Αφηρημένο

Αναλύσεις NY-ESO-1-ειδικά αυθόρμητη ανοσοαποκρίσεις σε ασθενείς με καρκίνο αποκάλυψε ότι αποκρίσεις αντισωμάτων και τα δύο CD4

+ και CD8

+ Τ κυττάρων που προκαλείται από κοινού σε ασθενείς με καρκίνο. Να διερευνήσει κατά πόσον τέτοια ολοκληρωμένη ανοσολογικές αποκρίσεις έχουν επίσης αυθόρμητα προκαλείται από άλλα αντιγόνα όγκων, έχουμε εκτίμησε τις ανταποκρίσεις αντισωμάτων και Τ κυττάρων εναντίον αυτο /όγκου p53 αντιγόνου σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και υγιή άτομα. Βρήκαμε ότι το 21% (64/298) των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, αλλά δεν υγιείς δότες έδειξε ειδική IgG αποκρίσεις έναντι πρωτεΐνης ρ53 άγριου τύπου. Ενώ καμία από 12 ασθενείς με αντίσωμα p53 υψηλού τίτλου έδειξε αυθόρμητη ρ53-ειδική CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις μετά από μία μόνο

in vitro

ευαισθητοποίηση, σημαντικές ρ53-ειδική ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ T κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε 6 ασθενείς. Παραδόξως, παρόμοια επίπεδα ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα αλλά όχι CD8

+ Τ κύτταρα επίσης ανιχνεύθηκαν σε 5/10 ασθενείς με καρκίνο και οροαρνητικά 9/12 υγιείς δότες. Σημαντικά, ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιείς δότες προήλθε από μια CD45RA

– πληθυσμός κυττάρων Τ αντιγόνο έμπειρο και αναγνωρίζονται φυσικά επεξεργασμένης πρωτεΐνης ρ53 άγριου τύπου. Αυτά τα αποτελέσματα εγείρουν την πιθανότητα ότι η ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα αντανακλούν ανωμαλίες στο ρ53 συμβαίνουν σε φυσιολογικά άτομα και ότι μπορεί να παίζει ένα ρόλο στις διαδικασίες της ανοσολογικής ή ανοσορύθμιση της ρ53 που σχετίζονται με νεοπλασματικές γεγονότα.

Παράθεση: Tsuji Τ, Matsuzaki J, Ritter Ε, Miliotto Α, Ritter G, Odunsi K, et al. (2011) Σπλιτ Τ κυττάρων ανοχή έναντι ενός αντιγόνου Αυτο /Όγκου: Αυθόρμητη CD4

+ αλλά όχι CD8

+ Τ κυττάρων έναντι p53 σε ασθενείς με καρκίνο και υγιείς δότες. PLoS ONE 6 (8): e23651. doi: 10.1371 /journal.pone.0023651

Επιμέλεια: Mauricio Martins Rodrigues, Ομοσπονδιακό Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, Βραζιλία

Ελήφθη: 4 Μαρ 2011? Αποδεκτές: 22 Ιουλ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Tsuji et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από τον Όμιλο Cancer Research Institute Καρκίνος των ωοθηκών εργασίας Grant και τον Καρκίνο Εμβόλιο Συνεργατική χρηματοδοτείται από Cancer Research Institute και Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και την ανάλυση δεδομένων, την απόφαση να δημοσιεύσει, ή προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι τόσο όγκο αντιγόνου-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην εξάλειψη του καρκίνου [1], [2]. Ερευνήσαμε εκτενώς αυθόρμητη ή επάγονται από το εμβόλιο ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι αντιγόνου καρκίνου όρχεων NY-ESO-1 ως αντιγόνο πρωτότυπο όγκου σε ανθρώπινο [3], [4], [5], [6], [7], [8 ]. Φυσικά απαντώμενες NY-ESO-1-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις ήταν συνήθως ανιχνεύεται μόνο σε ασθενείς οι οποίοι είχαν αντίσωμα ορού έναντι NY-ESO-1, δεικνύοντας ότι αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι NY-ESO- 1 σε ασθενείς με καρκίνο με ΝΥ-ΕδΟ-1 που εκφράζουν όγκοι υψηλό βαθμό ολοκλήρωσης [3], [4]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι μετά τον εμβολιασμό με ΝΥ-ΕδΟ-1 πρωτεΐνη και CpG, ΝΥ-ESO-1-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων έγινε ανιχνεύσιμη πρώτη, ακολουθούμενη από την εμφάνιση του αντισώματος και CD8

+ Τ κύτταρα , υποδηλώνοντας ένα ρόλο για το ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα στη διευκόλυνση αντίσωμα και CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις μετά την ανοσοθεραπεία [8]. Επιπλέον, βρήκαμε πρόσφατα ότι ο εμβολιασμός με MAGE-Α3 πρωτεΐνη που επάγεται ολοκληρωμένη ΜΑΟΕ-Α3-ειδικό αντίσωμα, οι αποκρίσεις CD8

+ και CD4

+ Τ κυττάρων [9]. Σε μη-μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που έλαβαν MAGE-Α3 πρωτεΐνη που διατυπώθηκαν στην AS02B ανοσοενισχυτικό σύστημα, CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις προκλήθηκαν μόνο σε ασθενείς οι οποίοι ανέπτυξαν πολύ υψηλό τίτλο αντισώματος και ισχυρή CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις . Ωστόσο, μια τέτοια συσχέτιση μεταξύ αντισώματος και Τ κυτταρικές αποκρίσεις δεν έχει πλήρως αντιμετωπιστεί για άλλα αντιγόνα ανθρώπινων όγκων.

Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, η ανοσολογική απάντηση έναντι ρ53 έχουν ερευνηθεί εκτενώς [10], [11], [12 ], [13]. Η πρωτεΐνη p53 ανακαλύφθηκε στο εργαστήριο μας ως μία ανοσογονική ογκοειδικό αντιγόνο με ορολογική εξέταση ποντικών που φέρουν όγκο [14], και ταυτόχρονα σε δύο άλλα εργαστήρια που χρησιμοποιούν άλλες μεθόδους [15], [16]. Αργότερα ανακαλύφθηκε ότι το γονίδιο ρ53 συχνά μεταλλάσσεται σε διάφορους καρκίνους, οδηγώντας σε απώλεια του heterozygoty, απορρύθμιση των δικτύων ανατροφοδότησης ρ53, και, τελικά, με αποτέλεσμα βραδύτερη κύκλου εργασιών ρ53 και έτσι συσσώρευση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 σε κύτταρα όγκου. Στους ανθρώπους, ρ53 συσσωρεύεται σε ποσοστό έως 70% των όγκων από ασθενείς με ορισμένους καρκίνους όπως του παχέος εντέρου ή καρκίνο κεφαλής και λαιμού, και αυτή η συσσώρευση είναι μια εξαιρετικά ανοσογόνος γεγονός, αυθόρμητα ενεργοποιεί ειδικές αποκρίσεις υψηλού τίτλου αντισωμάτων [12]. Πράγματι, ρ53 έχει ένα από τα πιο συχνά ανιχνεύονται αντιγόνα που αναγνωρίζονται από φυσικώς ενυπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς με καρκίνο από την διαλογή βιβλιοθηκών έκφρασης cDNA που προέρχεται από ανθρώπινους όγκους με αυτόλογο αντίσωμα (SEREX) και με ELISA στο εργαστήριο μας [17], [18] [19], [20]. Φυσικώς ενυπάρχοντα αντισώματα ορού p53 σε ασθενείς με καρκίνο είναι γνωστό ότι αναγνωρίζουν το άγριου τύπου Ν-τελικό άκρο ή αλληλουχίες Ο-άκρο της ρ53, αλλά όχι την κεντρική περιοχή της πρωτείνης όπου συμβαίνουν το 90% των μεταλλάξεων. Εμείς και άλλοι έχουν επίσης ερευνηθεί αποκρίσεις Τ κυττάρων έναντι του άγριου-τύπου ρ53 και πολλοί επίτοποι τόσο CD8

+ και CD4

+ Τ κυττάρων έχουν προσδιοριστεί με αντίστροφη προσεγγίσεις ανοσολογία και επαναλαμβανόμενη διέγερση των Τ κυττάρων με συντιθέμενα πεπτίδια [10 ], [21], [22]. Πρόσφατα αποτελέσματα του κυττάρου Τ immunomonitoring των ασθενών των ωοθηκών και του παχέος εντέρου που εμβολιάστηκαν με p53 επικαλυπτόμενα πεπτίδια έδειξαν ισχυρή επαγωγή του ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις, που ήταν ακόμη ανιχνεύσιμη με

ex vivo

αναλύσεις περιφερικού αίματος μονοπύρηνα κύτταρα (PBMCs) μετά τον εμβολιασμό χωρίς να προκαλεί οποιαδήποτε ανιχνεύσιμη ρ53-ειδική CD8

+ Τ κύτταρα [23], [24].

αποκρίσεις

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αυθόρμητη αντισώματος και Τ κυττάρων εναντίον p53 σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, των οποίων οι όγκοι συχνά συσσωρεύονται πρωτεΐνη p53 [25], και υγιείς δότες. Για να συγκριθεί η

in vivo

ανοσογονικότητα της ρ53 με εκείνη του ΝΥ-ΕδΟ-1, παρακολουθήσαμε ρ53-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις με χρήση των διαδικασιών που immunomonitoring αναπτύχθηκαν για να παρακολουθεί αυθόρμητη NY-ESO-1-ειδικές αποκρίσεις Τ κυττάρου. Αυτές οι τυποποιημένες μέθοδοι είχαν προηγουμένως δείξει να ανιχνεύσουν NY-ESO-1-ειδικά κυκλοφορούντων CD4

+ και CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις μόνο σε NY-ESO-1 οροθετικούς ασθενείς με ΝΥ-ΕδΟ-1 που εκφράζουν όγκου, αλλά όχι σε υγιείς δότες με χαμηλή συχνότητα των πρόδρομων [4], [26]. Χρησιμοποιώντας αυτό το πρωτόκολλο, βρήκαμε ότι η ΙΡΝ-γ που παράγουν CD4

+ Τ κυττάρων έναντι αλληλουχιών άγριου τύπου ρ53 ανιχνεύθηκαν συχνά σε ασθενείς με καρκίνο οροθετικοί. Παραδόξως, αυθόρμητη ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις παρόμοιου μεγέθους βρέθηκαν επίσης στα περισσότερα οροαρνητικούς ασθενείς και υγιείς δότες. Σε αντίθεση, καμία αυτόματη CD8

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις έναντι του άγριου-τύπου ρ53 ούτε κατά τη δική μεταλλαγμένες αλληλουχίες ρ53 των ασθενών ανιχνεύθηκαν σε οποιαδήποτε δότες που ελέγχθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυθόρμητη ενεργοποίηση των CD8

+ κύτταρο αποκρίσεις Τ έναντι p53 είναι έντονα ελέγχεται

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα υγιών δοτών »

PBMCs και ορού ελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών σε το Roswell Park Cancer Institute, στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμική. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. PBMCs και ορό από υγιείς δότες ελήφθησαν από το Κέντρο Αίματος της Νέας Υόρκης.

Μέτρηση της ρ53-ειδικού αντισώματος του ορού

Η ανασυνδυασμένη άγριου-τύπου ρ53 παρήχθη και το επίπεδο αντισωμάτων στον ορό ρ53-ειδικό μετρήθηκε ως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Μια αμοιβαία τίτλος υπολογίστηκε από αναγνώσεις οπτικής πυκνότητας σειριακά αραιωμένα δείγματα και τους ελέγχους όπως περιγράφεται [20].

