Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) που προκαλείται από το ΕΤΠ προωθεί τραχήλου της εξέλιξης του καρκίνου? Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν το ΕΤΠ που προκαλείται από EMT παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, ανέφερε ότι η υπερέκφραση miR155 κατέστειλε προκαλούμενη από EGF EMT, μειωμένη ικανότητες μετανάστευση /την εισβολή, πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναστέλλεται και αύξησε την χημειο-ευαισθησία σε DDP σε ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου Caski κύτταρα. Περαιτέρω, η υπερέκφραση του miR155 αυξημένης έκφρασης ΤΡ53 αλλά μείωσε SMAD2, και τα επίπεδα έκφρασης CCND1. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι miR155 ρυθμίζει αρνητικά EGF-επαγόμενη EMT. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι miR155 δεν ενεργεί ως ογκογονίδιο αλλά ως καταστολέας των όγκων σε κύτταρα Caski

Παράθεση:. Lei C, Wang Υ, Huang Υ, Yu H, Huang Υ, Wu L, et al. (2012) ρυθμίζεται Up-miR155 Αντιστρέφει τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβαση Προκαλούμενη από EGF και αυξάνει χημειοθεραπείες ευαισθησία έναντι σισπλατίνης σε ανθρώπινα κύτταρα Caski καρκίνο του τραχήλου. PLoS ONE 7 (12): e52310. doi: 10.1371 /journal.pone.0052310

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Lei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση για το έργο αυτό παρέχεται από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Χουμπέι (Grant όχι. 2011CDB181), Ανεξάρτητη Ταμείο Έρευνας, Πανεπιστήμιο Wuhan (αρ. 201130302020016). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικών συμφερόντων exsit

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η δεύτερη μεγαλύτερη κατηγορία των κακοήθων όγκων για τις γυναίκες, και θέτει σε κίνδυνο την υγεία των γυναικών, ιδίως στις αναπτυσσόμενες χώρες. Μετάσταση και εισβολή είναι οι κύριοι λόγοι για το θάνατο του τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων καρκίνου, έτσι είναι σημαντικό να διευκρινιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί αυτών των φαινομένων. Έχει αναφερθεί ότι η επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι μια σημαντική διαδικασία που εμπλέκονται στη μετάσταση όγκου και εισβολή [1]. Τα κύρια χαρακτηριστικά της EMT περιλαμβάνει τη διάλυση των επιθηλιακών σφιχτό κόμβους, αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού, την απώλεια του κορυφαίου-βασική πολικότητα, και την απόκτηση των δεικτών μεσεγχυματικών, όπως Ν-cadherin και βιμεντίνης. ΕΜΤ προικίζει τα καρκινικά κύτταρα με υψηλότερα επεμβατικές /μεταστατικό ικανότητες, τα βλαστικά κύτταρα παρόμοια χαρακτηριστικά, αντοχή σε απόπτωση, και ανοσολογικής ανοχής [2].

EGF (επιθηλιακό αυξητικό παράγοντα) είναι ένας από τους πιο σημαντικούς EMT ρυθμιστικών παραγόντων ότι πυροδοτεί ΕΜΤ σε μια ποικιλία στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Έχει αναφερθεί ότι οι όγκοι με έκφραση υποδοχέα υψηλής EGF έχουν κακή κλινική πρόγνωση, και EGF-επαγόμενη EMT μπορεί να είναι ένας λόγος για αυτό [3] – [5]. Έτσι, η πρόληψη EGF-επαγόμενη EMT θα μπορούσε να είναι μια κατάλληλη μέθοδος για την αναστολή της εισβολής και της μετάστασης.

Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ΕΜΤ [6], [7]. miRNAs είναι 18 έως 25 νουκλεοτιδίων μήκους μη κωδικοποιητική RNA που μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση μέσω της επιτάχυνσης της υποβάθμισης και αναστέλλοντας την μετάφραση των mRNA στόχου. Μεταξύ των miRNAs έχουν αναγνωριστεί μέχρι σήμερα, miR155 σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των όγκων και υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους όγκους [8]. Μια μελέτη που απεικονίζεται ότι η μη φυσιολογική έκφραση του miR155 ήταν ένα πρώιμο συμβάν στον καρκίνο του παγκρέατος και σχετίζονται στενά με χαμηλό ποσοστό επιβίωσης [9]. Στον καρκίνο του ενδομητρίου, η εμφάνιση EMT συνοδευόταν από αυξημένα επίπεδα έκφρασης miR155 [10]. Δεν είναι ακόμη σαφές κατά πόσον miR155 ασχολείται με την εμφάνιση των EMT στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση EGF ως παράγοντας EMT επαγωγής σε ανθρώπινα τραχήλου καρκινικά κύτταρα, διερευνήσαμε τις ρυθμιστικές ρόλους miR155 στη διαδικασία ΕΜΤ, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, και αξιολόγησε την πιθανή αξία του miR155 ως μοριακός στόχος για την έγκαιρη πρόληψη του τραχήλου της μήτρας εισβολή καρκίνου και μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

κύτταρα Caski αγοράστηκε από την Τράπεζα κυττάρων της Κίνας (Wuhan) και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO2 σε RPMI-1640 που περιείχε 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 100 μονάδες /ml πενικιλίνη.

Απομόνωση RNA και Ανίχνευση miRNA

RNA από τα καλλιεργημένα κύτταρα απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) και χρησιμοποιήθηκε έπειτα για τη σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA. Ανίχνευση των ωριμάσει miRNAs πραγματοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας το SYBR Προμίγματα Ex Taq

TM (TAKARA). U6 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα φαίνονται στον Πίνακα S1.

Κατασκευή πλασμιδίου και Σταθερή /παροδική επιμόλυνση των miR155

Ένα ανθρώπινο γονιδιωματικό θραύσμα DNA περίπου 400 bp που περιέχει την αλληλουχία miR155 κλωνοποιήθηκε εντός της pcDNA3.1-GFP. Το προκύπτον πλασμίδιο pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 φέρει ένα ανασυνδυασμένο DNA αλληλουχία για GFP και τον miR155 περιέχει θραύσμα. Για τη δημιουργία μιας κυτταρικής γραμμής που εκφράζει σταθερά miR155, τα κύτταρα Caski επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1-GFP-miR155 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά την επιλογή με G418, το ενιαίο κλώνο ότι υπερ-εκφράζεται miR155 ταυτοποιήθηκε. Για miR155 παροδική υπερέκφραση, miR155 μιμείται (RIBOBRO) χρησιμοποιήθηκαν για να επιμολύνουν τα κύτταρα Caski.

In vitro

τη Μετανάστευση και την εισβολή Αναλύσεις

δοκιμασία φρεατίων Α Matrigel που βασίζεται χρησιμοποιήθηκε με τη μετανάστευση των κυττάρων και προσδιορισμού εισβολή

in vitro

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Για την ανάλυση των ιδιοτήτων επεμβατική, 2 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν στην κορυφή των Matrigel επικαλυμμένων ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας σε 200 μΙ RPMI-1640 χωρίς FBS και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα ένθετα στη συνέχεια πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Αφού βάφονται με αιμάτινης, τα επεμβατικές κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. Η δοκιμασία μετανάστευσης διεξήχθη με τον ίδιο τρόπο που περιγράφηκε παραπάνω, εκτός του ότι δεν Matrigel επικαλύφθηκε στα ένθετα.

Western Blot (WB)

Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (0,5 % ΝΡ-40, 0.5% SDS, 1.5 mM Tris-HCl ρΗ 7.4, και 15 mM NaCl). Δείγματα πρωτεΐνης (20 μg /λωρίδα) ηλεκτροφορήθηκαν, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και επωάζονται όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (sc-7870, Santa Cruz Biotechnology), Ν-cadherin (BA0637, Boster), ΜΜΡ1 (130-1- 16, RayBiotech) και αννεξίνη Α2 (A2485, Sigma). Οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με HRP αίγας-αντι-κουνελιού (Invitrogen). Οι ζώνες πρωτεΐνης στόχου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια που παρέχονται στο ECL + συν κιτ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).

Immuno fl uorescence Ανάλυση

Immuno fl uorescence ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης Ε-καδερίνης με αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (sc-7558, Santa Cruz Biotechnology), και την έκφραση της Ν-καδερίνης με αντισώματα έναντι Ν-καδερίνης (BA0637, Boster) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12].

