​​

Αφηρημένο

Διάφορα κύτταρα θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων, να ρίξει εξωκυττάριο κυστίδια (ΕΕΥ), επίσης γνωστή ως εξωσώματα και μικροκυστίδια, σε περιβάλλοντες ιστούς. Αυτές ΗΟ παίζουν ρόλους στην ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση με προαγωγή αγγειογένεσης. Ωστόσο, ο λεπτομερής μηχανισμός του τρόπου με τον καρκίνο που προέρχεται από τα ΗΟ προκαλούν ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων παραμένει άγνωστη. Εδώ, θα παρέχει αποδείξεις ότι η πρώιμη ανάπτυξη απόκρισης-1 (Egr-1) ενεργοποίηση σε ενδοθηλιακά κύτταρα που εμπλέκονται στην αγγειογενετική δραστηριότητα του ορθοκολικού καρκίνου ΕΕΥ που προέρχεται από κύτταρα. Τόσο παρεμβολή RNA με μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του Egr-1 και ERK1 /2 ή αναστολέας JNK μπλοκαριστεί σημαντικά EV-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση Egr-1 και μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, λιπίδιο αναστολέας ενδοκυττάρωση σχεδία μεσολάβηση μπλοκάρει αποτελεσματικά ενδοθηλιακά ενεργοποίηση Egr-1 και η μετανάστευση που προκαλείται από τον καρκίνο που προέρχεται ΕΕΥ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ενεργοποίηση Egr-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να είναι ένας μηχανισμός κλειδί που εμπλέκονται στην αγγειογενετική δραστηριότητα του καρκίνου που προέρχεται ΕΕΥ. Τα ευρήματα αυτά θα βελτιώσουν την κατανόησή μας σχετικά με τις προ-αγγειογόνος δραστηριότητες της ΕΕΥ σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, των καρδιαγγειακών παθήσεων και των νευροεκφυλιστικών νόσων

Παράθεση:. Yoon YJ, Kim DK, Yoon CM, το Park J, Kim YK, Ρο TY, et al. (2014) ενεργοποίηση Egr-1 από λαμβάνεται από καρκίνο Εξωκυτταρική Κυστίδια Προωθεί μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω ERK1 /2 και JNK μονοπάτια σηματοδότησης. PLoS ONE 9 (12): e115170. doi: 10.1371 /journal.pone.0115170

Επιμέλεια: Shilpa J. Buch, του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 19 του Νοέμβρη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Yoon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα μέσα της σταδιοδρομίας Πρόγραμμα Ερευνητής μέσω NRF επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από το ΜΕΣΤ (Νο 2014023004), BK21 Plus (10Z20130012243) που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας , την Κορέα, και το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (2011 – 0030049). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Διάφοροι τύποι κυττάρων θηλαστικών, όπως τα καρκινικά κύτταρα, μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα, αιμοπετάλια, και επιθηλιακά κύτταρα απελευθερώνουν εξωκυτταρικό κυστίδια (EV) στο περιβάλλον τους από τα διαμερίσματα της μεμβράνης του πλάσματος και ενδοσωματική [1] – [4] . Αυτές οι ΕΕΥ θηλαστικών, επίσης γνωστή ως εξωσώματα και μικροκυστίδια, είναι σφαιρικά διστοιβαδικών proteolipids με μέση διάμετρο 40-250 nm και είναι εμπλουτισμένα με διάφορα βιοδραστικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, λιπιδίων, και γενετικό υλικό [1] – [9]. Αυξανόμενες ενδείξεις αποκάλυψε ότι ΕΕΥ παίξει πλειοτροπικές λειτουργίες σε ενδοκυτταρική επικοινωνία:. EVs διεγείρουν τα κύτταρα αποδέκτη από την ενεργοποίηση του υποδοχέα και τη μεταβίβαση των πρωτεϊνών μεμβράνης, τα μόρια σηματοδότησης, mRNA, και miRNAs [4] – [9]

ΕΕΥ έχουν συχνά αναφέρεται ως «κυτταρική σκόνη», αν και κύτταρα που αποβάλλονται ΕΕΥ είτε μόνιμα είτε σε οργανωμένη τρόπο [1] – [9]. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες, mRNAs, ή miRNAs στην ΕΕΥ διαφέρουν στη σύνθεση, ανάλογα με τα μέλη των κυττάρων δότη [1], [4]. Πρόσφατα, η ομάδα μας έδειξε ότι οι πρωτεΐνες του ανθρώπινου ΗΟ ορθοκολικού καρκίνου που προέρχεται από κύτταρα διασυνδέονται μέσω φυσικών αλληλεπιδράσεων και σύμπλεγμα σε λειτουργικές ενότητες που εμπλέκονται στην EV βιογένεση και η λειτουργία [4], [10]. Επιπλέον, η έκκριση των ΗΟ είναι μια καθολική κυτταρική διεργασία που προκύπτουν από απλή οργανισμούς (Archea ή Gram-αρνητικά και Gram-θετικά βακτήρια) σε πολύπλοκες πολυκύτταρους οργανισμούς, υποδηλώνοντας ότι αυτό το EV-μεσολάβηση επικοινωνία εξελικτικά συντηρημένη [9], [11] – [13]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ΕΕΥ παίζουν διαφορετικούς ρόλους στην ενδοκυτταρική επικοινωνία [6], [10]. Ωστόσο, οι παθοφυσιολογικές ρόλοι των ΗΟ δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Η αγγειογένεση, ο σχηματισμός νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχον αγγειακό σύστημα, είναι μια σύνθετη και πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει προσκόλληση, μετανάστευση, εισβολή, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων [14], [15]. Αυτή η νεοαγγείωση συμβαίνει κάτω από διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις [14]. Για παράδειγμα, η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση με την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών στον αυξανόμενο όγκο [15]. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου, ένας ετερογενής πληθυσμός κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων καρκινικών κυττάρων, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού διαμορφώνει ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την ανάπτυξη του όγκου και εισβολή [16] – [18]. Αυτά τα καρκινικά και τα στρωματικά κύτταρα εκκρίνουν αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας 2 (FGF2), Παράγοντα Νέκρωσης Όγκου-α (TNF-α), και IL-6 στην περιβάλλουσα περιοχή και αυτοί οι παράγοντες συμβάλλουν σε συνδεόμενη με όγκο αγγειογένεση [16] – [19].