επικαλυπτόμενα πεπτίδια

Ακολουθίες των επικαλυπτόμενων πεπτιδίων από πρωτεΐνη ρ53 άγριου τύπου που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και presensitization παρουσιάζονται στον πίνακα S1. Όλα τα πεπτίδια συντέθηκαν με βιοσύνθεση (Lewisville, ΤΧ) και διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε συγκέντρωση 10 mM και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Είχαν σχεδιαστεί για να είναι μήκους 25 αμινοξέων εκτός # 1 (19-μερές) και # 30 (22-μερές) και έχουν 15 αμινοξέων επικαλύπτει. Αμινοξέων για κωδικόνιο 72 του άγριου τύπου ρ53 δείχνει συχνά Arg σε Pro πολυμορφισμό [27]. Για την αντιμετώπιση αυτού του πολυμορφισμού, δύο διαφορετικά πεπτίδια με Arg ή Pro στην θέση 72 παρασκευάστηκαν για το πεπτίδιο # 6 και αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:01.

Presensitization

In vitro

presensitization πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. CD8

+ και CD4

+ Τ κύτταρα διαχωρίζονται από PBMCs χρησιμοποιώντας Dynabeads (Invitrogen-Dynal AS) και ανεξάρτητα διεγείρονται με CD8

-CD4

– κύτταρα που δονήθηκαν όλη τη νύχτα με 1 πισίνα ( # 1- # 30), 2 πισίνες (# 1- # 15 και # 16- # 30), ή 3 πισίνες (# 1- # 10, # 11- # 20 και # 21- # 30) επικαλυπτόμενων πεπτιδίων σύμφωνα με τον αριθμό των κυττάρων μετά από διαχωρισμό και ακτινοβολημένα. Οι κυτταρικές καλλιέργειες συμπληρώθηκαν με 10 U /ml IL-2 και 20 ng /ml IL-7 φορές την εβδομάδα. Παράλληλα, ένα τμήμα του CD4

+ Τ κυττάρων πολυκλωνικά επεκταθεί με φυτοαιμοσυγκολλητίνη (ΡΗΑ, Remel) παρουσία χαμηλής δόσης IL-2 και IL-7, για να χρησιμοποιηθεί ως κύτταρα στόχοι (Τ-APC) σε ELISPOT χημική δοκιμή. Σε μερικά πειράματα, CD4

+ Τ κύτταρα διαχωρίστηκαν περαιτέρω σε CD45RA

+ και CD45RA

– υποσύνολα με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-CD45RA μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) (BD Biosciences) και αντι-ΡΕ Μαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyi Biotec).

Ανίχνευση της p53-ειδική απόκριση των κυττάρων Τ

παραγωγή IFN-γ p53-ειδικές αξιολογήθηκε με δοκιμασία ELISPOT την ημέρα 9-12 για CD8

+ Τ κυττάρων και την ημέρα 18-25 για CD4

+ Τ κύτταρα. Πρώτον, τα κύτταρα Τ αξιολογήθηκαν για τη δραστικότητά τους έναντι 6 πισίνες 5 πεπτίδια (# 1- # 5, # 6- # 10, κ.λπ.). Σε μερικά πειράματα, μια δεξαμενή 17 επικαλυπτόμενων πεπτιδίων από NY-ESO-1 χρησιμοποιήθηκε ως άσχετα πεπτίδια. Εάν η παραγωγή ΙΡΝ-γ ανιχνεύθηκε εναντίον οποιουδήποτε από πισίνες πεπτιδίου, ανεξάρτητα πεπτίδια στην πισίνα ελέγχθηκαν για να προσδιορισθεί μία μόνο πεπτίδιο αναγνωρίζεται. Όλα τα αποτελέσματα από προσδιορισμούς ELISPOT παρουσιάστηκαν ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων που σχηματίζουν κηλίδες ΙΡΝ-γ από φρεάτια εις διπλούν χωρίς αφαίρεση του αριθμού των κηλίδων υποβάθρου ενάντια unpulsed κυττάρων στόχων. Οι αποκρίσεις θεωρήθηκαν θετικές εάν ο αριθμός των κηλίδων έναντι του πεπτιδίου (ων)-παλμού κυττάρων στόχων ήταν 3 φορές περισσότερο από ότι κατά unpulsed κύτταρα-στόχους και πάνω από 25 σημεία /50000 δραστικά Τ κύτταρα. Για ορισμένους ασθενείς, ρ53-ειδικών Τ κυττάρων ανιχνεύθηκαν με ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης και δοκιμασίες έκφρασης CD107a. Ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης για ΙΡΝ-γ, IL-4, και ΤΝΡ-α διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Για τις δοκιμασίες έκφραση CD107a, προευαισθητοποιήθηκε CD8

+ Τ κύτταρα επαναδιεγέρθηκαν παρουσία 40 μΙ /ml ΡΕ-συζευγμένα αντι-CD107a mAb (Βϋ Biosciences) και 0,66 μΙ /ml GolgiStop (BD Biosciences). Σε μερικά πειράματα, ρ53 πεπτίδιο-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα απομονώθηκαν με κυτταρομετρία ροής διαλογή των CD154 κυττάρων που εκφράζουν μετά την επαναδιέγερση με πεπτίδια ρ53 και είχαν επεκταθεί με πολυκλωνικά ΡΗΑ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Αναγνώριση των φυσικώς επεξεργασμένης πρωτεΐνης ρ53 και της παραγωγής κυτοκίνης από ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν με τη χρήση αυτόλογα δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από μονοκύτταρα (mo-DCS) προ-παλμική διάρκεια της νύχτας με p53 επικαλυπτόμενα πεπτίδια (3,3 μΜ), ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη p53 (20 μg /ml) ή ελέγχουν πρωτεΐνη ΝΥ-ΕδΟ-1 (20 μg /ml). επίπεδα κυτοκινών στα υπερκείμενα μετρήθηκαν με σάντουιτς ELISA χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ζεύγη mAb: μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-ΙΡΝ-γ (BD Biosciences), μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-GM-CSF mAbs (BD Biosciences), μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι -IL-4 mAbs (BD Biosciences), μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-IL-13 mAbs (eBioscience), μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-IL-10 mAbs (eBioscience), μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-ΤΟΡ-β mAbs (eBioscience ), μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-IL-17 mAbs (eBioscience) και μη σημασμένο και βιοτινυλιωμένο αντι-IL-9 mAbs (eBioscience). Πρότυπο πρωτεΐνες κυτοκίνης ελήφθησαν από eBioscience.

