Αφηρημένο

Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για βελτιωμένη θεραπεία για προχωρημένο καρκίνωμα των ωοθηκών, που μπορούν να καλυφθούν με τη χορήγηση ανοσο-ρυθμιστική μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) για τη δημιουργία ενός όγκου-καταστροφική ανοσολογική απόκριση. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών ID8 ποντίκι, ερευνήσαμε την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των διαφόρων συνδυασμών mAb σε ποντίκια με ενδοπεριτοναϊκή (ε.π.) όγκου συστάθηκε με μεταμόσχευση 3 χ 10

6 κύτταρα ID8 10 ημερών το πολύ. Ενώ οι περισσότερες από τις εξετασθείσες mAbs ήταν αναποτελεσματικές όταν χορηγούνται χωριστά ή μαζί, τα δεδομένα επιβεβαιώνουν προηγούμενο εύρημα μας ότι το 2 ε.π. ενέσεις ενός συνδυασμού αντι-CD137 με αντι-Ρϋ-1 mAbs διπλασιάζει συνολική επιβίωση. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το συνδυασμό αυτό mAb έχουν σημαντικά αυξημένη συχνότητα και το συνολικό αριθμό των CD8

+ Τ κύτταρα, τόσο στην περιτοναϊκή πλύση και σπλήνες και αυτά τα κύτταρα είναι λειτουργικά όπως αποδεικνύεται από κυτταρολυτική δραστικότητα και ΙΡΝ-γ παραγωγή αντιγόνου-ειδική. Ενώ η χορήγηση του αντι-CD137 mAb ως μοναδικός παράγοντας αυξάνει παρομοίως CD8

+ Τ κύτταρα, αυτά δεν έχουν καμία λειτουργική δραστηριότητα, η οποία μπορεί να αποδοθεί σε αυξητική ρύθμιση του συν-ανασταλτικών PD-1 και ΤΙΜ-3 μόρια που επάγεται από CD137 . Η προσθήκη του cisplatin αντικαρκινικού φαρμάκου στο mAb συνδυασμού 2 αύξησε τη συνολική επιβίωση & gt? 90 ημέρες (και ήταν μάλλον θεραπευτικές) από ένα μηχανισμό που περιελάμβανε μια συστημική CD8

+ Τ κυτταρική απόκριση με εξειδίκευση όγκου και ανοσολογική μνήμη. Εντυπωσιακά, συνδυασμένη θεραπεία της σισπλατίνης και CD137 /PD-1 mAb προκάλεσε επίσης τη μακροπρόθεσμη επιβίωση των ποντικών με καθιερωμένους όγκους πνεύμονα TC1. Ένας παρόμοιος συνδυασμός των 2 mAbs και σισπλατίνη θα πρέπει να θεωρούνται για κλινική «μετάφραση».

Παράθεση: Wei H, Zhao L, Λι W, Fan K, Qian W, Χου S, et al. (2013) Συνδυαστική PD-1 Αποκλεισμός και CD137 ενεργοποίηση έχει θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε μοντέλα ποντικών Καρκίνος και συνεργεί με σισπλατίνη. PLoS ONE 8 (12): e84927. doi: 10.1371 /journal.pone.0084927

Επιμέλεια: Ramon Arens, Πανεπιστήμιο Leiden Ιατρικό Κέντρο, Κάτω Χώρες

Ελήφθη: 5 του Ιούνη του 2013? Αποδεκτές: 20, Νοεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Wei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81372528), Υπουργείο Επιστημών & amp? Τεχνολογία της Κίνας «973» (Αρ 2012CB917104), ειδικές επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Παιδείας της Κίνας και της Σαγκάης Επιτροπής Παιδείας για την εξαιρετική ερευνητική ομάδα στην Ογκολογία και τη Σαγκάη KeyProject στην Ογκολογία, καθώς και από RO1CA134487 από την US National Institutes of Health. Οι οργανισμοί χρηματοδότησης είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο ωοθηκών (EOC) είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες στις Ηνωμένες Πολιτείες και είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες [1]. Πάνω από το 70% των γυναικών με ΕΓΚ παρόν με προχωρημένο στάδιο της νόσου και τη διάδοση των όγκων σε όλη την περιτοναϊκή κοιλότητα [2]. Η τυπική θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών είναι η χειρουργική debulking ακολουθούμενη από πλατίνα-ταξάνης χημειοθεραπεία βασισμένη [3]. Η σισπλατίνη και τα παράγωγα πλατίνας είναι πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικών παραγόντων στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Σισπλατίνη επάγει την απόπτωση μέσω μιας μη αναστρέψιμης παρεμβαλλόμενα DNA μέσω της διεπιστημονικής και ενδοκλωνικά προσαγωγές DNA, προκαλώντας έτσι βλάβες στο DNA και την ενεργοποίηση του αποπτωτικών μηχανήματα [4]. Οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται στην χημειοθεραπεία κατά την πρώτη? Ωστόσο, η πλειοψηφία θα έχει τελικά μια υποτροπή και να πεθάνουν από τη νόσο. Ως εκ τούτου, οι νέες συμπληρωματικές στρατηγικές για τη βελτίωση της έκβασης του καρκίνου των ωοθηκών.

Υπάρχουν διάφοροι λόγοι να αναμένεται ότι η ανοσοθεραπεία για ΕΓΚ θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική [5]. κύτταρα EOC εκφράζουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους κατά τις οποίες έχουν ανιχνευθεί ειδικές ανοσοαποκρίσεις [6-10]. Μελέτες για πρώτη φορά από Coukos δείχνουν ότι ανοσολογικοί μηχανισμοί παίζουν σημαντικό ρόλο στην κλινική έκβαση δεδομένου ότι υπάρχει στενή συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης και της διείσδυσης του όγκου με CD3

+ Τ κύτταρα [11]. EOC μεταστάσεις συχνά περιορίζονται στην περιτοναϊκή κοιλότητα, η οποία διευκολύνει την τοπική χορήγηση θεραπευτικών παραγόντων [12]. Οι περισσότεροι ασθενείς με προχωρημένη νόσο μπορεί να τεθεί σε προσωρινή κλινική ύφεση, όπου το φορτίο του όγκου είναι μικρή και συνεπώς πιο πιθανό να ανταποκριθούν [9]. Ωστόσο, η κλινική επιτυχία με ανοσοθεραπεία για EOC υπήρξε περιορισμένη [13].

Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν επιδείξει θεραπευτική αποτελεσματικότητα τόσο σε μοντέλα ποντικών και ανθρώπων ασθενών με χορήγηση mAbs που μπορούν να τροποποιήσουν την ανοσοαπόκριση όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους ή σε συνδυασμούς. Για παράδειγμα, mAbs να CTLA4 έχουν αντικαρκινική αποτελεσματικότητα με την παρατεταμένη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με μεταστατικό μελάνωμα, και ένα αντι-ΟΤΙ_Α4 mAb κλινικά εγκεκριμένο από το FDA [14]. έχουν ευεργετικά θεραπευτικά αποτελέσματα έχει αποδειχθεί σε ποντικούς με καθιερωμένους όγκους [14,15] από την εμπλοκή CD137 (γνωστός και ως 4-1ΒΒ), χρησιμοποιώντας αντισώματα αγωνιστή, διμερή RNA απταμερή ή κύτταρα όγκου που εκφράζουν ένα αντίσωμα αντι-CD137 μονής αλυσίδας επιφάνεια εγγεγραμμένων [15, 16], και τα προκλινικά δεδομένα έχουν οδηγήσει σε κλινικές δοκιμές με ανθρωποποιημένα μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον CD137 [17]. Προγραμματισμένος θάνατος 1 (PD-1) πρωτεΐνη είναι ένα συν-ανασταλτικός υποδοχέας επί Τ κυττάρων με μια δομή παρόμοια με εκείνη του CTLA-4, αλλά με μια ξεχωριστή βιολογική λειτουργία και επιλεκτικότητα προσδέματος [18]. Ο αποκλεισμός της αλληλεπίδρασης μεταξύ PD-1 και συνδέτη, PD-L1, ενισχύει Τ-κυττάρων ανοσοαποκρίσεων in vitro και μεσολαβεί αντικαρκινική δραστικότητα [19-21]. Τα προκλινικά ευρήματα έχουν οδηγήσει σε πρόσφατα αναφερθεί κλινικές δοκιμές δείχνουν ότι το αντι-PD-1 και αντι-ΡD-L 1 mAbs παράγουν ένα εντυπωσιακό αντικαρκινική δραστικότητα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, μελάνωμα και καρκίνο νεφρικών κυττάρων με πλήρη υποχώρηση επιτευχθεί σε ορισμένους ασθενείς [22-24].

Παρά την υποσχόμενη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα αρκετών mAbs, πολλοί όγκοι είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία με ενιαίο αντι-CD137, αντι-PD-1 ή αντι-ΟΤΙ_Α4 mAbs [25,26] και συνδυασμούς δύο ή περισσοτέρων μπορεί να χρειαστούν mAbs. Δείξαμε πρόσφατα σε όλα 4 μοντέλα όγκου ποντικού, συμπεριλαμβανομένου του κλώνου ID8 του καρκίνου MOSEC ποντικού των ωοθηκών, που επαναλαμβάνονται παράδοση στη θέση του όγκου ενός συνδυασμού mAbs προς CD137 /PD-1 /CTLA4 προκαλείται μακροχρόνια παλινδρομήσεις όγκου και ακόμη και θεραπείες και ότι ένας συνδυασμός mAb το οποίο περιελάμβανε επίσης ένα mAb προς CD19 ήταν ακόμη πιο αποτελεσματική [27]. Αν και τα στοιχεία αυτά είναι σημαντικά, αποδεικνύοντας ότι η στροφή από έναν τύπο Th2 φλεγμονώδη αντίδραση, η οποία είναι διαδεδομένη σε όγκους [28-30], σε μια απάντηση του τύπου Th1 μπορεί να είναι θεραπευτική, επανέλαβε την παράδοση των 3-4 mAbs σε θέσεις όγκου δεν είναι πρακτικό για την κλινική «μετάφραση».

Το πρόβλημα που συνδέεται με την ανάγκη για την τοπική παράδοση μπορεί να ξεπεραστεί για καρκίνους των ωοθηκών, δεδομένου ότι αναπτύσσονται και μεταστάσεις κυρίως στην περιτοναϊκή κοιλότητα και έτσι είναι προσβάσιμα. Επιπλέον, ο αριθμός των απαιτούμενων mAbs μπορεί να μειωθεί σε δύο, αφού έχουμε ήδη βρει ότι ένας συνδυασμός από αντι-CD137 και mAbs αντι-PD-1 μπορεί να διπλασιάσει την επιβίωση των ποντικών με εγκατεστημένων όγκων ID8 αν και δεν είναι θεραπευτική. [28] Με βάση αυτά τα ευρήματα που έχουμε τώρα σε σχέση ο

in vivo

θεραπευτική αποτελεσματικότητα, μετρούμενη ως παρατεταμένη συνολική επιβίωση, αντι-CD137 /PD-1 συνδυασμό με εκείνη των mAbs δίνονται σαν απλούς παράγοντες, καθώς και με άλλα mAbs και mAb συνδυασμούς. Ερευνήσαμε περαιτέρω τις συστημικές και τις τοπικές τους ανοσολογικούς μηχανισμούς που ασχολούνται με ενιαία ή σε συνδυασμό μονοκλωνικά αντισώματα αντι-CD137 /PD-1. Είναι σημαντικό, εμείς στη συνέχεια έδειξε ότι ο συνδυασμός των αντι-CD137 /PD-1 mAbs με την σισπλατίνη αντικαρκινικό φάρμακο παρατείνει σημαντικά τη ζωή και είναι ίσως θεραπευτική έως 80% των ποντικών με καθιερωμένες καρκίνωμα ID8 από έναν μηχανισμό που εμπλέκει λειτουργικά CD8

