Αφηρημένο

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι η θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) στον καρκίνο του προστάτη, αν και αρχικά αποτελεσματικές, επάγει αλλαγές στην kinome όγκου, η οποία στη συνέχεια προώθηση της ανάπτυξης του ευνουχισμού ανθεκτικά (CR) νόσου. Αναγνωρίζοντας το συσχετισμό μεταξύ υποξία όγκου και κακή πρόγνωση στον καρκίνο του προστάτη, υποθέσαμε περαιτέρω ότι οι αλλαγές αυτές θα μπορούσε να επηρεαστεί από την υποξία. Μικροσυστοιχίες με πεπτιδικά υποστρώματα 144 κινάσης εφαρμόστηκαν για την ανάλυση CWR22 προστάτη δείγματα ξενομόσχευμα καρκινώματος από ADT-αφελή, ανδρογόνο-στέρησε (AD), μακροχρόνια AD (ADL), και τα στάδια της νόσου CR. Η επίδραση της υποξίας εκτιμήθηκε που ταιριάζουν με το προφίλ δραστηριότητας ξενομόσχευμα κινάσης με αυτά που αποκτώνται από υποξική και ορθοξικές καλλιέργειες κυττάρων καρκίνου του προστάτη, ενώ η κλινική σημασία αξιολογήθηκε από την ανάλυση δειγμάτων προστατεκτομή όγκου από ασθενείς με τοπικά προχωρημένη νόσο, είτε σε ADT-αφελείς ή στις αρχές στάδια της νόσου CR. Με τη χρήση αυτής της νέας μεθόδου μικροσυστοιχιών υπόστρωμα πεπτιδίου που αποκάλυψε υψηλή δραστικότητα κινάσης που προκαλείται από μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 5Α (STAT5A) στο CR καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, αποκαλύψαμε δραστηριότητα κινάσης υψηλής STAT5A ήδη υποχωρεί ADL ξενομοσχεύματα, πριν από την ανανέωση της ανάπτυξης CR αποδείχθηκε. Τέλος, καθώς η δραστηριότητα κινάσης αυξήθηκε STAT5A επίσης ανιχνεύθηκε μετά από έκθεση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη σε υποξία, προτείνουμε τη μακροπρόθεσμη ADT να προκαλέσει υποξία του όγκου και την τόνωση της δραστηριότητας της κινάσης STAT5A, στη συνέχεια οδηγεί στην εκ νέου ανάπτυξη του όγκου CR. Ως εκ τούτου, η μελέτη ανιχνεύεται STAT5A ως υποψήφιος πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω για το δυναμικό του ως δείκτης του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη και ως πιθανή θεραπευτική πρωτεΐνη-στόχο

Παράθεση:. Roe K, Bratland Α, Vlatkovic L, Ragnum HB, Saelen MG, Olsen DR, et al. (2013) Υποξική όγκου κινάσης σηματοδότηση μέσω του STAT5A στην ανάπτυξη του ευνουχισμού-ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (5): e63723. doi: 10.1371 /journal.pone.0063723

Επιμέλεια: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Πανεπιστήμιο, Γαλλία

Ελήφθη: 27 Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 11, Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Μαΐου 2013

Copyright: © 2013 Roe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Νότιο-Ανατολική Νορβηγία Περιφερειακή Αρχή Υγείας χορηγεί 2009070 και 2012002 (KR), επιχορηγήσεις από το Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Akershus, και τη χορήγηση του 7ου προγράμματος πλαισίου της Ευρωπαϊκής Ένωσης 222741- Μετόχια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η αρχική ανάπτυξη ενός κακοήθους όγκου του προστάτη διεγείρεται από ανδρογόνα [1], και τυπική θεραπεία πρώτης γραμμής ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη περιλαμβάνει θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) [2]. Παρά το γεγονός ότι αρχικά αποτελεσματικές, οι όγκοι αναπόφευκτα επαναληφθεί σε ευνουχισμό ανθεκτικό (CR) κατάσταση. Μεταστατικό, CR καρκίνο του προστάτη εξακολουθεί να παραμένει η πιο διστακτικούς πτυχή στη διαχείριση του καρκίνου του προστάτη, αψηφώντας παρατεταμένη αποτελέσματα της θεραπείας. Ως εκ τούτου, η βελτίωση της κατανόησης από τις κινητήριες δυνάμεις πίσω από CR καρκίνος του προστάτη είναι αναγκαία για να καταστεί δυνατή η ανάπτυξη στρατηγικών πιο αποτελεσματική θεραπεία για αυτή την ομάδα ασθενών.

Η υποξία είναι ένας κοινός παράγοντας μικροπεριβάλλον των συμπαγών όγκων, την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, καθώς και αγγειογένεση, μετάσταση, και η θεραπεία αντίσταση [3], [4]. Στον καρκίνο του προστάτη, υποξία όγκος έχει πράγματι συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση [5] – [7], αν και σκεπτικισμός παραμένει ως προς το ρόλο της και συνήθη κλινική σημασία.

In vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι η υποξία αυξάνει την δραστικότητα και την ευαισθησία του υποδοχέα ανδρογόνων [8], η οποία σε πολλούς όγκους CR μπορεί να οδηγήσει σε επιλογή προσαρμοσμένο φαινοτύπων [9].

έχει για πολλά χρόνια γνωστό ότι η εξέλιξη της νόσου και την ανάπτυξη ανθεκτικότητας θεραπείας στον καρκίνο γενικά χαρακτηρίζονται από αλλοιωμένη έκφραση και τη δραστηριότητα των βασικών διαμεσολαβητών στην κυτταρική μεταγωγή σήματος, ρυθμίζοντας διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, εισβολή, και την αγγειογένεση [10]. Η σημασία και η πιθανή χρήση αυτών των αλλαγών για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο, ειδικά ως παρεκκλίνουσα πρωτεϊνικών κινασών που παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της κακοήθειας του όγκου [11] – [13]. Από το ανθρώπινο kinome (όλα κινάσες), περίπου το ήμισυ του συμπληρώματος κινάσης τυροσίνης εμπλέκεται στον καρκίνο [14]. Ταυτοποίηση παρεκκλίνουσα κινασών τυροσίνης έχει ως εκ τούτου προέκυψε ως μια ελκυστική προσέγγιση στην αναζήτηση για βελτιωμένη ανίχνευση της επιθετικότητας της νόσου και νέων θεραπευτικών στόχων.