Εκτός από αυτούς τους προ-αγγειογόνος διαλυτών παραγόντων, τα κύτταρα που περιλαμβάνουν ο ιστός του όγκου εκκρίνουν ΕΕΥ στο εξωκυτταρικό περιβάλλον και αυτές ρίχνουν τα ΗΟ παίξει πολλαπλούς ρόλους στην ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση με την προώθηση της αγγειογένεσης, εισβολή όγκου, και το ανοσοποιητικό διαφυγή [4] – [8], [20] – [23]. Μετά την αρχική έκθεση σχετικά με τις αγγειογενετική δραστηριότητα της ΕΕΥ προέρχεται από ΗΤ1080 ανθρώπινου ινοσαρκώματος και τα κύτταρα DU-145 ανθρώπινου καρκινώματος του προστάτη [5], αρκετές μελέτες επιβεβαίωσαν ότι η ΕΕΥ προέρχεται από τα καρκινικά κύτταρα, ινοβλάστες, και τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου προωθήσει

in vitro

και

in vivo αγγειογένεση

[4], [8], [24] – [28]. Αυτές οι δραστηριότητες αγγειογενετική των ΗΟ διαμεσολαβούνται από φυσαλιδώδη λιπίδιο (-α), πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων υποδοχέων και πρωτεϊνών τετρασπανίνη, mRNAs, και miRNAs. Ωστόσο, ο λεπτομερής μηχανισμός του τρόπου με ΗΟ εκμαιεύσει αγγειογενετική δραστηριότητα δεν έχει μελετηθεί εκτενώς.

πρώιμης ανάπτυξης απόκριση-1 (Egr-1), ένα άμεσο πρώιμο γονίδιο και ένας παράγοντας μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση [29] – [32]. Εκτός από την έκθεση του ορού, Egr-1 μπορεί να διεγείρεται ταχέως και παροδικά από κυτοκίνη, αυξητικό παράγοντα, και περιβαλλοντικό στρες, συμπεριλαμβανομένης υποξίας, διατμητικής τάσης ρευστού, και αγγειακή βλάβη [33], [34]. Egr-1 ρυθμίζει την έκφραση του προ-αγγειογόνος γονιδίων, όπως ο VEGF, FGF2, και IL-6 σε ενδοθηλιακά κύτταρα ή ΤΝΡ-α σε μακροφάγα [31], [34] – [36]. Εντός του καρκινικού ιστού, ενδοθηλιακά κύτταρα, τα καρκινικά κύτταρα, ινοβλάστες και μακροφάγα που διηθούν όγκο μπορεί να εκφράσει Egr-1. Επιπλέον, οι πυκνότητες των μικροαγγείων σε ιστούς όγκων που λαμβάνονται από Egr-1-ανεπαρκή ποντίκια είναι χαμηλότερες από εκείνες που λαμβάνονται από ποντικούς άγριου τύπου [37] και το δοχείο που μοιάζει με σχηματισμό δομή στον ιστό του όγκου κατεστάλη με DNA ζύμες που στοχεύουν Egr-1 mRNA [31] , γεγονός που υποδηλώνει ότι το Egr-1 παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση. Από την άποψη αυτή, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι Egr-1 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, μακροφάγα και έχει σχέση με την εξέλιξη του όγκου [32], [36] – [38]. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το Egr-1 παίζει σημαντικό ρόλο στη σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση και την εξέλιξη του όγκου.

Στην έκθεση αυτή, θα παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ενεργοποίηση Egr-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα θα πρέπει να αποτελέσει βασικό μηχανισμό που συμμετέχουν στην αγγειογενετική δραστηριότητα του καρκίνου που προέρχονται ΕΕΥ. Βρήκαμε ότι ενεργοποίηση Egr-1 με καρκίνο του παχέος εντέρου ΕΕΥ που προέρχεται από κύτταρα προωθείται μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω της ERK1 /2 και JNK οδών σηματοδότησης και λιπιδίων σχεδία ενδοκυττάρωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρων καλλιέργεια