+ Τ κυττάρων και έχει καρκινικά ειδικότητα αντιγόνου, καθώς και ανοσολογική μνήμη. Ένα παρόμοιο σχήμα οδήγησε επίσης σε μακροπρόθεσμη επιβίωση του 33,3% των ποντικών με καθιερωμένες καρκίνωμα πνεύμονα TC1. Μια παρόμοια προσέγγιση πρέπει να είναι «μεταφράσιμο» στην κλινική.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια και κυτταρικές σειρές

Για τα πειράματα που διεξάγονται στην Κίνα, 6-8 -Εβδομάδα θηλυκά C57BL αγοράστηκαν από το Πειραματικό Κέντρο Ζώων του Β Στρατιωτική Ιατρική Πανεπιστήμιο και ζωικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της δεύτερης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. πειράματα σε ζώα που πραγματοποιήθηκαν στο Σιάτλ που χρησιμοποιούνται ποντίκια αγοράστηκαν από Charles River Laboratories (Wilmington, ΜΑ) και τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον.

ID8 είναι ένας κλώνος του ωοθηκικού καρκινώματος MOSEC των C57BL /6 καταγωγής [31] και TC1 είναι κλώνος που προέρχεται από πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα από ποντικούς C57BL /6 συν-μετασχηματισμένα με HPV-16 Ε6 και Ε7 [27]. Τα κύτταρα Τ κυττάρων λεμφώματος EL4 ποντικού είναι C57BL /6 προέλευσης [32]. καρκινικά κύτταρα ID8 και TC1 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, πριν κυτταρικά εναιωρήματα παρασκευάστηκαν και μεταμοσχεύθηκαν σε ποντίκια. Τα κύτταρα EL4 και τα κύτταρα σπλήνας διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 25 mM HEPES, 2 mM γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη.

Αντιδραστήρια

Τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα (mAb) που χρησιμοποιούνται σε πειράματα με ζώα αγοράστηκαν από BioXcell (West Lebanon, ΝΗ): αντι-CD137 (κλώνος lob12.3), αντι-Ρϋ-1 (κλώνος RMP1-14), αντι- CTLA4 (κλώνος 9D9), αντι-ΝΚ1.1 (κλώνος ΡΚ136), αντι-CD8 (κλώνος 2.43), αντι-CD4 (GK1.5 κλώνος) και ελέγχου (κλώνος 2Α3). Το αντι-CD137 αντίσωμα του κλώνου 2Α παρασκευάστηκε στο εργαστήριο μας όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [33].

Μελέτες σε ζώα

Ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς (ε.π.) με 3 × 10

6 ID8 κύτταρα σε 0.1 mL PBS. Τις ημέρες 10 και 14 μετά τον εμβολιασμό του όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν ί.ρ. με 0.5 mg κάθε mAb σε συνολικό 0,5 mL PBS, όπως φαίνεται στις λεζάντες σχήμα. Σε πειράματα με /σισπλατίνη συνδυασμένη θεραπεία mAb, ομάδα ποντικών (10 ποντικοί ανά ομάδα) που φέρει 10 ημερών εγκατεστημένος ID8 όγκου έλαβαν δύο δόσεις ελέγχου, αντι-Ρϋ-1, αντι-CD137 ή αντι-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg ανά δόση ανά ποντίκι) σε διάστημα 4 ημερών ή χωρίς σισπλατίνη (10 mg /kg), η συγχορήγηση με την πρώτη θεραπεία τους. Τα ποντίκια ζυγίστηκαν κάθε δεύτερη ημέρα και να ελέγχονται καθημερινά για πρησμένα κοιλιές ως ενδεικτικό της ασκίτη πληροφοριών και για τυχόν ενδείξεις τοξικότητας, όπως άλλαξε συμπεριφορά, αδυναμία να κινηθεί, να φάει ή να πιει. Μετά από οδηγίες του ιδρύματος, τα ποντίκια σκοτώθηκαν όταν ανέπτυξαν ασκίτη και είχε μια αύξηση βάρους & gt? 30%. Η επιβίωση κάθε ποντικού καταγράφεται και συνολική επιβίωση υπολογίστηκε. Για πειράματα συνδυασμένη θεραπεία στο μοντέλο TC1 όγκου, τα ποντίκια (6 ανά ομάδα) εγχύθηκαν υποδορίως (s.c.) με 5 × 10

5 TC1 κύτταρα σε 0.1 mL PBS. Τις ημέρες 5 και 9 μετά τη μεταμόσχευση του όγκου, τα ποντίκια ενέθηκαν εντός του όγκου (ε.τ.) με mAbs ή /και σισπλατίνη χρησιμοποιώντας δόση /πρόγραμμα που περιγράφεται παραπάνω. Τρεις κάθετες διαμέτρους s.c. όγκοι μετρήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο και υπολογίστηκαν τα φορτία όγκου σύμφωνα με τον τύπο: 1/2 χ (μήκος) χ (πλάτος)

2. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν φάνηκε ετοιμοθάνατα ή υποδόρια τους όγκοι έφτασαν 10 mm σε διάμετρο.