Υποθέσαμε ότι ADT στον καρκίνο του προστάτη, αν και αρχικά αποτελεσματική, προκαλεί αλλαγές στη δραστηριότητα του η kinome όγκου που στη συνέχεια να οδηγήσουν σε ανανεωμένη, την ανάπτυξη του όγκου CR. Να εξετάσει την υπόθεση αυτή, μικροσυστοιχίες με πεπτίδιο κινάσης υποστρώματα, που εκπροσωπούν κυρίως τυροσίνης, εφαρμόστηκαν για την ανάλυση δειγμάτων από ένα

in vivo

προκλινικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη που αντανακλούν διαφορετικά στάδια στην εξέλιξη της νόσου CR. Η επίδραση της υποξίας εκτιμήθηκε με το ταίριασμα προφίλ δραστηριότητα κινάσης αυτού του μοντέλου με αυτά που δημιουργούνται από υποξική και ορθοξικές καλλιέργειες κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Κλινική σημασία αξιολογήθηκε από την ανάλυση δειγμάτων προστατεκτομή όγκου από ασθενείς με τοπικά προχωρημένη νόσο, είτε σε ADT-αφελείς ή πρώιμα στάδια της νόσου CR.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εγκεκριμένα από τη Φροντίδα και Χρήση επιτροπή ζώων στο Τμήμα Συγκριτικής Ιατρικής, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Όσλο (Αριθμός άδειας: 32 έως 1984), σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για την καλή μεταχείριση των ζώων της Εθνικής Επιτροπής νορβηγική για τα πειράματα σε ζώα . Το πρωτόκολλο της κλινικής μελέτης εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή για την ιατρική και την υγεία Δεοντολογίας (REC Νότια Ανατολή, Αριθμός Άδειας: S-08607b) και ήταν σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι. Γραπτή συγκατάθεση ήταν απαραίτητη για τη συμμετοχή.

Τα προκλινικά Όγκου Μοντέλο

θραύσματα ιστού (~ 2 × 2 × 2 mm

3) του ανθρώπινου, ξενομόσχευμα καρκινώματος ανδρογόνα-ευαίσθητο CWR22 προστάτη [ ,,,0],15] ήταν υποδορίως (sc) εμφυτεύεται στην μία πλευρά των ανδρών, BALB /c γυμνά ποντίκια (30-35 g, ηλικίας 6-8 εβδομάδων), σε συνδυασμό με 12.5 mg σφαιρίδιο υπέστη τεστοστερόνης απελευθέρωσης (Innovative Research of America, Sarasota, FL ).

Η πορεία της ανάπτυξης της νόσου CR εξής ADT απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α, χρησιμοποιώντας το προκλινικό μοντέλο για να αποσπάσει διάφορα στάδια της νόσου. Κατ ‘αρχάς, ξενομοσχεύματα που εκπροσωπούν ADT-αφελή νόσο είχαν προσληφθεί κατά την μικρότερη διάμετρο τους έφθασε τα 8 mm. Δεύτερον, ADT εκτελέστηκε όταν η συντομότερη διάμετρος ξενομόσχευμα φτάσει τα 12 mm, με χειρουργικό ευνουχισμό και ταυτόχρονη διακοπή έκθεσης στον σφαιρίδιο τεστοστερόνης. Ανδρογόνο στέρησε (AD) ξενομοσχεύματα είχαν προσληφθεί όταν η διάμετρος τους μειώθηκε σε 8 mm (περίπου 1 μήνα μετά τον ευνουχισμό). Τρίτον, η μακροχρόνια AD (ADL) ξενομοσχεύματα είχαν προσληφθεί όταν η διάμετρος τους μειώθηκε έως 4 mm (περίπου 4 μήνες μετά τον ευνουχισμό). Τελευταία, CR ξενομοσχεύματα με την ανανέωση της ανάπτυξης συμπεριλήφθηκαν όταν η διάμετρος τους έφθασε τα 8 mm, που είναι 5.4 ± 0.4 μήνες μετά τον ευνουχισμό. Ξενομοσχεύματος διάμετροι μετρήθηκαν με παχύμετρο δύο φορές την εβδομάδα από την εμφύτευση μέχρι ευνουχισμού και μια φορά την εβδομάδα μετά τον ευνουχισμό μέχρι το τέλος του πειράματος

(Α) Ξενομοσχεύματος διαμέτρους έναντι του χρόνου κατά τη μετάβαση από τη θεραπεία στέρηση ανδρογόνου (ADT). – αφελής, μέσω ανδρογόνων-στέρησε (AD) και η μακροχρόνια AD (ADL), σε ευνουχισμό ανθεκτικά (CR) νόσο, μετά από ADT από τον ευνουχισμό. Ο χρόνος για την ανάπτυξη της νόσου σε ασθενείς CR είναι ~ 2 έως 5 έτη. Στο μοντέλο μας ξενομοσχεύματος καρκινώματος του προστάτη, ο αντίστοιχος χρόνος ήταν 5,4 ± 0,4 μήνες. Οι τέσσερις κύκλοι αντιπροσωπεύουν τις τέσσερις πειραματικές ομάδες στη μελέτη αυτή. Τα δείγματα αίματος για αντιγόνο (PSA) μετρήσεις ειδικού προστατικού αποσύρθηκαν από όλα τα ποντίκια πριν αποκόπηκαν όγκους και καταψύχθηκαν ταχέως για τη σκιαγράφηση δραστικότητα κινάσης. (Β) Τα επίπεδα ορού PSA αντανακλούσε την κλινική πρότυπο της εξέλιξης της νόσου. PSA μειώθηκε σε AD και ADL όγκων, προτού αποκατασταθεί σε όγκους CR. Σημαντικές διαφορές (p & lt? 0,05) σε σύγκριση με το ADT-αφελή όγκους υποδεικνύονται (*). Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση και s.e.m 3-6 όγκων.