Ανθρώπινο ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (SW480), ορθοκολικό καρκίνωμα (HCT116), αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (Α549) και ινοσάρκωμα (ΗΤ1080), και φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (BEAS-2Β) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Invitrogen), 100 U /mL πενικιλλίνη, και 0,1 mg /mL στρεπτομυκίνη. κύτταρα καρκινώματος ανθρώπινου νευροβλαστώματος (SH-SY5Y) και του προστάτη (PC3) διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% FBS, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 0,1 mg /mL στρεπτομυκίνη. SW480, HCT116, Α549, ΗΤ1080, SH-SY5Y, PC3 και BEAS-2Β αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMEC-1s) καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Ανάπτυξης Ενδοθηλιακών-2 (EGM-2? Lonza, Walkersville, MD, USA) [5]. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) απομονώθηκαν από προσφάτως παραδίδεται ομφάλιο λώρο και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. HUVECs καλλιεργήθηκαν σε μέσο 199 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 20% FBS, 3 ng /mL FGF2 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA), 5 U /mL ηπαρίνη (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) , 100 U /mL πενικιλλίνη, και 0,1 mg /mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Όλες οι κυτταρικές σειρές ήταν μυκόπλασμα χωρίς επιβεβαίωσε τη χρήση e-MYCO Mycoplasma PCR Detection Kit (Intron Βιοτεχνολογία. Inc., Σεούλ, Κορέα).

Καθαρισμός της ΕΕΥ

ΕΕΥ καθαρίστηκαν από ένα συνδυασμό διαφορική φυγοκέντρηση, υπερδιήθηση χρησιμοποιώντας μεμβράνη κοίλης ίνας 100-kDa, υπερφυγοκέντρηση πάνω σε μαξιλάρια σακχαρόζη, και υπερφυγοκέντρησης κλίσης πυκνότητας iodixanol σύμφωνα με προηγουμένως καθιερωμένες μεθόδους [8]. Εν συντομία, 80-90% συρρέοντα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες σε RPMI 1640 χωρίς ορό (SW480, HCT116, Α549, ΗΤ1080, και BEAS-2Β) ή μέσο ΜΕΜ χωρίς ορό ( SH-SY5Y και PC3). Περίπου 2.000 mL ρυθμισμένου μέσου υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 500

g

για 10 λεπτά, και στη συνέχεια δύο φορές σε 2000

g

για 15 λεπτά για την εξάλειψη της μόλυνσης των κυττάρων. Το υπερκείμενο συμπυκνώθηκε περαιτέρω με τη χρήση του Συστήματος Benchtop QuixStand με 100-kD μεμβράνη κοίλης ίνας (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Το συμπύκνωμα (-35 mL) τοποθετήθηκε επάνω σε 0.5 κ.εκ. 0.8 και 2.0 Μ σακχαρόζη μαξιλάρια σε ρυθμιστικό (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, ρΗ 7,4) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 100.000

g

για 2 h (SW 32 Ti swing κουβά ρότορα με ένα k-παράγοντα 256,8). Οι ΗΟ (0.5 κ.εκ.) συλλέχθηκαν από τη διεπαφή μεταξύ των μαξιλαριών σακχαρόζη 0,8 και 2,0 Μ, αραιωμένο με 9 mL ρυθμισμένου με φωσφορικό αλατούχου διαλύματος, τοποθετούνται επάνω 0,35 mL 0,8 Μ και 0,15 mL 2,0 Μ μαξιλάρια σακχαρόζη, και φυγοκεντρήθηκε στα 100.000

g

για 2 ώρες (SW 41 Ti swing κουβά ρότορα με ένα k-παράγοντα 256,6). Οι ΗΟ (0.5 κ.εκ.) συλλέχθηκαν από τη διεπαφή μεταξύ των μαξιλαριών σακχαρόζη 0,8 και 2,0 Μ, και αραιώθηκαν με 1,42 κ.εκ. αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό άλας και 2,88 mL 50% iodixanol (Axis-Shield PoC AS, Nycomed, Νορβηγία), για δίνουν 30% iodixanol. Αυτό το δείγμα τοποθετείται στο κάτω μέρος του σωλήνα και επικαλύπτονται με 3 mL 20% iodixanol και 2,5 mL 5% iodixanol. Μετά από φυγοκέντρηση στα 200.000

g

για 2 h (SW 41 Ti κούνια κουβά ρότορα με ένα k-συντελεστή 128.3), 10 κλάσματα ίσο όγκο (1 mL) απομακρύνθηκαν από την κορυφή της κλίσης. Τέλος, τα καθαρισμένα ΗΟ μετρήθηκαν για περιεκτικότητα πρωτείνης τους χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford (Bio-Rad, Munich, Germany) και εφαρμόστηκε σε περαιτέρω δοκιμασίες. Έχουμε λάβει 70-150 μg του ΗΟ σε ολικές πρωτεΐνες από ~2,000 κ.εκ. 24 ώρες χωρίς ορό ρυθμισμένο μέσο των καρκινικών κυττάρων (SW480, HCT116, Α549, ΗΤ1080, SH-SY5Y, και PC3): η απόδοση του ΗΟ από το ίδιο ποσό κανονικών ανθρώπινων βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων (BEAS-2Β) είναι ~ 10 μg συνολικά πρωτεΐνες.

Western ανάλυση κηλίδος

Κάθε κλάσμα του βαθμίδες πυκνότητας iodixanol διαχωρίστηκε με SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Η μεμβράνη αποκλείστηκε και επωάστηκαν με αντι-CD81 (BD Biosciences, San Jose, CA), αντι-CD63 αντίσωμα ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντίσωμα αντι-GM130 ποντικού (BD Biosciences), και αντι-ποντικού -cytochrome

γ

αντισώματος (BD Biosciences), που ακολουθείται από αντισώματα αντι-ποντικού κατσίκας συζευγμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz Biotechnology). Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με ένα υπόστρωμα chemiluminnescent.