Για την εκτίμηση της εξέλιξης της ανοσολογικής μνήμης, 15 μακροπρόθεσμη επιζών ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη /αντι-PD1 /CD137 συνδυασμένη θεραπεία (συγκεντρωτική από 2 ανεξάρτητα πειράματα) ή 5 ίδιας ηλικίας αφελή ποντίκια (η οποία χρησίμευσε ως έλεγχος) προκλήθηκαν ip ή s.c. με 3 × 10

6 κύτταρα ID8 ή 1 × 10

6 συγγενικά αλλά αντιγονικά διαφορετικά TC1 κύτταρα. Η ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς εκτιμήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

Για πειράματα εξάντληση, ένα αντι-CD4 (0,2 mg /ποντικό), αντι-CD8 (0,2 mg /ποντικό), αντι-ΝΚ1.1 (0,1 mg /ποντικού) ή mAb ελέγχου (0,2 mg /ποντικό) εγχύθηκε ip 48 και 72 ώρες πριν από τη θεραπεία και κάθε 3-4 ημέρες μετά τη διάρκεια των πειραμάτων. Η εξάντληση των κατάλληλων υποσυνόλων των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αξιολόγηση των ανοσοκυττάρων υποσύνολα σε σπλήνες και περιτοναϊκή πλύσεις με κυτταρομετρία ροής

Ποντίκια τα οποία είχαν μεταμοσχευθεί ε.π. με κύτταρα ID8 ευθανατώθηκαν 7 και 14 ημέρες αφού είχαν ενεθεί με αντι-PD1, αντι-CD137, αντι-PD1 /CD137 ή ελέγχου όπως στα πειράματα θεραπείας. Αιωρήματα απλών κυττάρων από σπλήνες παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Για να αποκτήσετε περιτοναϊκή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, 3 ml PBS εγχύθηκε στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών με ID8 όγκους αμέσως μετά την ευθανασία, την κοιλιά τους ήταν μαλάξεις και το υγρό απομακρύνθηκε, διηθήθηκε μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 70 μΜ (BD Biosciences, San Jose, CA) , πλύθηκε και το ανοσοποιητικό κύτταρα απομονώθηκαν με τη χρήση ενός ρυθμιστικού διαλύματος απομόνωσης λεμφοκυττάρων ποντικού (Cedarlane, Burlington, Ontario) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Single-κυτταρικά εναιωρήματα πλύθηκαν με ρυθμιστικό χρώσης FACS και επωάστηκαν με αναστολέα δέσμευσης υποδοχέα Fc ποντικού για 10 λεπτά πριν από τη χρώση με αντισώματα του CD45 (κλώνος 30-F11), CD3 (κλώνος 145-2C11), CD4 (κλώνος GK1.5), CD8 (κλώνος 53-6.7), CD19 (κλώνος eBio1D3), CD11b (κλώνος Μ1 /70), GR-1 (κλώνος RB6-8C5), ΤΙΜ-3 (κλώνος 8B.2C12) και PD-1 (κλώνος J43? όλα από eBioscience, San Diego, CA) για 30 λεπτά. Για ενδοκυτταρική χρώση των FoxP3 (κλώνος FJK-16? EBioscience), ΙΡΝ-γ (κλώνος XMG 1.2? EBioscience), και IL-10 (κλώνος JES5-16E3? EBioscience), τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και βάφτηκαν μετά από την οδηγία του κιτ Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience). Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση FACSCalibur (BD Biosciences) και ο πληθυσμός των λεμφοκυττάρων επιλέχθηκε από gating CD45-θετικά κύτταρα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Flow Jo (Tree Star, Ashland, OR). Όλα κυτταρομετρίας ροής πειράματα πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Αξιολόγηση των ειδικών για το αντιγόνο ανοσολογικής απόκρισης

Απομονωμένα σπληνοκύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή καλλιεργήθηκαν σε παρουσία 10 μg /mL H-2Db-περιορισμένο mesothelin προερχόμενο πεπτίδια (mesothelin αμινοξύ 406-414) ή τον έλεγχο HPV-Ε7-πεπτίδιο που προέρχεται από (HPV-Ε7 49-57? όλα από τη Σαγκάη Επιστήμης Peptide Βιολογική Technology Co.Ltd, Σαγκάη.) για 3 ημέρες. Ακολούθως, ΙΡΝ-γ στα υπερκείμενα ανιχνεύθηκε με Mouse ΙΡΝ-γ Quantikine ELISA Kit (R &? Συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν μετά από κανονικοποίηση σύμφωνα με τους αριθμούς των Τ κυττάρων.

Για τις ανιχνεύσεις CTL, τα κύτταρα-τελεστές ελήφθησαν με τη συγκαλλιέργεια 5 × 10

6 σπληνοκυττάρων με 5 × 10

5 UV-ακτινοβολημένα κύτταρα ID8 για 4 ημέρες. Peptide-παλμική EL4 κύτταρα στόχους παρήχθησαν με προσθήκη 10 μg /ml πεπτιδίου και επώαση για 4 ώρες. CTL δραστικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ CytoTox96 μη ραδιενεργού κυτταροτοξικότητας Assay (Promega, Madison, WI) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα στόχοι επωάστηκαν με ποικίλους αριθμούς κυττάρων-δραστών για περίπου 4 ώρες, και τα υπερκείμενα στη συνέχεια αναλύονται για γαλακτικής αφυδρογονάσης απελευθέρωση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό ειδική λύση, η οποία υπολογίζεται ως (πειραματική απελευθέρωση-αυθόρμητη απελευθέρωση /Σύνολο απελευθέρωσης αυθόρμητη απελευθέρωση) χ 100. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα-τελεστές επωάσθηκαν με αντι-CD4 ή CD8 αντίσωμα (10 μg /mL) για 2 ώρες πριν από τον προσδιορισμό CTL.

ELISA

Ποντίκια με ένεση ε.π. με 3 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρα νωρίτερα εγχύθηκαν δύο φορές σε διάστημα 4 ημερών 0.5 mg κάθε mAb σε 0,5 mL PBS. Δύο εβδομάδες μετά την τελευταία ένεση mAb, περιτοναϊκή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (1 × 10

6 /φρεάτιο) συλλέχθηκαν από ποντίκια με αγωγή διεγέρθηκαν in vitro με 50 ng /ml ΡΜΑ και 1 μg /ιονομυκίνη ml για 6 ώρες πριν από την ανάλυση του IL-2 και την παραγωγή της ΙΡΝ-γ στα υπερκείμενα με ELISA σύμφωνα με το εγχειρίδιο (R &? συστήματα D). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν μετά από κανονικοποίηση σύμφωνα με τους αριθμούς των Τ κυττάρων στο σύνολο των περιτοναϊκών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος.