Η

Ο ευνουχισμός πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία, χρησιμοποιώντας υποδορίως ενέσεις zoletil μίγματος (2,4 mg /ml τιλεταμίνη, 2,4 mg /ml ζολαζεπάμη (Zoletil κτηνίατρο, Virbac Laboratories, Carros, Γαλλία), 3,8 mg /ml ξυλαζίνης (Narcoxyl κτηνίατρο, Roche, Βασιλεία, Ελβετία), και 0,1 mg /ml βουτορφανόλης (Torbugesic, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, ΙΑ)), αραιωμένο 1:05 σε αποστειρωμένο νερό, σε μία δόση των 7,5 μl /g. Η αναλγησία δόθηκε σε ευνουχισμένα ζώα ως s.c. ενέσεις της βουπρενορφίνης (Temgesic, Schering-Plough, Brussels, Belgium), σε δόση 0,1 mg /kg.

Τα δείγματα αίματος για ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) ανάλυση αποσύρθηκαν από μηριαίες φλέβες όλων των ζώων »δεξιά πριν από την ευθανασία. Τα δείγματα αφέθηκαν να πήξει πριν φυγοκέντρηση και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρις ότου όλα τα δείγματα αναλύθηκαν ταυτόχρονα. Δωρεάν και τα συνολικά επίπεδα του PSA στον ορό προσδιορίστηκαν από την fluoroimmunonometric AutoDELFIA ProStatus ™ PSA Free /Σύνολο σετ (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Ογ, Turku, Φιλανδία). Ευθανασία των ζώων έγινε με αυχενική εξάρθρωση και αμέσως ακολουθείται από εκτομή του ιστού του όγκου, η οποία απ ​​’ευθείας ήταν καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C.

Ασθενείς

Για την σκοπός της επικύρωση προκλινικών δεδομένων, τέσσερις ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που είχαν υποβληθεί σε ριζική προστατεκτομή με σαφή περιθώρια εκτομή συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη (Πίνακας 1). Οι ασθενείς είχαν προσληφθεί στο Νορβηγικό ράδιο Νοσοκομείο, Όσλο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Ιστοπαθολογικές όγκου και κομβικά κατάστασης (ρΤΝ), όγκου Gleason σκορ, και προεγχειρητική τα επίπεδα του PSA στον ορό καταγράφηκαν ως μέρος των τυπικών κλινικών διαδικασιών. Ασθενής 4 είχε λάβει παρατεταμένη (~ 2 έτη) τριμηνιαία υποδορίως goserelin σε δόση των 10,8 mg μέχρι το επίπεδο του PSA του άρχισε να αυξάνεται μετά την ADT ναδίρ, και ήταν αναφέρονται οριστική χειρουργική επέμβαση.

Η

Παρασκευή ιστών

Ξενομοσχεύματα και χειρουργικές βιοψίες από το δείγματα προστατεκτομή, φρέσκο ​​κατεψυγμένο αμέσως μετά από την εκτομή, αξιολογήθηκαν πρώτα για το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου, αφού χωρισμένο χρησιμοποιώντας μικροτόμο κρυοστάτη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Κάθε φυσιολογικός ιστός υπάρχει σε δείγματα όγκων ήταν περίπου αφαιρέθηκε με ανατομή καθοδηγείται από τους λεκέδες. Όλα τα δείγματα όγκων που χρησιμοποιήθηκε είχε περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου μεγαλύτερη από 80%. Τα δείγματα στη συνέχεια κόβονται σε 10 μm τομές, συνεχώς διατηρείται κατεψυγμένο και αμέσως εκ νέου αποθηκεύεται στους -80 ° C. Ένας όγκος ~ 3 mm

3 κόπηκε όλων των ξενομοσχευμάτων δειγμάτων, ο απαιτούμενος αριθμός των τμημάτων να κόψει υπολογίζεται μετά από μέτρηση πλάτος και το μήκος των δειγμάτων ». Τις ίδιες διαδικασίες, ~ 5 mm

3 χωρισμένο κάθε βιοψία προστατεκτομή (κανονικό και όγκου) του δείγματος.

Ανάλυση Δεδομένων της κινάσης Προφίλ Δραστηριότητα καρκινώματος προστάτη ξενομοσχεύματα »

Οι διαδικασίες για την προετοιμασία της τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης και παραγωγή των προφίλ δραστικότητας κινάσης που περιγράφεται στην S1 κειμένου. λύματα πρωτεϊνών από τρεις βιολογικούς επαναλήψεις από κάθε μία από τις τέσσερις πειραματικές ομάδες (ADT-αφελή, AD, ADL, CR) αναλύθηκαν για την παραγωγή των προφίλ δραστηριότητας ξενομόσχευμα κινάσης.