Μυοειδούς Matrigel δοκιμασίας και ανοσοχρώση

Χρησιμοποιήσαμε ηλικίας 6-8 εβδομάδων ποντικούς άγριου τύπου από το Jackson Laboratory. Ποντίκια (n = 5) εγχύθηκαν υποδορίως με 0,5 mL Matrigel (BD Biosciences) που περιέχουν 20 μα SW480 προερχόμενων ΕΕΥ ή αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (Invitrogen). Την ημέρα 7 μετά την ένεση, τα ποντίκια θανατώθηκαν, και ο Matrigel απομακρύνθηκε και χρωματίστηκαν για ολόκληρο-mount ανοσοφθορισμού. Τα αιμοφόρα αγγεία ανοσοχρωματίστηκαν με αντι-CD31 αντίσωμα κατσίκας (Cell Signaling Technology) ακολουθούμενο από αντίσωμα κατσίκας αντι-AlexaFluor488 γάιδαρος (Invitrogen). Όλες οι εικόνες έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ένα FV1000 Ολύμπου ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) εφοδιασμένο με ένα αντικειμενικό φακό UPlanSApo 20 × /0.75 και απέκτησε χρησιμοποιώντας FV1000-ASW 1,5 λογισμικού (Όλυμπος). Η CD31-θετική περιοχή (μm

2) στην εικόνα ανοσοφθορισμού αναλύθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health). Όλα τα ζώα έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα, και τα πειράματα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών ζώων σε Ποχάνγκ Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ποχάνγκ, Δημοκρατία της Κορέας (αριθμός έγκρισης: 2011-01-0015).

Ξυστό επούλωση της πληγής δοκιμασία

HMEC-1s απλώθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων (Corning Inc., Corning, ΝΥ) σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν διανυκτέρευση. Συρρέοντα HMEC-1s τραυματίστηκαν από μια σκόπιμη μηδέν και επωάζονται με έλεγχο, SW480 που προέρχονται ΕΕΥ (1 μg /ml, 0,5 ml), ή EGM-2. Δώδεκα ώρες μετά από τον τραυματισμό, τα κύτταρα πλύθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο, χρωματίστηκαν με CellTracker (Invitrogen), και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη πριν από την απεικόνιση φθορισμού. Εικόνες έγιναν ορατά κάτω από τον Όλυμπο 1 × 81 ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus) και απέκτησε τη χρήση του λογισμικού MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών δοκιμασία

HMEC-1s ήταν τοποθετήθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων (Corning Inc., Corning, ΝΥ) με γυάλινες καλυπτρίδες (Fisher Scientific, Rochester, ΝΥ) σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Μετά από θεραπεία 24 ώρες με έλεγχο, ΗΟ SW480 προερχόμενα (1 μg /mL, 0.5 mL), ή EGM-2, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και επωάστηκαν με Η3 (ΡΗ3) αντίσωμα-φωσφο-ιστόνης αντι-κουνελιού (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ) ακολουθούμενο από αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού κατσίκας AlexaFluor488 (Invitrogen). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst (Sigma-Aldrich). Εικόνες έγιναν ορατά κάτω από συνεστιακό μικροσκόπιο FV1000 Ολύμπου (Olympus) και απέκτησε χρησιμοποιώντας FV1000-ASW 3,0 λογισμικού (Όλυμπος). Το ποσοστό των ΡΗ3-θετικών κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση των κυττάρων με συν-εντοπισμένη σημάτων φθορισμού.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Primer3 (Whitehead Institute, https://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση γονιδίου ήταν ως εξής: GAPDH προς τα εμπρός, 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3 ‘? αντίστροφη GAPDH, 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3 ‘? EGR1 εμπρός, 5’-CCGCAGAGTCTTTTCCTGAC-3 ‘? EGR1 αντίστροφη, 5’-AGCGGCCAGTATAGGTGATG-3 ‘. HMEC-1s (2 × 10

5 κύτταρα) επιστρώθηκαν σε πλάκα των 6 φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΗΟ (1 μg /mL, 2.0 mL) για 0,5, 1, 1,5, 2 και 4 ώρες. RNA εκχυλίστηκε από καλλιεργημένα κύτταρα με τη χρήση του RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Για πραγματικού χρόνου RT-PCR, ολικό RNA (100 ng) ενισχύθηκε με ένα βήμα SYBR RT-PCR Kit (Takara Bio, Tokyo, Japan) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα LightCycler PCR 2.0 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των δειγμάτων στους 50 ° C για 2 λεπτά, στη συνέχεια στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από επαναλαμβανόμενους κύκλους στους 95 ° C για 15 sec, 55 ° C για 10 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 10 sec, για συνολικά 45 κύκλους. Η συγκριτική μέθοδος Ct χρησιμοποιήθηκαν για σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου κατά εκείνη ενός γονιδίου housekeeping, GAPDH [40].