Στατιστικά

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (Μ ± SEM). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test GraphPad Prism 5. Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η στατιστική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων και μονόδρομη ANOVA για να συγκριθούν τρεις ή περισσότερες ομάδες. Τα ποσοστά επιβίωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και αξιολογήθηκαν με την δοκιμασία log-rank. Οι διαφορές έγιναν δεκτές ως σημαντικές σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Synergistic αντικαρκινική δράση των αντι-CD137 /PD-1 mAbs

Αξιολογήσαμε την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα των διαφορετικών συνδυασμών αγωνιστική ή ανταγωνιστική mAbs έναντι συν-διεγερτική ή συν-ανασταλτικά μόρια σε ποντίκια C57BL μεταμοσχευμένο ip 10 ημέρες προηγουμένως με 3 × 10

κύτταρα 6 ID8. Με βάση δημοσιευμένα στοιχεία που δείχνουν ένα θεραπευτικό δυναμικό σε διάφορα μοντέλα όγκου που εξετάσαμε μονοκλωνικά αντισώματα για CD137, CD40, CTLA-4, PD-1, TIM-3 και LAG-3 [34,35], ως ενιαίο πράκτορες και σε συνδυασμούς. Τα ανεπεξέργαστα ποντίκια και ποντίκια που δέχθηκαν ένα στοιχείο ελέγχου mAb αναπτυχθεί ασκίτη περίπου 30 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου και έπρεπε να ευθανασία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, οι περισσότερες από τις δοκιμαζόμενες mAbs συνδυασμούς είχαν μικρή ή καμία επίδραση στη συνολική επιβίωση των ποντικών που φέρουν όγκο, και κανένα από τα mAbs ήταν θεραπευτικά αποτελεσματική όταν χρησιμοποιείται μόνο του. Συνεπής με πρόσφατα δημοσιευμένα αποτελέσματα μας [27], συνδυασμένη αγωγή των αντι-ΟΤΙ_Α4, PD-1 και CD137 mAbs σημαντικά παρατεταμένη επιβίωση των ποντικών με το μέσο χρόνο επιβίωσης με αύξηση σε 80 ημέρες (Σχήμα 1Α, Β? Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με ελέγχους) . Συνδυασμένη θεραπεία των αντι-ΟΤΙ_Α4, PD-1, ΤΙΜ-3 και CD40 mAbs κατέστειλαν επίσης την ανάπτυξη του όγκου, αλλά ήταν λιγότερο αποτελεσματική με μέσος χρόνος επιβίωσης 49 ημερών. Άλλα mAb συνδυασμούς, συμπεριλαμβανομένων των αντι-ΟΤΙ_Α4 /PD-1, αντι-ΟΤΙ_Α4 /PD-1 /CD40, αντι-ΟΤΙ_Α4 /PD-1 /TIM-3, αντι-ΟΤΙ_Α4 /PD-1 /LAG-3 και αντι-ΟΤΙ_Α4 /PD-1 /LAG-3 /CD40 δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου.

Ποντίκια (5 /ομάδα) μεταφυτεύθηκαν ε.π. με 3 × 10

6 κύτταρα ID8 10 ημέρες προηγουμένως εγχύθηκαν ε.π. δύο φορές στις 4 ημέρες μεσοδιάστημα με τις υποδεικνυόμενες συνδυασμούς mAb (0,5 mg εκάστου mAb /ποντικό)? επιβίωση καταγράφηκε (A, C) και μέσος χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε (Β, D). Το πείραμα επαναλήφθηκε μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Ε, ποντίκια (8-9 /ομάδα) μεταφυτεύθηκαν ε.π. με 3 × 10

6 κύτταρα ID8 3 ημέρες προηγουμένως εγχύθηκαν ε.π. δύο φορές στις 4 ημέρες μεσοδιάστημα με 0,5 mg του ελέγχου, αντι-Ρϋ-1, αντι-CD137 και αντι-PD-1 /CD137 mAb και την επιβίωσή τους καταγράφηκε. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, σε σύγκριση με ποντικούς που υπέστησαν αγωγή ελέγχου mAb.

Η

επόμενο επανέλαβε τα παραπάνω πειράματα με τη χρήση δύο διαφορετικών κλώνων του μονοκλωνικού αντισώματος έναντι CD137 (2Α και lob12.3). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C και D, αν και μόνο θεραπεία mAb δεν παρέτεινε τη συνολική επιβίωση, συνδυασμός του αντι-Ρϋ-1 mAb είτε με αντι-CD137 mAb εξίσου παρατεταμένη επιβίωση των ποντικών με το μέσο χρόνο επιβίωσης διπλασιάστηκε (ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο και ενιαία ομάδες mAb), το οποίο ενισχύεται περαιτέρω με την προσθήκη του αντι-ΟΤΙ_Α4 mAb (ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο και την ενιαία mAb ομάδες). Μια επανάληψη του πειράματος έδωσε παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αξιοσημείωτα, δεν είχαμε ανιχνεύσει οποιαδήποτε έκφραση του CD137 και PD-1 μορίων και τους αντίστοιχους συνδέτες CD137L και PD-L1 /PD-L2 στην επιφάνεια των ID8 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), με εξαίρεση το πιθανότητα ότι η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου ID8

in vivo

άμεσα διαμεσολαβείται από αντι-CD137 συν αντι-Ρϋ-1 mAbs.

Είναι ενδιαφέρον ότι, είτε αντι-CD137 ή αντι-Ρϋ-1 mAb μόνο προστατεύονται έναντι μεγάλωμα κυττάρων ID8 σε 3 μέρες εγκατεστημένος ID8 μοντέλο με τις αντίστοιχες 66,7% και 37,5% των ποντικών που επιβιώνουν 90 ημέρες, όταν το πείραμα τερματίστηκε και τα ποντίκια υποβάλλονται σε ευθανασία (Σχήμα 1 Ε). Η περιτοναϊκή κοιλότητα αυτών των ποντικών ήταν ελεύθερη όγκου. Είναι αξιοσημείωτο ότι το αντι-CD137 mAb ήταν πιο αποτελεσματικό από αντι-PD1 mAb και ότι ένας συνδυασμός των δύο ήταν μετρίως πιο αποτελεσματική (77,8% επιβιώσαντες ποντικοί) από μόνη της αντι-CD137 mAb.