Μετά από οπτικό έλεγχο και την αφαίρεση υποβάθρου, οι εντάσεις σήματος τελικό σημείο (η μέση ένταση του σήματος των τριών τελευταίων κινητική κύκλοι) για κάθε σημείο, δηλαδή για κάθε πεπτίδιο υπόστρωμα της κινάσης ανά συστοιχία, υπολογίστηκαν με BioNavigator (PamGene International BV). αντιμετωπίστηκαν Ένας μικρός αριθμός αρνητικών εντάσεων σήματος αφαιρώντας ποσοστημόριο 1% του συνόλου των δεδομένων και τον καθορισμό υπόλοιπο εντάσεις σήματος μικρότερη του 1 προς 1. Στη συνέχεια, όλοι οι εντάσεις σήματος ήταν log

2-μετασχηματισμένα, πριν από τη μέση ένταση του σήματος αντιγράφεται εντός κάθε πείραμα υπολογίστηκε για κάθε υπόστρωμα πεπτιδίου. Για να διορθωθεί για πιθανή πείραμα-to-πείραμα παραλλαγή, ο μέσος όρος των εντάσεων σήματος των τεσσάρων πειραματικών ομάδων για κάθε υπόστρωμα πεπτίδιο αφαιρείται από την ένταση του σήματος πεπτίδιο υπόστρωμα της κάθε ομάδας. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών υποβάλλονται στην ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)? αριθμός ένταξη E-mtab-1572

Η στατιστική ανάλυση διενεργήθηκε εν συνεχεία σε PASW Στατιστικά 18.0 (IBM, Somers, Νέα Υόρκη), με p & lt?. 0.05 θεωρούνται ως στατιστικά σημαντική. ANOVA εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό πεπτιδικά υποστρώματα με σημαντικά διαφορετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης μεταξύ των πειραματικών ομάδων (ADT-αφελή, AD, ADL, και CR). πολλά-προς-ένα (AD, ADL, και CR έναντι ADT-αφελή) post-hoc δοκιμασία του Dunnett για προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις. πρωτεϊνών και γονιδίων τα ονόματα των υποστρωμάτων πεπτιδίου », συμπεριλαμβανομένων των πληροφοριών σχετικά με τις κυτταρικές διεργασίες που εμπλέκονται στην, ανακτήθηκαν χρησιμοποιώντας UniProt (https://uniprot.org? 15 Μαΐου 2012) και HUGO Gene ονοματολογίας Επιτροπής (HGNC) (http: //www.genenames.org?. 15 Μάη 2012) [16]

κινάσης Δραστηριότητα προφίλ του προστατεκτομή δείγματα βιοψίας

Τρεις τεχνικά αντίγραφα (τόσο του όγκου και φυσιολογικά δείγματα) αναλύθηκαν από κάθε ασθενή, σε μία πλάκα τυροσίνη PamChip®96, στη θέση PamGene International BV στο ‘s-Hertogenbosch, Ολλανδία. Δείγμα τρέξιμο εκτελέσθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Από το προκύπτον σύνολο δεδομένων, που υπολογίζεται μετά από οπτικό έλεγχο και την αφαίρεση φόντο, τα δεδομένα ήταν log

2-μετασχηματίζεται μετά τη ρύθμιση σε μερικά σημεία δεδομένων με εντάσεις σήματος μικρότερη του 1 προς 1.

Υποξική έκθεσης του προστάτη Καρκίνωμα Κυττάρων

Ο 22Rv1, PC3 και DU145 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκινώματος του προστάτη λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Όλες οι κυτταρικές σειρές επικυρώνονται από μικρή διαδοχική επανάληψη (STR) προφίλ με βάση 16 πολυμορφικών δεικτών σε χρήση από ATCC και πατρότητας δοκιμές, και επιβεβαίωσε ότι είναι μυκόπλασμα-free (MycoAlert, BioNordika, Όσλο, Νορβηγία). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Oslo, Norway) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% L-Γλουταμίνη (Invitrogen, Όσλο, Νορβηγία), και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα συνήθως αναπτύσσονται ως μονοστιβάδα σε 75 cm

2 φιάλες στους 37 ° C σε 95% αέρα /5% CO

2, και υποκαλλιεργήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα για να διατηρηθεί η εκθετική αύξηση.

Για να διερευνηθεί αλλαγές στην δραστικότητα της κινάσης που επάγεται από υποξία, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα σε -60% συρροή, με φρέσκο ​​μέσο, ​​μεταφέρθηκαν σε ένα θάλαμο υποξίας για 24 ώρες (200 Invivo2? Ruskinn Technologies, Leeds, UK). Μέτρια υποξία (1% O

2) επιτεύχθηκε με 5% CO

2 και υπολειμματική Ν

2. Σοβαρή υποξία (ανοξία) ελήφθη με 5% CO

2 και ένα μίγμα από 10% Η

2 και 90% Ν

2 σε συνδυασμό με έναν καταλύτη που καταλύεται την μετατροπή του H

2 με οποιαδήποτε O

2 αριστερά προς τα H

2O. Όλα τα πειράματα νορμοξία και υποξία διεξήχθησαν τρεις φορές ώστε να δημιουργηθούν τρεις βιολογικούς επαναλήψεις όλες τις πειραματικές συνθήκες.

Δραστικότητας Κινάσης Ο χαρακτηρισμός του καρκινώματος προστάτη Cells

Παρασκευή προϊόντων λύσης πρωτεΐνη περιγράφεται Κείμενο S1. Κινάση προφίλ δραστηριότητας έγινε ταυτόσημα όπως και για τα ξενομοσχεύματα, χρησιμοποιώντας 10 μα συνολικής πρωτεΐνης από όλα τα δείγματα. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από τρία βιολογικά αντίγραφα από καθεμία από τις τρεις πειραματικές ομάδες (φυσιολογική οξυγόνωση, μέτρια υποξία, υποξία σοβαρή) αναλύθηκαν για να δημιουργήσει το προφίλ της δραστικότητας κινάσης. Στο τεστ post-hoc του Dunnett, η κατάσταση ελέγχου που αντιπροσωπεύονται από τους νορμοξικά κύτταρα. Μια αξιολόγηση της τεχνικής αναπαραγωγιμότητας των συστοιχιών (interchip και συσχετίσεις intrachip μετά από ανάλυση του ίδιου προϊόντος λύσης της κυτταρικής καλλιέργειας σε όλες τις συστοιχίες) παρουσιάζεται στο κείμενο S2.