Αποτελέσματα

απόκριση αντι-ρ53 αντίσωμα

Για την αξιολόγηση αυθόρμητη ανοσίας κατά του p53, μετρήσαμε τίτλοι αντισωμάτων του ορού έναντι p53 και NY-ESO -1 πρωτεϊνών σε 298 ασθενείς με προχωρημένο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και 153 υγιή άτομα με ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, το 21% των ασθενών, αλλά κανένα από τα υγιή άτομα έδειξαν σημαντική αντισώματος ορού anti-p53, η οποία ήταν πολύ παρόμοια με την συχνότητα των αντι-ΝΥ-ΕδΟ-1 αντισώματος αποκρίσεις που παρατηρούνται (21%). Αυτές οι συχνότητες αυθόρμητες αποκρίσεις αντισώματος έναντι ρ53 και ΝΥ-ΕδΟ-1 είναι στην περιοχή εκείνων που αναφέρθηκαν για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών σε διάφορες μελέτες [29]. Αντίθετα, ένας μικρότερος αριθμός ασθενών (7%) έδειξε σημαντική αντισώματος ορού έναντι του αντιγόνου του καρκίνου /όρχεων MAGE-A3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η συχνότητα των ασθενών που εμφάνισαν και οι δύο NY-ESO-1 και αντισώματα ορού p53 ήταν 4,7%, η οποία είναι κοντά στην υπολογισμένη συχνότητα από τις συχνότητες έναντι εκάστου αντιγόνου υποθέτοντας ότι η επαγωγή αυτών των απαντήσεων είναι ανεξάρτητος (0,21 (21% έναντι ρ53) × 0,21 (21% έναντι NY-ESO-1) = 0,044 (4,4% έναντι αμφοτέρων των αντιγόνων)).

οροί από 298 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και 153 υγιή άτομα αξιολογήθηκαν για το αντίσωμα έναντι του άγριου-τύπου ρ53 και ΝΥ -ESO-1 πρωτεϊνών με ELISA. Οι αμοιβαίες τίτλοι υπολογίζονται όπως περιγράφεται στην αναφορά [20].

Η

Μη ανιχνεύσιμο αυθόρμητη CD8

+ απόκριση των Τ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο και υγιείς δότες

Για την immunomonitoring της αυθόρμητης Τ κυττάρων απαντήσεις, είναι σημαντικό να επιλέξετε μια μέθοδο που μπορεί να διακρίνει

in vivo

διεγειρόμενων Τ κύτταρα από

in vitro

επαγόμενη από τα Τ κύτταρα. Για την παρακολούθηση αυθόρμητα επαγόμενη Τ κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον ρ53, χρησιμοποιήσαμε ένα ενιαίο

in vitro

πρωτόκολλο ευαισθητοποίησης που έχει αναπτυχθεί και επικυρωθεί για την ανίχνευση αυθόρμητης NY-ESO-1-ειδικές αποκρίσεις Τ κυττάρου μόνο σε NY-ESO- 1 οροθετικούς ασθενείς με καρκίνο αλλά όχι σε υγιή άτομα. Χρησιμοποιώντας αυτό το πρωτόκολλο, NY-ESO-1-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα συχνά ανιχνεύονται από NY-ESO-1 ασθενείς οροθετικούς καρκίνο των ωοθηκών, αλλά όχι από υγιή άτομα στην ομάδα αυτή μελέτη (Σχήμα S1 (A)). Σε αντίθεση, πολλαπλούς γύρους διέγερσης από επαγγελματίες κύτταρα επεξεργασίας αντιγόνου (APCs) όπως mo-DCs μπορεί να επάγει NY-ESO-1-ειδικά Τ κύτταρα από παρθένα NY-ESO-1-ειδικά προδρόμων σε υγιείς δότες [30], [31 ]. Λόγω της συχνής εμφάνισης της αυθόρμητης αντισώματος ορού έναντι ρ53 σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, αναλύσαμε πρώτα ρ53-ειδική CD8

+ Τ κυτταρικών αποκρίσεων σε αυτούς τους ασθενείς. Από το εύρημα ότι αυθόρμητη NY-ESO-1-ειδικών Τ κυττάρων είναι ανιχνεύσιμα μόνο σε οροθετικούς ασθενείς, επιλέχθηκαν 12 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών αυθόρμητες αποκρίσεις αντισώματος έναντι ρ53 για την αξιολόγηση των απαντήσεων των Τ κυττάρων. CD8

+ και CD4

+ Τ κύτταρα απομονώθηκαν από PBMCs όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους, και χωριστά διεγέρθηκαν με ρ53 πεπτίδιο παλμικά CD4

-CD8

– κύτταρα. Μετά την καλλιέργεια για περίπου 10 ημέρες, ο αριθμός των IFN-γ που παράγουν ρ53-ειδική CD8

+ Τ κύτταρα αξιολογήθηκε με δοκιμασία ELISPOT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, δύο αντιπροσωπευτικές οροθετικούς ασθενείς δεν έδειξαν καμία ανιχνεύσιμη αντι-p53 CD8

+ Τ κυτταρική απόκριση με πρότυπο πρωτόκολλο immunomonitoring μας. Παρομοίως, καμία σημαντική παραγωγή ΙΡΝ-γ από CD8