Αύξηση του ποσοστού των δραστικών Τ κυττάρων και μειωμένη ποσοστό των ανοσοκατασταλτικών κυττάρων που προκαλείται από αντι-CD137 PD-1 mAbs /

Για να διερευνήσουν κατά πόσον συνδυασμό αντι-PD-1 /CD137 mAbs προκάλεσε μια συστηματική ανοσοποιητικό απάντηση, με ένεση ποντικούς μεταμοσχεύονται 10 ημέρες νωρίτερα με κύτταρα ID8 (όπως στα πειράματα θεραπεία) είτε με ένα συνδυασμό του αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAbs ή είτε μόνα mAb. Επτά ημέρες αργότερα, αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής του ποσοστού, απόλυτος αριθμός και λειτουργία τελεστή των υποσυνόλων λεμφοκυττάρων σε σπλήνες από τους ποντικούς που υπέστησαν αγωγή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, σπλήνες από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με συνδυασμένη αντι-PD1 /CD137 mAbs εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη συχνότητα και απόλυτος αριθμός των CD3

+ (ρ & lt? 0,01) και CD8

+ T (ρ & lt? 0.001) κύτταρα και μειωμένα επίπεδα των CD4

+ FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg) (p & lt? 0.001) και GR-1

+ CD11b

+ μυελοειδή που προέρχονται κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) (p & lt? 0,05 )? Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις που φαίνεται στο (Σχήμα 2Β). Σε συνδυασμό αντι-PD1 /CD137 mAbs αυξημένα τα επίπεδα των CD44

+ CD62L

– τελεστή /μνήμης (σελ & lt? 0.01), CD44

+ CD62L

+ κεντρική μνήμη (p & lt? 0.05), IFN -γ που παράγουν τελεστικά CD8

+ Τ κύτταρα (ρ & lt? 0,01) και μειώθηκε CD8

+ Τ κύτταρα που παράγουν IL-10 (ρ & lt? 0.001) στις σπλήνες (Σχήμα 3Α)? Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις που φαίνεται στο Σχήμα 3Β. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAbs θεραπεία δημιουργείται μια συστημική ανοσοαπόκριση κυριαρχείται από σημαντικά αυξημένη CD8

+ ενεργά Τ κύτταρα και μειωμένη ανοσοκατασταλτική κύτταρα.

Ποντίκια (3 /ομάδα) μεταφυτεύθηκαν ε.π. με 3 × 10

6 κύτταρα ID8 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν ε.π. με 0,5 mg του ελέγχου, αντι-CD137, αντι-PD-1 ή αντι-PD-1 /CD137 mAb και η έγχυση mAb επαναλήφθηκε 4 ημέρες αργότερα. Επτά ημέρες μετά τη δεύτερη ένεση, οι σπλήνες συλλέχθηκαν και απλά εναιωρήματα κυττάρου παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με επισημασμένα φθορισμό αντισώματα έναντι δεικτών των υποσυνόλων λεμφοκυττάρων πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Τα ποσοστά και οι αριθμοί των CD3

+, CD4

+, CD8

+, CD19

+, FoxP3

+ /CD4 και GR-1

+ CD11b

+ κύτταρα σε οι σπλήνες φαίνονται στο (Α) και είναι αντιπροσωπευτικά dotplots φαίνεται στο (Β). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως m ± SEM από 3 ποντίκια /ομάδα και είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? Οι 0.001, τα ευρήματα με αντι PD-1 ή CD137 μόνο μονοκλωνικά αντισώματα σε σύγκριση με mAb ελέγχου, και τα ευρήματα με αντι PD-1 /CD137 mAbs σε σύγκριση τόσο με τον έλεγχο και την ενιαία mAb.

Η

Ποντίκια (3 /ομάδα) που είχε μεταμοσχευθεί ε.π. με 3 × 10

6 κύτταρα ID8 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν ε.π. δύο φορές στις 4 ημέρες μεσοδιάστημα με 0,5 mg του ελέγχου, αντι-CD137, αντι-PD-1 ή αντι-PD-1 /CD137 mAb. Σπλήνες από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή αναλύθηκαν για φαινοτύπους και λειτουργίες τελεστή του CD8

+ Τ λεμφοκύτταρα με κυτταρομετρία ροής 7 ημέρες μετά τη δεύτερη ένεση mAb. Τα ποσοστά και οι αριθμοί των CD44

+ CD62L

– τελεστή /μνήμης και CD44

+ CD62L

+ κεντρική μνήμη και ΙΡΝ-γ- και IL-10 που παράγουν κύτταρα του CD8

+ πληθυσμός κυττάρων Τ φαίνονται στο (Α) και είναι αντιπροσωπευτικά dotplots φαίνεται στο (Β). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως m ± SEM από 3 ποντικούς σε κάθε ομάδα και είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, PD-1 ή CD137 mAb σε σύγκριση με mAb ελέγχου, PD-1 /CD137 mAb σε σύγκριση με τον έλεγχο και την ενιαία mAb.