Χλωριούχο κοβάλτιο Θεραπεία

Για την προσομοίωση υποξική έκθεση και η έκφραση του υποξία παράγοντα-1α κύτταρα (HIF-1α) εκτέθηκαν σε 100 μΜ της υποξίας μιμητικής χλωριούχο κοβάλτιο παράγοντα (COCI

2) (Sigma Aldrich) για 4 ώρες πριν έγιναν λύματα πρωτεΐνη. Η θεραπεία με CoCl

2 επάγει την έκφραση του HIF-1α με σύνδεση προς τον τομέα PAS, το οποίο αποκλείει δέσμευσης HIF-1α pVHL, δίνοντας έτσι τη σταθεροποίηση HIF-1α [18].

Ανάλυση Western Blot

πρωτεϊνών και φωσφοπρωτεΐνη εκφράσεις μετρήθηκαν με τη δυτική ανοσοστυπώματα. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν αντι-HIF-1α (BD Biosciences, Trondheim, Νορβηγία), αντι-STAT5A (Sigma-Aldrich), και αντι-φωσφο STAT5A /B (Y694 /Y699) (Millipore, Temecula, CA). Mouse μονοκλωνικό αντι-γ-τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δευτερογενή αντισώματα ήταν συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού και γαϊδάρου αντι-ποντικού (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΜΑ). Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας SuperSignal West Dura Extended Διάρκεια υποστρώματος (Thermo Scientific, Rockford, IL) ή LumiGLO Χημειοφωταυγές υπόστρωμα (KPL, Gaithersburg, MD).

Αποτελέσματα

Επικύρωση της προκλινικό μοντέλο

Τα ξενομοσχεύματα CWR22 καρκίνου του προστάτη παρουσίασαν τα πρότυπα απόκρισης του όγκου μετά από ευνουχισμό παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται σε ασθενείς, και ανέπτυξε ξενομοσχεύματα CR μετά από 5.4 ± 0.4 μήνες (Εικόνα 1Α). Όταν αντιπροσωπεύοντας το περίπου πέντε φορές γρηγορότερο μεταβολισμό σε ποντίκια, αυτό αντιστοιχεί σε περίπου 2-3 ​​χρόνια σε ανθρώπους. Η κλινικά σχετική εξέλιξη της νόσου του ξενομοσχεύματος επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ποσοτικοποιήσεις PSA ορού από δείγματα αίματος των ζώων (Σχήμα 1Β). Η μείωση του PSA από ADT-αφελή ξενομοσχευμάτων σε AD και ADL ξενομοσχεύματα ήταν σημαντική (p = 0,032 και p = 0,042, αντίστοιχα). Σε CR ξενομοσχεύματα, προ-ADT επίπεδα PSA αποκαταστάθηκαν.

Kinase Activity σε ξενομοσχεύματα Μετά ADT

Από την ανάλυση των προφίλ δραστικότητας κινάσης που παράγεται από τα ξενομοσχεύματα, φωσφορυλίωση 35 των πεπτιδικών υποστρωμάτων κινάσης βρέθηκε να επηρεάζεται σημαντικά (μειώνεται ή αυξάνεται) μετά ADT από τον ευνουχισμό (Πίνακας 2). Αυτά τα υποστρώματα που αντιπροσωπεύεται πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, όπως η αγγειογένεση (π.χ. PDGFR, VEGFR, EPOR), την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, και την εξέλιξη (π.χ. ΜΑΡΚ, RAF, STAT), και προσκόλληση, η μετανάστευση, και διείσδυση (π.χ. FER, FES, ΚΟΑ).

η

σε σύγκριση με το ADT-αφελή ξενομοσχευμάτων, ορισμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης του υποστρώματος που παράγεται από Αϋ ήταν ασθενώς μειώθηκε, ενώ άλλοι αυξήθηκαν. Στο Σχήμα 2Α, η μέση λογαριθμική

2 αναλογία και s.e.m. για όλα τα 35 σημαντικά υποστρώματα παρουσιάζονται για τις τρεις ομάδες θεραπείας έναντι ADT-αφελείς ξενομοσχευμάτων, με μπλε χρώμα υποδεικνύοντας αρνητική log

αναλογία 2 και το κόκκινο χρώμα δείχνει θετική ημερολόγιο

2 αναλογία, αντίστοιχα. Σε οικόπεδα ηφαίστειο Εικόνα 2Β (-log

10 π-συνάρτηση του log

2 αναλογίες) είναι οπτικοποίηση των υποστρωμάτων πεπτιδίου κινάσης με την πιο σημαντική ή /και υψηλότερη log

2 αναλογίες μεταξύ θεραπεία και ADT-αφελής όγκους «επίπεδα φωσφορυλίωσης

(Α) μειώθηκε. (μπλε? αρνητική log

2 αναλογία) και αυξημένη (κόκκινο? θετικά ημερολόγιο

2 αναλογία) επίπεδα φωσφορυλίωσης του πεπτιδίου κινάσης υποστρώματα από ανδρογόνο στέρησε (μ.Χ. ), μακροχρόνια AD (ADL), και ο ευνουχισμός ανθεκτικά (CR) ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με το ADT-αφελή όγκοι (μέση αναλογία και sem ανά υποστρώματος). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από τρία βιολογικά αντίγραφα από καθεμία από τις τέσσερις πειραματικές ομάδες (ADT-αφελή, AD, ADL, CR) αναλύθηκαν για να δημιουργήσει το προφίλ της δραστικότητας ξενομοσχεύματος κινάσης. Απαριθμούνται τα αντίστοιχα ονόματα γονίδιο Τα υποστρώματα », με έναρξης και λήξης θέσεων για την πεπτιδική αλληλουχία μέσα στην πρωτεΐνη σε παρένθεση. (Β) οικόπεδα Volcano (-log

10 p-τιμές σε σχέση με αναλογίες) οπτικοποίηση πεπτίδιο κινάσης υποστρώματα με σημαντικότερη ή /και υψηλότερη log

