Αφηρημένο

All-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) έχει γίνει ευρέως διερευνηθεί για θεραπείες πολλών μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη .

HOXB13

, σιγήσει στην ανδρογόνων υποδοχέων-αρνητικό (AR

-) κύτταρα καρκίνου του προστάτη, παίζει ρόλο στην AR

– προστάτη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σύλληψη. Στη μελέτη αυτή προορίζεται να φωτιστούν οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού του AR

– προστάτη καρκινικών κυττάρων που προκλήθηκε από ATRA. Ανακαλύψαμε ότι ATRA ήταν σε θέση να επάγει την διακοπή αύξησης και να αυξηθεί

HOXB13

έκφραση σε AR

– κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τόσο ΕΖΗ2 και DNMT3b συμμετείχε στην καταστολή των

HOXB13

έκφραση μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει επιγενετική DNA και ιστονών μεθυλίωση τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, ΕΖΗ2 προσληφθεί DNMT3b να

HOXB13

υποστηρικτής να σχηματίσει ένα σύμπλοκο καταστολής. Επιπλέον, ATRA θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα πάνω

HOXB13

μέσω της μείωσης ΕΖΗ2 και DNMT3b εκφράσεις και μειώνοντας τις αλληλεπιδράσεις τους με το

HOXB13

υποκινητή. Ταυτόχρονα, το επίπεδο μεθυλίωσης της

HOXB13

υποκινητή μειώθηκε κατά την αγωγή της ATRA. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη εμπλέκεται μία νέα δράση του ATRA σε αναστολή της ανάπτυξης του AR

-. Ανθεκτικός ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω τροποποίησης του

HOXB13

έκφρασης ως αποτέλεσμα επιγενετικών τροποποιήσεων

Παράθεση: Liu Ζ, Ren G, Shangguan C, Guo L, Dong Ζ, Li Υ, et al. (2012) ATRA Αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 καρκίνου του προστάτη μέσω της μείωσης του επιπέδου μεθυλίωση του HOXB13 Gene. PLoS ONE 7 (7): e40943. doi: 10.1371 /journal.pone.0040943

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20, Απριλίου, 2012? Αποδεκτές: 15 Ιούνη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30971613, 31071149, 91019011, 30800557), και της βασικής έρευνας ταμεία για τις Κεντρικές πανεπιστήμια (09ZDQD01). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή κακοήθεια στους άνδρες στην Ευρώπη, τη Βόρεια Αμερική και σε ορισμένες αφρικανικές χώρες [1], [2]. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη έχει αυξηθεί μετά τη γήρανση του πληθυσμού παγκοσμίως [3]. Επί του παρόντος, συμβατικές θεραπείες όπως η εγχείρηση και η ορμονική αγωγή συχνά αποτυγχάνουν να επιτευχθεί το ικανοποιητικό αποτέλεσμα. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αποκτήσει τα ανθεκτικά ορμονών και φαρμάκων χαρακτηριστικά κάτω από αυτές τις τάσεις της θεραπείας [4]. Μέχρι στιγμής, οι προσπάθειες για την κατάκτηση αυτής της κακοήθους νόσου έχουν επιτύχει περιορισμένη επιτυχία [5]. Έτσι, έρευνες που στοχεύουν στην ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο του προστάτη παραμένει μια ανοικτή ευκαιρία.

HOXB13

γονίδιο ανήκει σε μια μεγάλη υπεροικογένεια ομοιοκυτίου, πολλά από τα οποία είναι παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν την αξονική περιφερειακή εξειδίκευση κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης [6], [7]. Περιορισμένη έκφραση του

HOXB13

παρατηρήθηκε στο ουραίο έκταση του νωτιαίου μυελού, του ουρογεννητικού κόλπου, και του παχέος εντέρου και του ορθού κύτταρα σε ανδρογόνα ανεξάρτητο τρόπο? αλλά εκφράζεται σε προστατικό ιστό με αξιοσημείωτη εξειδίκευση για να διατηρηθεί η κανονική φυσιολογική λειτουργία της και να επάγει την τελική διαφοροποίηση [8], [9].

HOXB13

έχει σιγήσει στο υποδοχέα ανδρογόνων-αρνητικό (AR

-) κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Jung

et al

. [5] έδειξε ότι η έκτοπη έκφραση του

HOXB13

σε καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή που επάγεται G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της αρνητικής ρύθμισης των Τ-κυττάρων παράγοντα-4, αλλά δεν οδήγησε σε μεταβολή των αποπτωτικών ρυθμό. Η υπερέκφραση του

HOXB13

στο AR

– προστάτη καρκινικών κυττάρων είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων [10]. Ωστόσο, ο μηχανισμός βασίζεται η παρούσα γονιδιακή σίγηση δεν είναι πλήρως κατανοητός. Πρόσφατα, ερευνήσαμε τις λειτουργίες της ομάδας Polycomb (PCG) πρωτεΐνες και επιγενετικών τις δράσεις τους σε αποσιώπηση του

HOXB13

στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, και διαπίστωσε ότι υπήρχε μια λογομαχία μεταξύ ακετυλίωση των ιστονών και τα μέλη των πρωτεϊνών ΟΠΣ καταστολή της

HOXB13

έκφρασης [11]. Σε αυτή τη μελέτη, θα παρείχε περαιτέρω ενδείξεις ότι μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) και πρωτεΐνες PCG αναστέλλεται συνεργικά

HOXB13

δραστηριότητα του υποκινητή.