Η

αντιγονο-ειδική απόκριση CTL που επάγεται από αντι-CD137 /PD-1 mAbs

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι συνδυασμένες /PD-1 /CD137 mAbs αντι-ΟΤΙ_Α4 επάγουν μια ισχυρή αντιγονο -ειδικές τύπου Th1 ανοσολογικής απόκρισης σε σπλήνες από ID8 φέρουν ποντικούς [27], του οποίου σπληνοκύτταρα παρήγαγε υψηλά επίπεδα της ΙΡΝ-γ μετά από διέγερση με πεπτίδιο προερχόμενο από ID8 κύτταρο που εκφράζει mesothelin, καλώς χαρακτηρισμένης αντιγόνο όγκου των ωοθηκών [9]. Παρομοίως, ανιχνεύσαμε παραγωγή ΙΡΝ-γ από σπληνοκύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAbs σε απόκριση σε διέγερση από mesothelin αλλά όχι ένα HPV-Ε7 πεπτίδιο προερχόμενο που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έχουμε ακόμη προσδιοριστεί αν οι σπλήνας είχε κυτταρολυτική δραστηριότητα. Σπληνοκύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με αντι-PD-1 /CD137 mAbs επαναδιεγέρθηκαν με κύτταρα ID8 UV-ακτινοβολημένα για 4 ημέρες πριν από διεξήχθησαν ΟΤΙ δοκιμασίες χρησιμοποιώντας κύτταρα EL4 δόνηση με HPV-Ε7 ή πεπτίδιο mesothelin προερχόμενα ως κύτταρα-στόχους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, σπληνοκύτταρα από αντι-Ρϋ-1 /CD137 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή εμφανίζεται κυτταροτοξική δραστικότητα επί των κυττάρων EL4 πάλλονται με mesothelin αλλά όχι με το πεπτίδιο HPV-Ε7. Η προ-επώαση με αντίσωμα CD8 κατέστειλε την δραστηριότητα θανάτωσης (Σχήμα 4Β). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι σε συνδυασμό αντι-PD-1 /CD137 mAbs προκάλεσε ένα αντιγόνο όγκου ειδικά CTL απόκριση που προκαλείται από τα κύτταρα CD8.

Ποντίκια (3 /ομάδα) μεταφυτεύθηκαν ε.π. με 3 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν ε.π. δύο φορές στις 4 ημέρες μεσοδιάστημα με 0,5 mg του αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAb. Επτά ημέρες μετά τη δεύτερη ένεση mAb, ομαδοποιήθηκαν σπληνοκύτταρα (5 × 10

6) από 3 ποντικούς επωάστηκαν με 5 × 10

5 UV-ακτινοβολημένα κύτταρα ID8 για 4 ημέρες. Τα προκύπτοντα σπληνοκύτταρα συνέχεια αξιολογήθηκαν για δραστικότητα CTL ειδικών για το αντιγόνο από CytoTox 96 μη ραδιενεργό ποσοτικό προσδιορισμό κυτταροτοξικότητας χρησιμοποιώντας κύτταρα EL4 δόνηση με H-2Db-περιορισμένο mesothelin ή πεπτίδιο HPV-E7 ως κύτταρα στόχοι (Α). Η δραστικότητα θανάτωσης αξιολογήθηκε επίσης με την παρουσία του αντι-CD4, αντι-CD8 ή αντίσωμα μάρτυρα (Β). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως m ± SEM από φρεάτια εις τριπλούν.

Η

Τοπική τύπου Th1 ανοσολογική απόκριση που προωθείται από αντι-CD137 /PD-1 mAbs

Για να αναλυθεί η αλλαγή στα τοπικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα ποντίκια που φέρουν 10 ημερών ιδρύθηκε όγκου ID8 υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με απλή ή συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAbs και περιτοναϊκή πλύσεις τους συλλέχθηκαν 7 ημέρες μετά την τελευταία ένεση mAb. Επιβεβαιώνοντας προηγούμενα ευρήματα μας [27], θεραπεία αντι-PD-1 /CD137 mAbs επάγεται σημαντικά αυξημένη διείσδυση του CD3

+ (ρ & lt? 0,01) και CD8

+ (ρ & lt? 0,01) κύτταρα καθώς και μειωμένη διήθηση του CD19

+ (ρ & lt? 0.001) κύτταρα σε σύγκριση με είτε έλεγχο ή απλής θεραπείας mAb (Σχήμα 5Α). Περαιτέρω ανάλυση της έκφρασης CD44 και CD62L έδειξε ότι οι περισσότεροι από CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα από αντι-PD-1 /CD137 mAbs ποντίκια που έλαβαν θεραπεία ήταν CD44

+ CD62L

– τελεστή /μνήμης Τ κύτταρα και τα ποσοστά τους ήταν πολύ υψηλότερα (ρ & lt? 0,01) από ότι από τον έλεγχο ή μονά mAb αγωγή ποντίκια (Σχήμα 5Β)? Τα αντιπροσωπευτικά dotplots φαίνεται στο Σχήμα S1. Επιβεβαιώσαμε επίσης μειωμένα επίπεδα των Tregs και MDSCs όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται? Ref 27).

Ποντίκια (3 /ομάδα) μεταφυτεύθηκαν ε.π. με 3 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν ε.π. δύο φορές στις 4 ημέρες μεσοδιάστημα με 0,5 mg του ελέγχου, αντι-CD137, αντι-PD-1 ή αντι-PD-1 /CD137 mAb. Δύο εβδομάδες αργότερα, περιτοναϊκή πλύση από ποντίκια με αγωγή αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής για το ποσοστό και φαινότυπο περιτοναϊκών λεμφοκυττάρων. Τα ποσοστά των CD3

+, CD4

+, CD8

+ και CD19

+ λεμφοκυττάρων σε περιτοναϊκή πλύση και CD44

+ CD62L

– τελεστές /κύτταρα μνήμης σε CD4

τα + και CD8

+ Τ κύτταρα φαίνεται στο (Α) και (Β) αντίστοιχα. Το ποσοστό των PD-1

-TIM-3

+ + κυττάρων TIM-3

+ και PD-1 σε περιτοναϊκή CD4

+ και CD8 είναι

+ Τ κύτταρα εμφανίζονται στο (C) με αντιπροσωπευτικά dotplots στο σχήμα S2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Μ ± SEM από 3 ποντικούς από κάθε ομάδα και είναι αντιπροσωπευτικά 2 ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, PD-1 ή CD137 mAb σε σύγκριση με mAb ελέγχου, PD-1 /CD137 mAb σε σύγκριση με τον έλεγχο και την ενιαία mAb.