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Caski και CaSki-miR155 σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DDP (cis-διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος, DDP) για 0-3 ημέρες σε RPMI-1640. Το μέσο σε κάθε φρεάτιο απομακρύνθηκε και 100 μΙ (μεθυλ θειαζολυλο τετραζολίου, ΜΤΤ) προστέθηκε διάλυμα (0.25 g /L σε RPMI-1640). Μετά από επώαση στους 37 ° C για 4 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και 200 ​​μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση (Α) στα 570 nm καταγράφηκε. Ο ρυθμός ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων και αναστολέας υπολογίστηκαν ως εξής:

Κυτταρομετρίας Ροής

Caski και Caski-miR155 κύτταρα συλλέχθηκαν στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης και σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα με 80% αιθανόλη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ψυχρό PBS, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, 0,05 mg /ml) και RNase Α (0,5 mg /ml). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η κατανομή των κυττάρων σε υπο-φάσεις του κυτταρικού κύκλου και να μετρηθεί η κορυφή απόπτωση που επάγεται από DDP (10 μmol /ml) για 24 ώρες.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική ανάλυση μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκε με δύο-tailed t-test και ANOVA Student. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

EGF επάγει EMT σε Caski κύτταρα

Έχει αναφερθεί ότι ο υποδοχέας EGF είναι ιδιαίτερα αυξημένος του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκθεση EGF μπορεί να επάγουν EMT στις κυτταρικές γραμμές του τραχήλου της μήτρας [13], [14], [15]. Σε αυτό το πείραμα, τα κύτταρα Caski καλλιεργήθηκαν σε συνήθεις συνθήκες, με ή χωρίς EGF (50 ng /mL) για 1, 3, ή 5 ημέρες, και οι αλλαγές EMT σχετίζονται προσδιορίστηκαν. Η μορφολογική αλλαγή πρώτη ορατή σε αυτή τη διαδικασία. Μετά από διέγερση EGF, τα κύτταρα Caski έγινε πιο ατρακτοειδές και η σύνδεση μεταξύ των κυττάρων μειώθηκε (Σχήμα 1Α). Όταν Ε-καδερίνη (Ε-CAD) έκφραση αναλύθηκε με WB, τα αποτελέσματα που απεικονίζονται ότι η έκθεση EGF μειωτικά έκφραση Ε-CAD σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1Β). Η προς τα κάτω ρύθμιση παρόμοια της έκφρασης Ε-CAD επαληθεύτηκε με μία δοκιμασία IF στην οποία τα κύτταρα Caski υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGF (50 ng /ml) για 3 ημέρες (Σχήμα 1 C). Την ίδια χρονική στιγμή, ανιχνεύσαμε επίσης την έκφραση άλλων παραγόντων που σχετίζονται με ΕΜΤ-(Ν-cadherin, ΜΜΡ1 και αννεξίνη Α2) με WB και βρέθηκε ότι και οι τρεις παράγοντες ρυθμίζεται αυξητικά (Εικόνα 1D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο EGF μπορεί να επάγει ΕΜΤ στα κύτταρα Caski.

κύτταρα Caski καλλιεργήθηκαν υπό συνήθεις συνθήκες, με ή χωρίς EGF (50 ng /ml) για 1 έως 5 ημέρες. A. Η μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από το ΕΤΠ παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο. B. Προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης με αγωγή με EGF προσδιορίστηκε με κηλίδα western. Η πυκνομετρική ανάλυση των τριών ανεξάρτητων τριπλούν Western blots. C. Ε-καδερίνη προς τα κάτω ρύθμιση σε απόκριση σε EGF (/ml 50 ng) θεραπεία για 3 ημέρες πιστοποιήθηκε με IF. Δ Η αναβάθμιση της Ν-cad, ΜΜΡ1 και αννεξίνη Α2 στη διαδικασία EMT, όπως ερευνήθηκε από κηλίδα western. Η πυκνομετρική ανάλυση των τριών ανεξάρτητων τριπλούν Western blots. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος της τριπλής προσδιορισμών με το Τ.Α. που υποδεικνύεται από μπάρες σφάλματος. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