2 αναλογίες μεταξύ των επιπέδων φωσφορυλίωσης αντιμετωπίζονται και ADT-αφελή όγκων ». Χρώμα επισήμανσης: κίτρινο: p & lt? 0,01 και ο δείκτης & gt? 1.0? πράσινο: p & lt? 0,01 και αναλογία = 0,5-1,0? σκούρο ροζ: p = 0,01-0,05 και ο δείκτης & gt? 1.0? πορτοκαλί: p = 0,01-0,05 και αναλογία = 0,5-1,0? μπλε: p = 0,01-0,05 και ο δείκτης & lt? 0.5? ανοιχτό ροζ:. p & gt? 0,05

Η

Σύμφωνα με τη σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μετά από μακροχρόνια ADT το επίπεδο φωσφορυλίωσης υποστρώματος από ADL ξενομοσχεύματα μειώθηκε έντονα για 32 από τα πεπτιδικά υποστρώματα 35 κινάσης, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα επίπεδα φωσφορυλίωσης που προέρχονται από εκθετικά αυξανόμενη ADT-αφελής ξενομοσχευμάτων. Δύο από τα τρία εναπομείναντα πεπτιδικά υποστρώματα κινάσης, που αντιπροσωπεύει το μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 1 και 5Α (STAT1 και STAT5A), έδειξαν σημαντικά αυξημένη φωσφορυλίωση από ADL ξενομοσχευμάτων, με ένα ημερολόγιο

αναλογία 2 έναντι ADT-αφελείς ξενομοσχευμάτων 1,5 ± 0.3 για STAT1 (p = 0,004) και 1,5 ± 0,7 για STAT5A (p = 0.019). Φωσφορυλίωση από CR ξενομοσχεύματα ήταν για την πλειοψηφία των υποστρωμάτων αποκατασταθεί στα ίδια επίπεδα όπως και για ADT-αφελείς ξενομοσχευμάτων. Ωστόσο, και από τα ξενομοσχεύματα CR, η φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων STAT1 και STAT5A ήταν υψηλή, για STAT5A είναι σημαντική σε σύγκριση με το ADT-αφελή ξενομοσχεύματα (p = 0,040? Log

2 αναλογία = 1.3 ± 0.8)

κινάσης δραστηριότητα στο ADT-αφελή προστατεκτομή δείγματα

Για την εκτίμηση κλινική σημασία, προφίλ δραστηριότητα κινάσης δειγμάτων προστατεκτομή από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη παρήχθησαν. Μια υπογραφή δραστικότητα κινάσης ανακτήθηκε από τα 100 πεπτίδιο κινάσης υποστρωμάτων με υψηλότερα επίπεδα φωσφορυλίωσης, για ξενομοσχεύματα και δείγματα όγκου ασθενών. Για ξενομοσχεύματα, η υπογραφή εκπροσωπήθηκε από τη μέση τιμή όλων των ADT-αφελής ξενομοσχευμάτων. Για κλινικά δείγματα, η υπογραφή εκφράστηκε από τη μέση τιμή των τριών δειγμάτων όγκου ADT-αφελή (περιπτώσεις 1, 2 και 3 του πίνακα 1). Η σύγκριση των δύο προκύπτουν υπογραφές αποκάλυψε 74 κοινόχρηστο φωσφορυλιώσεις υπόστρωμα (Σχήμα 3Α και Β), ενώ το καθένα από αυτά αποτελείται αποκλειστικά 26 φωσφορυλιωμένη υποστρώματα (Σχήμα 3C). Η επικάλυψη 74% δηλώνει ότι το μοντέλο ξενομοσχεύματος που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη είναι ένα βιολογικά σχετικό υπόδειγμα της κλινικής κατάστασης.

Ένα ADT-αφελή υπογραφή δραστηριότητα της κινάσης ορίστηκε ως 100 πεπτίδιο κινάσης υποστρωμάτων με υψηλότερα επίπεδα φωσφορυλίωσης. Για ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη, η υπογραφή εκπροσωπήθηκε από τον μέσο όρο όλων των επιπέδων φωσφορυλίωσης του υποστρώματος ADT-αφελής. Για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, μια κορυφαία 100 υπογραφή παρήχθη από τον υπολογισμό του μέσου όρου των τριών ADT-αφελή (περίπτωση 1, 2, και 3? Πίνακας 1) επίπεδα φωσφορυλίωσης του όγκου. (Α) Εβδομήντα τέσσερα από τα 100 υποστρώματα από κοινού από το ξενομόσχευμα και όγκου ADT-αφελή υπογραφές των ασθενών. (Β) Η φωσφορυλιωμένη πεπτιδικά υποστρώματα κινάσης μοιράζονται ADT-αφελή ξενομοσχευμάτων καρκινώματος του προστάτη (n = 3) και ADT-αφελή όγκους από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (μέσος όρος της περίπτωσης 1, 2, και 3). Απαριθμούνται τα αντίστοιχα ονόματα γονίδιο Τα υποστρώματα », με έναρξης και λήξης θέσεων για την πεπτιδική αλληλουχία μέσα στην πρωτεΐνη σε παρένθεση. (Γ) Οι αποκλειστικά φωσφορυλιωμένο υποστρώματα πεπτιδίου κινάσης (n = 26) στην υπογραφή ξενομόσχευμα (αριστερά) και στην υπογραφή ασθενή όγκου (δεξιά).