+ Τ κύτταρα ανιχνεύθηκε από 10 επιπλέον οροθετικούς ασθενείς (Σχήμα 2Β). Δέκα οροαρνητικοί ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και 12 υγιείς δότες ελέγχθηκαν επίσης για αυθόρμητη τους CD8

+ Τ κυτταρική απόκριση κατά της ρ53 και όπως αναμενόταν, δεν υπήρχε καμία ένδειξη του ρ53-ειδικών CD8

+ Τ κύτταρα (Σχήμα 2Β). Είναι πιθανό ότι η ρ53-ειδική CD8

+ Τ κύτταρα έχουν έλλειψη ΙΡΝ-γ που παράγουν ικανότητα και ότι είναι ανιχνεύσιμη με την έκφραση άλλων μορίων. Για να ελεγχθεί αν ρ53-ειδική CD8

+ Τ κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα με άλλα μόρια που προκαλείται από ενεργοποίηση, 5 οροθετικά και οροαρνητικά 5 ασθενείς αναλύθηκαν για παραγωγή ΤΝΡ-α και η έκφραση CD107a μετά την επαναδιέγερση με πεπτίδια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, δεν ρ53-ειδική CD8

+ Τ κυτταρική απόκριση ανιχνεύθηκε με βάση ΤΝΡ-α και η έκφραση CD107a.

(Α) CD8

+ Τ κύτταρα από αντίσωμα θετικού καρκίνου των ωοθηκών ασθενείς προευαισθητοποιήθηκε με πισίνα 30 p53 επικαλυπτόμενα πεπτίδια. Μετά από 9-12 ημέρες, ρ53-ειδική ΙΡΝ-γ Τ κύτταρα που παράγουν αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες ELISPOT. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD) διπλών πηγαδιών. Αυτόλογα Τ-APCs χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα στόχοι σε προσδιορισμούς ELISPOT. Τα (Β) CD8

+ Τ κυτταρικών αποκρίσεων σε 7 οροθετικούς και ασθενείς με 5 οροαρνητικά καρκίνο των ωοθηκών και 12 υγιείς δότες που φαίνεται. (Γ) presensitized CD8

+ Τ κύτταρα αναλύθηκαν με προσδιορισμούς ενδοκυτταρική χρώση ΤΝΡ-α και η έκφραση CD107a μετά την επαναδιέγερση με p53-πεπτίδια-παλλόμενα, άσχετο (NY-ESO-1) πεπτίδια-παλμικού ή unpulsed κύτταρα στόχους.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι αυθόρμητη ΙΡΝ-γ που παράγουν CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον άγριου τύπου ρ53 δεν ήταν ανιχνεύσιμες ακόμη και σε ασθενείς οροθετικούς καρκίνου με πρωτόκολλο presensitization μας, σε αντίθεση με τη συχνή ανίχνευση του NY -ESO-1-ειδικά CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις σε NY-ESO-1 οροθετικούς ασθενείς (Σχήμα S1 (A)). Συσσώρευση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 σε κύτταρα όγκου είναι γνωστό ότι συσχετίζεται με ανταπόκριση αντισώματος [32]. Επειδή τα μεταλλαγμένα πεπτίδια θεωρείται ότι είναι ανοσογόνος λόγω της απουσίας ανοχή και η ανοσογονικότητα του μεταλλαγμένου ρ53 να επάγει CD8

+ αποκρίσεις κυττάρων Τ καταδείχθηκε σε ποντικούς [33], [34], από την επόμενη αναζήτησε CD8

+ κυττάρων Τ αποκρίσεις έναντι μεταλλαγμένο p53. Για να γίνει αυτό, τα εξόνια 5-7 του γονιδίου ρ53 από ιστούς όγκων και φυσιολογικών λεμφοκυττάρων των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία για τον εντοπισμό πιθανών μεταλλάξεων ρ53 στον όγκο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεταξύ των μεταλλάξεων ανιχνευθεί, τρία συχνά εμφανιζόμενες μεταλλάξεις, S127F, R273C, και R282W, επιλέχθηκαν να ψάξουν για ειδικό CD8

+ Τ κυτταρική απόκριση κατά επιτόπων περιλαμβάνει αυτές τις μεταλλάξεις. CD8

+ Τ κύτταρα από τρεις ασθενείς οι οποίοι είχαν όγκους με S127F, R273C ή μετάλλαξη R282W διεγέρθηκαν με τα πεπτίδια που περιέχουν μετάλλαξη p53 του ασθενούς ή με πεπτίδια που περιέχουν την αντίστοιχη αλληλουχία άγριου τύπου. Αριθ μεταλλαγμένου πεπτιδίου-ειδικά CD8

+ Τ κυτταρική απόκριση ανιχνεύθηκε σε αυτούς τους τρεις ασθενείς (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις σε ασθενείς με καρκίνο και υγιή άτομα

αποκρίσεις για την ανίχνευση φυσικά CD4

+ Τ κυττάρων έναντι ρ53, CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς με καρκίνο οροθετικούς διεγέρθηκαν με επικαλυπτόμενα πεπτίδια στην κυτταρική παλμικά-εξαντλημένο PBMCs αυτόλογα Τ χρησιμοποιούνται ως APCs. Μετά από 20 ημέρες καλλιέργειας με την παρουσία χαμηλών δόσεων IL-2 και IL-7, ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ Τ κύτταρα απαριθμήθηκαν με δοκιμασία ELISPOT έναντι υποομάδες των επικαλυπτόμενων πεπτιδίων και έπειτα κατά μεμονωμένων πεπτιδίων από αντιδραστικά υποομάδες . Σε αντίθεση με την μη ανιχνεύσιμο ρ53-ειδική CD8