miR155 υπερεκφράζεται στον EGF-επαγόμενη EMT

Ολικό RNA καθαρίστηκε από το ΕΤΠ που προκαλείται mesenchymal- όπως τα κύτταρα Caski και φυσιολογικά κύτταρα Caski. Τα επίπεδα έκφρασης του miR155 ή miR200c ανιχνεύθηκαν από την εκτέλεση πραγματικού χρόνου PCR σε αυτά τα ολικά RNAs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα Caski, miR155 ήταν σε μεγάλο βαθμό ρυθμίζεται αυξητικά στα μεσεγχυματικά κύτταρα Caski, αλλά καμία αλλαγή του επιπέδου έκφρασης παρατηρήθηκε για miR200c, το οποίο βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της διαδικασίας EMT σε πολλούς συμπαγείς όγκους από άλλες μελέτες [ ,,,0],16], [17] (Σχήμα 2).

Α. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR155 και miR200c ανιχνεύθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. miR155 ρυθμίζεται αυξητικά με 3 ημέρες θεραπείας EGF (50 ng /ml), και καμία αλλαγή βρέθηκε στο επίπεδο έκφρασης miR200c υπό διέγερση EGF. Η σχετική αναλογία έκφρασης miR155 σε EGF επεξεργασίας /ελέγχου είναι 12.21. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές. T-test χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση? ** P & lt? 0,01. B. Η ρυθμισμένη προς τα πάνω επίπεδο έκφρασης miR155 επαληθεύθηκε με αντίστροφης-μεταγραφής ΡΟΚ. U6 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος, Λωρίδα 1 και 2 είναι EGF θεραπεία, η λωρίδα 3 είναι αρνητικός μάρτυρας, λωρίδα 4 δείκτη, λωρίδα 5 και 6 είναι έλεγχος (χωρίς EGF).

Η

Η υπερέκφραση του miR155 Αναστέλλει EMT

Αν και miR155 ρυθμίζεται αυξητικά σε μεγάλο βαθμό στη διαδικασία EMT EGF που προκαλείται, είναι πιθανό ότι αυτό είναι μόνο μια αντισταθμιστική γεγονός ή μια άσχετη φαινόμενο. Για την περαιτέρω αποσαφήνιση του ρόλου της miRNA155 στη διαδικασία EMT, μια κυτταρική γραμμή Caski με υπερ-εκφράζεται miR155 (Caski-miR155) δημιουργήθηκε με επιμόλυνση pcDNA3.1-GFP-miR155 πλασμίδιο μέσα στα κύτταρα Caski, με την έκφραση miR155 επαληθεύεται από τους πραγματικούς -Time PCR (Σχήμα 3Α). Χρησιμοποιώντας αυτή την κυτταρική γραμμή ως μοντέλο, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR155 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και παρενέβαινε με τον κυτταρικό κύκλο με μείωση της αναλογίας των κυττάρων στη φάση S (17% σε κύτταρα ελέγχου Caski, 5,4% σε Caski-miR155) αλλά αυξάνοντας η αναλογία των κυττάρων στην G1 φάση (63.7% σε κύτταρα ελέγχου Caski, 81,4% σε Caski-miR155), όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β. Το EGF-επαγόμενη μειορύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης αντιστράφηκε εν μέρει με παροδικά επιμολυσμένα miR155 μιμείται (Σχήμα 3C). Με miR155 υπερέκφραση, η μορφολογία των κυττάρων έγινε πιο κυβοειδές. Μετά από 3 ημέρες θεραπείας με EGF (50 ng /ml), μόνο ένα μικρό μέρος των κυττάρων Caski-miR155 μετασχηματίστηκαν σε ατρακτοειδή κύτταρα (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπερέκφραση της miR155 ανέστειλε EGF-επαγόμενη EMT.