Egr-1 πυρηνική μετατόπιση

HMEC-1s απλώθηκαν σε 24- καλά πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας (Corning Inc.) με γυάλινες καλυπτρίδες (Fisher Scientific) σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL, 0.5 mL), μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, και επωάστηκαν με αντι-Egr-1 αντισώματος κουνελιού (Cell Signaling Technology, Hitchin, Ηνωμένο Βασίλειο) που ακολουθείται από κατσίκα αντι- AlexaFluor488 αντίσωμα IgG κουνελιού (Invitrogen). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst (Sigma-Aldrich). Εικόνες έγιναν ορατά κάτω από συνεστιακό μικροσκόπιο FV1000 Ολύμπου (Olympus) και απέκτησε χρησιμοποιώντας FV1000-ASW 3,0 λογισμικού (Όλυμπος). Το ποσοστό των Egr-1-θετικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση των κυττάρων με συν-εντοπισμένη σημάτων φθορισμού.

Για να διερευνηθεί η επίδραση των αναστολέων (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, ΡΑ, USA) ή μεθυλ- σηματοδότησης β-κυκλοδεξτρίνης (MβCD? Sigma-Aldrich) σε Egr-1 πυρηνική μετατόπιση, HMEC-1s υποβλήθηκαν σε αγωγή με /2 αναστολέα ERK1 (PD98059, 20 μΜ), αναστολέα ρ38 ΜΑΡΚ (SB203580, 10 μΜ), αναστολέα JNK (SP600125, 20 μΜ), ο αναστολέας Akt (BML-257, 20 μΜ), ή MβCD (10 mM) παρουσία ή απουσία SW80 προερχόμενων ΗΟ (1 μg /mL).

παρεμβολή RNA διαμεσολαβούμενη μειορύθμιση του Egr -1

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) της Egr-1 (Bioneer, Daejeon, Κορέα) σε τελική συγκέντρωση 50 ηΜ επιμολύνθηκε σε HMEC-1s χρησιμοποιώντας Welfect-Q (Welgene, Taegu, Κορέα). Μη σίγηση περιπλεγμένο siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση για να προσδιοριστεί το επίπεδο της έκφρασης mRNA Egr-1, Egr-1 ανιχνεύσεις πυρηνικής μετατόπισης, και το μηδέν δοκιμασίες επούλωση πληγών. Οι αλληλουχίες siRNA ήταν ως εξής: κωδικοποιημένο siRNA, 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ‘? Egr-1 siRNA-1, 5’-CAGUAUCAUCUCCAUCAUA-3 ‘? Egr-1 siRNA-2, 5’-AGUUUGCCAGGAGCGAUGA-3 ‘? Egr-1 siRNA-3, 5’-GUGCAAUUGUGAGGGACAU-3 ‘.

EV πρόσληψη

SW480 προερχόμενα ΗΟ σημάνθηκαν με με Dil (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, SW480 προερχόμενο ΗΟ (100 μg) επωάστηκαν με με Dil (1 μΜ) για 15 λεπτά στους 37 ° C και φυγοκεντρήθηκαν στα 100.000

g

για 2 ώρες στους 4 ° C (τύπου 90 Τί σταθερής γωνίας στροφείο με k-παράγοντα 126,4). Τα σφαιρίδια, με Dil-σημασμένο ΕΕΥ, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα, και μετά υπερφυγοκέντρηση σε 100.000

g

για 2 ώρες στους 4 ° C (τύπου 90 Τί σταθερής γωνίας στροφείο με k-συντελεστή 126.4), επανααιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. HMEC-1s προκατεργάστηκαν χωρίς ή MβCD (10 mM) για 0,5 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με SW480 προερχόμενο ΕΕΥ με Dil-επισημασμένο (1 μg /mL, 0.5 mL) για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και οι πυρήνες βάφτηκαν με Hoechst (Sigma-Aldrich). Εικόνες έγιναν ορατά κάτω από συνεστιακό μικροσκόπιο FV1000 Ολύμπου (Olympus) και απέκτησε χρησιμοποιώντας FV1000-ASW 3,0 λογισμικού (Όλυμπος).

Στατιστικές αναλύσεις

Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± Τ.Α.

P τιμές

υπολογίστηκαν από μονόδρομη ή αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με διόρθωση Bonferroni, με βάση τις συγκρίσεις με τα κατάλληλα δείγματα ελέγχου δοκιμάστηκαν συγχρόνως.

Αποτελέσματα

SW480 που προέρχονται ΕΕΥ προωθούν

in vivo

και

in vitro

αγγειογένεση

EVs που απελευθερώνεται από SW480 κύτταρα καθαρίστηκαν από υπερκείμενα καλλιέργειας από ένα συνδυασμό διαφορικής φυγοκέντρησης , υπερδιήθηση χρησιμοποιώντας μεμβράνη κοίλης ίνας 100-kDa, υπερφυγοκέντρηση πάνω σε μαξιλάρια σακχαρόζη, και κλίσεις πυκνότητας iodixanol όπως αναφέρθηκε [8]. Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη [8], τα καθαρισμένα ΕΕΥ είχε πυκνότητα ~1.098 g /mL και έτρεφε CD81 και CD63, πρωτεΐνες δείκτη EV (Εικ. 1Α). Ωστόσο, αυτά τα καθαρισμένα ΗΟ δεν περιείχαν GM130 (α

cis

-Golgi πρωτεΐνης) και κυτόχρωμα

γ

(α μιτοχονδριακή πρωτεΐνη που βρίσκεται σε αποπτωτικά σώματα): αυτές οι δύο πρωτεΐνες είναι πολύ γνωστές μη φυσαλιδώδους πρωτεΐνες (Εικ. 1Β). Δείξαμε, πρώτον, ότι η ΕΕΥ προέρχεται από SW480 κύτταρα του παχέος αδενοκαρκινώματος του ανθρώπου που προκαλείται