+ Τ κύτταρα, σημαντική ΙΡΝ-γ παραγωγής ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις σε υποομάδες των επικαλυπτόμενων πεπτιδίων βρέθηκαν σε 6 από τους 12 οροθετικών ασθενών (Σχήμα 3Α και τα δεδομένα δεν φαίνονται), με συγκρίσιμα μεγέθους με αυθόρμητη CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον NY-ESO-1 σε NY-ESO-1 ασθενείς οροθετικούς καρκίνου των ωοθηκών στην ομάδα αυτή μελέτη (Σχήμα S1 (Β)). Είμαστε δίπλα αξιολογούνται αυθόρμητη CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον p53 σε 10 οροαρνητικούς ασθενείς και 12 υγιή άτομα. Παραδόξως, αν και η μέθοδος presensitization μας δεν ανίχνευσε NY-ESO-1-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιή άτομα (Σχήμα S1 (Β)), ανιχνεύθηκε η ίδια διαδικασία σημαντική ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ T κύτταρο αποκρίσεις σε 5/10 ασθενείς οροαρνητικά και 9/12 υγιή άτομα που δοκιμάστηκαν (Σχήματα 3Β και C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε επιλεγμένους ασθενείς, ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα με ΤΝΡ-α παραγωγή ακόλουθη ενδοκυττάρια χρώση κυτοκίνης (Εικόνα S2).

CD4

+ Τ κύτταρα από αντίσωμα θετικό (Α) και αρνητικό (Β) ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και υγιείς δότες (C) έχουν προευαισθητοποιήθηκε με πισίνα (ες) του p53 επικαλυπτόμενων πεπτιδίων. Μετά από 18-25 ημέρες, ρ53-ειδική ΙΡΝ-γ Τ κύτταρα που παράγουν αξιολογήθηκαν έναντι του πεπτιδίου-παλμικού ή unpulsed (

φ

) κυττάρων-στόχων με δοκιμασίες ELISPOT. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν πρότυπη απόκλιση διπλά πηγάδια. Αυτόλογα Τ-APCs χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα στόχοι σε προσδιορισμούς ELISPOT. Τ κυτταρικές αποκρίσεις αξιολογήθηκαν αρχικώς σε σύγκριση υποομάδες πεπτιδίων (1η δοκιμασία) και, στη συνέχεια, έναντι των ανεξάρτητων πεπτίδιο σε ένα αντιδραστικό υποομάδα (2η δοκιμασία). Για την υγιή δότη που φαίνεται στο (C), CD4

+ Τ κύτταρα που είχαν προευαισθητοποιημένα με # 1- # 10 ή # 21- # 30 του πεπτιδίου δεν έδειξαν καμία σημαντική αποκρίσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Σχήμα 4 συνοψίζει επιτόπια που αναγνωρίζονται από CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς οροθετικά και οροαρνητικά καρκίνο και υγιείς δότες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, επίτοπα που βρίσκονται στους δύο ασθενείς οροθετικά και οροαρνητικά καρκίνο και υγιείς δότες κατανεμήθηκαν επί ολόκληρης της αλληλουχίας της πρωτεΐνης ρ53. Ορισμένα πεπτίδια όπως # 9, # 13 και # 26 που προκαλείται συχνότερα CD4

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις σε 4 (20% των ασθενών που ανταποκρίθηκαν), 6 (30%) και 7 (35%) δότες, αντίστοιχα. Μερικοί ασθενείς οροαρνητικοί καρκίνο και υγιείς δότες έδειξε πολλαπλού επιτόπου-ειδικών CD4

αποκρίσεις + κυττάρων Τ, όπως φαίνεται σε ασθενείς με καρκίνο οροθετικοί. Για να εξεταστεί η συχνά παρατηρούμενη πολυμορφισμού σε κωδικόνιο 72, χρησιμοποιήσαμε ένα μίγμα δύο παραλλαγής πεπτιδίων για το πεπτίδιο # 6 (Πίνακας S1), που θα μπορούσε να επάγει

de novo

αποκρίσεις σε άτομα με ομόζυγο γονότυπο p53 σε ένα κωδικόνιο 72. Ωστόσο, δεν κυττάρων Τ απόκριση ενάντια # 6 πεπτιδίων ανιχνεύθηκε σε αυτή τη μελέτη, που δείχνει ότι η βραχυπρόθεσμη πρωτόκολλο του πολιτισμού μας δεν φάνηκε να προκαλέσουν

de novo

CD4

αποκρίσεις + Τ κυττάρων. Το μέγεθος των αποκρίσεων και της διανομής των επιτόπων ήταν παρόμοια σε ασθενείς με καρκίνο και υγιή άτομα. Είναι γνωστό ότι οι επίτοποι που αναγνωρίζονται από το ρ53-ειδικό αντίσωμα περιορίζεται στο Ν-άκρο και την περιοχή C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης [32], [35]. Ωστόσο, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των χαρτών των επιτόπων για CD4

+ Τ κυττάρων και για αντισώματα (Σχήμα 4). Επιπλέον, η μετάλλαξη της πρωτεΐνης ρ53 σε καρκινικά κύτταρα συχνά βρίσκεται στην κεντρική περιοχή του γονιδίου [32]. Ωστόσο, δεν υπήρχε υπερεκπροσώπηση των CD4 επίτοπα

+ Τ-λεμφοκυττάρων σε αυτήν την περιοχή, υποδηλώνοντας ότι οι αποκρίσεις δεν διαμεσολαβείται από διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του μεταλλαγμένου πεπτιδίου-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα. Για να βρείτε μετάλλαξη ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα σε τρεις ασθενείς με μεταλλαγμένο ρ53 που εκφράζουν όγκου, CD4

+ Τ κύτταρα από τους ασθενείς είχαν προευαισθητοποιημένα με πεπτίδια που περιέχουν συγγενή μετάλλαξη των ασθενών. Παρά το γεγονός ότι ένας ασθενής οποίων ο όγκος είχε μετάλλαξη S127F έδειξαν ασθενή CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον και των δύο μεταλλαγμένα και αντίστοιχα πεπτίδια άγριου τύπου, καμία σημαντική μετάλλαξη ειδικά CD4