Η

Ενιαία CD137 mAb θεραπεία ποντίκια παρουσίασαν επίσης αυξημένη διείσδυση των CD3

+ (p & lt? 0.05), CD8

+ (p & lt? 0,05) και CD44

+ CD62L

– τελεστή /μνήμη CD8

+ T (ρ & lt? 0,05) κύτταρα στην περιτοναϊκή κοιλότητα αν και ήταν αναποτελεσματική στην επιμήκυνση συνολική επιβίωση (Σχήμα 1 D). Για να διερευνήσουν τους μηχανισμούς που διέπουν την αποτυχία της προστασίας του όγκου που προκαλείται μόνο από τον αντι-CD137 mAb, εξετάσαμε την έκφραση του PD-1 και του ανοσοποιητικού ρυθμιστή Τ βλεννίνης κυττάρου ανοσοσφαιρίνης (ΤΙΜ-3) συν-ανασταλτικά μόρια επί Τ κυττάρων, τα οποία έχουν αναφερθεί να συνδέεται στενά με λειτουργική εξάντληση των Τ κυττάρων [36,37]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, αντι-CD137 mAb up-ρυθμίζεται η έκφραση του PD-1 και ΤΙΜ-3 σε περιτοναϊκή CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα και μονά αντι-Ρϋ-1 mAb είχε μικρή επιδράσεις στην ΤΙΜ-3 έκφραση μολονότι εξασθένησε την έκφραση του PD-1 σε CD8

+ Τ κυττάρων σε σύγκριση με το mAb ελέγχου. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ταυτόχρονη αποκλεισμός PD-1 εμπόδισε σημαντικά την προς τα πάνω ρύθμιση του PD-1 και ΤΙΜ-3 επί Τ κυττάρων που προκαλείται από ενεργοποίηση CD137? Τα αντιπροσωπευτικά dotplots φαίνεται στο (σχήμα S2). Σε συμφωνία με την προς τα πάνω ρύθμιση του PD-1 και ΤΙΜ-3, περιτοναϊκή Τ κύτταρα που απομονώνονται από αντι-CD137 mAb αγωγή ποντίκια παρήγαγαν χαμηλότερα επίπεδα IL-2 και ΙΡΝ-γ (Σχήμα S3).

Μακράς διάρκειας αντικαρκινική δράση που προκαλείται από τη συνδυασμένη αντι CD137-/PD-1 mAbs και σισπλατίνη

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα αντι-CD137 mAb συνεργεί με σισπλατίνη, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για ωοθηκών καρκίνος, για να προκληθεί υποστροφή του μυϊκού CT-26 καρκίνο του παχέος εντέρου στο 60% των ποντικών [38]. Για να διερευνηθεί η αποτελεσματικότητα του αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAbs συν σισπλατίνη στο πρότυπο καρκίνου των ωοθηκών ID8, πρώτα ποντίκια με αγωγή που φέρουν όγκο με ε.π. ένεση μιας δόσης σισπλατίνης ακολουθούμενα από 2 δόσεις του αντι-Ρϋ-1 /CD137 mAbs σε διάστημα 4 ημερών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, σε συνδυασμό αντι-Ρϋ-1 /CD137 /αγωγή σισπλατίνη παρήγαγε μια σημαντική αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με μονά mAb, και τα δύο mAbs ή cisplatin μόνο του, με αποτέλεσμα τη μακροπρόθεσμη επιβίωση του 80% (8 ποντίκια από τα 10 ) ποντικούς? δεν υπήρχε όφελος επιβίωσης από μόνα τους ή σε συνδυασμό με είτε αντι-PD-1 ή αντι-CD137 mAbs σισπλατίνη. Έχουμε λάβει παρόμοια αποτελέσματα από μία επαναλαμβανόμενη πείραμα. Η απομάκρυνση των CD8

+ Τ κύτταρα κατήργησε εντελώς την αντικαρκινική δράση (Σχήμα 6Β), επιδεικνύοντας έναν κεντρικό ρόλο αυτών των κυττάρων σε προστασία του όγκου. Οι μακροπρόθεσμες επιζώντες αναπτύξει μια συστημική ανοσοαπόκριση με μνήμη και ογκο-εξειδίκευση, όπως αποδεικνύεται από την αντοχή τους σε πρόκληση με κύτταρα ID8 αλλά όχι από την πρόκληση με αντιγονικά άσχετος κύτταρα TC1 (Σχήμα 6C). Ελέγχου, αφελή ποντίκια υπέκυψαν να αμφισβητήσει είτε με ID8 ή TC1 κύτταρα τα οποία είχαν παρόμοια ποσοστά αύξησης (Σχήμα 6D).

Ποντίκια (10 /ομάδα) μεταφυτεύθηκαν ε.π. με 3 x 10

6 κύτταρα ID8 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν ε.π. με δύο δόσεις του ελέγχου, αντι-Ρϋ-1, αντι-CD137 ή αντι-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg ανά δόση ανά ποντικό) στις 4 ημέρες διάστημα, με ή χωρίς συγχορήγηση σισπλατίνης (10 mg /kg) κατά την πρώτη θεραπεία και η επιβίωση τους αξιολογήθηκε (Α). (10 /ομάδα) ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /CD137 /σισπλατίνη είχαν εξαντληθεί υποσυνόλων λεμφοκυττάρων με ένεση αντι-CD4 (0,2 mg /ποντικό), αντι-CD8 (0,2 mg /ποντικό), αντι-ΝΚ1. 1 (0,1 mg /ποντικό) ή mAb ελέγχου (0,2 mg /ποντικό) 48 και 72 ώρες πριν την πρώτη θεραπεία και εν συνεχεία για τη διάρκεια των πειραμάτων κάθε 3-4 ημέρες. Ανεπεξέργαστα ποντίκια που φέρουν όγκο ήταν ως αρνητικοί έλεγχοι (UNT ομάδα).