Α. Μετά pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 επιμόλυνση, το επίπεδο έκφρασης miR155 αυξήθηκε περισσότερο από 12 φορές, αλλά δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε για έκφραση miR200c. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές ανεξάρτητα. ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. B. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ελέγχθηκε με ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπερέκφραση miR155 ανέστειλε σημαντικά τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων. Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή των επιδράσεων miR155 υπερέκφραση επί του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια μειωμένη αναλογία των κυττάρων στη φάση S (17% σε κύτταρα ελέγχου Caski, 5,4% σε Caski-miR155), αλλά μια αυξημένη αναλογία των κυττάρων σε φάση G1 (63,7% σε κύτταρα ελέγχου Caski, 81,4% σε Caski-miR155). Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές ανεξάρτητα. Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Γ E-CAD έκφραση ελέγχθηκε με western blot. το επίπεδο έκφρασης Ε-καδερίνης μειώθηκε σημαντικά από 3 ημέρες EGF (50 ng /ml) έκθεση σε κύτταρα Caski. Η πυκνομετρική ανάλυση των τριών ανεξάρτητων τριπλούν Western blots. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος της τριπλής προσδιορισμών με το Τ.Α. που υποδεικνύεται από μπάρες σφάλματος. * P & lt? 0,05. Το αποτέλεσμα αυτό εμποδίζεται μερικώς από επιμόλυνση με μιμείται miR155. Δ Οι μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από miR155 υπερέκφραση. κύτταρα Caski-miR155 είναι πιο κυβικής από τα φυσιολογικά κύτταρα Caski. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGF (50 ng /ml) για 3 ημέρες, μόνο ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων Caski-miR155 μετασχηματίστηκαν στα ατρακτοειδή κύτταρα που μοιάζουν.

Η

ΤΡ53 και SMAD2 έχουν συνδεθεί με την EMT ρυθμιστικής οδού [18], [19]. Με διαλογή Targetscan (https://www.targetscan.org), TCF4, CCND1 και SMAD2 είχαν προβλεφθεί να είναι τα γονίδια-στόχους της miR155. Έτσι, ερευνήσαμε ΤΡ53, SMAD2, TCF4, cmyc και τα επίπεδα έκφρασης CCND1 mRNA σε κύτταρα Caski αγωγή με EGF (50 ng /ml) για 3 ημέρες, με ή χωρίς την επιμόλυνση του miR155 μιμείται (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΤΡ53 ήταν μειωτικά στη διαδικασία ΕΜΤ EGF επαγόμενη και απορυθμίζεται με miR155 υπερέκφραση, αλλά η έκφραση επάγεται από ΤΡ53 miR155 αντιστράφηκε πλήρως με αγωγή με EGF. miR155 υπερέκφραση μειώθηκε SMAD2 έκφρασης. Παρόλο TCF4 επαληθεύτηκε ως πρωτεΐνη-στόχο miR155 από μια άλλη ομάδα [20], δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε πειράματα μας για την έκφραση TCF4 mRNA σε κύτταρα EGF επαγόμενη και miR155 μιμούνται επιμολυνθεί. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές για cmyc, η οποία είναι μια προς τα κάτω στόχος του και ρυθμίζεται από TCF4. CCND1 (μία ρυθμιστική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου και ένα άλλο προς τα κάτω στόχος του TCF4) επίπεδο έκφρασης του mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω από miR155 υπερέκφραση και μπορεί να αντιστραφεί εν μέρει από αγωγή με EGF. Έτσι, υποτίθεται ότι miR155 αντιστραφεί EGF-επαγόμενη EMT με προς τα πάνω ρύθμιση TP53, ρύθμιση προς τα κάτω τα επίπεδα έκφρασης SMAD2, και τον περιορισμό της ανάπτυξης των κυττάρων αναστέλλοντας την έκφραση CCND1.

Α. Προβλεπόμενη miR155 δεσμευτικές θέσεις στην 3’UTR του SMAD2, TCF4 και CCND1 mRNA. επίπεδα έκφρασης Β ΤΡ53, SMAD2, TCF4, cmyc και CCND1 mRNA προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου σε κύτταρα Caski αγωγή με EGF (50 ng /ml) για 3 ημέρες, με ή χωρίς την επιμόλυνση του miR155 μιμείται. TP53 ήταν μειωτικά από αγωγή με EGF, αλλά σημαντικά απορυθμίζεται από miR155 υπερέκφραση. Αυτή η αυξημένη έκφραση TP53 ανατράπηκε από αγωγή με EGF. SMAD2 ήταν μειωτικά τόσο από αγωγή με EGF και miR155 υπερέκφραση. Κατάρριψη miR155-κύτταρα που υπερεκφράζουν με EGF οδήγησε σε περαιτέρω μείωση της SMAD2. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην TCF4 ή cmyc mRNA παρατηρήθηκαν μεταξύ EGF-θεραπεία και miR155 μιμούνται-επιμολυσμένα κύτταρα. έκφραση CCND1 του mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω από miR155 υπερέκφραση, και αυτή η ρύθμιση προς τα κάτω εν μέρει αντιστράφηκε από αγωγή με EGF.

