σταθερώς κλείσει την έκφραση του γονιδίου, αλλά αντ ‘αυτού χρησιμεύει ως μοριακός δείκτης για μακροπρόθεσμη διατήρηση του γονιδιακής σίγησης [11]. Λόγω DNA μεθυλίωση αντιπροσωπεύει περισσότερο χημικά και βιολογικά σταθερή πηγή μοριακού διαγνωστικές πληροφορίες από RNA ή περισσότερες πρωτεΐνες [29], έχει μεγάλες δυνατότητες για να είναι ένα χρήσιμο πληροφοριακό βιοδείκτη σε προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου [12, 13]. Από αυτή την άποψη, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση του miR-124-2 και miR-124-3 μπορεί να παρέχει ένα χρήσιμο βιοδείκτη για AR-αρνητικά κύτταρα του προστάτη.

Θα πρέπει να τονιστεί όμως η υπερέκφραση του ΜΙΚ 124 μπορεί να αναστείλει προστάτη καρκινογόνες διαδικασία

in vitro

και

in vivo

, το νοκ ντάουν του miR-124 στα κύτταρα LNCaP δεν αλλάζει την καρκινογόνο κατάσταση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια εξήγηση μπορεί να είναι ότι οι ώριμες αλληλουχίες του miR-124 έχουν τρεις πρόδρομος παραλλαγές αλληλουχιών, και είναι δύσκολο να ρυθμίσουν προς τα κάτω σε βάθος την έκφραση. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να αποσαφηνιστεί το θέμα αυτό.

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό ρύθμισης των ογκοκατασταλτικών miR-124 και διάφορα κατάσταση μεθυλίωσης του miR-124 παραλλαγές θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δυνητικά χρήσιμο βιοδείκτη για τα κύτταρα του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Έκφραση of Mir-124 σε προστάτη κύτταρα.

Σχετική έκφραση του miR-124 σε κυτταρικές σειρές προστάτη προσδιορίστηκε από qRT-PCR και να διορθωθεί σε επίπεδα RUN44. Τιμές σημαίνουν fold-αλλαγές ομαλοποιηθεί στα κύτταρα LNCaP. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως τα μέσα ± από 3 ξεχωριστά πειράματα, καθένα από τα οποία έγινε εις τριπλούν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0116197.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

η μελέτη υποστηρίζεται από τα ταμεία για να WQ Gao από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας κινέζικα (2012CB966800? 2013CB945600 και 2012CB967900), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81130038 και 81372189), Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (Pujiang πρόγραμμα), Επιτροπή Σαγκάη Παιδείας Βασικά Πειθαρχία και Ειδικότητα Ίδρυμα (J50208), Key Πειθαρχία και Ειδικότητα Ίδρυμα της Σαγκάης Γραφείο Υγείας και KC Wong θεμέλια, και να Μ Chu από τη Σαγκάη Μεταδιδακτορικός Επιστημονικό πρόγραμμα της Κίνας (12R21415100).