All-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA), η βιταμίνη Α μεταβολίτης, θεατρικά έργα ένα ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη ρυθμίζοντας κυτταρικές διαδικασίες όπως πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και μετανάστευση [12]. ATRA υλοποιεί την δράση της με ειδικό δεσμευόμενο υπεροικογένειας πυρηνικών υποδοχέων, οι υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RARs). Οι RARs σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές με το X-υποδοχέα ρητινοειδούς [13]. Προγενέστερες μελέτες αποκάλυψαν ότι η θεραπεία των λευχαιμικών κυττάρων με ΑΤΡΑ είχε σαν αποτέλεσμα την απόπτωση, πιθανώς δευτερεύων στη διαδικασία διαφοροποίησης [14], [15]. Από ATRA μπορεί να διορθώσει παρεκκλίνουσα ανάπτυξη των κυττάρων και διεγείρουν απόπτωση, έχει ευρέως ερευνηθεί σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της πρόωρης γαστρικού καρκίνου του προστάτη και του καρκίνου [16], [17]. Σε AR

– και ανθεκτικοί στα φάρμακα DU145 κύτταρα καρκίνου προστάτη, ATRA αποδείχθηκε να αυξήσει την ευαισθησία των κυττάρων σε αντικαρκινικά docetaxel παράγοντα? Ωστόσο, οι μηχανισμοί πώς μόνος ATRA προκαλεί διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων παραμένουν ασαφείς [18].

PCG πρωτεΐνες είναι παγκόσμιες καταστολείς της γονιδιακής έκφρασης μέσω του σχηματισμού Polycomb κατασταλτικά συμπλόκου (PRC), όπως PRC1 και PRC2 [19]. Αρκετές πρωτεΐνες PCG ενοχοποιηθεί σε ογκογόνο δραστηριότητες [20]. Υπήρξαν ενδείξεις ότι δραστικότητα καταστολέα PCG αυξάνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [21]. Επιπλέον, ορισμένοι

PCG

γονιδιακά προϊόντα βρέθηκαν επίσης να απαιτούνται για τη σταθερή αποσιώπηση του

Hox

γονίδια σε όλη την

Drosophila

ανάπτυξη [22]. Enhancer της Zeste ομόλογο 2 (ΕΖΗ2), την καταλυτική υπομονάδα της PRC2, κατέχει μια δραστηριότητα μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών για ιστόνης 3 λυσίνη 27 trimethylation (H3K27me3), η οποία θεσπίζει ένα ισχυρό κατασταλτικό μήνυμα για τη γονιδιακή έκφραση [19]. Αποδείχθηκε ότι η έκτοπη υπερέκφραση του

ΕΖΗ2

όχι μόνο διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά επίσης και προωθείται ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και κυτταρική εισβολή

in vitro

[20]. Σε αντίθεση, η εξάντληση του

ΕΖΗ2 από

μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs) ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που επάγεται στον προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του κύτταρα [23], [24], [25].

η μεθυλίωση του DNA είναι ένα σημαντικό επιγενετική τροποποίηση που επηρεάζει τη μεταγραφή γονιδίων. Η μεθυλίωση του DNA σε κύτταρα θηλαστικών είναι εγκατεστημένος και συντηρείται από DNMTs. Μεθυλίωση ξεκίνησε από πολύ ομόλογο Dnmt3a και DNMT3b, και κληρονομικά πολλαπλασιάζονται με DNMT1 [26]. Μεταξύ αυτών των τριών ενζύμων, προς τα πάνω ρύθμιση του

DNMT3b

είναι ένα χαρακτηριστικό πολλών καρκινικών κυττάρων, και DNMT3b μπορεί να διαδραματίσει έναν αιτιώδη ρόλο στην ογκογένεση [27]. Μελέτες σε ένα μοντέλο ποντικού έδειξε ότι η υπερέκφραση του

DNMT3b

, αλλά όχι

Dnmt3a

, προωθείται ογκογένεση του παχέος εντέρου σε

ApcMin /+

ποντίκια [28]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση του

HOXB13

ελέγχθηκε σε μεθυλίωση με τρόπο που εξαρτάται και μεθυλίωση του συσχετίστηκε θετικά με το βαθμό του όγκου και εισβολή μικροαγγείων [29]. Στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου,

HOXB13

, ως στόχος της DNMT3b, μεθυλιώθηκε σε ανάντη νησί CpG, και λειτουργούσε ως καταστολέας των όγκων στην πρωτοβάθμια παχέος όγκους [26].

Από DNMT3b κάνει δεν έχουν πεδία δέσμευσης DNA, χρειάζεται μεταγραφή συμπαράγοντες για να αλληλεπιδρά με ειδικές αλληλουχίες του γονιδίου [30]. Είναι γνωστό ότι πολλά μέλη της PCG, όπως ΕΖΗ2, κατέχουν τις δεσμευτικές περιοχές για

HOXB13

υποστηρικτής, και καταστέλλουν

HOXB13

έκφραση μέσω της ιστόνης μεθυλίωσης [31]. Σημαντικά, ΕΖΗ2 έχει ενοχοποιηθεί για να διαδραματίσει καίριο ρόλο στη διαμεσολάβηση τόσο μεθυλίωση των ιστονών και της μεθυλίωσης του DNA των

HOXB13

γονιδίου σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα [21], [32]. Επίσης, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ΥΥ1 και η αποακετυλάσης της ιστόνης 4 (HDAC4) επηρέασε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη από την καταστολή

HOXB13

μεταγραφή μέσω της τροποποίησης των ιστονών [11]. Αυτά τα διαθέσιμα δεδομένα μας κέντρισε το ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι ΕΖΗ2 να είναι σε θέση να προσλάβει DNMT3b να

HOXB13

υποκινητή να καταστέλλει την έκφραση του μέσα από συγκεκριμένα επιγενετικές τροποποιήσεις.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινίσει τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού σε AR