Η

Η υπερέκφραση του miR155 αναστέλλει τις ικανότητες Μετανάστευση και την εισβολή των Caski κύτταρα

Για να διευκρινιστεί η επιδράσεις της miR155 για τη μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα Caski

in vitro

, transwell εισβολή /δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν (Σχήμα 5). φυσιολογικά κύτταρα Caski Caski-miR155 και σπάρθηκαν στα ένθετα. Μετά από 24 ώρες, ο αριθμός των κυττάρων που είχαν μεταφερθεί στην κατώτερη πλευρά της μεμβράνης υπολογίστηκε για την ποσοτικοποίηση των εισβολή και τη μετανάστευση ικανότητες. Ο αριθμός των κυττάρων που διήλθε μέσω της μεμβράνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα Caski-miR155 από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα Caski. Έτσι, υποτίθεται ότι miR155 εμποδίζει τις επεμβατικές και μετανάστευση ικανότητες σε κύτταρα Caski

in vitro

.

Caski-miR155 και Caski κύτταρα σπάρθηκαν σε Transwell ένθετα με ή χωρίς Matrigel. Τα ένθετα μονιμοποιήθηκαν και βάφτηκαν μετά από 24 ώρες, και στη συνέχεια οι μεταναστευτικές /εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Ο αριθμός των κυττάρων Caski-miR155 διέρχεται μέσω της μεμβράνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα Caski, είτε ανιχνεύονται από τη μετανάστευση ή την εισβολή δοκιμασίες. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος της τριπλής προσδιορισμών με το Τ.Α. που υποδεικνύεται από μπάρες σφάλματος. * Ρ & lt?. 0.05

Η

miR155 αύξησε την Chemo-ευαισθησία Caski κύτταρα να DDP

Η μέθοδος ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει την επίδραση της υπερέκφρασης miR155 στην χημειο-ευαισθησία Caski κύτταρα να DDP. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ρυθμός αναστολής της Caski-miR155 όταν θεραπεύονται με DDP ήταν πολύ υψηλότερες από ό, τι εκείνη των φυσιολογικών κυττάρων Caski με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων Caski-miR155 όταν θεραπεύονται με DDP ήταν πολύ βραδύτερη από εκείνη των φυσιολογικών κυττάρων Caski σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 6 Α, Β). Η θεραπεία με DDP (10 μmol /L) για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια πολύ υψηλότερη αναλογία αποπτωτικών κυττάρων στα κύτταρα Caski-miR155 από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα Caski (Σχήμα 6C). Το επίπεδο έκφρασης αννεξίνης Α2, μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται με την αντοχή της απόπτωσης, προσδιορίστηκε με WB. Αυτά τα αποτελέσματα δεν δείχνουν ότι η αννεξίνη Α2 μειωτικά από miR155 υπερέκφραση (Σχήμα 6D).

Α. Caski και Caski-miR155 κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές δόσεις DDP για 24 ώρες, και ο ρυθμός αναστολής αξιολογήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Μέση ± SD, η = 4, Ρ & lt? 0.05 με ΑΝΟνΑ. Β κυτταρικός πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε με μία μέθοδο προσδιορισμού ΜΤΤ. Caski και Caski-miR155 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DDP (10 μmol /L) για 0-3 ημέρες. Μέση ± SD, η = 4, Ρ & lt? 0.05 με ΑΝΟνΑ. C. Μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσει την απόπτωση των Caski και Caski-miR155 κυττάρων που επάγεται από DDP (10 μmol /L) για 1 ημέρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και FCM χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση απόπτωσης. Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση της κορυφής της απόπτωσης. έκφραση Δ αννεξίνη Α2 προσδιορίστηκε με κηλίδα western. Η έκφραση αννεξίνη Α2 δεν ρυθμίζονται από miR155 υπερέκφραση και θα μπορούσε να ρυθμίζεται προς τα πάνω με κατεργασία ΕΤΠ. Πυκνομετρική ανάλυση τριών ανεξάρτητων τριπλούν Δυτική blots.P & gt? 0,05, miR155- σε σύγκριση με miR155 +, * P & lt? 0,05, EGF- σε σύγκριση με EGF +