in vivo

νεοαγγείωση (Εικ. 1Γ και 1Δ). Όταν SW480 προερχόμενο ΗΟ εντός Matrigel εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς, παρατηρήθηκε μαζική σχηματισμός δομών CD31-θετικών σκάφος-όπως (Εικ. 1 C). Αντιθέτως, δεν σχηματισμός εμφανής σκάφος ανιχνεύθηκε στο Matrigel χωρίς ΕΕΥ. ΗΟ επάγεται σημαντικά ένα 10,4-πλάσια αύξηση στο CD31-θετικά περιοχή στην Matrigel σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Σχ. 1D).

(Α, Β) που απελευθερώνεται από τα ΗΟ SW480 κύτταρα καθαρίστηκαν από υπερκείμενα καλλιέργειας με ένας συνδυασμός διαφορική φυγοκέντρηση, υπερφυγοκέντρηση πάνω σε μαξιλάρια σακχαρόζη, και βαθμίδες πυκνότητας iodixanol. Κάθε κλάσμα βαθμίδες πυκνότητας iodixanol αναλύθηκε με κηλίδωση Western για την ανίχνευση CD81 και CD63, πρωτεΐνες δείκτη της ΕΕΥ (Α). Τα καθαρισμένα ΕΕΥ στο κλάσμα 3 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για την ανίχνευση πρωτεϊνών δείκτη μη-EV (GM130 και κυτόχρωμα

γ

). SW480 προερχόμενο ολόκληρο λύμα κυττάρων (WCL? 10 μg) και ΗΟ SW480 προερχόμενο (ΗΟ? 10 μg) φορτώθηκαν για κηλίδωση Western ανάλυση (Β). (C, D) Matrigel εν τη παρουσία ή απουσία SW480 προερχόμενων ΗΟ (20 μg) εγχύθηκε υποδορίως σε ποντικούς C57BL /6. Μετά από 7 ημέρες, ολόκληρο-mount χρώση Matrigel με αντι-CD31 αντίσωμα διεξήχθη (n = 5). Αντιπροσωπευτικά ομοεστιακό Z-stack φωτογραφίες ολόκληρων αναρτήσεις χρώση για CD31 (πράσινο) φαίνεται στο μπαρ του πίνακα Γ Κλίμακα αντιπροσωπεύουν 100 μm. Ο φθορισμός εντάσεις CD31 χρώση του επιπέδου Ζ-στοίβα του Matrigel μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (D). (Ε) Μεταναστευτικό δραστηριότητα ΕΕΥ SW480 που προέρχονται αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής μηδέν. Συρρέοντα HMEC-1s ήταν γδαρμένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL)? τότε ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην απογυμνωμένη ζώνη αξιολογήθηκε μετά από 12 h (n = 3). (F) Η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των ΗΟ SW480 προερχόμενων (1 μg /mL) αξιολογήθηκε με αξιολόγηση της ΡΗ3 δείκτη μίτωσης. Μετά από 24 ώρες, το ΡΗ3 και οι πυρήνες χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΡΗ3 και Hoechst, αντιστοίχως, και αξιολογούνται με συνεστιακή μικροσκόπηση. Το ποσοστό των ΡΗ3-θετικών κυττάρων σε HMEC-1s ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση των κυττάρων με συν-εντοπισμένη σήματα φθορισμού (n = 3). Ως θετικός έλεγχος, HMEC-1s υποβλήθηκαν σε αγωγή με μέσο EGM-2 συμπληρωμένο με ποικίλα αγγειογόνους παράγοντες όπως EGF, FGF2, VEGF, και IGF1. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001? N.S., δεν είναι σημαντική.

Η

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την προ-αγγειογόνος δραστηριότητα SW480 που προέρχονται ΕΕΥ σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, HMEC-1s

in vitro

. δοκιμασίες επούλωση της πληγής ξυστό αποκάλυψε ότι ΗΟ προκάλεσε μία 4,1-πλάσια αύξηση στον αριθμό των μετανάστευσαν ενδοθηλιακών κυττάρων στο απογυμνωμένη ζώνη σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Σχ. 1Ε). Επιπλέον, τα ΗΟ ισχυρώς διέγειρε τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων: το ποσοστό των ΡΗ3-θετικών κυττάρων αυξήθηκε 8,9 φορές έναντι εκείνης των μη διεγερμένα κύτταρα (Σχ 1F.). Ο θετικός μάρτυρας, EGM-2 συμπληρωμένο με ποικίλα αγγειογόνους παράγοντες όπως EGF, FGF2, VEGF, και IGF1, επίσης επάγεται τόσο μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. Τα μεταναστευτικά και πολλαπλασιαστικές δραστηριότητες των SW480 που προέρχεται ΕΕΥ παρατηρήθηκαν επίσης σε άλλους ενδοθηλιακά κύτταρα, HUVECs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η SW480 προερχόμενο ΕΕΥ έχουν

in vivo

και

in vitro

αγγειογενετική δραστηριότητα.