– προστάτη καρκινικών κυττάρων που προκλήθηκε από ATRA. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι ATRA ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη DU145 κυττάρων μέσω προς τα πάνω ρύθμιση

HOXB13

έκφραση, μειώνοντας το επίπεδο μεθυλίωσης της. Αυτό επιτεύχθηκε με ATRA να αλλοιώσει τη δράση του ΕΖΗ2 και DNMT3b, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη μεθυλίωση του

HOXB13

υποκινητή. Δεδομένα κατέρρευσε από τη μελέτη αυτή μπορεί να παράσχει χρήσιμες ενδείξεις για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για AR

– καρκίνο του προστάτη που περιλαμβάνουν τη χρήση του ATRA και επιγενετικών τροποποιητές

Αποτελέσματα

HOXB13 συμμετείχε. σε ΑΤΡΑ επαγόμενη DU145 κυτταρική ανάπτυξη σύλληψης

ATRA αναφέρθηκε για να είναι σε θέση να επάγουν διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων, αλλά ο μηχανισμός δεν είναι πλήρως σαφής. Η υπερέκφραση του HOXB13 στο AR

– προστάτη καρκινικά κύτταρα μπορεί επίσης να οδηγήσει σε σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Για να διευκρινιστεί αν HOXB13 παίζει ένα ρόλο στην προκαλούμενη από ΑΤΡΑ διακοπή της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη κύτταρα, ελέγξαμε πρώτα το σχετικό ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων μετά τη θεραπεία του ATRA. κύτταρα DU145 εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΤΡΑ (από 20 έως 120 μΜ) για 24, 48 και 72 ώρες. Όπως αποδεικνύεται στο σχήμα. 1Α και 1Β, ATRA πράγματι επαγόμενη διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων σε κύτταρα DU145 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Υψηλή κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε σε 72 ώρες. Εν τω μεταξύ, τόσο HOXB13 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν αυξημένα σε DU145 κύτταρα κατά την αγωγή ATRA (Εικ. 1 C). Επαληθεύσαμε περαιτέρω την επίδραση της ATRA σε άλλο AR

– προστάτη κυτταρική σειρά καρκίνου του PC-3, και παρατηρήσαμε την παρόμοια εξαρτώμενη από την δόση επίδραση του ATRA κατά τη σύλληψη της κυτταρικής ανάπτυξης, όπως αποκαλύπτεται από προσδιορισμούς ΜΤΤ (Εικ S1.). Εν τω μεταξύ, τόσο HOXB13 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν επίσης αυξημένα κατά την κατεργασία ATRA (Εικ. S2).

(Α) δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα της ATRA επί DU145 κυτταρική ανάπτυξη σύλληψης. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του ΑΤΡΑ για 72 ώρες. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 (n = 6). (Β) Χρονική πορεία της επίδρασης διακοπής αύξησης του ATRA σε κύτταρα DU145. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 (n = 6). (Γ) ATRA αυξημένη έκφραση HOXB13 σε κύτταρα DU145. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 80 μΜ ATRA επί 72 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε για RT-PCR (

uppe

R), και το σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκε για την κηλίδωση Western (

κατώτερο

). (Δ) Το ATRA επαγόμενη DU145 διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων αντιστράφηκε εν μέρει με την καταστολή της έκφρασης HOXB13. Η ανάπτυξη των κυττάρων ισχυρός μετρήθηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 (n = 6)

Η

Στη συνέχεια, για να ελέγξετε το ρόλο της HOXB13 στην ATRA-. μεσολάβηση DU145 ανάπτυξη των κυττάρων σύλληψη, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα το

HOXB13

πλασμίδιο siRNA σε κύτταρα DU145 θεραπεία με ATRA. Η κατασκευή και παρεμβαίνει αποτελεσματικότητα της HOXB13 siRNA περιγράφονται στην προηγούμενη έκθεσή μας [11]. Βρήκαμε ότι knockdown του HOXB13 με siRNA προφανώς ανέστρεψε την διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων που προκαλείται από ΑΤΡΑ (Σχ. 1D). Αυτό ενοχοποιηθεί ότι το ATRA που προκαλείται DU145 διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων που σχετίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, με την έκφραση της HOXB13.

DNMT3b Συμμετοχή σε HOXB13 μεταγραφική καταστολή

HOXB13

γονίδιο σιγήσει στο AR

– προστάτη καρκινικών κυττάρων και υπερέκφραση του HOXB13 στο AR

– προστάτη καρκινικών κυττάρων είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων [10]. Στη συνέχεια εξέτασαν τα μοριακά γεγονότα που εμπλέκονται στην

HOXB13

γονιδιακή σίγηση στο AR

– προστάτη καρκινικά κύτταρα. Ο υποκινητής του

HOXB13

έχει συχνά αναφερθεί ότι υπερμεθυλίωση σε διάφορες μορφές καρκίνου [33]. Για να διευκρινιστεί αν αποσιώπηση του

HOXB13

γονίδιο διαμεσολαβείται από DNA υπερμεθυλίωση στο AR

– κύτταρα καρκίνου προστάτη, εκτιμήσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του

HOXB13

υποκινητή με τη χρήση του όξινου θειώδους αλληλουχίας PCR (BSP), και βρήκαμε ότι οι

HOXB13

υποστηρικτής ήταν πιο εντατικά μεθυλιωμένο στα κύτταρα DU145 σε σύγκριση με εκείνη στα ταπεινούς κακοήθη LNCaP κύτταρα (Εικ. 2Α, Β).