Η

Συζήτηση

EMT είναι ένα. δυναμική διαδικασία που μπορεί να ρυθμίζεται και να αντιστραφεί από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων miRNAs. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το ανθρώπινο Caski καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή ως το μοντέλο για τη διερεύνηση του ρόλου των miR155 σε EGF-επαγόμενη EMT και προσπάθησε να απαντήσει στο ερώτημα του κατά πόσον miR155 ρυθμίζει EMT και έχει ένα ρόλο στη μετάσταση και χημειο-ευαισθησία.

Εμείς χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το ΕΤΠ για να προκαλέσει EMT στα κύτταρα Caski, η οποία επιβεβαιώθηκε από την E-cadherin, N-cadherin, την έκφραση και τη μορφολογία των κυττάρων. Το επίπεδο έκφρασης miR155 προσδιορίστηκε με RT-PCR. Μια 12-πλάσια αύξηση του επιπέδου έκφρασης miR155 παρατηρήθηκε μετά από αγωγή EGF, αλλά καμία αλλαγή βρέθηκε για miR200c, η οποία είχε αναφερθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε παγκρεατικού καρκίνου και άλλων στερεών όγκων [16], [17]. Έτσι καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι miR155, αλλά δεν miR200c, εμπλέκεται σε EGF-επαγόμενη EMT στα κύτταρα Caski. Παρόμοια στοιχεία που δημοσιεύθηκαν από άλλη ομάδα δείχνουν επίσης ότι miR155 υπερεκφράζεται σε EMT που παρατηρείται σε ενδομητρίου καρκινοσάρκωμα [10].

Για να διαλευκανθεί ο ρόλος των miR155 στο EMT, κυτταρικές σειρές Caski υπερεκφράζουν miR155 υπερέκφραση κατασκευάστηκαν από σταθερό και παροδικές επιμολύνσεις . Είναι ενδιαφέρον, παρεκκλίνουσα υπερέκφραση miR155 πολλαπλασιασμό δραματικά ανέστειλε κυττάρων, ανέστειλε τη μετανάστευση /την εισβολή, και προώθησε την χημειο-ευαισθησία των κυττάρων Caski να DDP

in vitro

. Ταυτόχρονα, βρήκαμε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν miR155 έγινε πιο κυβικής, και μόνο ένα μικρό τμήμα των κυττάρων είχε μετατραπεί σε κύτταρα ατρακτοειδή μετά από 3 ημέρες θεραπείας EGF. Η ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης που προκαλείται από αγωγή με EGF είχε επίσης εν μέρει αντιστραφεί από miR155 μιμείται σε κύτταρα Caski.

Παλαιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι το miR-155 ήταν ένα ογκο-miR και ότι υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό ανθρώπινων κακοηθειών , συμπεριλαμβανομένων των Β-κυττάρων λεμφώματος και καρκινωμάτων του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, των ωοθηκών και [8], [9]. Έχει αναφερθεί ότι το miR-155 καταστέλλεται πυρηνική πρωτεΐνη Ρ53 που προκαλείται από 1 (TP53NP1) και οδήγησε στην ανάπτυξη παγκρεατικού όγκου [21]. Στον καρκίνο του μαστού, miR155 ενισχυμένη οι JAK2 /ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ μονοπάτι και επιμόλυνση miR155 μιμείται σηματοδότησης προωθείται MDA-MB-231 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MCF-7 [22]. Τα δεδομένα μας, ωστόσο, δείχνουν ότι miR155 υπερέκφραση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Caski και αποτρέπει EMT. Παρόμοια στάση στη λειτουργία miR155 εγκρίθηκε από άλλη ομάδα [20], απέδειξαν ότι miR155 εμπόδισε EMT με τη μείωση του επιπέδου έκφρασης TCF-4 σε 4Τ1 καρκινικά κύτταρα του μαστού.