Η

STAT1 και STAT5A τύπου υποστρώματος φωσφορυλίωσης από προστατεκτομή Δείγματα

Μετά την αποκάλυψη αυξημένη φωσφορυλίωση της STAT1 και υποστρώματα STAT5A από ADL και ξενομοσχευμάτων CR σε σύγκριση με το από ADT-αφελή ξενομοσχευμάτων, διερευνήθηκαν τα αντίστοιχα επίπεδα φωσφορυλίωσης υποστρώματος από δείγματα προστατεκτομή. Για να γίνουν συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών ασθενών, οι φωσφορυλιώσεις υπόστρωμα από κάθε δείγμα όγκου του τρία ADT-αφελή ασθενούς ομαλοποιήθηκε στα αντίστοιχα φωσφορυλιώσεις από τον ετερόπλευρο λοβού δείγμα φυσιολογικού ιστού. Ένας ασθενής (περίπτωση 4, Πίνακας 1) είχαν λάβει μακροχρόνια ADT πριν τα πρώτα σημάδια της νόσου CR ανιχνεύθηκαν (άνοδο του PSA ορού) και παραπομπή σε ριζική προστατεκτομή. Από κανονικό ιστό αυτού του ασθενούς ήταν επίσης ανδρογόνων στερηθεί, ομαλοποίηση της φωσφορυλίωσης του υποστρώματος που παράγεται από το δείγμα όγκου με εκείνη από το κανονικό δείγμα ιστού αποκλείεται. Έτσι, για αυτόν τον ασθενή, φωσφορυλιώσεις υποστρώματος από το δείγμα όγκου κανονικοποιήθηκαν προς τη μέση τιμή των κανονικών φωσφορυλιώσεις υπόστρωμα ιστού από τις τρεις ADT θεραπεία ασθενείς. Η φωσφορυλίωση του υποστρώματος STAT1 ήταν χαμηλό και παρόμοιο για όλους τους ασθενείς. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη ότι η φωσφορυλίωση του υποστρώματος STAT5A από όγκο σε σχέση με τα κανονικά δείγματα σε όλες τις ADT θεραπεία ασθενείς ήταν χαμηλή? log

2 αναλογία = 0.7 ± 1.2 (n = 3), ήταν σημαντικά υψηλότερες στις αρχές της δεκαετίας του ασθενούς CR? ημερολόγιο

2 αναλογία = 2,6 (n = 1) (Εικόνα 4Α).

(Α) Για την θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) ασθενείς -naïve καρκίνο του προστάτη, το αρχείο καταγραφής

2 αναλογίες μεταξύ τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του υποστρώματος που παράγεται από το δείγμα προστατεκτομή όγκου έναντι του αντίστοιχου δείγματος αντίπλευρο λοβού φυσιολογικό ιστό υπολογίστηκαν. Για τον ασθενή που έλαβε τη μακροπρόθεσμη ADT πριν τη ριζική προστατεκτομή, το αρχείο καταγραφής

2 αναλογία μεταξύ των επιπέδων φωσφορυλίωσης του υποστρώματος από το δείγμα όγκου έναντι των επιπέδων φωσφορυλίωσης μέση υπόστρωμα από φυσιολογικά δείγματα ιστού του ADT θεραπεία ασθενείς »υπολογίστηκαν (δεδομένου ότι αυτό φυσιολογικό ιστό του ασθενούς, επίσης, εκτέθηκε σε ADT). (Β) Western ανοσοαποτύπωμα ανάλυση των προϊόντων λύσης των δειγμάτων προστατεκτομή όγκου »με ένα αντίσωμα έναντι υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α), η κύρια πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται και να σταθεροποιηθεί κάτω από συνθήκες υποξίας, αποκαλύπτοντας αυξημένη έκφραση του HIF-1α στην λύμα από τις αρχές του όγκου CR (περίπτωση 4). Δεν HIF-1α έκφραση παρατηρήθηκε σε λύματα από ADT-αφελή όγκους.

Η

υποξία που προκαλείται Αύξηση STAT5A υποστρώματος φωσφορυλίωση από καρκίνωμα του προστάτη κύτταρα

Από τα αποτελέσματα που έχουν επιτευχθεί σε ξενομοσχεύματα και προστατεκτομών , σε συνδυασμό με την αναγνώριση του πιθανού ρόλου της υποξίας σε εξέλιξη της νόσου CR [5], έγινε η υπόθεση ότι η υποξία μπορεί να εμπλέκεται στην μεταβάλλεται δραστηριότητα STAT5A κινάσης. Για να εκτιμηθεί εάν η κατάσταση υποξίας ήταν παρούσα στα δείγματα προστατεκτομή, Western ανοσοαποτύπωσης ανάλυση του HIF-1α πραγματοποιήθηκε στα λύματα προστατεκτομή όγκου. HIF-1α είναι ο κύριος ρυθμιστής της ομοιόστασης του οξυγόνου, είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται και να σταθεροποιηθεί κάτω από συνθήκες υποξίας. Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι η έκφραση του HIF-1α βρέθηκε στο λύμα από τον ασθενή με πρώιμη νόσο CR, όπως αντανακλάται από την αύξηση του PSA μετά από μακροχρόνια ADT (περίπτωση 4), ενώ δεν έκφραση HIF-1α παρατηρήθηκε στα κυτταρολύματα από ADT -naïve όγκοι

για να επιθεωρήσει περαιτέρω αυτή η υπόθεση, τα προφίλ δραστικότητας κινάσης δημιουργήθηκαν από νορμοξικά κύτταρα καρκινώματος 22Rv1 προστάτη, όπως επίσης και από τα κύτταρα που εκτίθενται σε μέτρια (1% O

2) και σοβαρή (& lt.? 0,02% O

2) υποξία για 24 ώρες. Η κυτταρική γραμμή 22Rv1 είναι αποκρίνονται στο ανδρογόνο και αρχικά προέρχεται από την υποτροπή ξενομόσχευμα CWR22 [19], που εκφράζουν τόσο τον υποδοχέα ανδρογόνων και PSA, που αντιπροσωπεύει έτσι ένα μοντέλο του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του πεπτιδίου υποστρωμάτων 22 κινάση ήταν σημαντικά αυξημένη ή μειωμένη κατά προϊόντων λύσης υποξικών κυττάρων (μέτρια ή σοβαρή υποξία) σε σύγκριση με με προϊόντα λύσης νορμοξικό κύτταρο. Αυτά περιελάμβαναν την υπόστρωμα STAT5A, το οποίο παρουσίασε ένα αυξανόμενο επίπεδο φωσφορυλίωσης με την αύξηση υποξία (Σχήμα 5Α, μπλε μπάρες), αν και το μέσο επίπεδο φωσφορυλίωσης για το σύνολο των 22 επηρεάζονται σημαντικά πεπτιδικά υποστρώματα κινάσης ήταν χαμηλή (Σχήμα 5Α, γκρι μπάρες). Η διαφορά στο μέσο επίπεδο φωσφορυλίωσης σε μέτρια έναντι σοβαρή υποξία δεν ήταν σημαντική. Για STAT5A, το αρχείο καταγραφής