δοκιμασίες BSP έδειξε την μεθυλίωση των CpG νησίδων στον υποκινητή HOXB13 σε άκρως κακοήθη κύτταρα DU145 (Α) και σε ταπεινούς κακοήθη κύτταρα LNCap (Β). (Γ) HOXB13 ρυθμίζεται αυξητικά σε κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με το πλασμίδιο DNMT3b siRNA, συγκριτικά με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον φορέα siRNA ελέγχου. (D) δοκιμασίες BSP έδειξε το μειωμένο επίπεδο μεθυλίωσης του υποκινητή HOXB13 στα κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με DNMT3b siRNA (

κάτω

), σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA (

πάνω

).

Η

Δεδομένου ότι το DNA μεθυλοτρανσφεράση DNMT3b διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μεθυλίωση των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο, και

HOXB13

αναφέρθηκε ότι είναι ένα γονίδιο στόχος του DNMT3b σε πρωτογενείς όγκους του παχέος [26], [27], μπορούμε πιθανολογείται ότι DNMT3b μπορούν επίσης να συμμετέχουν σε

HOXB13

μεταγραφική καταστολή στα κύτταρα DU145. Για να επαληθευθεί αυτή η υπόθεση, θα γκρέμισε την έκφραση DNMT3b με ένα συγκεκριμένο siRNA, και βρήκαμε ότι το HOXB13 έκφραση προφανώς αυξημένη στα κύτταρα DU145 και η παρεμβαίνει αποτελεσματικότητα της DNMT3b siRNA είχε δείξει (Εικ. 2C). Τα αποτελέσματα από προσδιορισμούς BSP έδειξε ότι το επίπεδο μεθυλίωσης του

HOXB13

υποκινητή σε DU145 μειώθηκε μετά knockdown του ενδογενούς DNMT3b (Σχ. 2D, κατώτερο), σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2D άνω). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τροποποίηση της μεθυλίωσης του DNA που προκαλούνται από DNMT3b ήταν υπεύθυνος για την αποσιώπηση του

HOXB13

στα κύτταρα DU145.

Η PCG Πρωτεΐνες ΕΖΗ2 και BMI1 Συμμετοχή σε HOXB13 μεταγραφική καταστολή

στη συνέχεια, προορίζεται για τον προσδιορισμό του παράγοντα (ες) μεταγραφής που μπορούν να συμμετέχουν στην ρύθμιση του

HOXB13

γονίδιο. Οι πρωτεΐνες PCG έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην εξέλιξη της προστάτη και του μαστού, καθώς και σε αποσιώπηση του

HOXs

[3], [21], [34], [35]. Πρέπει πρώτα διαπίστωσε ότι οι εκφράσεις των πρωτεϊνών PCG ΕΖΗ2 και BMI1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε εξαιρετικά κακοήθη κύτταρα DU145 ό, τι σε ταπεινούς κακοήθη LNCaP κύτταρα, και τις εκφράσεις τους ήταν αρνητική συσχέτιση με HOXB13 έκφραση, όπως αποκαλύπτεται από RT-PCR και κηλίδωση Western (Εικ. 3Α, Β).

Το mRNA (Α) και πρωτεΐνες (Β) επίπεδα BMI1, ΕΖΗ2 και HOXB13 σε διάφορα καρκινικά κύτταρα κακοήθεια του προστάτη, LNCap και DU145. (C) Τα επίπεδα mRNA του HOXB13 και ΕΖΗ2 σε κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με ΕΖΗ2 siRNA πλασμίδιο. (D) Τα επίπεδα mRNA του HOXB13 και BMI1 σε κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με BMI1 siRNA πλασμίδιο. (Ε) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του HOXB13 και ΕΖΗ2 στα κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με ΕΖΗ2 siRNA πλασμίδιο. (Στ) τα επίπεδα της πρωτεΐνης του HOXB13 και BMI1 στα κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με BMI1 siRNA πλασμίδιο.

Η

Για την περαιτέρω διευκρινίσει αν ΕΖΗ2 και BMI1 συμμετείχε σε

HOXB13

μεταγραφική καταστολή σε DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα, κατασκευάσαμε ΕΖΗ2 siRNA και BMI1 siRNA πλασμίδια και επιμολύνονται τους σε κύτταρα DU145, αντίστοιχα. Διαπιστώσαμε ότι τόσο HOXB13 mRNA (Σχ. 3C, E) και πρωτεϊνών (Εικ. 3D, F) επίπεδα ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, όταν ΕΖΗ2 και BMI1 ήταν γκρέμισε. Οι ανασταλτικές αποδόσεις αυτών των πλασμιδίων siRNA στην ενδογενή ΕΖΗ2 και BMI1 σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης δείχθηκε (Σχήμα 3C, D και Ε, ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΕΖΗ2 και BMI1 μπορεί να καταστείλει την έκφραση HOXB13 μεσολαβώντας την τροποποίηση των ιστονών μεθυλίωσης.

DNMT3b προσλήφθηκε στην HOXB13 Διοργανωτή από ΕΖΗ2

Ως συν-καταστολείς της μεταγραφής, DNMTs δεν διαθέτουν κανονική DNA περιοχές σύνδεσης και συνήθως προσλαμβάνονται σε συγκεκριμένες περιοχές χρωματίνη από παράγοντες μεταγραφής [26], [30]. Σημαντικά, ΕΖΗ2 έχει αναφερθεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στη διαμεσολάβηση τόσο μεθυλίωση των ιστονών και της μεθυλίωσης του DNA των

HOXB13

γονιδίου σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα [21], [32]. Στη συνέχεια θέλησε να προσδιορίσει αν ΕΖΗ2 στρατολογεί DNMT3b να

HOXB13

υποκινητή. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις τσιπ για την ανίχνευση μεταβολών στη σύνδεση των ΕΖΗ2 στις τρεις καθορισμένες περιοχές (P1-P3) του

HOXB13

υποστηρικτής μετά το νοκ ντάουν της ενδογενούς ΕΖΗ2. Το μέτρο ανοδική περιοχή Ρ4 επιλέχθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος (Σχ. 4Α). Τα αποτελέσματα ChIP έδειξαν ότι η αφθονία των ΕΖΗ2 στο P1-P3 του

HOXB13

υποστηρικτής μειώθηκε κατά ενδογενούς ΕΖΗ2 κατεστάλη από

ΕΖΗ2

siRNA στα κύτταρα DU145. Παράλληλα, το επίπεδο H3K27me3 σχετίζονται με τη λειτουργία ΕΖΗ2 στο P1-P3 ήταν προφανώς μειωμένη (Εικ. 4Β).