SW480 προερχόμενο ΕΕΥ επάγει ενεργοποίηση Egr-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα

Egr-1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση [29] – [32]. Εξετάσαμε έτσι τη δυνατότητα της ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών Egr-1 με SW480 προερχόμενο ΗΟ (Εικ. 2). Οι αναλύσεις πραγματικού χρόνου RT-PCR αποκάλυψε ότι η θεραπεία με ΗΟ SW480 προερχόμενο προκάλεσε ταχεία και παροδική αύξηση του Egr-1 έκφραση στο μεταγραφικό επίπεδο σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, HMEC-1s και HUVECs (Σχ. 2Α). Χρησιμοποιήσαμε HMEC-1s στα ακόλουθα πειράματα. Επιπλέον, ΗΟ από άλλα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα (ορθοκολικό καρκίνωμα HCT116, αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549, ΗΤ1080 ινοσαρκώματος, καρκίνωμα προστάτη PC3, και SH-SY5Y νευροβλαστώματος) προκάλεσε επίσης mRNA έκφραση Egr-1 σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ τα ΗΟ από φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (BEAS-2Β) δεν (Εικ. 2Β). Ερευνήσαμε περαιτέρω ενεργοποίηση Egr-1 μετά από διέγερση από SW480 που προέρχονται ΕΕΥ. ΗΟ προκαλούμενη ταχεία και παροδική έκφραση και πυρηνική μετατόπιση του Egr-1 πρωτεΐνη σε HMEC-1s? το μέγιστο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία EV (Σχ. 2C και 2D). Στο σύνολό τους, που λαμβάνεται από καρκίνο ΕΕΥ επάγει ενεργοποίηση Egr-1 με την αύξηση της έκφρασης της και πυρηνική μετατόπιση σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι ενεργοποίηση Egr-1 μπορεί να είναι κρίσιμη για την διαμόρφωση EV-επαγόμενη αγγειογένεση.

(Α) HMEC-1s και HUVECs επωάζονται με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL) ή μη κατεργασμένο έλεγχο. mRNA απομονώθηκε από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα που κατεργάζονται με ΗΟ για 0, 0,5, 1, 2, και 4 ώρες και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR (n = 3). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν Egr-1 mRNA /GAPDH mRNA κανονικοποιημένα προς μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου. (Β) HMEC-1s υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΗΟ (1 μg /ml) που προέρχεται από καρκίνωμα HCT116 ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549, ΗΤ1080 ινοσαρκώματος, καρκίνωμα του προστάτη PC3, SH-SY5Y νευροβλαστώματος, και BEAS-2Β κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων για 0.5 h ( n = 3). (C, D) Σε HMEC-1s, πυρηνική μετατόπιση της πρωτεΐνης Egr-1 μετά από διέγερση με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL) για 0,5, 1, 2, και 4 ώρες αναλύθηκε υπό συνεστιακή μικροσκοπία (n = 3) . πρωτεΐνες Πυρήνες και Egr-1 υπέστησαν χρώση με Hoechst (μπλε) και-Egr-1 αντίσωμα (κόκκινο), αντίστοιχα. σήματα φθορισμού Co-εντοπισμένο (μοβ) δείχνουν την μετατόπιση του Egr-1 στον πυρήνα. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες φαίνονται στον πίνακα Γ Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 30 μm. Το ποσοστό των Egr-1-θετικών πυρήνων προσδιορίσθηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων με πυρήνα colocalized σήματα πάνω από αυτή του συνόλου των κυττάρων (D). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? **

P

& lt? 0.001? ns, δεν είναι σημαντική.

Η

Egr-1 siRNA εξασθενεί μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων που προκαλείται από ΗΟ SW480 προερχόμενο

επόμενο διερευνηθεί ο ρόλος των Egr-1 σε EV-επαγόμενη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τη χρήση siRNA. Όταν εξετάσαμε τρεις Egr-1 siRNAs, διαπιστώσαμε ότι το Egr-1 siRNA-1 μείωσε τον πλέον αποτελεσματικό τρόπο το επίπεδο mRNA Egr-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα αλλά κωδικοποιημένα siRNA δεν έδειξαν αυτή την ανασταλτική επίδραση (Εικ. 3Α). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα υπέστησαν αγωγή με Egr-1 siRNA-1 αποκλεισμένη αποτελεσματικά EV-επαγόμενη ενεργοποίηση Egr-1 (Σχ. 3Β) και τη μετανάστευση όπως παρατηρείται σε δοκιμασίες επούλωση της πληγής μηδέν (Εικ. 3C και 3D), ενώ κωδικοποιημένα siRNA δεν δείχνουν αυτές τις ανασταλτικές δράσεις . Έτσι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι EV-επαγόμενη έκφραση και πυρηνική μετατόπιση του Egr-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα πρέπει να συμβάλει στην EV-επαγόμενη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων.

(Α) HMEC-1s επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ siRNA κωδικοποιημένα ή Egr-1 siRNA-1, Egr-1 siRNA-2, ή Egr-1 siRNA-3. mRNAs απομονώθηκαν από τα κύτταρα μετά από 48 ώρες και το επίπεδο της Egr-1 mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR (n = 3). (Β) πυρηνική μετατόπιση της πρωτεΐνης Egr-1 μετά από διέγερση με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL) για 1 ώρα αναλύθηκε σε κωδικοποιημένο siRNA (50 ηΜ) ή Egr-1 siRNA-1 (50 ηΜ) επιμολυσμένα HMEC-1s (n = 3). (C, D) Συρρέοντα HMEC-1s επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA (50 ηΜ) ή Egr-1 siRNA-1 (50 ηΜ) ήταν γδαρμένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL)? τότε ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην απογυμνωμένη ζώνη αξιολογήθηκε μετά από 12 h (n = 3). Ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην απογυμνωμένη ζώνη κάθε ομάδα φαίνεται στον πίνακα D. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 100 μm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? 0.001? ns, δεν είναι σημαντική.