2 αναλογίες σε σχέση με νορμοξικές κύτταρα ήταν 0,47 ± 0,27 (ρ & gt? 0,05) για τα μετρίως υποξικά κύτταρα και 0,63 ± 0,31 (ρ = 0,020) για τα σοβαρά υποξικά κύτταρα. Μια λίστα με τα πεπτιδικά υποστρώματα 22 κινάση επηρεάζονται σημαντικά από την υποξία παρέχεται στο Σχήμα 5Β

(Α) 22Rv1 κύτταρα εκτέθηκαν σε μέτρια (1% O

2) και σοβαρή (& lt?. 0,02% O

2) υποξία για 24 ώρες σε ένα θάλαμο υποξίας. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από τρία βιολογικά αντίγραφα από καθεμία από τις τρεις πειραματικές ομάδες (φυσιολογική οξυγόνωση, μέτρια υποξία, υποξία σοβαρή) αναλύθηκαν για να δημιουργήσει το προφίλ της δραστικότητας κινάσης. Κινάσης προφίλ δραστικότητας υποξικών και ορθοξικές κυτταρολύματα ανιχνεύεται αυξημένη φωσφορυλίωση του υποστρώματος STAT5A με αυξανόμενη υποξία (μπλε γραμμές), ενώ το μέσο επίπεδο φωσφορυλίωσης για όλες πεπτιδικά υποστρώματα 22 κινάσης με σημαντικές αλλαγές ήταν χαμηλή (γκρι ράβδοι). * Η αύξηση από τη φυσιολογική οξυγόνωση έως σοβαρή υποξία ήταν σημαντική (p = 0,020). Η διαφορά στο μέσο επίπεδο φωσφορυλίωσης σε μέτρια έναντι σοβαρή υποξία δεν ήταν σημαντική. (Β) Το ποσοστό των μειωμένη έναντι αυξημένη δραστικότητα κινάσης σε υποξικά έναντι κυτταρολύματα ορθοξικές 22Rv1. Εμφανίζεται είναι τα ονόματα γονιδίων των επηρεαζόμενων πεπτιδίου κινάσης υποστρώματα, με έναρξης και λήξης θέσεων για την πεπτιδική αλληλουχία μέσα στην πρωτεΐνη σε παρένθεση. (C) κηλίδα Western της έκφρασης αντι-φωσφο-STAT5A /Β και αντι-STAT5A σε νορμοξικά (-) και σοβαρά υποξική (& lt? 0,02% O

2, 24 h) (+) κυτταρολύματα από PC3, DU145 και 22Rv1 κύτταρα. Anti-γ-τουμπουλίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) στύπωμα Western αντι-HIF-1α, αντι-φωσφο-STAT5A /B και έκφραση αντι-STAT5A των προϊόντων λύσης από PC3, DU145 και 22Rv1 κυττάρων με (+) ή χωρίς (-) από 4 ώρες έκθεσης σε 100 μΜ η υποξία-μιμητικό παράγοντα χλωριούχο κοβάλτιο (COCI

2), ένα χημικό επαγωγέα του HIF-1α. Anti-γ-τουμπουλίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Ένα Western ανοσοαποτύπωση επιβεβαίωσε αντίστοιχα αυξημένο επίπεδο έκφρασης της φωσφο-STAT5A /Β (Y694 /699) σε σοβαρά υποξικά 22Rv1 κύτταρα, σε σύγκριση με ορθοξικές 22Rv1 κύτταρα (Σχήμα 5C). Η έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης STAT5A βρέθηκε επίσης να αυξηθεί κάτω από υποξία, αλλά σε μικρότερο βαθμό από την αύξηση σε φωσφο-STAT5A /έκφραση Β. Να αποκλείσει ότι η διαπίστωση της υποξίας που προκαλείται από αυξημένη δραστηριότητα STAT5A ήταν κυτταρική σειρά ειδικών αναλύσαμε δύο επιπλέον κυτταρικές γραμμές, τις γραμμές PC3 και DU145 καρκίνου του προστάτη κυττάρων, αποκαλύπτοντας παρόμοια αποτελέσματα όπως και στην κυτταρική σειρά 22Rv1 (Σχήμα 5C).

Για να διευκρινιστεί αν η ενεργοποίηση STAT5A άμεσα προκαλείται από την ενεργοποίηση του HIF-1α που έλαβαν τα κύτταρα με CoCl

2, ενός χημικού επαγωγέα του HIF-1α. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5D, CoCl

2 επάγεται αυξημένη έκφραση τόσο του HIF-1α και φωσφο-STAT5A /Β σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Η έκφραση της πρωτεΐνης STAT5A αυξήθηκε σε μία κυτταρική σειρά και αμετάβλητη στις δύο άλλες κυτταρικές γραμμές. Από HIF-1α επαγόμενη ειδικά μια αύξηση στη φωσφορυλίωση STAT5 αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζει ότι η υποξία είναι η αιτία της αυξημένης δραστηριότητας STAT5, μέσω ενός μηχανισμού HIF-1α μεσολάβηση.

Συζήτηση

Η τρέχουσα μελέτη εντόπισε αυξημένο επίπεδο φωσφορυλίωση του υποστρώματος πεπτιδίου STAT5A από ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη ADL και CR, σε σύγκριση με το από ADT-αφελής ξενομοσχευμάτων.