Για να διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός της miR155 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και EMT σε κύτταρα Caski, προσδιορίσαμε τα επίπεδα έκφρασης κάποιων παραγόντων που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και EMT (Σχήμα 7). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΤΡ53 έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά από miR155 υπερέκφραση και ρυθμίζεται προς τα κάτω από τον EGF. Είναι ενδιαφέρον ότι, EGF-επαγόμενη μειορύθμιση Ε-καδερίνης αντιστράφηκε πλήρως με την επιμόλυνση με μιμείται miR155. Πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι τα άγρια ​​TP53 ελέγχεται η αποτελεσματικότητα με την οποία επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται EMT σε απάντηση TGFβ [23]. Έτσι υποτίθεται miR155 αντιστραφεί EMT μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης TP53.

Η

Το μονοπάτι σηματοδότησης SMAD2 εμπλέκεται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης και EMT [23]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι, με miR155 υπερέκφραση, η έκφραση SMAD2 ήταν μειωτικά. Επειδή υπάρχουν δύο miR155 περιοχές εντός της 3’UTR του mRNA SMAD2 δεσμευτική, προτείνουμε ότι miR155 ρυθμίζει αρνητικά EMT μέσω της αναστολής της έκφρασης Smad2.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR155 κατέστειλε τις μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των Caski κύτταρα

στο

vitro

. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα έχει αναφερθεί σε μια άλλη μελέτη με καρκινικά κύτταρα 4Τ1 του μαστού, στην οποία βρέθηκε miR155 να καταστέλλει άμεσα την έκφραση του TCF4 και ρυθμίζουν αρνητικά την ΕΜΤ [20]. Στη μελέτη μας, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές μεταβολές στο επίπεδο έκφρασης TCF4 στα κύτταρα Caski σε επεξεργασία με ή χωρίς EGF και miR155 μιμείται. Πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι CCND1 αύξησε τη μεταναστευτική ικανότητα και την αιτία EMT στον καρκίνο του μαστού [24]. Cmyc και CCND1 είναι κατάντη γονίδια που ρυθμίζονται από τον παράγοντα μεταγραφής TCF4. Σε αντίθεση με cmyc, υπάρχει ένα site miR155 δέσμευσης στο CCND1 3’ΙΙΤΡ. Συνεπής με αυτή τη διαπίστωση, miR155 υπερέκφραση προφανώς μειωτικά επίπεδο CCND1, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση cmyc. Αυτό το εύρημα υπέδειξε ότι, εκτός από την οδό TCF4, CCND1 θα μπορούσαν επίσης να ρυθμίζεται άμεσα από miR155.

Annexin Α2 θεωρείται ότι είναι μια δυνητική παράγοντας για τη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, εισβολή και χημειο-αντίσταση [25 ]. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ο EGF θεραπεία οδηγούν σε μια αύξηση της έκφρασης αννεξίνης Α2. Και δεν υπάρχει καμία αλλαγή στην έκφραση Α2 Annexin κάτω miR155 υπερέκφραση. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της ρύθμισης αννεξίνη Α2 από το ΕΤΠ.

Εν ολίγοις, έχουμε αποδείξει ότι, στα κύτταρα Caski, miR155 δεν ενήργησε ως ογκογονίδιο αλλά ως καταστολέας των όγκων. miR155 ρυθμίζεται αρνητικά EGF επαγόμενη EMT, μειωμένο πολλαπλασιασμό, ανέστειλε τη μετανάστευση /την εισβολή και την αυξημένη ευαισθησία χημειο-σε κύτταρα Caski in vitro. Σε EGF επαγόμενη EMT, η προς τα πάνω ρύθμιση του miR155 είναι ένα γεγονός που τα κύτταρα μπορεί να αντισταθμίσει. Η μελέτη μας δείχνει μια νέα πτυχή της miR155 και τους ρόλους της στον πολλαπλασιασμό των όγκων και τη μετάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Αστάρια για το Real-time PCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0052310.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Changbai Liu και Zhaoqi Liu για την παροχή τεχνικών συμβουλών και τεχνικής βοήθειας εκτέλεση πραγματικού χρόνου PCR. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω την κα Ma Jielan για τη βοήθειά της στην εκτέλεση πλασμίδιο επιμολύνσεις και παρέχοντας το θραύσμα GFP DNA. Ευχαριστούμε το προσωπικό του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημίου Τριών Φαραγγιών.