+ Τ κυτταρική απόκριση θα μπορούσε να ανιχνευθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Το μέγεθος των CD4

+ αποκρίσεις Τ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με ή χωρίς αντίσωμα ορό ρ53-ειδικά και υγιείς δότες έναντι ρ53 επικαλυπτόμενα πεπτίδια σχεδιάζεται. Κάθε σύμβολο αντιπροσωπεύει ένα άτομο. Όλες οι απαντήσεις φαίνονται ήταν σημαντικές σε σύγκριση με τον αριθμό των κηλίδων υποβάθρου. 6/12 οροθετικοί (ροζ σύμβολα) και 5/10 οροαρνητικά (μπλε σύμβολα) ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και 9/12 υγιή άτομα (μαύρα σύμβολα) έδειξαν θετικά CD4

+ Τ κυττάρων έναντι ρ53 κυττάρων στόχων πεπτίδιο-παλμική σε σύγκριση με unpulsed κύτταρα-στόχους.

η

Προέλευση του ρεπερτορίου της ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα

σε αντίθεση με την ανίχνευση του ρ53-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα σε οροθετικά και οροαρνητικά ασθενείς με καρκίνο καθώς και σε υγιείς δότες, το πρωτόκολλο presensitization μας επιτρέπει μόνο την ανίχνευση του ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ Τ κυττάρων σε NY-ESO-1 ασθενείς με καρκίνο οροθετικούς αλλά όχι σε ασθενείς οροαρνητικά καρκίνο και υγιείς τα άτομα όταν τα PBMC προερχόμενων ολόκληρο CD4

+ Τ κύτταρα προευαισθητοποιημένα με ΝΥ-ΕδΟ-1 επικαλυπτόμενα πεπτίδια. Ωστόσο, πρόσφατα αναφέρθηκε ότι NY-ESO-1-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα θα μπορούσαν να προκληθούν από CD45RA

+ αφελής CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιείς δότες μετά

in vitro

presensitization αφαιρώντας CD25

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα [36], [37]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι πρόδρομοι των κυττάρων NY-ESO-1-ειδικά CD4

+ T παρούσα σε υγιή άτομα είναι ευαίσθητα σε καταστολή από ρυθμιστικά Τ κύτταρα, αλλά σε ασθενείς με καρκίνο,

in vivo

διεγειρόμενων NY-ESO -1-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα γίνονται ανθεκτικά σε αυτή την καταστολή [36], [37]. Ανίχνευση ΙΡΝ-γ εκκρίνοντα ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιή άτομα μετά από μία μόνο

in vitro

ευαισθητοποίηση με την παρουσία των ρυθμιστικών Τ κυττάρων υποδηλώνει ότι είναι ήδη γεμάτοι,

in vivo

. Για να προσδιοριστεί η κατάσταση ενεργοποίησης της ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιείς δότες, αφελή και αντιγόνου έμπειρο CD4

+ Τ κύτταρα διαχωρίστηκαν με βάση την έκφραση CD45RA και διεγέρθηκαν με p53 επικαλυπτόμενα πεπτίδια. Επαγωγή του ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα αξιολογήθηκε με δοκιμασίες ELISPOT. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5Α και 5Β, σε αντίθεση με ό, τι είχε παρατηρηθεί με ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα, ρ53-ειδική ΙΡΝ-γ παραγωγή CD4

+ Τ κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα από ένα CD45RA

– αντιγόνο-έμπειρο πληθυσμό από υγιείς δότες. Επιπλέον, οι μικρότερες αποκρίσεις επίσης επάγονται από CD45RA

+ αφελής πληθυσμό κυττάρων Τ (Σχήμα 5Α). Επειδή CD45RA δεν αποτελεί απόλυτη δείκτης για παρθένα κύτταρα Τ, υπάρχει ακόμα μια πιθανότητα ότι η ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων στο

+ κυτταρικό πληθυσμό Τ CD45RA είχαν ήδη ενεργοποιηθεί

in vivo

[ ,,,0],38]. Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι τουλάχιστον ένα μέρος του ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα έχει ασταρωθεί

in vivo

ακόμη και σε υγιή άτομα.

(Α-Β)

In vivo

εκκίνηση του ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιή άτομα. CD4

+ CD45RA

+ αφελής και CD4

+ CD45RA

– αντιγόνο-έμπειρο Τ κύτταρα απομονώθηκαν με κυτταρομετρία ροής και προευαισθητοποιήθηκε με p53 επικαλυπτόμενα πεπτίδια. Μετά από 20 ημέρες, ρ53-ειδική ΙΡΝ-γ Τ κύτταρα που παράγουν αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες ELISPOT. Αυτόλογα Τ-APCs χρησιμοποιήθηκαν ως APCs. (Γ) Αναγνώριση των φυσικώς επεξεργασμένης πρωτεΐνης ρ53. ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυτταρικές γραμμές κατά p53 # 1- # 15 πεπτίδια πισίνα ή # 16- # 30 πεπτίδια πισίνα ήταν εγκατεστημένος από 3 υγιείς δότες όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Είχαν διεγείρονται από αυτόλογα mo-DC προ-παλλόμενα με πεπτίδια ρ53, ρ53 πρωτεΐνη, ή πρωτεΐνη ΝΥ-ΕδΟ-1. παραγωγή ΙΡΝ-γ αξιολογήθηκε με δοκιμασίες ELISPOT (αριστερά) και ELISA (δεξιά). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD διπλότυπων φρεατίων.