Η

Τα μονοπάτια ERK1 /2 και JNK σηματοδότησης που εμπλέκονται στην EV-επαγόμενη ενεργοποίηση Egr-1 και της μετανάστευσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα

Στη συνέχεια ερευνήσαμε τα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην EV-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση Egr-1. /2 αναστολέα ERK1 (PD98059) και αναστολέα JNK (SP600125) σχεδόν πλήρως κατασταλεί Egr-1 πυρηνική μετατόπιση σε ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από διέγερση με ΗΟ SW480 που προέρχεται, αλλά αναστολέα ρ38 ΜΑΡΚ (SB203580) και ο αναστολέας Akt (BML-257) δεν είχε καμία επίδραση (Εικ. 4Α και 4Β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι PD98059 και SP600125 θεραπείες σχεδόν μπλοκαριστεί εντελώς EV-επαγόμενη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ αυτοί οι αναστολείς δεν έδειξαν εμφανή επίδραση στη βασική μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Σχ. 4C και 4D). Επιπλέον, PD98059 ή SP600125 ανέστειλε σχεδόν πλήρως τις

in vivo

αγγειογενετική δραστηριότητα της ΕΕΥ SW480 που προέρχονται από (Εικ. 4Ε και 4F). Όλες αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι οι /2 και JNK οδών σηματοδότησης ERK1 είναι απαραίτητα για ενεργοποίηση Egr-1, μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, και

in vivo

αγγειογένεση.

(Α, Β) HMEC-1s προκατεργάστηκαν με αναστολείς σηματοδότησης για 1 ώρα και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 1 ώρα με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL). Πυρηνική μετατόπιση της πρωτεΐνης Egr-1 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (n = 3). πρωτεΐνες Πυρήνες και Egr-1 υπέστησαν χρώση με Hoechst (μπλε) και-Egr-1 αντίσωμα (κόκκινο), αντίστοιχα. σήματα φθορισμού Co-εντοπισμένο (μοβ) δείχνουν την μετατόπιση του Egr-1 στον πυρήνα. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες φαίνονται στον πίνακα Α Το ποσοστό του Egr-1-θετικών πυρήνων προσδιορίσθηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων με πυρήνα colocalized σήματα επί του συνόλου των κυττάρων (Β). (C, D) Συρρέοντα HMEC-1s ήταν γδαρμένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΗΟ SW480 προερχόμενο (1 μg /mL) υπό την παρουσία ή απουσία αναστολέων σηματοδότησης? τότε ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην απογυμνωμένη ζώνη αξιολογήθηκε μετά από 12 h (n = 3). Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες ομοεστιακού μικροσκοπική απεικόνιση φαίνεται στο πάνελ C και ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων στην απογυμνωμένη ζώνη κάθε ομάδα φαίνεται στον πίνακα αναστολέα D. ERK1 /2, PD98059 (20 μΜ)? αναστολέα ΜΑΡΚ p38, SB203580 (10 μΜ)? αναστολέα JNK, SP600125 (20 μΜ)? αναστολέα της Akt, BML-257 (20 μΜ). (Ε, F) C57BL /6 ποντίκια εγχύθηκαν υποδορίως με Matrigel που περιέχουν SW480 προερχόμενα ΗΟ (20 μg) με ΡΟ98059 (20 μΜ) ή SP600125 (20 μΜ). Μετά από 7 ημέρες, ολόκληρο-mount χρώση Matrigel με αντι-CD31 αντίσωμα διεξήχθη (n = 5). Αντιπροσωπευτικά ομοεστιακό Z-στοίβα φωτογραφίες ολόκληρων αναρτήσεις χρωματίστηκαν για CD31 (πράσινο) φαίνονται στον πίνακα Ε εντάσεις φθορισμού του CD31 στο επίπεδο Ζ-στοίβα του Matrigel μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους (F). Ράβδοι κλίμακας σε πάνελ Α, C, και Ε αντιπροσωπεύουν το 30, 100, και 100 μm, αντίστοιχα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. ***

P

& lt?. 0.001

Η

αναστολέας Ενδοκυττάρωση αναστέλλει ενεργοποίηση Egr-1 και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων που προκαλείται από την ΕΕΥ SW480 που προέρχονται

Ως μια πιθανή συμμετοχή λιπιδίου ενδοκύτωσης σχεδία πρόσληψης EV [41], [42], εξετάσαμε το ρόλο των λιπιδικών σχεδιών στην πρόσληψη EV από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Με Dil-επισημασμένο πρόσληψη EV ανεστάλη σημαντικά μετά από θεραπεία με MβCD (10 mM) (Σχ. 5Α). EV-επαγόμενη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε απογυμνωμένες ζώνη ήταν εντελώς αποκλεισμένη από επεξεργασία MβCD (Εικ. 5Β). Επιπλέον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα κατεργασμένα με MβCD μπλοκαριστεί εντελώς EV-επαγόμενη ενεργοποίηση Egr-1 (Σχ. 5C και 5D).