(Α) Διάγραμμα της anking περιοχής 5′-fl του γονιδίου HOXB13. Ρ1, Ρ2 και Ρ3 δηλώνουν τις τρεις περιοχές υποκινητή της HOXB13 γονιδίου αναλύθηκε σε δοκιμασίες ChIP, και Ρ4 είναι ένα ακραίο αρνητικό μάρτυρα. δοκιμασίες (Β) ChIP σε κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με ΕΖΗ2 siRNA και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα και αντι-H3K27me3 αντίσωμα, αντίστοιχα. αναλύσεις (C) CoIP για την ανίχνευση της σύνδεσης των DNMT3b με ΕΖΗ2 στα κύτταρα DU145. Κυττάρων πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και καταβυθίστηκε με αντι-ΕΖΗ2 ή αντι-DNMT3b αντίσωμα και ανιχνεύεται με ανοσοστύπωμα με αντι-DNMT3b ή αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα. (D) δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σε κύτταρα DU145 επιμολυσμένα με ΕΖΗ2 siRNA και DNA ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-DNMT3b αντίσωμα. Οι ποσότητες της καταβυθίζεται DNA προσδιορίστηκαν με PCR.

Η

Επιπλέον, CoIP δοκιμασίες με εκχυλίσματα κυττάρων DU145 αποκάλυψε ότι συμπλέγματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-DNMT3b ή αντι-ΕΖΗ2 αντισώματα, και θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε ανοσοκηλίδωση με αντι -EZH2 ή αντι-DNMT3b αντισωμάτων, αντίστοιχα (Εικ. 4C), προτείνοντας ότι DNMT3b και ΕΖΗ2 ήταν παρόντα στο ίδιο συγκρότημα. τσιπ δεδομένα μας στο σχ. 4D ανέφερε ακόμη ότι η αφθονία των DNMT3b στις τρεις περιοχές υποκινητή (P1-P3) μειώθηκε κατά το νοκ ντάουν της ενδογενούς ΕΖΗ2. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι DNMT3b είχε προσληφθεί για να

HOXB13

υποκινητή από ΕΖΗ2.

ATRA απομειωμένα ΕΖΗ2 και DNMT3b Έκφρασης και Αποδυναμωμένη αλληλεπιδράσεις τους με HOXB13 Διοργανωτή

Έχουμε αποδείξει παραπάνω προκύπτει ότι HOXB13 ήταν μειωτικά από ΕΖΗ2 και DNMT3b, και η θεραπεία ATRA οδήγησε σε μια αύξηση στο

HOXB13

έκφραση στα κύτταρα DU145. Για να βεβαιωθείτε ότι η υπόθεσή μας ATRA μπορεί να διευκολύνει την έκφραση HOXB13 μέσω αλλοιώνοντας τα αρνητικά ρυθμιστικά αποτελέσματα του ΕΖΗ2 και DNMT3b επί HOXB13, εξετάσαμε την έκφραση ΕΖΗ2 και DNMT3b σε κύτταρα DU145 σε επεξεργασία με 80 μΜ ATRA, και 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης (5 αζα-dc) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας απομεθυλίωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εκφράσεις τόσο ΕΖΗ2 και DNMT3b ρυθμίστηκαν προς τα κάτω κατά την κατεργασία ATRA τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (σχ. 5Α, Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από μια παράλληλη μελέτη χρησιμοποιώντας άλλο AR

-. Κακοήθους προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά PC-3 (Εικ. S2)

Θεραπεία των 80 μΜ ATRA απορυθμίζεται HOXB13 και μειωτικά ΕΖΗ2 και DNMT3b εκφράσεις στο επίπεδο mRNA (Α) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Β) σε κύτταρα DU145. 5-αζα-dc χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος απομεθυλίωση. Ελέγχου 1 ήταν ισοπυκνωτικής απόλυτης αιθανόλης και ελέγχου 2 ήταν ισοπυκνωτικής οξικό οξύ (C) ATRA απομειωθεί τις συνδέσεις των ΕΖΗ2 και DNMT3b, και μείωσε το επίπεδο H3K27me3 σε HOXB13 υποκινητή. δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σε κύτταρα DU145 σε επεξεργασία με 80 μΜ ATRA και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-H3K27me3, αντι-DNMT3b ή αντι-ΕΖΗ2 αντίσωμα. Τα ποσά των καθιζάνει ενδογενούς HOXB13 προαγωγέα DNA προσδιορίστηκαν με PCR. (D) δοκιμασίες BSP έδειξε την μειωμένη μεθυλίωση του υποκινητή HOXB13 σε κύτταρα DU145 μετά την αγωγή κατόπιν 80 μΜ ATRA, σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα.