Η

Χαρακτηρισμός των ρ53-ειδικών CD4

+ Τ κύτταρα

Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων σε υγιή δότες, ρ53-ειδικών Τ κυτταρικές γραμμές δημιουργήθηκαν με απομόνωση CD154 εκφράζουν CD4

+ Τ κυττάρων μετά την επαναδιέγερση με πεπτίδια ρ53 που ακολουθείται από πολύκλωνα διαστολή με ΡΗΑ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η μέθοδος CD154 έκφραση που βασίζεται χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει πολλαπλές CD4

+ υποσύνολα κυττάρων Τ για την ανάλυση του μοτίβου κυτοκίνης παραγωγής [28]. Τέσσερις CD4

κυτταρικές σειρές + Τ παρήχθησαν έναντι του πεπτιδίου ρ53 πισίνες από 3 υγιείς δότες. Όλα

+ κυτταρικές γραμμές CD4 Τ παράγονται ειδικά GM-CSF, το οποίο παράγεται από τα δύο Th1 και Th2 κύτταρα, μετά από διέγερση με το πεπτίδιο-παλμική mo-DCs (Πίνακας 1). Επίπεδα άλλων κυτταροκινών που παράγονται από CD4

+ Οι Τ κυτταρικές γραμμές που φαίνονται στον Πίνακα 1. Σύμφωνα με την αποτελεσματική ανίχνευση του ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων με ΙΡΝ-γ ELISPOT δοκιμασίες, όλα ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κυτταρικές γραμμές από υγιείς δότες παρήγαγαν μεγάλες ποσότητες ΙΡΝ-γ. Εκτός από την ΙΡΝ-γ, σημαντικά επίπεδα IL-13 και μικρές ποσότητες IL-4 επίσης ειδικά παραχθεί, υποδεικνύοντας ότι οι κυτταρικές σειρές Τ ήταν ένα μίγμα κυττάρων Th1 και Th2. Δύο κυτταρικές σειρές CD4

+ T που παράγεται μικρά επίπεδα ανοσορυθμιστικών κυτοκινών, IL-10. Ένα CD4

+ Τ κυτταρική γραμμή που παράγεται μικρή αλλά σημαντική επίπεδα της IL-9, το οποίο παράγεται με Th9 και ρυθμίζεται από το IL-4 και ΤΟΡ-β, δυνητικά υποδεικνύοντας την παρουσία σηματοδότησης ΤΟΡ-β κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των p53 -εξειδικευμένης CD4

+ Τ κύτταρα. Ωστόσο, η παραγωγή του ΤΟΡ-β δεν ανιχνεύθηκε στο υπερκείμενο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, IL-17, η οποία παράγεται από Th17, δεν ανιχνεύθηκε σε οποιοδήποτε

κυτταρικές γραμμές + Τ CD4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, η αναγνώριση της φυσικά επεξεργασμένης πρωτεΐνης ρ53 διερευνήθηκε με τη χρήση αυτόλογων mo-ΑΧ ως APC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, όλα CD4

+ Τ κυτταρικές γραμμές που αναγνωρίζονται αποτελεσματικά κύτταρα στόχους πρωτεΐνη-παλμική ρ53 όπως ανιχνεύεται με έκκριση IFN-γ. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ρ53-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα ανιχνεύσιμη σε υγιείς δότες είναι σε θέση να αναγνωρίζουν φυσικά επεξεργασμένη πρωτεΐνη p53 και καθιστά απίθανο ότι αυτή είναι ενεργοποιημένη

in vivo

από άλλες πρωτεΐνες με παρόμοιες ακολουθίες.

Συζήτηση

συσσώρευση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 σε καρκινικά παρατηρείται συχνά σε πολλούς τύπους όγκων και επάγει χυμική ανοσοαποκρίσεις, καταδεικνύοντας ισχυρή ανοσογονικότητα του p53 [12]. Έτσι, το ρ53 έχει θεωρηθεί ένα υποσχόμενο στόχο για τον εμβολιασμό έναντι πολλαπλών τύπων καρκίνου. Ωστόσο, αναφέρουμε εδώ την αποτυχία να ανιχνεύσει

in vivo

διεγειρόμενων ρ53-ειδική CD8

+ Τ κυττάρου αποκρίσεων σε ασθενείς με καρκίνο με αυθόρμητη αντισώματα προς το ρ53, καθώς και σε ασθενείς p53-οροαρνητικά και σε υγιείς δότες χρησιμοποιώντας μόνο

in vitro

πρωτόκολλο ευαισθητοποίηση μας. Σε αντίθεση, το ίδιο πρωτόκολλο συχνά ανιχνεύεται NY-ESO-1-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα σε ασθενείς με καρκίνο του ΝΥ-ΕδΟ-1-οροθετικοί στην ίδια ομάδα μελέτης, υποδηλώνοντας ότι η φυσική ανοσογονικότητα να επάγει αυθόρμητη CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις μπορεί να είναι διαφορετική σε ρ53 και ΝΥ-ΕδΟ-1, ακόμα και σε οροθετικούς ασθενείς για αυτά τα αντιγόνα. Έχει αναφερθεί ότι αν και η κυκλίνη Β1-ειδικά CD8

+ Τ κυττάρων έγινε ανιχνεύσιμη μετά από μία μόνο

in vitro

διέγερση, ρ53-ειδική CD8

+ Τ κυττάρων έναντι 6 HLA-A * 02 δεσμευτική σύντομο πεπτίδια δεν μπόρεσε να ανιχνευθεί σε 5 κυκλίνης Β1-αντιδραστική και 5 μη αντιδραστικά ασθενείς που χρησιμοποιούν την ίδια μέθοδο [39]. Τα αποτελέσματά μας επεκτείνουν τις παρατηρήσεις τους με παρακολούθηση CD8

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις σε ολόκληρη την περιοχή της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας επικαλυπτόμενα πεπτίδια και συμπεριλαμβάνοντας με immunomonitoring αυθόρμητης αντισώματος και CD4

αποκρίσεις + Τ κυττάρων. Αρκετές δοκιμές εμβολίου όπως ρ53-μεταδιηγερμένα DCs ή μεγάλης επικαλυπτόμενα πεπτίδια έχουν αναφέρει επαγωγή αποκρίσεων Τ κυττάρου με περιορισμένη κλινικό όφελος [23], [24], [40], [41].