Η

δοκιμασίες ChIP μας περαιτέρω αποδειχθεί ότι οι δέστρες του ενδογενούς ΕΖΗ2 και DNMT3b στο

HOXB13

υποστηρικτής μειώθηκε μετά τη θεραπεία ATRA, και εν τω μεταξύ τα επίπεδα H3K27me3 σε περιοχές P1-P3 ήταν προφανώς μειωμένη (Εικ. 5C).

Επιπλέον, αναλύσεις BSP αποκάλυψε ότι η θεραπεία με ATRA είχε ως αποτέλεσμα στη μείωση του επιπέδου μεθυλίωσης των CpG νησίδων στο

HOXB13

υποκινητή σε αντίθεση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων DU145 (Σχ. 5D). Προφανώς, ΕΖΗ2 προσληφθεί DNMT3b να

HOXB13

υποκινητή και ενεργοποιείται το γονίδιο σιωπή με την πρόκληση της H3K27me3 και αυξάνοντας τη μεθυλίωση των CpG νησίδων. Εν τω μεταξύ, τόσο η μεθυλίωση του DNA και H3K27me3 του

HOXB13

υποκινητή θα μπορούσε να μειωθεί κατά ATRA.

Συζήτηση

ATRA διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη ρυθμίζοντας διάφορες κυτταρικές διεργασίες και έχει γίνει ευρέως ερευνηθεί σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές ως ένας παράγοντας για τη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της πρόωρης γαστρικού καρκίνου και του καρκίνου του προστάτη [16], [17]. Επίσης, HOXB13 δείχθηκε να παίζουν ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης σε AR

– προστάτη [10], ορθοκολικό καρκίνο [26] και του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων [29]. Σύμφωνα με αυτές τις προηγούμενα δεδομένα, τα αποτελέσματα από τη μελέτη αυτή έδειξε ότι ATRA ήταν σε θέση να επάγει την ανάπτυξη σύλληψη δύο AR

– (. Εικ. 1Α και το Σχήμα S1) κυττάρων καρκίνου του προστάτη DU145 και PC-3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο , και αυτό το αποτέλεσμα επιτεύχθηκε εν μέρει μέσω της προώθησης HOXB13 mRNA και παραγωγή πρωτεΐνης (Εικ. 1 C και S2, S3). Αντίθετα, μια πρόσφατη έκθεση περιγράφεται ότι η εξουδετέρωση της ενδογενούς HOXB13 από την RNA παρεμβολής σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών σχετίστηκε με μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων [36]. Αυτές οι αντιφατικές περιγραφές μπορεί να είναι τα αποτελέσματα από την προφανή διαφορά μεταξύ των ωοθηκών και άλλων οργάνων, αφού HOXB13 είναι ανέκφραστη σε κανονική ωοθήκη [36], ενώ εκφράζεται σε υψηλό επίπεδο σε φυσιολογικό προστάτη και των νεφρών [5], [29]. Παρ ‘όλα αυτά, τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα έκθεση παρέχει ενδείξεις ότι η θεραπεία ATRA ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη DU145 κύτταρα, μέσω ενός μηχανισμού που εμπλέκεται στην ρύθμιση προς τα πάνω HOXB13 με τη μείωση του επιπέδου μεθυλίωσης σε υποκινητή γονιδίου.

Η μεθυλίωση του DNA καταλύεται και συντηρείται από DNMTs. Ορισμένες DNMTs, που εκφράζεται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα σε σωματικά κύτταρα, συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκινικά κύτταρα. Αποκτήστε-του-λειτουργία μελέτες έδειξαν ότι DNMT3b αλλά δεν Dnmt3a προωθείται ογκογένεση του παχέος εντέρου σε APC

Min /+ ποντίκια από την πρόκληση

de novo

μεθυλίωσης των πολλαπλών γονιδίων που φέρουν CpG νησίδων [26]. Υπήρχε επίσης ένδειξη ότι η εξάντληση των DNMT3b οδήγησε σε αυξημένο ρυθμό απόπτωσης και μειωμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων PC-3 προστάτη [37]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι HOXB13 έκφραση σίγησε σε DU145 (Εικ. S4), και BSP δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι η σιωπή της μπορεί να σχετίζεται με την υπερμεθυλίωσης του γονιδίου υποκινητή (Εικ. 2Α). Έχει αναφερθεί ότι

HOXB13

γονίδιο ήταν ένας στόχος της DNMT3b σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [26]. Ως εκ τούτου, καθίσταται σημαντικό να κατανοήσουν τη λειτουργία της DNMT3b στην αποσιώπηση του

HOXB13

γονιδίου σε DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι θα μπορούσε να ρυθμίσει DNMT3b

HOXB13

μεταγραφή μέσω μεταβολής της τροποποίησης μεθυλίωσης του DNA στο γονίδιο υποκινητή, αν και knockdown του DNMT3b δεν μείωσε τη μεθυλίωση των CpG σε

HOXB13

υποκινητή όπως αναμένεται (Σχ. 2C, D). Προφανώς, άλλοι μηχανισμοί μπορεί να υπάρχουν στις οποίες βασίζεται η DNMT3b μεσολάβηση

HOXB13

καταστολή.

Ειδικότερα, η κανονική και παρεκκλίνουσα προτύπων μεθυλίωσης μπορεί να προκαλείται από χρωματίνης πρωτεΐνες κατευθυντήριες μεθυλοτρανσφεράσες DNA σε γονίδια-στόχους τους [38] . Πιο πρόσφατα, η PCG πρωτεΐνη ΕΖΗ2 αναφέρθηκε για την πρόσληψη μεθυλοτρανσφεράσες DNA, ιδιαίτερα DNMT1 και DNMT3b, για την εφαρμογή της αποσιώπηση του

MYT1

και

WNT1

τόπους μέσω μεθυλίωσης του DNA [21], [32 ]. Η υπερέκφραση του ΕΖΗ2 εμφανίζεται συνήθως σε ένα ποικίλο κακοηθειών, που περιλαμβάνουν καρκίνους του προστάτη, του μαστού και του ήπατος, ιδιαίτερα σε προχωρημένες περιπτώσεις [39]. Varambally

et al

[40] κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η απορυθμισμένη έκφραση ΕΖΗ2 μπορεί να είναι μια αιτία της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, καθώς επίσης και όντας ένας δείκτης που διακρίνει νωχελικός καρκίνο του προστάτη από εκείνους που διατρέχουν κίνδυνο θανατηφόρου εξέλιξης. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι PCGS συμμετείχε στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Δείξαμε ότι η έκφραση του ΕΖΗ2 και BMI1 ήταν πολύ υψηλότερη σε κύτταρα DU145 ό, τι σε κύτταρα LNCaP (Σχ. 3Α, Β). Ακόμη πιο ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι PCGS καταστέλλεται HOXB13 έκφραση σε κύτταρα DU145. RT-PCR και κηλίδωση Western αναλύσεις έδειξαν ότι HOXB13 έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά όταν ΕΖΗ2 και BMI1 χτυπήθηκαν κάτω (Σχ. 3C, Δ, Ε και ΣΤ). Περαιτέρω, δοκιμασίες ChIP μας αποκάλυψαν ότι ΕΖΗ2 ήταν ικανό να δεσμεύεται απευθείας πάνω στο

HOXB13

προαγωγό (Εικ. 4Β), και αυτό μπορεί να είναι ένας μηχανισμός σίγηση του

HOXB13

στην DU145 κακοήθη καρκίνο του προστάτη κύτταρα.

έχει προταθεί ότι ΕΖΗ2 καταστέλλει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων, κυρίως μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών. Το πρώτο περιλαμβάνει την πρόσδεση του ΕΖΗ2 να υποκινητή του γονιδίου-στόχου να επάγει την τροποποίηση H3K27me3, μειώνοντας έτσι την δραστικότητα προαγωγέα [39], [41]. Ο δεύτερος μηχανισμός προτείνει ότι ΕΖΗ2 προσλαμβάνει συν-καταστολέα ή σύνθετη, όπως DNMT1 και DNMT3b, με τον υποκινητή και αυτή η συν-καταστολέα είτε αρνητικά επηρεάζει άλλους παράγοντες που είναι παρόντες, ή αλλοιώνει την τοπική δομή χρωματίνης για να διευκολύνει την καταστολή [30], [35]. Προφανώς, τα αποτελέσματα από τη μελέτη αυτή είναι σε γενική συμφωνία με δύο από τα δύο μοντέλα. Συγκεκριμένα, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ΕΖΗ2 ήταν σε θέση να δεσμεύονται άμεσα με την

HOXB13

υποκινητή να επάγει την τροποποίηση H3K27me3 (Εικ. 4Β). Εν τω μεταξύ, τα δεδομένα μας επίσης πρότεινε ότι ΕΖΗ2 μπορεί να προσλαμβάνει DNMT3b να

HOXB13

υποκινητή να επηρεάσουν την κατάσταση μεθυλίωσης υποκινητή και συνεπώς καταστέλλουν τη μεταγραφή του γονιδίου (Σχ. 4C, D). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν περαιτέρω αποδείξεις για μια στιχομυθία μεταξύ των δύο διακριτών επιγενετικών μηχανισμών γονίδιο σιωπή.

ATRA είναι συνήθως χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα, όπως η δοκεταξέλη, TSA και ζολεδρονικό οξύ στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [18], [42], [43], αλλά ο μοριακός μηχανισμός δράσης ATRA είναι ασαφής. Το γεγονός ότι ΕΖΗ2 στρατολογεί DNMT3b με το

HOXB13

υποστηρικτής για την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, και ότι η θεραπεία με ATRA αποτελέσματα στην προς τα πάνω ρύθμιση του HOXB13 έκφρασης, μας κέντρισε το ενδιαφέρον να προτείνει μια υπόθεση που θα μπορούσε να ATRA upregulate HOXB13 μέσω της μείωσης του επίπεδο μεθυλίωσης του γονιδίου επάγεται από ΕΖΗ2 και DNMT3b. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη επικυρώνεται ότι οι εκφράσεις του

ΕΖΗ2

και

DNMT3b

μειώθηκαν μετά από αγωγή ATRA τόσο DU145 και 3-PC κυτταρικές σειρές (Σχ.5 Α, Β και Εικ. S2, S3 ). Επίσης, οι συνδέσεις των ΕΖΗ2 και DNMT3b πάνω στο

HOXB13

υποκινητή και το επίπεδο H3K27me3 σύμφωνα με την οποία μειώθηκαν σε κύτταρα DU145 θεραπεία με ATRA (Εικ. 5C). Είναι ενδιαφέρον, BSP αναλύσεις αποκάλυψαν ότι το επίπεδο μεθυλίωσης του DNA των

HOXB13

υποστηρικτής μειώθηκε επίσης σε κύτταρα DU145 κατά την αγωγή ATRA (Εικ. 5D).

Υπάρχουν τρεις

RAR

γονίδια, δηλαδή,

ΡΑΡα, β

και

γ

στα κύτταρα, και έχουν όλες τις απαιτούμενες για τη λειτουργία ATRA. Δεδομένου ότι

RARβ

έχει σιγήσει στα κύτταρα DU145, η ευαισθησία των κυττάρων DU145 να ATRA είναι χαμηλότερη από εκείνη των LNCaP κυττάρων [44]. Εν τω μεταξύ, εξετάσαμε επίσης την επίδραση της ATRA σε 293 κύτταρα και 293Τ, δύο φυσιολογικό ανθρώπινο κύτταρο νεφρού σειρές εμβρυϊκών. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ευαισθησία αυτών των κυττάρων να ATRA ήταν υψηλότερη από ότι σε DU145 κύτταρα (Σχ. S5A). Εμφανώς, η θεραπεία του AR

– προστάτη καρκινικά κύτταρα με ATRA δεν άλλαξε τις εκφράσεις του HOXB13, ΕΖΗ2 και DNMT3b σε επίπεδο mRNA (Σχήμα S5B.), Εμπλέκοντας έναν διαφορετικό μηχανισμό δράσης ATRA σε αυτό το συγκεκριμένο υπόβαθρο κυττάρων. Προφανώς, οι επιγενετικές τροποποιήσεις που διαμεσολαβείται από ATRA που περιγράφονται στην παρούσα έκθεση μπορεί πιθανώς να περιορίζεται σε ορισμένους τύπους καρκινικών κυττάρων, όπως AR

– καρκινικών κυττάρων του προστάτη, δεδομένου ότι δεν υπήρξαν αναφορές για ATRA μεσολάβηση επιγενετικές τροποποιήσεις σε φυσιολογικά κύτταρα μέχρι σήμερα. Ομοίως, οι περισσότερο κακοήθη και φάρμακο ανθεκτικά κύτταρα PC-3 επέδειξε μια ακόμα υψηλότερη ευαισθησία για ATRA από κύτταρα DU145 (Εικ. S1).

Μια προηγούμενη έκθεση κατέρρευσε ότι η μειωμένη έκφραση DNMT3b οδήγησε σε υπομεθυλίωση του

ρετινοβλάστωμα (Rb)

,

RARβ

, και

αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC)

γονίδιο υποστηρικτές [37]. Πιθανώς, προς τα κάτω ρύθμιση μπορεί να ενισχύσει DNMT3b εν μέρει την ευαισθησία των κυττάρων DU145 να ATRA, και αυτό μπορεί να δημιουργήσει ένα θετικό ανατροφοδοτεί μεταξύ της θεραπείας ATRA και την προς τα κάτω ρύθμιση DNMT3b για τη διευκόλυνση της HOXB13 έκφραση, και, κατά συνέπεια, να επάγει την διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων DU145. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ATRA ήταν σε θέση να ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση των HOXB13 και να επάγει DU145 κύτταρα διακοπή αύξησης, ως αποτέλεσμα του μειωμένου επιπέδου μεθυλίωσης του

HOXB13

. Αυτό θέτει ένα ερώτημα αν μια συνεργιστική δράση μεταξύ ATRA και DNMTs αναστολείς, π.χ. 5-αζα-dc, υπάρχει. Τα αποτελέσματα από ΜΤΤ μας και πειράματα PCR πραγματικού χρόνου υποστήριξαν αυτή την υπόθεση, δεδομένου ότι η ταυτόχρονη θεραπεία τόσο της ATRA και 5-αζα-dc επέδειξε μια πολύ ισχυρότερη ανασταλτικά αποτελέσματα σε κύτταρα DU145 από κάθε ένα από τα δύο φάρμακα μόνο του (Σχ. S6). Εν τω μεταξύ, η έκφραση της HOXB13 ρυθμίζεται αυξητικά, αλλά και οι δύο ΕΖΗ2 και DNMT3b ρυθμίστηκαν προς τα κάτω αισθητά κατά την επεξεργασία των δύο φαρμάκων (Εικ. S7).

Συνολικά, τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε αυτή την υποστήριξη έκθεση ένα μοντέλο εργασίας στην οποία HOXB13 , ΕΖΗ2 και DNMT3b εμπλέκονται σε ΑΤΡΑ επαγόμενη διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων σε κύτταρα DU145 (Εικ. 6). Συγκεκριμένα, ATRA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των DU145 κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω της μείωσης του επιπέδου μεθυλίωσης του

HOXB13

υποκινητή που προκαλείται από ΕΖΗ2 και DNMT3b. Προοπτικά, τα δεδομένα που προκύπτουν από τη μελέτη αυτή μπορεί να παράσχει χρήσιμες ενδείξεις για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για AR

-. Καρκίνο του προστάτη που περιλαμβάνουν τη χρήση του ATRA και επιγενετικών τροποποιητές

ΕΖΗ2 προσδένεται απευθείας πάνω στο προαγωγό HOXB13 και προκαλεί trimethylation της H3K27 να καταστείλει το HOXB13 έκφρασης. DNMT3b προσλαμβάνεται για HOXB13 υποκινητή με ΕΖΗ2 να επάγει την υπερμεθυλίωση του DNA με αποτέλεσμα την περαιτέρω καταστολή του γονιδίου. Εν τω μεταξύ, ATRA καταστέλλει έκφραση ΕΖΗ2 και DNMT3b, και εξασθενίζει σύνδεσής τους σε προαγωγό HOXB13 να μειώσει το επίπεδο μεθυλίωσης του υποκινητή HOXB13, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του HOXB13, η οποία με τη σειρά της αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων DU145. Επιπλέον, η καταστολή της DNMT3b ρυθμίζει προς τα πάνω και το

RARβ

έκφρασης, η οποία μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία των κυττάρων DU145 να ATRA. Μια συνδυασμένη θεραπεία τόσο του ATRA και 5-αζα-dc επιφέρει ενισχυμένη επιπτώσεις στην HOXB13 ρύθμιση προς τα πάνω και την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων DU145.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

DU145, τα κύτταρα PC-3, LNCap, 293 και 293Τ αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας (Σαγκάη, Κίνα).